Universidad de Cartagena

Facultad de Ciencias Farmacéuticas

Programa de Química Farmacéutica
Laboratorio de Microbiología

Arnedo Mayoral A1; Hernández Elles J1; Marquez Polo D1; Arzuza Navarro O2.
1. Estudiantes, universidad de Cartagena, facultad de ciencias farmacéuticas,
programa de química farmacéutica, VI semestre, Microbiología.
2. Docente de microbiología, Química Farmacéutica, Universidad de Cartagena, Sede
Zaragocilla, Cartagena de indias.
Correspondencia: jhernandeze1@unicartagena.edu.co (Jarrison Hernandez E.).
Resumen
Medios de cultivo. Son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en
condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Son esenciales
en el Laboratorio de Microbiología ya que estos cultivos se utilizaron durante el transcurso
de las practicas por lo que se deben tomar muchas medidas en su fabricación, preparación,
conservación y uso, asegurando la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los
resultados obtenidos.
Los medios de cultivos se pueden clasificar de diferentes maneras ya sea según su origen,
composición, uso etc. Estos cultivos presentan múltiples funciones entre las que tenemos
determinación de la sensibilidad de una bacteria ante ciertos agentes antimicrobianos.
En el presente informe se describe la preparación de medios de cultivos de una muestra de
alimento a la cual se le harán recuentos de microorganismos fermentadores de lactosa
(Coliformes), seguida de un aislamiento de una bacteria, pruebas de metabolismo, tinción
gran y por último se determinara la sensibilidad de la bacteria ante ciertos agentes
antimicrobianos.
Palabras claves: Coliformes, antimicrobianos, bacteria.
Abstract
Culture media they are a mixture of nutrients that, in adequate concentrations and in optimal
physical conditions, allow the growth of microorganisms. They are essential in the
Microbiology Laboratory, since these cultures were used during the course of the practices,
so many measures must be taken in their manufacture, preparation, conservation and use,
ensuring the accuracy, reliability and reproducibility of the results obtained.
Culture media can be classified in different ways, either according to their origin,
composition, use, etc. These cultures have multiple functions, among which we have the
determination of the sensitivity of a bacterium to certain antimicrobial agents.
This report describes the preparation of culture media from a food sample that will have
lactose fermenting microorganisms (Coliforms), followed by an isolation of a bacterium,
metabolism tests, large staining and finally the sensitivity of the bacteria to Certain
antimicrobial agents will be determined.

Keywords: Coliforms, antimicrobials, bacteria.

Introducción
Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de
microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar
sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer
y multiplicarse para dar colonias. Los microorganismos son los seres más abundantes de la
tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno,
colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más
importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e
hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de
crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros.
(Madigan M, et al 2010)
Los medios de cultivos se pueden clasificar según su origen en:
a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o
vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce
exactamente.
b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cuali y
cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo
una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.
También se pueden clasificar según su consistencia:
a) LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución acuosa. No tienen
agar.
b) SÓLIDOS: Poseen una concentración de agar de 1,5% cuando es para cultivos de bacterias
y 2% cuando es para cultivos de hongos.
c) SEMISÓLIDOS: Constituidos por 0,5% de agar y estos medios son utilizados para
microorganismos flagelados.
Cuando se obtienen los cultivos de microorganismos por lo general se utilizan técnicas de
recuentos ya que cuando trata de medirse una colonia con ayuda del microscopio es muy
difícil y además que este no diferencia entre microorganismos.
Existen diversos métodos para enumerar microorganismos en muestras de muy diferente
origen. Cada método tiene sus peculiaridades a la hora de transformar los datos obtenidos en
una densidad microbiana de la muestra estudiada, bien sea Unidades Formadoras de
Colonias, Microorganismos Totales, etc.
Un método sencillo para la enumeración de bacterias y hongos se basa en la cuantificación
de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por mL o g de muestra.
Las poblaciones microbianas poseen muchas especies diferentes, por lo que se hace necesario
obtener cultivos puros, para así poder determinar características de un microorganismo.
Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismos. Sólo después de
haber obtenido un cultivo puro se puede identificar un microorganismo y/o estudiar sus
características bioquímicas o de otro tipo.
La obtención de un cultivo puro se hace mediante una técnica de aislamiento. La técnica de
aislamiento más utilizada consiste en sembrar en un medio de cultivo sólido en placa de tal
manera que los microorganismos generen colonias separadas ("Aislamiento por agotamiento
en estrías"). Se sabe que cada colonia procede de una sola célula. Por lo tanto el cultivo
descendiente de una colonia es un cultivo puro.
Se trata de un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo
sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener, a partir de un
elevado número de bacterias, un número reducido de ellas distribuidas individualmente sobre
la superficie de la placa. Al incubar ésta, cada una de las bacterias originará una colonia.
Consiste en tomar con asa o aguja de siembra el cultivo de partida y sembrarlo en agar en
placa haciendo tandas de estrías sucesivas tal y como se muestra en la figura. Entre cada
tanda de estrías debe esterilizarse el asa de forma que la siguiente estría se hace con los
microorganismos que arrastramos de la anterior. De esta forma conseguimos que en las
sucesivas estrías sea cada vez menor el número de células que arrastramos con el asa.

