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Sebenta de MIA(U)

Henrique Mestre, Inês de Sá Martins, Rafaela Quitéria

2º Ano

2º Semestre

Ano lectivo 2017/2018


Índice
Parte Teórica
Capítulo 1 – Introdução aos Métodos Instrumentais de Análise
Página 1
Capítulo 2 – Absorção Molecular de UV-Visível – Espectroscopia UV-Visível
Página 10
Capítulo 3 – Zona de Infravermelho – Espectrofotometria de Absorção Molecular
Página 39
Capítulo 4 – Espectroscopia de Emissão Molecular – Fluorescência
Página 56
Capítulo 5 – Métodos Espectroscópicos Atómicos – Fotometria de Emissão com Chama
Página 68
Capítulo 6 – Métodos Espectroscópicos Atómicos – Fotometria de Absorção Atómica
Página 78
Capítulo 7 – Métodos Espectroscópicos Atómicos – Fotometria de Emissão com Plasma de Árgon
Página 85
Capítulo 8 – Métodos Espectroscópicos Atómicos – Fluorescência Atómica
Página 88
Capítulo 9 – Potenciometria: Introdução
Página 90
Capítulo 10 – Potenciometria: Elétrodos
Página 96
Capítulo 11 – Condutimetria
Página 107
Capítulo 12 – Técnicas de Preparação de Amostras
Página 118
Capítulo 13 – Métodos Cromatográficos – Introdução aos Métodos Cromatográficos
Página 124
Capítulo 14 – Métodos Cromatográficos - Cromatografia Gasosa
Página 135
Capítulo 15 – Métodos Cromatográficos - Cromatografia Líquida
Página 142
Capítulo 16 – Electroforese Capilar
Página 163
Capítulo 17 – Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Página 180
Capítulo 18 – Espectrometria de Massa
Página 203
Capítulo 19 – Validação de Método e de Equipamento
Página 221
Capítulo 20 – Qualificação de Equipamentos
Página 234

Parte Laboratorial
Trabalho laboratorial n.ª1 – Determinação do Teor de Quinino em Água Tónica Por
Espectrofotometria UV-VIS
Página 239
Trabalho laboratorial n.ª2 – Determinação do Teor de Cafeína e Ácido Acetilsalicílico (AAS) em
Comprimidos
Página 243
Trabalho laboratorial n.ª3 – Análise Quantitativa do Cloridrato de Piridoxina (Vit. B6) por
Colorimetria Indireta
Página 249
Trabalho laboratorial n.ª4 – Determinação do Teor de Benzocaína num Medicamento por
Espectrofotometria UV-Vis
Página 253
Trabalho laboratorial n.ª5 – Análise Quantitativa do Quinino em Água Tónica Por
Espectrofluorimetria
Página 258
Trabalho laboratorial n.ª6 – Análise Quantitativa do Potássio em Ampolas por Fotometria de
Chama
Página 263
Trabalho laboratorial n.ª7 – Análise Quantitativa do Cálcio numa Solução por Espetrofotometria
de Absorção Atómica com Chama
Página 267
Trabalho laboratorial n.ª 8 – Análise Quantitativa do Sódio numa Solução de Ringer por
Potenciométrica Direta
Página 271
Trabalho laboratorial n.ª 9 – Análise Quantitativa de Cloretos e Iodetos numa Solução por
Titulação Potenciométrica
Página 274
Trabalho laboratorial n.ª 10 – Análise Quantitativa de Água numa Amostra pelo Método de Karl
Fischer com Deteção por Bipotenciometria
Página 280
Trabalho laboratorial n.ª 11 – Determinação da Condutividade de Diferentes Tipos de Água por
Condutimetria Direta
Página 284
Trabalho laboratorial n.ª 12 – Análise Quantitativa de uma Solução Ácida por Titulação
Condutimétrica
Página 288
Trabalho laboratorial n.ª 13 – Identificação e Quantificação do Mentol e do Salicilato de Metilo
num Elixir por Cromatografia Gasosa
Página 292
Trabalho laboratorial n.ª 14 – Análise Quantitativa de Cafeína numa Bebida por HPLC
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)
Página 299
Introdução aos Métodos Instrumentais de Análise
- Considerações Gerias sobre um Laboratório de Análises
Laboratório de Análises:

O laboratório de análises vai ter várias variantes em jogo (como pessoal, equipamento, reagentes, equipamento
analítico, entre outros), sendo que para conseguir obter análises, tanto qualitativas como quantitativas de
amostras, com resultados credíveis, tem que ser implementado um sistema de controlo de qualidade.

Qualidade dos Resultados Obtidos no Laboratório:

 Análise programada de modo adequado.


 Funcionamento correto do laboratorio: Controlo de Qualidade (CQ) / Garantia de Qualidade (GQ)

- Procedimentos de amostragem e recepção de amostra;


- Procedimentos de verificação/calibração do material - Balanças, termómetros, material de vidro,
micropipetas;
- Procedimentos de validação de equipamento - Instalação e funcionamento correctos;
- Procedimentos de validação de método analítico.;
- Análise correta dos resultados.

Isto tudo…..

Tem como objetivo de obter uma análise em que os resultados são fiáveis

Implementação de um Sistema de Qualidade:

 Acreditação de métodos analíticos (IPAC - Instituto Português de Acreditação).


 Reconhecimento BPL - Boas Práticas de Laboratório:

- Aplicável a estudos
- IPAC e INFARMED

Qualidade no Laboratório de Análises:

 Validação de um método – Realização, de um modo sistemático, de uma série de testes dirigidos ao


procedimento analítico a fim de verificar se o método é digno de confiança, isto é, se conduz a
resultados suficientemente precisos e exatos.
 Validação de um aparelho – Execução de um conjunto de testes de forma a avaliar se o aparelho
fornece resultados dignos de confiança.
 Acreditação de laboratório – Refere-se aos laboratórios que usam métodos normalizados.
 Reconhecimento de laboratório – Refere-se aos laboratórios que utilizam os princípios das Boas Práticas
de Laboratório oriundos da OCDE.

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 Um laboratório de qualidade deve possuir:
 Documentação:

- Manuais de Qualidade (MQ): definição de responsabilidades e competências.

- Procedimentos Operativos (PO): modo de efetuar tarefas.

 Rastreabilidade - significa que é possível identificar: os técnicos, os PO, os equipamentos, os


reagentes que foram usados numa análise.
 Qualidade Ambiental:

- Local de trabalho
- Exterior

 Segurança no trabalho

Tipologia das Análises:

As análises podem ser de dois tipos:

 Análises de rotina
 Análises não rotina

O que se pretende fazer ?

 Se o método é novo no laboratório:

- Implementar
- Otimizar para a amostra em estudo
- Validar

 Se o método não é novo mas vai ser analizada nova matriz (amostra):

- Adaptar, otimizar
- Validação sumária

Diferentes fases na Implementação e Execução de uma Análise:

1. Definição do Problema (não rotina)

- Objetivo da análise: Porque vou fazer esta análise?


- Características do analito.
- Pretendo identificar (técnicas qualitativas) ou quantificar (técnicas quantitativas)?
- Em que tipo de amostras (matriz)?
- Quais são as concentrações previstas?
- Quantas são as amostras?
- Entre outros…

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2. Escolha do método analítico

 Amostra:

- Propriedades fisícas e químicas do analito e da matriz.


- Gama de concentrações previstas.
- Quantidade de amostra disponível.
- Número de amostras a analisar.

 Características do método:

- Sensibilidade, exatidão e precisão necessárias


- Seletividade
- Rapidez
- Disponibilidade do equipamento
- Custo da análise

Quando se pretende implementar um Método de Análise deve-se conhecer:

- Fundamento teórico do método


- Campo de aplicação
- Equipamento necessário
- Requisitos específicos do método
- Vantagens e inconvenientes

3. Os reagentes e material:

 Os reagentes a adquirir devem ser adequados ao tipo de trabalho a efetuar.

 A água é um reagente vulgar no laboratório, e como tem diferentes utilizações (lavagem de material
e preparação de soluções), também vão existir diferentes tipos de água (de rede - tipo 3, destilada-
tipo 2 e “ultra-pura” - tipo 1), adequando-se à função para qual se aplicam.

 Material de laboratório:
- O material é fabricado em vidro (borosilicato ou pyrex) e tem valores de tolerância.
- É classificado em:
• Classe A: Limite de tolerância mais apertado: trabalho de maior exatidão.
• Classe B: Trabalho de rotina.

4. Amostragem:

 É o processo de seleção de material para análise (amostra):

- Qual o tipo de amostra a recolher?


- Qual o volume de amostra necessário?
- Como colher?
- Como conservar?

Objetivo: Amostra representativa do lote.

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 Colheitas e recepção de amostras:

- Utensílios adequados.
- Quantidade da amostra.
- Técnica de colheita.
- Transporte e conservação.
- Identificação.
- Observações na recepção da amostra.
- Toma da amostra para análise.

5. Preparação de amostras:

 Características físicas da amostras  Como ?


