Guía Práctica 8

Sclerotium rolfsii

Enfermedad: Añublo sureño

Manejo del hongo

en el laboratorio

Contenido
Guillermo Castellanos, Experto en Investigación–2 Generalidades 8-2
Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación Procedimientos 8-3
Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto A. Recolección y transporte de las muestras 8-3
B. Preparación del medio de cultivo PDA 8-5
Fitopatología de Frijol
C. Aislamientos de S. rolfsii 8-6
1. En el medio de cultivo PDA 8-6
2. Aislamiento monomicelial 8-8
D. Incremento de S. rolfsii 8-10
E. Inoculación en el invernadero 8-12
F. Conservación de S. rolfsii para almacenamiento 8-15
G. Recuperación del hongo almacenado 8-15
 Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol

Generalidades

Sclerotium rolfsii es el hongo causante de la enfermedad

conocida como añublo sureño. Este hongo patógeno habita
en el suelo y hace su aparición, principalmente en las épocas
lluviosas del año cuando la temperatura es alta.

Los síntomas característicos de la enfermedad se observan

en el cuello de la raíz de la plántula de frijol; luego la
enfermedad se extiende por el tallo. Cuando el ataque del
hongo es muy fuerte, en el cuello de la raíz se ve su micelio
blanco y los esclerocios en formación (Foto 1), lo que indica
la muerte próxima de la plántula. La Foto 2 presenta una
semilla de frijol que ha germinado y es atacada por el hongo,
que la cubre de micelio.
Foto 1
Los esclerocios de S. rolfsii son de forma esférica y su color
varía: son blancos al iniciar su formación y pocos días
después, cuando han madurado, se tornan de color castaño.

Foto 2

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Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii
Enfermedad: Añublo sureño

Procedimientos

A. Recolección y transporte de las muestras

Para aislar el hongo Sclerotium rolfsii es necesario
obtener material vegetal enfermo de una planta de frijol
que presente síntomas específicos de la enfermedad;
éstos, generalmente, aparecen en el cuello de la raíz.

Materiales

– Toallas de papel
– Bolsas de papel
– Rótulos para identificar el material
– Prensa para muestras o un cuaderno corriente

• Toallas de papel. La muestra de tejido de frijol

infectado (de la raíz, generalmente) que se colecta
se envuelve en una toalla de papel que sirve,
además, para absorber su humedad. Si no hay
toallas, pueden usarse materiales similares como
servilletas, papel higiénico, pañuelos faciales y, en
último caso, papel periódico.

• Bolsas de papel. Las muestras de tejido infectado

envueltas en algún papel absorbente se colocan en
bolsas o sobres de papel. No se deben usar bolsas
plásticas porque no son porosas y contribuyen,
por ello, a la acumulación de humedad en su
interior; esta humedad favorece el crecimiento de

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Manejo de Patógenos del Frijol

microorganismos saprofitos, los cuales dificultarán

el aislamiento del patógeno que se hace a partir del
tejido de frijol.

• Rótulos para marcar las muestras. Es muy

importante identificar claramente la muestra con la
siguiente información: variedad (o genotipo) de frijol,
tamaño y color de sus granos, lugar donde se toma
la muestra (localidad, provincia, departamento,
país), fecha de recolección de la muestra,
nombre del recolector y, en lo posible, latitud y
longitud (aproximadas) del lugar en que se hizo la
recolección. El rótulo debe quedar bien adherido en
cada muestra.

Recomendaciones

– Indicar en el rótulo si la recolección se hizo en

el campo de un agricultor o en una estación
experimental.
– Cuando no haya suficientes rótulos para todas
las muestras, marcar las bolsas con un código y
registrar la información completa en una libreta de
campo.
– No recolectar material vegetal húmedo; si está en
esas condiciones, secarlo con toallas de papel antes
de ser transportado. Una vez en el laboratorio, y si
no se procesa inmediatamente, dejarlo sobre toallas
de papel al aire libre para que termine de secarse.