Existen diversas pruebas bioquímicas para, estas pruebas son utilices para la identificación y
clasificación bacteriana. Algunas de las pruebas utilizadas tenemos el agar citrato, este se
basa en la asimilación del citrato como única fuente de carbono, existen otras pruebas tales
como, medio SIM, agar T.S.I. (Faddin J, 2013)
Luego del cultivo y aislamiento de las bacterias, los investigadores deben utilizar la
microscopia para el estudio de estas, pero debido al tamaño de la mayoría de las células
bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal
dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. El modo más simple
de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el contraste de las células para la microscopía, son
suficientes los procedimientos que usan un solo colorante llamado de tinción simple. Sin
embargo, a menudo se utilizan métodos que no tiñen de igual modo todas las células, es el
proceso denominado tinción diferencial. Uno muy usado en microbiología es la tinción
Gram. Basándose en su reacción a la tinción Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos: gran positivas y gran negativas. Esta tinción tiene gran importancia en taxonomía
bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas
bacterias. (Lourdes, 2004)
Las bacterias gran negativas dan coloraciones de color rosado pálido, mientras que las
bacterias gran positivas dan coloración violeta.

En la actualidad para la lucha contra las bacterias se utilizan muchos antibióticos, pero para
poder fabricar un nuevo antibiótico, se requieren muchos estudios, para ello muchos
investigadores determinan la sensibilidad de una bacteria a determinados agentes
antimicrobianos: antibiograma.
El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que
se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos. En efecto, la
sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento
antibiótico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones terapéuticas
individuales.
El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las resistencias
bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a escala de un servicio, un centro de
atención médica, una región o un país, es como puede adaptarse la antibioterapia empírica,
revisarse regularmente los espectros clínicos de los antibióticos y adoptarse ciertas decisiones
sanitarias, como el establecimiento de programas de prevención en los hospitales. (Lourdes
M, 2004).
En el presente informe se describirá la realización de un medio de cultivo, determinación de
la sensibilidad antimicrobiana etc.