 Complexidade da matriz - Centrifugação/Filtração
 Concentrações baixas dos analitos em - Extração
estudo - Pré-concentração
- Limpeza da amostra
- Derivatização

6. O Equipamento/Instrumento e o Método de Análise:

 Finalidade do Instrumento:

 Um instrumento analítico converte um sinal,


que pode ser ou não percetível, num sinal
compreensível para o operador.
 O instrumento funciona como meio de
comunicação entre o sistema a analisar e o
operador.

 Equipamento analítico:

 Métodos Clássicos – Utilização de meios mecânicos (balanças, indicadores de cor) e biológicos


(operador)
 Métodos instrumentais – Mais rápidos, mais sensíveis, e mais selectivos, porém tendem a
destruir as amostras biológicas.

 Avaliação do Equipamento e método de análise:

 Validação/Verificação do equipamento – Processo pelo qual se confirma se o equipamento


está em boas condições de utilização para o fim em vista, ou seja, se é adequado ao objetivo
da análise a efetuar.
 Validação do método – Processo pelo qual se confirma se o método a ser utilizado permite
obter os resultados pretendidos, ou seja, se é adequado ao objetivo da análise a efectuar.

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 Componentes básicos de um Instrumento:

Emissor de Detetor de Processador Periférico de


Sinal Sinal de Sinal Sinal

 Emissor de Sinal – É originado um sinal a partir de um componente do instrumento ou da


amostra.
 Detetor de sinal – É sensível ao sinal gerado, convertendo-o, em geral, em sinal elétrico.
 Processador de Sinal – Elabora os sinais detetados, tornando-os adequando a interpretação:
amplifica, atenua, integra, diferencia, …
 Periférico de Saída – Converte os sinais em linguagem compreensível para o operador:
mostradores (analógicos ou digitais), impressoras, fotografias, …

 Podemos ter dois tipos de sinais:

a) Sinal Analógico: Varia de um modo contínuo e pode apresentar qualquer um de infinitos


valores entre certos limites, ou seja, um qualquer valor dentro de um intervalo numérico.

b) Sinal Digital: Varia de um modo descontínuo ou discreto apresentando valores bem


definidos. É menos influenciado pelo ruído ambiente e é mais susceptível de ser trabalhado
a computador.

 Vantagens dos sinais digitais:

- Menos influenciados pelo ruído ambiente.


- Suscetíveis de serem trabalhados em computador.

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 Utilização de computadores:
 Modo Ativo (automação):

 Aquisição de dados.
 Comando de aparelhos.

 Modo auxiliar (rapidez de cálculo):

 Tratamento elaborado de dados.


 Armazenamento dos dados em memória.

 Simulação:

 Funcionamento de aparelhos.
 Processos analíticos.

 Instalação de equipamentos: A instalação dos equipamentos tem de ter em conta os seguintes


fatores:

7. Análise de Amostras:

• Qual o número de amostras que se pode analisar em sequência?

- A amostra necessita de temperatura controlada no amostrador automático…

- A amostra degrada-se ao fim de 𝑥𝑥 min/horas.

• Como vai ser feito o controlo da qualidade?

- Composto padrão controlo (com estabilidade conhecida) que é analisado entre 𝑥𝑥 amostras.

- O sinal do padrão controlo pode variar 𝑥𝑥 %.

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8. Apresentação e tratamento de resultados:

1) Algarismos significativos:

É o número mínimo de dígitos necessários para escrever determinado valor em notação científica
sem perder a exatidão.

2) Selectividade e Sensibilidade:
 Selectividade – Mede o grau de preferência, de detecção de uma substância em relação a
outra, embora tenha alguma sensibilidade para ambas.
 Sensibilidade – Capacidade de discriminação de pequenas quantidades em relação a outras.

3) Erros experimentais:

 Grosseiros (exatidão):

- Repetir a Experiência

 Sistemáticos (exatidão):

- É um erro consistente que pode ser detetado e corrigido.


a) Analisar substâncias de composição conhecida (materiais de referência)
b) Analisar branco que não deve dar valores diferentes de zero.
c) Utilizar diferentes métodos analíticos para a mesma amostra.

 Aleatórios (precisão e exatidão):

- É um erro que ocorre devido a variáveis incontroláveis. Está sempre presente e não
pode ser corrigido.

 Exactidão VS Precisão:
- Exactidão – avalia a proximidade dos nossos resultados em relação ao valor
verdadeiro.
- Precisão – Avalia a dispersão dos nossos resultados, conseguidos em condições
idênticas.

- Relação entre exatidão e precisão – O centro do alvo representa o valor verdadeiro da


substância testada

Perto do valor verdadeiro


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Exemplo (Exatidão VS Precisão)

4) Cálculo de incertezas:

 Nos métodos acreditados é obrigatório o cálculo.


 Há diferentes metodologias de cálculo:

5) Tratamento estatístico dos resultados (se necessário):

 Valor médio ± desvio padrão.


 Intervalo de confiança.
 Teste de significância (exemplos):

- Comparação dos valores médios de duas amostras.

- Teste de Fisher para comparar desvio padrão.

- Análise de variância (ANOVA).

- Teste de Chi-quadrado.

- Análise por componentes principais.

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Em conclusão:
O trabalho/organização do laboratório dever permitir:

 Rastreabilidade: Controlo de todos os passos da análise da amostragem aos resultados.

 Garantir qualidade

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Absorção Molecular de Ultravioleta e Visível – Espectrofotometria de UV-Visível

Os métodos instrumentais são baseados em propriedades físicas (químicas em alguns casos).


Existem métodos:

• Electroanalíticos, que se baseiam em propriedades eléctricas;


• Espectrométricos, que se baseiam em propriedades óticas;
• Separativos, baseados em diversas propriedades.
Dentro de cada método, exisem diversas técnicas:

Nota: As técnicas que iremos estudar estão a azul.

- Espectroscopia:
A espectroscopia estuda a interacção da matéria com
radiações do espectro electromagnético. A radiação
electromagnética consiste na emissão de energia sob a
forma de ondas electromagnéticas.

A matéria possui a capacidade de absorver radiações do


espectro electromagnético, sendo que estas podem ser
analisadas por espectroscopia de absorção. E também
possui a capacidade de emitir radiações do espectro
electromagnético, sendo que estas podem ser analisadas
por espectroscopia de emissão.

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A radiação electromagnética possui simultaneamente natureza ondulatória e natureza corpuscular:

a) Radiação electromagnética como onda:


λ = comprimento de onda (distância entre dois máximos ou mínimos sucessivos) (cm)
p = período (s) (intervalo de tempo necessário para dar passagem a 2 máximos ou mínimos sucessivos)
ν = frequência da radiação (ciclos/seg.), Hz (nº de oscilações do campo por segundo)
c = velocidade da radiação (no vácuo) (constante) (𝑐𝑐𝑐𝑐−1)
1
= número de onda (𝑐𝑐𝑐𝑐−1)
𝜆𝜆

b) Radiação electromagnética como partícula:

A radiação é constituída por um feixe de partículas discretas de luz, os fotões.

Assim, existe uma relação entre a energia e o comprimento de onda, onde a energia de um fotão é
dada pela seguinte equação:

𝒄𝒄
𝑬𝑬 = 𝒉𝒉 ∙ 𝝊𝝊 = 𝒉𝒉 ∙
𝝀𝝀
𝒄𝒄
 𝝊𝝊 = ⟺ 𝒄𝒄 = 𝝊𝝊 ∙ 𝝀𝝀
𝝀𝝀
- Espectro das Radiações Electromagnéticas e Efeitos Específicos da Absorção de Radiação:

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Como as radiações têm diferentes comprimentos de ondas, também terão diferentes energias, e como tal o
efeito que tem sobre as moléculas será diferente. Assim, existem diferentes medidas para as diferentes
radiações:

De notar que à medida que o comprimento de onda aumenta, a energia da radiação diminui, assim, a radiação
vai ter efeitos diferentes sobre as moléculas e átomos.
Por exemplo, com a absorção das radiações na zona UV-Visível ocorre excitação eletrónica, geralmente
acompanhada de efeitos vibracionais e rotacionais nas moléculas.

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Limites do UV Limites do Visível
200 nm – 380 nm 380 nm – 780 nm

Zona de trabalho do espectrofotómetro

O fenómeno de absorção ocorre porque as moléculas apresentam eletrões (atenção que são os eletrões mais
externos) que podem ser promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a absorção de energia, ou
seja, ocorrem transições eletrónicas. De notar que níveis discretos de energia são absorvidos devido à vibrações
e rotações das moléculas. Este é o motivo pelo qual não se observa uma linha de absorção nítida, mas sim uma
banda de absorção.

Em solução, as absorções eletrónicas sobrepõem-se às restantes.

Devemos sempre evitar trabalhar nos extremos da escala.

Abaixo dos 200 nm, o ar absorve e os espectrofotómetros têm que operar no vácuo.
O UV (UV qualitativo) é utilizado para identificar e caraterizar a família de um composto e não o composto em
si.
Relativamente as condições de ensaio, temos de ter em conta dois factores:
- Solvente – Não pode haver partículas em suspensão e não pode absorver no comprimento de onda em
questão.
- Leituras tem de ser no máximo de absorção, pois é onde a incerteza relativamente ao valor obtido é menor. Se
obtivermos um espectro em que temos dois picos, cuja a intensidade é semelhante, mas são a comprimentos de
onda diferentes como escolhemos que c.d.o. usar? Escollhemos o máximo cuja curvatura seja mais ampla, em
plataforma e ignoramos o máximo que é em pico.