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Enfermedad: Añublo sureño

Pasos del proceso

• Paso 1
Tomar muestras de una raíz que presente síntomas
de la enfermedad.

• Paso 2
Envolver la muestra en una toalla de papel, colocarla
en una bolsa o sobre de papel y adherir a ésta el
rótulo que corresponda (ver A. Recolección y...)

• Paso 3
Enviar la muestra, tan pronto como sea posible, al
sitio o laboratorio donde se hará el aislamiento del
hongo patógeno. Nunca envíe las muestras dentro
de bolsas plásticas o envueltas en papel aluminio
(ver A. Recolección y...).

B. Preparación del medio de cultivo PDA

Las siglas PDA corresponden a los componentes del
medio: papa, dextrosa y agar. Este medio se usa para
aislar el patógeno.

Materiales

– PDA deshidratado 39 g/litro

– Agua destilada 1 litro
– Frascos erlenmeyer de 1000 ml 2

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Preparación
– Se pesan los ingredientes (Foto 3), se colocan en
un recipiente grande, que puede ser un vaso de
precipitado, y se les agrega el agua; esta solución se
envasa en dos frascos erlenmeyer (500 ml en cada
uno).
– Los frascos erlenmeyer con el medio de cultivo PDA
se esterilizan en el autoclave. Esta máquina, con
Foto 3 una presión de 20 libras y una temperatura de
121 °C, realiza el proceso total de esterilización en
40 minutos.
– El medio esterilizado se deja enfriar hasta que pueda
manipularse (Foto 4) y se vierte luego en cajas petri,
a razón de 25 ml por caja (Foto 5).

C. Aislamientos de S. rolfsii

1. En el medio de cultivo PDA

Foto 4 Materiales

– Cámara de flujo laminar

– Tijeras
– Cajas petri de 60 y 100 mm
– Agua destilada estéril
– Hipoclorito de sodio al 2.5%
– Toallas de papel
– Mechero
– Marcador (punta de mediana a fina)
– Incubadora (a 24 °C)
Foto 5

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Enfermedad: Añublo sureño

– Medio de cultivo PDA

– Pinzas
– Muestra vegetal con síntomas

Nota: Todos los procedimientos se deben realizar

dentro de una cámara de flujo laminar; además, deben
cumplirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad
que se exigen en un laboratorio. En otras palabras, se Foto 6
aplican siempre las buenas prácticas microbiológicas
(BPM).

Pasos del proceso

• Paso 1
Cortar varios trozos del tejido infectado de la
muestra utilizando una tijera estéril (Foto 6).

• Paso 2
Desinfectar, durante 3 minutos, los trozos de Foto 7
muestra en una caja petri de 60 mm que contenga
una solución de hipoclorito de sodio al 2.5%.

• Paso 3
Lavar tres veces con agua destilada estéril los trozos
desinfectados (Foto 7).

• Paso 4
Colocar los trozos lavados sobre toallas de papel
estériles durante 10 minutos para que se sequen
(Foto 8).

Foto 8
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Manejo de Patógenos del Frijol

• Paso 5
Una vez que los trozos estén secos, tomar los
pedazos de tejido con una pinza estéril, ‘sembrarlos’
(tres por caja) en cajas petri que contengan el medio
de cultivo PDA (Foto 9). Incubar las cajas a 24 °C
durante 10 días, tiempo en que el hongo producirá
Foto 9 micelio blanco (Foto 10), del cual saldrán más tarde
esclerocios que pueden verse a simple vista como
puntos negros (Foto 11); con el tiempo, estos
esclerocios se tornarán de color café.

2. Aislamiento monomicelial
El objetivo de este procedimiento es obtener una
cepa del hongo genéticamente pura. Si el hongo se
aísla de tejido vegetal con síntomas, éstos pueden ser
producidos por varias cepas de un mismo hongo. Por
eso es necesario purificar el hongo obtenido en el primer
Foto 10 paso del aislamiento, empleando tejido de las puntas de
algunas hifas. El procedimiento comprende los pasos
siguientes:

• Paso 1
Con un sacabocado de aproximadamente 0.5 cm de
diámetro, transferir el hongo que ha crecido en el
medio de cultivo PDA (ver C., 1. En el medio…,
Paso 5) al centro de una caja petri que tenga el
medio de cultivo PDA. Incubar a 24 °C de 24 a
48 horas.