PROCEDIMIENTO:

1. Preparación de medios sólidos (agar) o semisólidos (geles).

a) Se pesó la 15.75g de medio de cultivo en un Erlenmeyer y se añadió aproximadamente la

mitad de la cantidad necesaria de agua, agitando con cuidado hasta obtener una suspensión
homogénea, en la cual no se observaron grumos en la parte inferior del recipiente.
b) Una vez se logró la disolución completa se adiciono el resto del agua y se sometió a
calentamiento.
c) Se utilizó la placa de calentamiento con agitación, introduciendo un magneto y atentos que
el medio se agitara constantemente, evitando en todo momento que el medio ebullera.
d) Se supo que el medio tipo agar estaba listo porque al agitar no se observaban grumos en
la superficie interna y el medio se ha vuelto transparente.
e) Por último se etiqueto el Erlenmeyer con el nombre del medio, cantidad preparada y fecha,
y se le entrego al auxiliar los medios de cultivo, para posteriormente sea sometido a
esterilización por calor húmedo (autoclave) a temperatura de 121°C X 15 minutos X 15 lb/p
cuadrada.

2. Preparación de las diluciones de la muestra

a) Se desinfecto con alcohol al 70% nuestra área de trabajo y se encendió el mechero.
b) Se marcó todo el material: frasco (10-2) tubos con solución salina o agua de peptona (10-3
y 10-4 ) y las 3 cajas vacías y los tubos con caldo Lactosa: 10-2 10-3 y 10-4 . L
c) Se mezcló bien la muestra suministrada por el docente, para asegurar su homogenización
antes de preparar las diluciones.
d) Se prepararon diluciones consecutivas de la muestra (10-2 10-3 y 10-4).

3. Siembra de la muestra
a) Con la ayuda de una pipeta se tomaron 5 mL del tubo de dilución marcado como 10-4,
transfiriendo 1 mL a la caja correspondiente y a los 3 tubos con caldo Lactosa.
b) Con la misma pipeta, se repitió el procedimiento hasta sembrar las dos diluciones restantes
tanto en las cajas de Petri como en los tubos con caldo Lactosa.
c) Se agitaron los tubos con caldo Lactosa y se llevaron a incubar a 35 °C +/- 2 °C durante
48 horas.
d) En las cajas de Petri que se le añadieron 1 mL de cada una de las diluciones, se vertieron
aproximadamente 15 mL de Agar Plate Count fundido y mantenido a 45 °C.
e) Se mezcló el inoculo con el medio de cultivo, realizando movimientos de la caja de arriba
hacia abajo, en contra de las agujas del reloj, de izquierda a derecha y por último en sentido
de las agujas del reloj.
f) Una vez solidificado el medio de cultivo, se invirtieron las placas para posteriormente ser
sometidas a temperaturas a 35 °C +/- 2 °C durante 48 horas para su adecuada incubación.
g) Pasado el tiempo se realizó el conteo de colonias.

4. Obtención de cultivos de bacterias a partir de la muestra inicialmente sembrada,

mediante la técnica de siembra por estría.
a) Se flameo el asa recta (que fue la que escogimos por el tipo de medio).
b) Se transfirió el inóculo al medio de cultivo estéril en la placa de Petri, realizando estrías
desde el borde hasta el centro de esta, repitiendo esta operación cuatro veces.
c) Se tapó la caja y se colocó en posición invertida para ser incubada de esta manera.
d) Transcurrido el tiempo de incubación, se observaron las características de las colonias,
seleccionando una de las colonias color azul verdoso (que son las fermentadoras) y
marcándola por debajo con un el marcador.
e) Luego se aislaron las bacterias con la ayuda de un asa redonda se tomó una colonia azul y
se transfirieron por estria a una nueva caja agar LMX Flurocult y a la superficie de cinco
tubos con agar nutritivo.
f) Por último se incubo en posición invertida a 35 °C hasta la próxima sesión de práctica.