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- Transições energéticas na matéria e energia total nas moléculas:

Os átomos/iões monoatómicos, quando As moléculas/iões poliatómicos, quando


expostos a radiações, podem realizar expostos a radiações, podem realizar transições
transições electrónicas, o que origina eletrónicas, vibracionais e/ou rotacionais, o que
espectros de riscas. origina espectros de bandas.

Assim, a energia total será:

Ao lado é apresentado um esquema de níveis energéticos


de uma molécula diatómica para melhor
compreendermos as diferentes energias.

- Absorção de radiações por soluções:

Fenómenos envolvidos quando um feixe (monocromático) de radiação incide sobre uma célula contendo uma
solução que absorve no comprimento de onda incidente.

I 0 = Intensidade do feixe incidente.


I r = Intensidade do feixe, resultado das diferenças
do índice de refracção entre o material
absorvente e o ambiente.
I e = Intensidade do feixe espalhado, resultado de
um meio não homogéneo (suspensão) e/ou de
flutuações térmicas.
I a = Intensidade do feixe absorvido pelo meio.
I t = Intensidade do feixe transmitido.
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- Duas leis fundamentais:
- A intensidade de luz (monocromática) transmitida por um corpo homogéneo é proporcional à intensidade
de luz incidente. Isto é:

- A intensidade de luz (monocromática) transmitida decresce exponencialmente com o aumento da


espessura da camada do corpo homogéneo. E também decresce exponencialmente com o aumento da
concentração (Lei Lambert-Beer).

- A transmitância é a relação entre o feixe emergente e o feixe incidente.

Nota: A absorvância deve


estar entre 0,1 e 1 para se
aplicar a Lei de Lambert-Beer
sem erros associados. A
A = Absorvância, absorvência, densidade ótica, coeficiente de extinção. absorvância ótima é 0,43.

Quando é feito incidir radiação sobre uma molécula, esta vai absorver determinada quantidade de energia,
passando os seus electrões de valência para o nível energético superior. Diz-se que a molécula está no estado
excitado.

A quantidade de radiação absorvida pode ser determinada, utilizando para isso um espectrofotómetro de
absorção molecular, que obedece à lei de Lambert-Beer.

% Transmitância VS Concentração Absorvência VS Concentração é


é uma curva pelo que é mais difícil mais fácil de trabalhar pois a relação
de se utilizar e analisar. entre estas duas variáveis é uma
reta.

- Lei de Lambert-Beer:
Para que a absorvância seja adimensional, atribui-se unidades às constantes de absorção de acordo com o
modo de expressão de c e l.
Se a concentração vem expressa em molar e a espessura em centímetros: ε vem expresso em 𝑀𝑀−1 . 𝑐𝑐𝑐𝑐−1 .
A absortividade é uma constante que depende do λ da radiação e da natureza do material absorvente.
Normalmente utilizam-se células de 1 cm quando a solução é concentrada e se consegue diluir. Mas quando
não se consegue diluir, recorre-se a células de 0,1 cm, por outro lado, caso a solução seja muito diluída e não
se consegue concentrar mais, usa-se células de 10 cm.

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numa célula de 1 cm

A lei de Lambert-Beer é
aditiva, ou seja, a
absorvância lida é a soma
das absorvâncias dos
componentes em solução
que absorvam no λ usado.

- Absorção molecular UV/Vis – Análise Quantitativa VS Análise Qualitativa

Análise Qualitativa Análise Quantitativa

 Pouco interessante  Diversas aplicações


 Banda pouco estruturadas  Elevada Sensibilidade
 Moléculas com grupos funcionais  Limites de deteção ente 10−4 e 10−6 M
semelhantes apresentam espectros muito  Razoável seletividade
parecidos  Razoável simplicidade e baixo custo
 Medida deve ser efetuada no λ max.
Resumindo….
Maior sensibilidade, minimiza erros
Não é dos melhores métodos para
identificar um composto químico porque é
igual para um grupo de moléculas e não
caraterístico de um único composto.

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- Análise Qualitativa

Ocorre absorção das radiações na zona UV- Visível ocorre excitação electrónica, geralmente
acompanhada de efeitos rotacionais nas moléculas, provocando transições de electrões π e σ
bonding e n non-bonding para σ∗ e π∗ anti-bonding, formando bandas.

A relação entre os espectros de absorção e a estrutura molecular baseia-se na seguinte


fórmula:

ℎ. 𝑐𝑐
𝐸𝐸 =
𝜆𝜆
Sendo que E é a energia de ligação que o fotão incidente necessita de superar e λ o
comprimento de onda de absorção que aparece no espectro. Sendo assim, ↑E = ↓λ, ou seja,
ligações que tenham menos energia (mais estáveis), emitirão fotões a um menos comprimento
de onda.

a) Relação entre espectros de absorção e estrutura molecular:

Hidrocarbonetos Hidrocarbonetos Compostos com átomos


Saturados Insaturados de O, N, S, X

↳ não ligantes

É necessário menos
↳ ligações duplas energia para que a
transição ocorra.
Para que esta transição ocorra é ↳ ligações simples
necessário 𝜆𝜆 < 280 nm

1. Hidrocarbonetos Saturados (apenas existem ligações simples entre C-C e C-H)

Todos os eletrões da camada externa intervêm nas ligações σ e tem que se quebrar a ligação molecular
para passar para uma orbital σ∗.
Necessária maior energia: UV de vácuo (transições σ → σ∗ ).

2. Hidrocarbonetos Insaturados

Cada átomo de carbono apresenta também uma ligação π. Quando existem ligações duplas, os electrões
π ligantes têm uma força de ligação menor e podem passar para níveis superiores de energia (π∗ ), sem se
dar uma completa ruptura da molécula. As ligações duplas vão aumentar a estabilidade da molécula,
diminuindo a sua energia e aumentado o λ a que absorvem. Compostos insaturados absorvem na zona do
UV-Visível (transições π→ 𝜋𝜋 ∗).
No caso de haver ligações duplas conjugadas, há maior deslocalização dos electrões π e as bandas de

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absorção deslocam-se para maiores comprimentos de onda (menor energia).
De notar que as ressonâncias vão ter o mesmo efeito, aumentando a deslocalização electrónica e
deslocando as bandas de absorção para um maior λ.
3. Compostos com átomos de O, N, S, X (X=halogéneos)

Compostos como o O, N, S ou X apresentam electrões não


ligantes na camada externa.
Tem tanto os electrões π como os electrões n (não
ligantes) que podem passar para o nível de energia π∗
(transições π→ 𝜋𝜋 ∗ e n→ 𝜋𝜋 ∗), absorvendo igualmente na
zona do UV, aumentando a intensidade absorção e o λ.
Os máximos de absorção das transições n→ 𝜋𝜋 ∗são menos intensos
que os das transições π→ 𝜋𝜋 ∗. Transições proibidas são
geralmente transições n→π* em
Menor intensidade → Menor energia → Maior Comprimento que o ε é muito baixo, não havendo
de Onda absorvência, ou havendo muito
Quanto mais grupos com duplas ou elementos de O, N, S, X (X=halogéneos) pouca absorvência.
maiores comprimentos de onda e intensidade dos espectros.

- Grupos Cromóforos e Auxocromos

• Cromóforos:

(Eletrões π)

Substância (grupos moleculares) que absorvem em visível (radiação – 200 – 800 nm). Contêm electrões
π capazes de absorver energia e excitar-se, aumentando a absortividade da molécula e assim o
comprimento de onda a que absorve. Exemplos encontram se acima. Provocam efeito batocrómico e
hipercrómico.

• Auxócromos:

(Eletrões n) → Provocam efeito batocrómico.

Auxócromos são grupos, que apesar de não absorver por si, aumentam a intensidade do cromóforo,
deslocando as bandas de absorção para maiores comprimentos de onda. Estes grupos têm pelo menos

→Maior Intensidade →Maior Energia


Maior Comprimento de onda

Menor Energia

→ Variação do comprimento de onda 18


→ Variação da absorção
um par de electrões não ligantes capazes de interactuar com os electrões π.

Esta interacção tem o efeito de estabilizar o estado 𝜋𝜋 ∗e baixar a sua energia. Provoca efeito batocrómico
e hipercrómico.

- O que é que influencia o espectro de UV-Visível?

1) Presença de Grupos Auxócromos

Comparando o benzeno com o fenol ou com a anilina, verifica -se que há um aumento tanto do
comprimento de onda máximo de absorção como da intensidade das bandas de absorção, ou seja,
ocorre um efeito batocrómico e hipercrómico, respectivamente. Tal deve-se ao facto de tanto o
grupo -OH do fenol como o grupo -NH 2 da anilina possuírem electrões não ligantes, que são
capazes de interactuar com os electrões π.