Foto 11

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Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii
Enfermedad: Añublo sureño

• Paso 2
Observar, durante este tiempo, el crecimiento del
micelio bajo el estereoscopio en la cámara de flujo
laminar. Enfocar los bordes de la colonia para
identificar las puntas de las hifas.

• Paso 3
Cortar, con un alfiler flameado, un pedacito de agar
que contenga la punta de una sola hifa, ejecutando
luego las siguientes operaciones:

– Tener la precaución de no tocar otras hifas

alrededor de la que se está aislando.
– Transferir el pedacito de agar con la hifa a una
nueva caja petri que contenga medio de cultivo
PDA; colocar solo una hifa en cada caja petri.
– Incubar estas cajas a 24 °C durante 10 días.
Después de este tiempo, el hongo producirá
esclerocios, que se observan como puntos
blancos pequeños; con el tiempo, éstos se
tornan de color castaño o café y llegan a la
madurez a los 25 días (Foto 12).
Foto 12

• Paso 4
Destapar, durante 3 días para que se sequen, las
cajas petri que contienen estos esclerocios maduros
(obtenidos partiendo del aislamiento monomicelial).
Una vez secados, cosechar los esclerocios y
almacenarlos a –20 °C, ya sea en sobres de papel
mantequilla o en tubos de vidrio cerrados.

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D. Incremento de S. rolfsii
En el laboratorio de Patología de Frijol se halló que
la producción de esclerocios de S. rolfsii se favorecía
cuando se suplementaba el medio de cultivo de agar
con harina de frijol.

Preparación del medio agar-harina de frijol

(AHF)

Materiales
– Agar granulado 15 g
– Agua destilada 1 litro
– Harina de frijol esterilizada 50 g
– Frascos erlenmeyer de 1 litro 4

Pasos del proceso

• Paso 1
Moler semillas de frijol que tengan una humedad
menor que 14%, utilizando un molino o un mortero;
el producto debe quedar molido, pero no muy
finamente. Colocar luego esta harina en un recipiente
cerrado y esterilizarlo en autoclave dos veces. Una
vez esterilizada la harina, proceder con la preparación
del medio AHF.

Nota: Cada vez que se necesite harina de frijol para

preparar el medio de cultivo, ésta debe obtenerse y
esterilizarse un día antes de la preparación.

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Enfermedad: Añublo sureño

• Paso 2
– Mezclar muy bien el agar y la harina de frijol.
– Adicionar 1 litro de agua destilada a esa mezcla.
– Verter, en los frascos erlenmeyer de 1 litro,
volúmenes de 250 ml de la mezcla líquida anterior.
– Colocar en la boca de cada frasco erlenmeyer un
capuchón de gasa y ajustarlo con una banda de
caucho; colocar papel aluminio sobre la gasa.
– Esterilizar los frascos erlenmeyer tapados en un
autoclave.
– Cuando se enfríe la mezcla, vaciarla en cajas petri.

• Paso 3
Transferir un esclerocio almacenado (ver
C., 2. Aislamiento monomicelial…, Paso 4) empleando
un alfiler flameado que lleve un pedacito de agar en la
punta, y sembrarlo en el medio AHF contenido en una
caja petri. Repetir este paso en varias cajas.

El esclerocio da comienzo al crecimiento del hongo,

el cual cubrirá todo el medio. A los 6 días de la
‘siembra’, se inicia la formación de los nuevos
esclerocios; primero se observan pequeños puntos
blancos que, con el paso del tiempo, se tornan de
color castaño o café y alcanzan la madurez a los
25 días.