5. Metabolismo bacteriano
a) Para la prueba de asimilación del citrato como única fuente de carbono, se utilizó el asa
redonda para sembrar sobre la superficie el agar Citrato y se dejó un poco floja la tapa.
b) Para la prueba de motilidad, producción de gas, sulfuro de hidrógeno y oxidación del
triptófano, se utilizó el asa recta, se tomó una muestra y se inoculo en el medio sim, por
siembra en picadura.
c) Para la prueba de fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa, producción de gas y sulfuro
de Hidrógeno se utilizó el asa recta, se tomó una muestra y se inoculo en el agar T.S.I. por
siembra en picadura, posteriormente y sin sacar el asa del tubo, se sembró en zigzag la
superficie del agar iniciando desde el fondo del tubo hacia la adelante.
d) Se incubo a 35 °C hasta la próxima sesión de laboratorio.
e) Para la prueba de la oxidasa, se tomó una pequeña muestra de la bacteria mediante el uso
de un palillo de madera y se froto sobre la región reactiva de una tirilla de Bactident Oxidase
- Merck®.
f) Reportando las lecturas en los resultados del presente informe.

6. Determinación de la sensibilidad de una bacteria a agentes

antimicrobianos
a) Primeramente con el asa redonda, se tomó una muestra de la bacteria en estudio y se
sembró en un tubo con solución salina estéril hasta que se obtuvo una turbidez visible.
c) Se sumergió un hisopo de algodón en el tubo de solución salina con el inóculo eliminando
el exceso de este presionándolo sobre la pared interna del tubo que lo contiene y por encima
del nivel del líquido.
d) Con el hisopo impregnado de la bacteria, se inoculo la superficie de una placa de agar
nutritivo, pasando el hisopo uniformemente por toda la superficie en tres direcciones y se
pasó el hisopo por el reborde de la placa de agar. Dejándolo secar por 5 minutos.
e) se dividió el agar nutritivo con el inocuo en cuatro partes iguales y en cada una de estas
exactamente en el centro se colocó un sensidisco de antibióticos diferentes cada uno, con
unas pinzas estériles sobre la superficie del agar.
f) Se dejaron las placas 15 minutos a temperatura ambiente para que comiencen a difundir
los antibióticos.
g) Se incubo la placa en posición con la tapa en la parte superior 35 0C durante 18-24 horas.
h) Luego que paso el tiempo de incubación, se midieron los diámetros de las zonas de
inhibición con una regla.
i) Se anotó la concentración del disco y la letra que aparece sobre el mismo para poder
identificarlo en la tabla que nos suministró el docente.

CONCLUSIÓN
Absolutamente todas estas prácticas de laboratorio de la asignatura de Microbiología se
encuentran finamente relacionadas, en las cuales era de suma importancia la responsabilidad
y agudeza por parte de cada uno de los integrantes de este grupo para que el resultado del
mismo fuese exitoso.
 Se logró identificar los diferentes tipos de cultivos, conociendo sus componentes básicos,
la correcta manera de prepararlos de tal forma que no afectáramos su calidad, manejando
adecuadamente los controles necesarios antes y después de su esterilización.
 Se aprendió de manera correcta la realización de diluciones seriadas de una muestra
biológica, al igual que realizar la siembra por profundidad de cada una de las diluciones,
también la forma ideal de realizar el recuento de microorganismos por la técnica de
Siembra en placa por profundidad, NMP; y el empleo de la reglas para recuento de
colonias.
 Se lograron obtener cultivos puros a partir de muestras de contenido microbiano
desconocido y se describieron las características de los cultivos de bacterias en cajas con
agar.
 Se logro entender y aplicar los conceptos básicos del metabolismo bacteriano, Explicando
el fundamento teórico de las diferentes pruebas bioquímicas de uso más común en la
identificación bacteriana.
 Se aprendió de manera clara y concisa hacer preparaciones para realizar exámenes por
microscopía óptica, haciendo frotis de la bacteria en estudio y coloreándola mediante el
uso de una técnica de tinción diferencial como la coloración de Gram de modo que al
observar la bacteria en estudio, se determinó si estábamos frente a una bacteria Gram
positivo o negativa, coco o bacilo.
 Finalmente se obtuvo el conocimiento adecuado para identificar y utilizar los discos de
antibióticos más adecuados para la bacteria en estudio, utilizando distintos antibióticos
con el método de difusión en discos determinando de esta manera la sensibilidad de la
bacteria.
Análisis de resultado