Mas comparemos agora dois benzenos, um que se encontra ligado a um grupo -NH 2 e outro que se
encontra ligado a um grupo -NH 3 +. O grupo -NH 3 + será hipsocrómico e hipocrómico relativamente
ao grupo -NH 2 , visto que deixa de existir o par de electrões não ligante.

Compostos de
Referência

2) Ciclização
Nos compostos cíclicos o pico do
comprimento de onda é mais elevado,
pois os electrões são mais facilmente
excitáveis, provocando o efeito
batocrómico face à cadeia linear.

3) Conjugação

Quanto maior o nº de conjugação,


maior é o pico do comprimento de
onda.

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Por outras palavras, o aumento do número de duplas conjugadas aumenta o efeito batocrómico, e causa uma
menor sobreposição espectral.

4) Número de Ciclos
Quanto maior o nº de ciclos, maior o
comprimento de onda, menor a Energia.
Logo mais estável é a transição.

Por outras palavras, o aumento do


número de ciclos aumenta o efeito
batocrómico, devido a menor
sobreposição das orbitais.

5) Efeitos do solvente – Influência do solvente no


espectro Zona serrilhada (estrutura

Geralmente, solventes polares, como a água ou álcoois


Estado gasoso
tendem a fazer desaparecer a estrutura fina (menos
detalhes) devido a efeitos vibracionais, ao contrário dos
solventes não polares.
A zona serrilhada (estrutura fina) vê-se melhor quando o
Solvente apolar
composto está no estado gasoso/vapor (não há interações
entre as moléculas e as moléculas podem vibrar
livremente) e com um solvente não polar. Já com o
solvente polar, como há interacções entre as moléculas e
as moléculas não podem vibrar livremente, perdemos a Solvente polar
estrutura em “serrilha” característica do benzeno e
passamos a ter uma única banda.
Ao escolher o solvente temos de ter o cuidado de escolher
um solvente que não absorva na gama de λ onde vamos
trabalhar.
O “cut-off” dos solventes é o λ a que o solvente deixa de ser transparente à radiação e tem de ser
tomado em conta a escolha do mesmo.

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6) Efeitos do pH

Certas moléculas podem


formar iões dependendo do pH
da solução. Esses iões podem
fornecer electrões à
ressonância (↑λ –
batocrómico) ou remover
electrões da mesma (↓λ –
hipsocrómico).

Efeito Hipsocrómico Efeito Batocrómico

Tabela resumo:

Condição Efeito
Cromóforos Batocrómico e Hipercrómico
Auxócromos Batocrómico e Hipercrómico
Solvente Espectro mais recortado
pH (protonação/desprotonação) Hipsocrómico/Batocrómico
Ciclização Batocrómico
Número de ciclos Batocrómico
Conjugação Batocrómico

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- Análise Quantitativa - Modos de conduzir um doseamento:
1. Aplicando a Expressão da Lei de Lambert-Beer (conhecendo a constante de absorção - K)

É importante ter em conta as condições de ensaio (escolha de solventes para amostras e escolha do
comprimento de onda), pois estes vão influenciar os resultados obtidos.
Para sabermos a constante de absorção (k) utilizamos uma solução padrão, após feita a sua diluição
começamos por traçar o espectro, sendo que no λ máximo retiramos a absorção e aplicamos a expressão da
lei de Lambert-Beer. Esta também pode ser conhecida pela literatura.
Ao efectuar as análises no máximo de absorção (máximo de intensidade), aumenta-se a sensibilidade.
Na figura A, temos duas retas de calibração para uma análise a dois comprimentos de onda diferentes e
sendo válida a lei de Lambert-Beer, o declive da reta corresponde ao valor ε.
A figura mostra que quanto maior for o declive da reta, ou seja, quanto maior for a sensibilidade, menor
será a incerteza na concentração, ou seja, quando as medidas têm uma variação ΔAbs.
Então o comprimento de onda onde a sensibilidade é máxima, corresponde aquele onde o coeficiente de
absortividade (e absorvência) é mais elevado. Assim, é claro que a gama espectral (ou comprimento de
onda) mais adequada é o máximo de absorção da espécie em estudo.

Ideias Chave:
1.Traçar o espectro
2. Calcular o λ máximo de
absorção
3. Aplicar a expressão da lei
de Lambert-Beer.

2. A Partir de Curva de Calibração (conseguida com amostras de padrões)

Temos de preparar de forma rigorosa várias soluções padrão de concentração conhecida, e depois realizar
a leitura do valor de Abs para as soluções padrão e para a solução problema. O valor da concentração da
solução problema é obtida por intrapolação.
Todavia, existem alguns erros analíticos na medida de transmitância e absorvência, sendo que o ΔC/C é
mínimo para T%~36,8 ou A~ 0,434. Em suma, quando A ~ 0,434, o erro relativo na concentração é mínimo.

Ideias Chave:
1.Preparação rigorosa de várias soluções
padrão 22
2. Leitura do valor de A para as soluções
padrão e solução problema
3. Comparando Absorvâncias de Amostras Padrão e Problema
 Análises Qualitativas (analisado anteriormente)

- Principais desvios à lei de Lambert-Beer:

1. Limitações pela concentração (Concentrações elevadas; Acima de 0,01M)


Causa: Concentrações elevadas da própria substância
e de outras substâncias do meio (electrólitos).
Distâncias médias entre os iões/moléculas estão
diminuídas ao ponto de cada partícula afectar a
distribuição de cargas, e assim, a absorção de
partículas vizinhas.
Ocorre um efeito semelhante em soluções diluídas
com altas concentrações de outras espécies,
especialmente electrólitos.
Quando iões estão muito próximos uns dos outros, a absortividade do analito pode ser alterada
devido a interacções electrostáticas.

Precauções: Uso de baixas concentrações, ou seja, uso de soluções diluídas.


Correção pela fórmula de Kortum:

(não se usa, só por curiosidade)

2. Limitações pela policromaticidade das radiações

Causa: Impossibilidade de o aparelho isolar uma


faixa muito estreita de radiação (próximo da
monocromaticidade).

Precauções: Selecionar uma faixa de comprimentos


de onda numa zona do espectro em plataforma. (no

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caso ao lado, preferir A a B, pois em toda a faixa A a absorvência é quase constante).
3. Desvios Químicos

Causa: 1.Deslocamento do equilíbrio: quando uma


amostra se dissocia, associa ou reage com um solvente
para formar um produto que tem espectro de absorção
diferente da amostra.
2.Dissociação de complexos: excesso ou insuficiência de
agente complexante.

Precauções: Fixação do pH/tampões. Trabalhando no


ponto isosbéstico, sendo que este corresponde ao valor
de comprimento de onda para o qual a absorvência se
mantém apesar das variações do pH do meio.

4. Radiações interferentes:

Causa: 1.Mau Isolamento do interior do aparelho – luz parasita;


2.Mau alinhamento do percurso ótico – luz difractada;
3.Emissão de fluorescência, proveniente da amostra ou proveniente de interferentes.

Precauções: Validação do equipamento; Validação do método.

- Apresentação gráfica dos dados em espectrofotometria:

 Caracterização de  Análise qualitativa


compostos comparando espectros
 Localização de máximos e de uma substância em
mínimos de absorção distintas concentrações
 A altura é tanto maior
quanto maior é a
contração da amostra

Informações de interesse no registo de espectros:


 Natureza da amostra
 Concentração da amostra na solução a analisar
 Natureza do solvente utilizado e condições químicas de ensaio (pH,
uso de tampões)
 Condições instrumentais utilizadas (largura da fenda utilizada,
espessura da célula)
 Marca e modelo do aparelho
 Data da análise

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Colorímetro → Permitem leituras no visível com um monocromador
rudimentar (filtro)
- Equipamentos - Espectrofotómetro Espectrocolorímetro → Utiliza um melhor monocromador
(prisma ou rede); Visível

Espectrofotómetro →Leituras no U.V. próximo e no visível


Instrumento de análise capaz de medir e comparar a quantidade de luz absorvida, transmitida ou
refletida por uma determinada amostra.

Constituintes:

 Fontes de radiação: Lâmpada de tungsténio (visível), lâmpada de deutério ou hidrogénio e laser


 Monocromador: filtros (são os piores monocromadores, selecionam uma pequena gama de 𝜆𝜆.
São utilizados nos colorímetros), prismas e redes
 Tinas ou células: quartzo (UV), vidro (Visível) e plástico (Visível)
 Detectores: célula fotoeléctrica/fototubo, tubo fotomultiplicador ou detector de díodos

a. Esquema simplificado de um equipamento de feixe simples (só mede uma célula de cada vez):

(Monocromador)

b. Esquema simplificado de um equipamento de feixe duplo (mede o valor do branco e da amostra em


simultâneo):

Nota: Se o valor de absorvância for negativo pode dever-se a uma troca das células: o aparelho retira o valor de
Abs do branco à Abs da amostra. Se as células estiverem trocadas, o valor dá negativo.