• Paso 4
Pasado este tiempo, destapar las cajas durante
3 días para que se sequen los esclerocios. Una vez
secos, cosecharlos y almacenarlos en sobres de
papel mantequilla o en tubos de vidrio, a –20 °C.

8 - 11
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E. Inoculación en el invernadero

Preparación del inóculo de S. rolfsii en suelo

Materiales

– Suelo
– Harina de frijol
– Agua destilada
– Bandejas autoclavables para preparar inóculo
– Papel aluminio y papel de envolver
– Esclerocios de S. rolfsii

Pasos del proceso

La preparación de inóculo de S. rolfsii, usando suelo

como vehículo, comprende los siguientes pasos:

• Paso 1

– Hacer una mezcla al 1% del suelo y la harina de frijol,

así: 10 g de harina de frijol estéril por 1 kg de suelo.
– Homogenizar la mezcla manualmente agitándola
dentro de una bolsa.
– Esparcir esta mezcla sobre la bandeja, de manera
que forme una capa de 5 cm de profundidad (o
menor) en la bandeja.
– Añadir enseguida 50 ml de agua destilada por
kilogramo de suelo empleado en la bandeja.

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– Cubrir la bandeja con papel aluminio y luego

con papel ‘kraft (papel de envolver) y llevarlas al
autoclave.
– Hacer bandejas de acuerdo a la cantidad de inóculo
que se necesite.

• Paso 2
Dejar enfriar esta mezcla de suelo en la bandeja,
una vez esterilizada en el autoclave. Pesar los
esclerocios antes cosechados y almacenados (ver
D. Incremento de..., Paso 4) y esparcirlos
uniformemente sobre la superficie del suelo de cada
bandeja, a razón de 0.2 g de esclerocios (200 mg)
por kilogramo de suelo.

• Paso 3
Colocar las bandejas en el laboratorio a temperatura
ambiente, y revisarlas semanalmente para
comprobar que no se haya contaminado ese suelo
inoculado. Pasados de 15 a 17 días, el hongo habrá
crecido lo suficiente para colonizar con micelio el
suelo y producir esclerocios. Este suelo (Foto 13) se Foto 13
empleará como inóculo en las pruebas de
invernadero.

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Manejo de Patógenos del Frijol

Inoculación

Preparar en el invernadero el suelo para la siembra del

modo siguiente:

– Mezclar suelo y arena en la proporción 2:1.

– Agregar a este suelo 5 g de harina de frijol estéril por
Foto 14 cada kilogramo de suelo.
– Añadir a este suelo el suelo-inóculo al 3%, obtenido
en el Paso 3 anterior (Foto 13); agregar, por tanto,
30 g de suelo-inóculo por cada kilogramo de suelo.

En la Foto 14 observamos una bandeja de siembra de

invernadero con una capacidad de 450 kg de suelo.
A esta bandeja de siembra se le agregan 13.5 kg de
suelo-inóculo obtenido en el Paso 3.

La evaluación del germoplasma se realiza a los 7, 14,

21 y 28 días después de la siembra (Foto 15).
Foto 15
Cuando el ensayo a que se somete el germoplasma
requiere cantidades grandes de mezcla de suelo, se usa
un mezclador o trompo eléctrico (Foto 16).

Foto 16

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Enfermedad: Añublo sureño

F. Conservación de S. rolfsii para

almacenamiento
Este hongo se conserva en los esclerocios obtenidos en
la etapa de incremento del hongo (ver D. Incremento
de..., Paso 4), los cuales fueron almacenados a –20 °C
en sobres de papel mantequilla o en tubos de vidrio.

G. Recuperación del hongo almacenado

Para reactivar el crecimiento de S. rolfsii se toman
varios esclerocios del aislamiento monomicelial que
fueron almacenados a –20 °C (ver C., 2. Aislamiento
monomicelial, Paso 4) y se transfieren al medio de
cultivo AHF, donde los esclerocios germinarán y se
reiniciará el desarrollo del hongo (Foto 17).

Foto 17

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