Es muy importante y fundamental mantener el orden y la asepsia durante un procedimiento de un

análisis microbiológico, ya que de esto dependerá la obtención de unos resultados confiables y
extrapolares. De tal manera, se pueden tener en cuenta algunos factores que pueden llegar a
contaminar el medio de cultivo como lo es el entorno de trabajo, instalaciones inadecuadas,
herramientas con materiales que acumules sustancias en su estructura física, etc. A partir de una
muestra de queso costeño entregada por el docente, se logró un cultivo de bacterias coliformes (ver
imagen 1, 1.1 y 1.2).

Imagen 1. Imagen 1.1 Imagen 1.2

Se pudo determinar, mediante una prueba de motilidad, bacterias con flagelos; estas presentaron
coloración (ver imagen 2, 2.1 y 2.2) y por tanto movilidad (natación y desplazamiento), se pudo
distinguir a un grupo de bacterias mediante pruebas bioquímicas (citrato, medio sim, agar TSI);
teniendo en cuenta si el microorganismo es o no capaz de fermentar azúcar o formar compuestos
coloreados.

Imagen Imagen Imagen

Imagen Imagen Imagen. Agar LMX

fluorocult
La bacteria no presentó citocromo oxidasa, ya que en la tirilla de la prueba no hubo cambios a color
violeta después de haber transcurrido 5min. aproximadamente.

Imagen xx. Prueba de

bactidentoxidase

La división número cuatro, donde está la centriazone, indica una efectividad contra los
microorganismos presentes en la caja. En comparación con los otros, que existe una gran resistencia
microbiana.

Imagen xx. Mezcla 1 Imagen xx. Mezcla 2 Imagen xx. Mezcla 3

Antibiótico Concentración (mg) Radio (cm)

Amoxicilina (1) 10 0
Lincomicina (2) 2 0
Eritromicina (3) 15 0,6
Centriaxone (4) 30 1
Tabla 2. Prueba de sensibilidad: mezcla 1

Antibiótico Concentración (mg) Radio (cm)

Amoxicilina (1) 10 0
Lincomicina (2) 2 0
Eritromicina (3) 15 0,5
Centriaxone (4) 30 1
Tabla 3. Prueba de sensibilidad: mezcla 2

Antibiótico Concentración (mg) Radio (cm)

Amoxicilina (1) 10 0
Lincomicina (2) 2 0
Eritromicina (3) 15 0,5
Centriaxone (4) 30 1
Tabla 4. Prueba de sensibilidad: mezcla 3
La distinción de esta bacteria fue con base a los resultados obtenidos y a la tabla de resultados de
pruebas bioquímicas (Tabla 1) que está a continuación:

Tabla 1
Resultados de pruebas bioquímicas. Identificación bacteriana
Características
Lectura obtenida para
Fundamento del medio de Reactivos a
Prueba Lectura positiva la bacteria que el grupo
de la prueba cultivo antes adicionar
analiza
de incubación
Presencia del
Tirilla de sistema La tirilla es Cambio a color
Ninguno Amarillo
bactidentoxidase citocromo blanca violeta
oxidasa
Utilización del
Agar citrato se citrato como Medio de color
Color verde Ninguno Color azul fluorescente
Simmons fuente de azul
carbono
Viraje amarillo en
Fermentación
el fondo del tubo
de glucosa
Fermentación Viraje amarillo en
de sacarosa el centro del tubo
Agar triple Fermentación
azúcar hierro o de lactosa Color rojo Ninguno Viraje amarillo en
TSI Producción de el pico de la flauta
sulfuro de
Aparición color
hidrogeno
negro en el tubo
Producción
Burbujas o
de gas
ruptura del agar
Crecimiento fuera
Motilidad
Ninguno de la línea de
(flagelos)
inoculación
Producción de Burbujas o
Ninguno burbujas
gas ruptura del agar
Transparente,
Medio SIM Producción de Precipitado de
sin burbuja Ninguno
H2S color negro
Reactivo de
Producción de Kovac-(2-3 Aparición de
Anillo rojo
indol gotas) lectura anillo rojo
inmediata
Agar LMX
fluorocult (este
dato lo toma de
Producción de Colonias de color
lo obtenido incoloro Ninguno Azul verdoso
betagalactosida azul verdoso
durante la
práctica de
aislamiento)
Discusión
Es muy importante mantener el control y la calidad de los alimentos para el consumo humano ya
sea para prevenir enfermedades, mortalidad o evitar su propagación, debido a que en cada proceso
de fabricación o manipulación la materia prima puede llegar a contaminarse si no se mantiene una
asepsia adecuada durante el proceso. Por esta razón, se han implementado los análisis
microbiológicos. La mayoría de las precauciones de manipulación y procesado de los alimentos van
dirigidas a las bacterias; se trata de microorganismos que carecen de membrana nuclear,
mitocondrias y cloroplasto, por lo que no se reproducen por mitosis sino por división binaria
transversal.