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Fontes de Radiação
a. Fontes de Energia Radiante

Na zona do visível (400 – 800 nm) usam se lâmpadas de


tungsténio. Por isso, usam-se tinas de vidro.
E na zona do UV (próximo: 200 – 400 nm) usam se lâmpadas de
Hidrogénio ou Deutério. Utiliza-se tinas de quartzo, pois o vidro
absorve radição de UV.
Evitam-se zonas próximas dos 200 e 400 nm (zonas de
transição), porque nestes comprimentos de onda, as lâmpadas
emitem pouco.
Ter em atenção que ambas as lâmpadas emitem radiação
policromática.

Nota: Quando um determinado material não absorve num


determinada radiação (UV, Visivel etc…) dizemos que esse material é transparente.

Podem também ser usadas lâmpadas de Xénon (250 – 1000 nm) ou de Mercúrio (280 – 1400 nm).

b. Fontes de Energia Laser (Light Amplification Stimulated Emission Radiation)

Os laser funcionam por amplificação de luz por emissão estimulada de radiação.


O laser é um dispositivo que produz radiação eletromagnética com características muito especiais:
A. Ela é monocromática (possui comprimento de onda muito bem definido);

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B. Coerente (todas as ondas dos fotões compõe o feixe estao em fase);

C. Colimada (propaga-se como um feixe de ondas praticamente paralelas).

Principais vantagens: Principais desvantagens:

- Obtenção de feixes de radiação muito estreitos - Custo elevado e de elevada manutenção

- Obtenção de feixes de radiação de alta - Acessível apenas a determinados comprimentos de


intensidade onda

- Funcionamento do LASER (Light Amplification Stimulated Emission Radiation)

Um laser funciona desde que se consiga excitar um número mínimo de eletrões de determinado material para
um nível de energia superior, de modo a obter-se uma inversão de população (quando existem mais eletrões
excitados do que eletrões no estado fundamental).

Quando isso ocorre, estimulam-se alguns eletrões a emitirem os seus fotões, o que vai iniciar um efeito em
cascata, de modo que o fotão emitido por um eletrão estimula o eletrão seguinte a emitir outro fotão de igual
comprimento de onda e fase, o que vai amplificando a emissão de feixes de luz de comprimento de onda
definido e coerente.

Analisando a figura ao lado, que explica o modo de funcionamento do laser: A radiação incide no cristal
(crómio), o que provoca a excitação dos eletrões para um nível
superior. De seguida há perda de energia por choques
mecânicos passando os eletrões para um nível mais baixo (não
há libertação de energia). Após permanecerem nesse meta-
estado estável, os eletrões regressam ao estado fundamental,
provocando a libertação de uma grande quantidade de energia
sob a forma de radiação monocromática.

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Monocromador

Um monocromador transforma a radiação policromática em monocromática, ou seja, seleciona um λ


específico através da separação em várias bandas de λ e a permissão da passagem de só uma através da fenda
de saída. O laser dispensa o monocromador.

Órgão Monocromador
do Espectrofotómetro

A largura da fenda vai influenciar o aspecto do


espectro, sendo que quanto maior for a largura
Apenas a radiação com o λ pertendido sai pela desta, mais as bandas são definidas.
fenda de saída.

Fenda de 0,5 nm Fenda de 0,2 nm

• Efeito da Largura de Fenda no Espectro

Quanto mais pequena é a fenda do monocromador, maior é a resolução do espectrofotómetro.

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- Identificação de Transições Vibracionais e Bandas de Absorção num Espetro

- Os Selecionadores de Comprimento de Onda que se encontram no monocromador podem ser de três tipos:

• Filtros
• Prismas
• Redes (mais eficazes)

Abaixo encontra se um quadro com algumas características destes:

Parâmetros de
Selecionadores Aspeto Tipos
caracterização

λ nominal
Absorção
Filtros Largura efetiva de
Interferência
banda

Vidro (400-800nm)
Poder dispersivo
Prismas Quartzo (200-800nm)
Poder resolvente
Sílica (180-800nm)

Superfície polida dura


sobre a qual foram Dispersão linear
Redes
riscadas ranhuras //; Poder resolvente
300 a 2000 nm

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-Filtros

 Filtros de Absorção:

- Seletivamente transmitem luz de diferentes λ, ou


seja, cores, enquanto bloqueiam os restantes,
absorvendo-os. Geralmente são filtros coloridos
como os usados em fotografia, pelo que são usados
em análise colorimétrica.
- Constituídos por uma ou mais substânicas.
- Isola bandas com 50 nm (no min.) de largura.
- Usada apnas na região do visível.
- Baixo custo.

 Filtros de Interferência:

- Um filtro de interferência consiste num dielétrico


transparente (fluoreto de Ca ou de Mg) entre 2
filmes metálicos semi-transparentes. Utiliza a
interferência ótica para fornecer bandas estreitas

de radiação.

- A espessura do dielétrico determina o λ da radiação transmitida.

- Quando uma radiação incide no filtro pode ser refletida ou


passar através deste, em qualquer umas das 2 camadas metálicas.
A radiação refletida no 2.º filme metálico pode sofrer nova
reflexão no 1.º filme, se o λ for o desejado ou múltiplo desse,

sofrendo interferência construtiva com radiação que passa diretamente os dois biofilmes (posteriormente
à interferência construtiva).

- Passa apenas 1 λ e os seus múltiplos.

- Isola bandas com até 10 nm de largura.

- Pode ser usado tanto no UV como no Visível.

Resumindo:

2- Filtro de Interferência

1- Filtro de Absorção

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- Prismas
A diferença entes os índices de refração leva a
dispersão da radiação em diferentes
comprimentos de onda.
O poder resolvente representa a capacidade de
distinguir dois λ próximos.
Prismas de quartzo ou sílica são usados no UV e de
viddro no visível.

- Redes

 Redes de Difração

É composta por um grande número de estrias paralelas,


equidistantes, traçadas sobre uma superfície altamente
polida. Quando se faz incidir radiação na rede cada estria ou
sulco da rede origina um pequeno espectro.
As estrias estão tão próximas umas das outras que são da
mesma ordem de comprimento de onda da radiação.
Formam-se assim, frentes de ondas que reforçam os λ em
fase e eliminam os que não estão em fase.
Ocorre um reforço, a interferência construtiva quando:

Mudando o ângulo de incidência (α) do raio de luz sobre a rede podemos selecionar o λ emergente a
esse ângulo.

Uma característica muito importante das redes de difração é a


produção de vários espectros que se sobrepõem parcialmente
de tal modo que para o mesmo ângulo de reflexão podem-se
observar a saída de radiação de λ = λ, λ/2, λ/3, … , λ/m, que
correspondem aos chamados espectros de 1.ª, 2.ª e 3.ª ordem.

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Normalmente, utilizam-se os espectros de 1.ª ordem e elimina-se a sobreposição à custa de filtros
apropriados.

As redes são o material que possui uma melhor resolução e pode ser usada no IV, UV e visível.

Células para Amostra:

Recipiente tubular ou prismático que vai conter a amostra.


Consoante a zona do espectro em que trabalhamos, o
material da célula pode variar, de modo a evitar que haja
absorção de radiação pela própria célula (seleciona-se
material que não absorva nessa zona).

 Material:

- Quartzo (200 – 3000 nm) → UV/ Visível


- Vidro (360 – 2000 nm) → Visível
- Plástico (360 – 800 nm) → Visível

 Células de Fluxo:

Células de fluxo nas quais a amostra circula continuamente através da célula com
leitura simultânea da absorvência ou transmitância.

Detetores:

Detetam a quantidade de radiação


transmitida após a passagem pela amostra,
porém o resultado pode ser convertido em
quantidade de radiação absorvida pela
amostra.

 Características de um bom detetor?

1. Detetor sensível/específico.
2. Responder rápido numa banda larga de λ.
3. Amplificar facilmente um sinal sem grande ruído de fundo.

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 Podem ser:

a) Célula fotoéletrica/fototubo
b) Tubo fotomultiplicador
c) Vector de díodos (dyode array)

a) Célular Fotoelétrica/fototubo

- Dispositivo capaz de transformar energia luminosa em


energia elétrica (sinal).

- Contém um cátodo que emite eletróes de modo


porporcional à energia que sobre ele incide. O ânodo
recolhe os eletrões originando uma diferença de potencial
que séra amplificada e lida.

- Tem baixa sensibilidade.

b) Tubo fotomultiplicador

- O fotomultiplicado fundamenta-se no princípio do


fototubo mas consegue uma amplificação de sinal (em
cascata) muito superior, o que lhe confere muito maior
sensibilidade.

- O tubo fotomultiplicador é similar, no entanto, o sinal


é amplificado através de díodos, sofrendo uma
ampliação de sinal em cascata. São mais rápidos, mais
sensíveis e têm menor efeito de fadiga que o fototubo.

- Detetor de Vector de Díodos/Diode Array

1. O detetor de vector de díodos fundamenta-se na utilização de materiais


semicondutores. A condução eléctrica em semicondutores envolve o
movimento de electrões e de ‘vazios’ (“hole”) em direções opostas.
2. Por outras palavras, condução eléctrica em semicondutores envolve o
movimento de eletrões e de “vazios” (holes) em direções opostas.
3. A condutividade do semiconduotr silíco (grupo IV) - Fig 7.30 (abaixo) -
pode ser muito aumentada contaminado-o (“doping”) com uma pequena
quantidade de um elemento do grupo V ou III.
4. Se, por exemplo, um cristal for contaminado com As (V), 4 dos seus 5
electrões de valência formam ligações covalentes com 4 átomos de silício,
deixando um electrão extra no cristal. É um semicondutor com carga
negativa, tipo n.
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5. Se, por exemplo, um cristal for contaminado com Ga (III), os seus 3 electrões de valência formam
apenas ligações com 3 atómos de silício, deixando um déficit de electrões ‘vazio’ na rede. É um
semicondutor com carga positiva, tipo p.

6. Juntando os dois materiais, um “n” e um “p”, resulta um díodo “pn” que é condutor apenas num
sentido (“reverse bias”). Com a chegada da radiação, a carga das duas regiões é rearranjada (movendo-
se para duas regiões opostas), verificando-se um aumento da condutividade que é proporcional à
intensidade da radiação a medir.
7. Um díodo em “reverse bias”, ao ser atingido por fotões suficientemente energéticos, zonas visíveis e
UV, sofre rearranjo das cargas nas duas regiões originando aumento da condutividdade que é
diretamente proporcional à intensidade da radiação a medir.
8. Um detetor de díodo de silício é mais sensível que um fototubo, mas em geral, menos sensível que um
tubo fotomultiplicador. Tem como vantagens o facto de permitir a obtenção de um espectro em menos
de um segundo; cada comprimento de onda é analisado individualmente; não há varrimento; dá mais
capacidade de análise.

Configurações possíveis dos espectrofotómeros de UV/Vis

- Feixe simples

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- Feixe duplo (2 detetores - com feixes separados no espaço)

Amostra e branco são medidos simultaneamente e o sinal do branco é subtraído do sinal da amostra.
Desvantagem: 2 detetores tornam o equipamento mais caro. Podem ocorrer erros se se trocarem a
ordem das células, por exemplo, se colocarmos o branco no local da amostra; se isto acontecer a Abs é
negativa.

- Feixe duplo (1 detetor – com feixes separados no tempo)

Espectrofotómetros mais comuns: os feixes são separados no tempo por um espelho giratório com
sectores que dirigem o feixe que vem do monocromador através da célula do branco e depois através da
célula da
amostra.

- Detetor de díodos
A radiação proveniente das fontes (tungsténio
e/ou deutério) é focalizada através de uma
lente sobre a amostra, ou seja, todo o espectro
de emissão das lâmpadas incide na amostra,
sendo uma parte absorvida e outra transmitida.
Esta radiação que atravessa amostra irá incidir
sobre uma lente que focaliza o feixe sobre uma
fenda e desta sobre uma rede de difração. Esta
rede irá difratar a radiação separando os
diferentes comprimentos de onda. Cada um deles irá incidir sobre um díodo do arranjo.

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 Este díodo ao ser irradiado produz uma corrente elétrica
cuja magnitude depende da intensidade de emissão.
 A radiação que atravessa a amostra é integral e
instantaneamente analisada.
 A absorvência em todos os comprimentos de onda é
determinada de um modo simultâneo.

Fibra Ótica e Espectrofotómetros com Fibra Ótica


A fibra ótica é constituída por vários filamentos de vidro com capacidade de transmitir a luz a alta velocidade,
sem ruído elétrico e manipulando mais sinais que os meios convencioanis.
A fibra ótica é constituida por um núcleo interior, “core”, transparente, com elevado índice de refração,
revestido por material com índice de refração inferior, “cladding”.
O conjunto é protegido exteriormente por película em plástico, “jacket”.

O raio de luz dirigido para o local de entrada, atinge a parede do núcleo interior segundo um determinado
ângulo de incidência θi, que ultrapassa o ângulo limite e por isso é refletida quase na sua totalidade.
Segundo a Lei de Snell, se o ângulo de incidência ultrapassar o ângulo limite, a luz é refleida quase totalmente
nas paredes do núcleo. Assim, toda a luz que entra no extremo da fibra emerge no outro extremo com uma
perda mínima na sua intensidade.

A condução por fibra ótica tem vindo a ser aplicada em espectrofotometria sendo de destacar o seu uso nos
‘fotómetros tipo sonda’ e em sensores destinados a análises específicas.

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Sensores de fibra ótica, consistem de um reagente imobilizado na extremidade da fibra ótica. Interação do
analito com o reagente provoca uma mudança na absorvência, fluorescência que é então transmitida a um
detetor via fibra ótica.

Colorimetria Indireta:

 Significado:

“Colorimetria” – Região do Visível


“indireta” – Mede-se o produto da reação

 Leitura da absorvância do produto da reação (processo


estático). Neste o analito reage com um “reagente de
coloração” originando um composto corado, visível na
região visível.

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Fatores a Atender na Colorimetria Indireta:

- Sensiblidade:

*Controlo do pH

*Eliminação de interferentes (uso de complexantes, precipitação, métodos separativos)

*Controlo das condições da matriz da amostra

- Estabilidade da coloração e tempo de leitura

- Efeito da temperatura

- Obediência à Lei de Beer e Elevada Absortividade Molar.

- Titulação Fotométrica:

Registo da variação de absorvância durante adição


de reagente (processo dinâmico).

Os espectrofotómetros com fibra ótica premitem o


registo da varição de absorvência durante adição de
reagente.

Escolha de condições de trabalho:

- Comprimento de onda (pode não corresponder


a λ max) – Evitar interferências em zonas
convenientes para leitura de absorvâncias

- Concentrações de componentes corados –


Situados em gamas que sigam a lei de Beer.

- Volume de titulante adicionado – Pequenas


porções; Introdução de fato de correção na leitura de absorvância: (V+v)/V

 Vantagens:

- Permite dosear substâncias não absorventes


- Aplicável a soluções de muito baixas concentrações
- Aplicável quando a variação da cor não é nítida (ex. reação incompleta)
- Permite doseamentos em presença de interferentes
- Precisão (~0,5%)

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Zona de Infravermelho – Espectrofotometria de Absorção Molecular
Espectro Electromagnético e Zona de Infravermelho:

No espectro electromagnético, a região infravermelho encontra-se depois da região visível e antes da região das
microondas.
A zona do infravermelho apresenta três partes, o IV Próximo, o IV Médio e o IV Afastado.
A zona de trabalho é a zona média.
Normalmente usa-se como unidade para quantificar o espectro de IV o número de onda (1/λ), que é
diretamente porporconal à frequência e à energia de radiação.
Não se utiliza a frequência (ν) devido à dimensão da unidade (ficaríamos com valores muito elevados).

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Infravermelho - Espectro:
Um espectro de IV é um gráfico que representa o conjunto das frequências de radiação absorvidas por uma
molécula.

Absorção da Radiação Electromagnética:

A radiação no IV é pouco energética (possui menor energia que a radiação UV, por exemplo), não sendo capaz
de provocar transições electrónicas. Ou seja, só provoca transições vibracionais e rotacionais. Para que haja
absorção no IV é necessário que ocorre alteração do momento dipolar da molécula, resultante de rotacionais e
vibracionais, e que a radiação incidente tenha uma frequência maior ou igual a frequência de vibração da
molécula.
Na ausência de um dipolo, não há interacção com a radiação IV, logo não há absorção. São chamados de
invisíveis.
Mudanças vibracionais são usualmente associadas com o intervalo infravermelho, enquanto as transições
rotacionais, que envolvem as menores quantidades de energia, tendem a estar associadas com a região de
micro-ondas.

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Absorção de Radiação na Zona IV:

A variação do momento dipolar da molécula absorvente leva ao aparecimento de transições vibracionais.


Os diferentes grupos funcionais vibram a diferentes frequências.
Um grupo funcional irá absorver energia se a frequência da radiação coincidir com a frequência de vibração.
Tomando abaixo o seguinte exemplo, quando se incide uma radiação cuja frequência é de 2Hz, vê-se uma
diminuição da transmitância (ou seja, um aumento da absorvância), mas quando esta é igual a 1 Hz ou 3 Hz, há
um aumento da transmitância (ou seja, uma diminuição da absorvância).

Abaixo apresentam se as diferentes transições vibracionais:

- Vibrações de Alongamento (Stretching)

Os átomos aproximam-se ou afastam-se ao longo do eixo de


ligação, podendo ser um alongamento simétrico ou
assimétrico.
Ocorre entre H e átomos de massa inferior a 19.
É um tipo de vibração que caracteriza grupos funcionais das
moléculas, surgindo como bandas de absorção na zona das
frequências de grupo (4000 a 1300cm-1).

- Vibrações de Deformação (Bending)


Os átomos aproximam-se ou afastam-se causando a alteração dos ângulos de ligação.
Ocorre entre átomos de hidrogénio e átomos de massa superior a 19.
A absorção respeitante a estas vibrações ocorre na zona das impressões digitais (1300 a 650 cm-1).