A partir de los resultados obtenidos, se pudo hacer una comparación con la tabla de referencia y
determinar un tipo de microorganismo como son las coliformes fecales, por ejemplo: la Escherichia
Coli. Gram negativa; esta es un bacilo corto Gram negativo, anaerobio facultativo, pertenece a la
familia Enterobacteria, tribu Escherichia, coloniza el intestino del hombre pocas horas después de
su nacimiento, se considera parte de la biota normal, peo existen cepas patógenas que pueden
causar daño intestinal, extraintestinal o ambos, produciendo diferentes síndromes entre ellos es
síndrome diarreico (Williams & Winkins, 2003).

Las pruebas llevadas a cabo se lograron manejar con una asepsia controlada a pesar de que las
instalaciones no cuentan con las condiciones requeridas para la siembra de cultivos, puesto que
existe la probabilidad de que estos sean contaminados por otras bacterias al margen de los
objetivos.

La muestra de queso costeño entregada para el análisis fue preparada por el asistente técnico del
laboratorio a condiciones establecidas, a partir de aquí, cada preparación fue realizada con la misma
disciplina y calidad. Por tanto, Los resultados indican que cada procedimiento de la práctica fue
culminado con éxito.

Los integrantes del grupo coliforme a menudo se denominan fermentadores mixtos de ácido,
fermentadores del ácido fórmico o bacterias colónicas-disentericas-tifoideas (grupo CDT). La
fermentación mixta de ácidos es característica de los miembros de la familia Enterobacteriaceae y
estos microorganismos degradan la glucosa en una diversidad de productos finales (Williams &
Winkins, 2003).

La tinción presentada fue de color rosa fuerte, lo que indica la presencia de Gram negativa; las Gram
positivas poseen una capa gruesa de peptidoglican y carecen de membrana externa, mientras que
las Gram negativas tienen una capa más delgada de peptidoglican y poseen una membrana externa
(Rodriguez Caballini y col).

El hecho de que un agente sea bactericida o bacteriostático depende fundamentalmente de su

mecanismo de acción, de la concentración alcanzada en el sitio de infección, del tipo de
microorganismo, del tiempo de acción y de la fase de crecimiento de la bacteria. La complicación
surge cuando vemos que en un medio de cultivo en el laboratorio cualquier antibiótico es capaz de
comportarse tanto como bactericida como bacteriostático. Todo se relega a un problema de
concentraciones (Torres, 2002). Los antibióticos depositados en cada división fueron iguales y
estaban a diferentes concentraciones pero con dosis ajustada dependiente de su toxicidad, por
tanto es posible afirmar que la población de bacterias resistente a la mezcla 1 y 2 (ver imagen xxx)
se debe a varios factores: 1: la concentración no fue la ideal, 2: las bacterias son inmunes al fármaco,
3: el tipo de bacterias.

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