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Tipos de Vibrações Moleculares:

Existem diferentes tipos de vibrações de alongamento e de deformação, induzidas pela absorção de energia IV.
As frequências de vibração dependem das massas atómicas, das constantes de força de ligação e da geometria
dos átomos.
Para que haja absorção no IV, é necessário que haja alteração no momento dipolar da molécula e que a
radiação incidente tenha uma frequência maior ou igual à frequência de vibração da molécula.

 Posição teórica de uma banda de vibração


 Intensidade de uma banda Podem ser calculadas matematicamente
 N.º de bandas fundamentais

Fundamento da Espectroscopia de IV:

A mecânica da frequência da onda não é alterada pela absorção do fotão, apenas a sua amplitude de oscilação
aumenta.

Oscilador Harmónio como Modelo para o Movimento Vibracional a nível molecular:

As frequências de alongamento de uma ligação podem ser deduzidas pela:c


Lei de Hooke: Modelo de um oscilador harmónico composto por duas massas
(átomos) ligados por uma mola (ligação química).
A massa movimenta-se em torno da posição de equilíbrio, sendo a energia
potencial máxima nos extremos do deslocamento.
A energia atingida depende do valor da massa e da força da mola.

Segundo a lei de Hooke, a frequência de vibração da mola está relacionada com a massa e a constante de força
da mola, através da seguinte expressão:

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Em contraste com os osciladores harmónicos, nos quais as vibrações podem ter qualquer valor positivo de
energia potencial, a nível molecular existem limitações quânticas e a energia das vibrações apresenta apenas
certos valores.

43
Máquinas
Tipos de equipamentos:

 Espectrofotómetros baseados na transformada de Fourier (FTIR) – análises qualitativas e quantitativas.


 Espectrofotómetros de IV dispersivos – descontinuados, usados principalmente para análise qualitativa.
 Fotómetros de IV contínuos não dispersivos – desenvolvidos para determinação de espécies orgânicas
na atmosfera.
 Espectrofotómetro de IV por reflectância total atenuada – utilizadas para análise de uma grande
variedade de amostras.

Componentes do equipamento do IV médio:

1. Fontes de energia radiante: Emissor de Nernst, Emissor Globar, Filamento Incandescente.


2. Constituição da ótica: Materiais transparentes no IV, Tipos de células.
3. Órgãos selecionadores do comprimento de onda: apenas nos equipamentos de IV dispersivos.
4. Detetores: Térmicos (Termopares e Bolómetros), Piroeléctricos

1. Fontes de energia radiante:

As fontes de radiação IV consistem num sódio inerte que é aquecido electricamente a uma temperatura entre
1500 e 2000 K, resultando uma radiação contínua semelhante à do corpo negro.
O corpo negro é um corpo que absorve toda a radiação que nele incide; nenhuma luz o atravessa, nem é
reflectida. Quando o corpo negro é aquecido, essas propriedades tornam-no uma fonte ideal de radiação
térmica.
Em equilíbrio térmico, a uma certa temperatura, um corpo negro emitirá exactamente a mesma quantidade de
energia que absorve, em todos os comprimentos de onda.
À temperatura ambiente, os corpos negros emitem radiação infravermelha.

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 Emissor de Nernst:
• Bastonete oco
• Óxidos de metais raros (zircónio e íctrio)
• 1500-2000 K
• Necessita pré-aquecimento até corrente eléctrica ser suficiente para
manter a temperatura.

 Emissor Globar:
• Cilindro
• Carbonato de silício
• 1300-1700 K
• Necessita refrigeração por água.

 Filamento incandescente:
• Hélice metálica (níquel e crómio)
• 1100 K
• Intensidade energia inferior.
• Maior duração

2. Constituição ótica:

Materiais transparentes no IV – brometo de potássio (KBr) e cloreto de sódio (NaCl). Ambos são halogéneos
alcalinos.

- Amostras gasosas:

 Células resistentes à pressão


 Células com grande percurso ótico (espelhos internos)
 São fechadas/estanques e transparentes.

- Amostras líquidas:

 Coloca-se directamente nas células de NaCl que


podem ser:

– Células fechadas (de espessura variável


ou fixa)

– Células abertas (discos de NaCl) –


transparentes à radiação IV.

Nota: Transparentes = não absorvem nem emite no IV.

- Amostras sólidas (solúvel num solvente orgânico [sulfureto de carbono]):

 Pastilha de KBr – dispersão em meio sólido, só se pode fazer com amostra cristalina.
- Para se formar a pastilha, é necessário um suporte para “dissolver” a amostra. KBr é transparente à
radiação IV; as pastilhas são o método mais prático.
 Discos (amostra sólida e solvente formam uma pasta) – Pasta (mull) - parafina de elevada pureza
(Nujol – solvente mais usado)
- Mistura da pasta que se quer analisar com parafina líquida, a pasta é colocada entre os discos de
NaCl; é necessário fazer um espectro da parafina para se “subtrair” à da mistura.
45
 Em solução com solvente orgânico (uso de células para líquidos)

Extra:

1. Técnicas de preparação das amostras para análise:

 Amostras em meio líquido: Dissolve-se a amostra a 1:100 num solvente orgânico como CCl 4 ou CS 2
(dependendo da zona de λ, pois o solvente não pode absorver) e coloca-se directamente em células de
NaCl. O NaCl tem ligações iónicas muito fortes, não sofrendo alterações rotacionais ou vibracionais, não
absorvendo nessa zona do espectro.
 Amostras em meio semi-sólido: Preparadas em Nujol (parafina muito pura). Usando um almofariz de
ágata tritura-se a amostra e adiciona-se umas gotas de nujol, formando o mull (uma pasta
esbranquiçada), coloca-se entre dois discos de NaCl e leva-se ao espectrofotómetro. A parafina também
absorve no IV, o que é uma desvantagem.
 Amostras em meio sólido: Preparação de pastilhas de KBr, que possui ligações muito fortes que não
absorvem. Tritura-se a amostra e unta-se 100vezes mais KBr. Põe-se parte do homogeneizado no
pastilhador fazendo uma pastilha fina mas que não se parta. Retira-se a pastilha com uma almofada e
coloca-se num suporte para pastilhas, levando-se ao espectrofotómetro.

2. Condições ambientais - Cuidados a ter

Polistireno: Utilizado como referência. Utiliza-se para verificar se o equipamento está calibrado (faz-se uma
comparação entre o espectro da literatura e o observado no equipamento). Também permite avaliar a sua
resolução.

46
A temperatura e a humidade tem que ser controlada, pois danifica a parte ótica e interfere no espectro – a
água tem uma ligação OH e a banda desta ligação é muito larga, pelo que pode perturbar outras leituras. Assim,
as amostras a analisar não podem ser aquosas.
Material de suporte não deve absorver no IV, sendo que para tal usam-se células de halogenetos alcalinos que
devido às suas ligações iónicas fortes, não absorvem no IV.
O solvente deve apresentar o mínimo de banda de absorção, de modo a minimizar as interferências no espectro
da amostra. Os solventes mais usados são o sulfureto de carbonilo e o tetracloreto de carbonilo.

3. Órgãos selecionadores de comprimento de onda (apenas nos espectrofotómetros de IV dispersivos):

Sistema de fendas de entrada e de saída de largura variável


(quanto maior a fenda menos monocromática será a radiação).

Elementos de dispersão, de preferência, redes de reflexão, por


vezes associadas a filtros.

Espelhos para encaminhamento das radiações, de preferência a


lentes devido à frágil natureza do material ótico.

4. Detetores de IV:

- Detetores Térmicos:

Baseados nas propriedades caloríficas das radiações IV.


Muito susceptíveis ao ruído térmico do ambiente, daí a necessidade de bom isolamento – são geralmente
encapsulados e protegidos da radiação térmica emitida por outros objectos.

Termopares Bolómetros ou Termómetros de Resistência

- A temperatura da radiação incidente vai - Têm por base materiais (platina ou níquel) que
influenciar o potencial eléctrico de uma junção de 2 exibem uma mudança de resistência em função da
materiais, como bismuto e antimónio, medindo-se temperatura.
esse potencial. - Não são tão utilizados para a região IV-médio,
- É muito sensível. embora sejam ideais para detetar radiação entre 5
- Bastante utilizado. e 400 cm-1.

- Detetores Piroelétricos:
Contém um cristal de sulfato de triglicina deuterado situado entre dois eléctrodos, um
dos quais é semi-transparente à radiação IV e recebe o impacto do feixe ótico.
Forma-se uma corrente eléctrica que é proporcional à temperatura atingida, ou seja,
quando recebe a radiação IV, vai criar uma corrente eléctrica que é diferente consoante a
radiação IV que capta.
Como têm uma resposta muito rápida, são utilizados nos aparelhos com Transformada de
Forrier (FTIR).

47
Espectrofotómetro IV Dispersivo
O monocromador permite a seleção da radiação transmitida, podendo remover-se o interferente.

Usado principalmente para análise quantitativa.

Espectrofotómetro FTIR
Transformada de Fourier é uma operação matemática que transforma sinais recebidos pelo detetor em
algoritmos.
Totalmente controlado por computador e caracteriza-se pela separação do feixe em 2, que seguem duas
direções em ângulos retos.
É um aparelho não-dispersivo, porque não apresenta primas ou redes que dispersem a radiação (sem
monocromador, logo não dispersa a radiação).
A radiação passa por um divisor do feixe (beamsplitter) que divide em duas direções em ângulos retos. Um dos
feixes de radiação é enviado para um espelho móvel. O movimento do espelho móvel move-se a alta
velocidade, variando a distância “d” e gerando sinais de diferentes intensidades. Por outras palavras, torna
variável a distância total percorrida pela radiação em relação à do espelho fixo. Quando os dois feixes de
radiação (procedentes dos espelhos) se encontram de novo no divisor do feixe, recombinam-se mas a diferença
entre as distâncias percorridas originam interferências construtivas e destrutivas, ou seja, um interferograma.
Este incide na amostra originando um outro interferograma reconhecido pelo detetor piroelétrico que
reconhece o λ de cada radiação, sendo cada ponto do interferograma tratado matematicamente no
computador, originando o espectro.
É usado tanto para análises qualitativas como quantitativas.
Quando se vai realizar análises temos que primeiro traçar um gráfico de base, sem amostras, o branco do ar,
pois o O 2 e o CO 2 que existem no ar são polares e apresentam momento dipolar. O instrumento vai descontar
este gráfico base à amostra – desconto do background.

48
• Explicando mais a fundo o que ocorre nesta máquina:

Quando a radiação electromagnética emitida pela fonte atinge o beamsplitter, parte da radiação passa e atinge
o espelho estático, enquanto outra parte é refletida e atinge o espelho móvel. Quando chegam aos espelhos,
são de novo refletidos, sendo que a radiação ao atingir o beamsplitter leva a que uma parte passe e atinga a
amostra e outra parte seja refletida de novo para a fonte de radiação. A radiação que atinge a amostra resulta
de uma combinação entre a que veio do móvel estático e a que veio do espelho móvel. Como o espelho móvel é
movido de uma posição A para uma posição B, vai levar a que ocorram dois tipos de interferências: as
construtivas (os dois comprimentos de onda estão na mesma fase) e as destrutivas (os dois comprimentos de
onda não estão na mesma fase).
https://www.youtube.com/watch?v=UA1qG7Fjc2A

Vantagens dos Aparelhos FTIR (não dispersivo, sem monocromador) Relativamente aos Aparelhos
Dispersivos:

 Maior rapidez
 Aumento da razão sinal-ruído
 Melhor resolução e sensibilidade
 Maior rigor nos valores de frequências
 Melhor capacidade no tratamento de dados

49
Diferenças entre as Técnicas FTIR de Transmissão e Reflexão:

Transmissão Reflexão

 Utilizada para sólidos, líquidos e gases  Analisa a luz reflectida a partir de uma
 Necessária preparação da amostra (por interface (sólido/amostra)
vezes difícil)  Utilizada para sólidos, líquidos, géis
 Utilizada para análise qualitativa  Não é necessário preparação da amostra
 Método de referência para análises (por vezes mínima)
quantitativas  Conveniente para análises qualitativas

Fotómetro de IV contínuo, Não Dispersivo


Desenvolvidos para determinação de espécies orgânicas na atmosfera.

Não tem monocromador, daí ser não dispersivo.

- Vantagens e aplicações:

 Baixo custo
 Sensibilidade
 Equipamento robusto
 Design simples
 Fácil utilização
 Determinação de gases atmosféricos

Absorve no IV → Há atenuação de
IV, que é proporcional à quantidade
de gás, e é detetada no detetor

Não absorve no IV → Não


há atenuação de IV

50
Espectroscopia no IV por Reflectância Total Atenuada (ATR – Attenuated Total
Reflectance)

A reflexão ocorre quando um feixe de radiação passa de um meio com maior índice de refração (cristal de ATR –
Zn, Se, Ge, diamante e KRS-5 – mistura de iodeto de tálio e bromo), para um meio com menor índice de refração
(amostra), sendo alguma radiação absorvida e bastante refletida e detetada.
A radiação não atravessa a amostra, pelo que esta técnica pode ser usada em amostras sólidas e opacas.
O feixe de radiação penetra apenas a uma curta distância (~1μm) na amostra (onda evanescente) antes de
ocorrer a reflexão completa. A intensidade do feixe de radiação é reduzida (atenuado) pela amostra nas regiões
do espectro onde esta absorve. Assim, a intensidade da radiação diminui cada vez que esta é reflectida na
amostra, por ser absorvida em parte por esta.
Se a amostra absorve num determinado λ, há uma atenuação do feixe a comprimentos de onda
correspondentes às bandas de absorção no IV, originando o espectro.
A onda evanescente depende:
 λ
 Índices de refracção (cristal e amostra)
 Ângulo de incidência

- Aplicações e Vantagens:
Os espectros de absorção são obtidos rapidamente numa grande variedade de amostras com um mínimo de
preparação.
• Pastas, pós, suspensões
• Linhas, fibras, tecidos, fios
• Soluções aquosas podem ser utilizadas desde que o cristal não seja solúvel em água
• Alimentos
• Produtos Biológicos
51
Espectroscopia no Infravermelho:
 Vantagens:
 Análise qualitativa por comparação dos espectros com uma biblioteca de espectros
 Aplicável à totalidade das substâncias orgânicas (mais do que o UV).

 Desvantagens:
 Desvios à Lei de Lambert-Beer – Radiação pouco monocromática devido as aberturas largas das
fendas dos monocromadores (IV dispersivo)
 Baixa sensibilidade dos detetores
 Dificuldade na preparação da amostra – Não se sabe a concentração exata ou a espessura exata da
pastilha.

Aplicações da Espectroscopia no Infravermelho:

 Análise qualitativa de substâncias e identificação em análises de rotina


 Elucidação estrutural de moléculas através da pesquisa de grupos funcionais
 Identificação de isómeros geométricos em compostos orgânicos e inorgânicos
 Determinação quantitativa de substâncias através da utilização da lei de Lambert-Beer

Análise Qualitativa:
Identificação de compostos orgânicos através de compostos funcionais e da zona de fingerprint (melhor que
UV).

A comparação da zona de impressão digital de dois compostos (um composto problema e um composto padrão,
cujo espectro é conhecido) permite saber qual é o composto problema, visto que esta zona é específica para
cada composto.

- Zona dos grupos funcionais: 4000 – 1300 cm-1

Nesta zona as principais bandas de absorção podem atribuir-se a unidades vibracionais que dependem
apenas por dois átomos de uma molécula, unidades que dependem mais ou menos do grupo funcional que
provocou a absorção e não da estrutura molecular completa.

52
- Zona da impressão digital: 1300 – 650 cm -1

O padrão de absorção desta zona é bastante complexo; corresponde às frequências de alongamento da


ligação simples dos sistemas poliatómicos, em que há movimento das ligações que unem um grupo
substituinte ao resto da molécula.

1. Análise dos Espectros:

 Comparação de espectros problema com espectros padrão

 Usando cartas de correlação ou tabela – Dão a posição de localização das bandas características dos grupos
funcionais, não é só um comprimento de onda, é uma gama de comprimentos de onda.

Recorrendo a sistemas de pesquisa computorizados – Comparação de espectro problema com espectros


guardados em memória (“software” com bibliotecas contendo muito milhares de espectros, mas não a
totalidade de compostos existentes; apresenta % de semelhança)

53
2. Absorções características dos grupos funcionais:
• Grupo Carbonilo
- Frequência do grupo carbonilo: 1780 – 1600 cm-1
- A frequência do grupo carbonilo depende dos átomos que o
rodeiam, ou seja, do grupo funcional (cetona, aldeído, éster,
etc.…).
- Considera-se a frequência normal:

- A substituição do grupo alquilo de uma cetona, por um heterótomo, altera a frequência de absorção
do carbonilo:
a) Efeito indutivo: Reduz o tamanho da ligação dupla entre o C e o O, aumentando a sua constante de
força e a sua frequência de absorção.

b) Efeito de Ressonância: Aumenta o tamanho da ligação dupla ente o C e o O, diminuindo a sua


constante de força e a frequência de absorção.

Análise Quantitativa:
Quantificação de um analito numa mistura complexa (pior que UV, não usado para este efeito).
Os métodos quantitativos de absorção no IV diferem da espectroscopia no UV-Visível devido à grande
complexidade dos espectros, à existência de bandas de absorção estreitas e à limitação instrumental.
Em princípio a lei de Beer aplica-se às determinações no IV, tal como no UV-Vis.

54
1. Principais Vantagens da análise quantitativa/qualitativa:
1. Espectros mais complexos
2. Aplicável à quase totalidade das substâncias orgânicas (muito maior n.º que no UV). → + universal que UV
3. Na análise de misturas há possibilidade de fuga às interferências, selecionando bandas afastadas. Ou seja,
menos interferências.

2. Principais Inconvenientes:
1. Dificuldade na preparação da amostra.
2. Desvios à lei de Beer (bandas de absorção estreitas).
3. Limitação instrumental (baixa intensidade das fontes emissoras e baixa sensibilidade dos detetores,
requerem o uso de fendas largas no sistema monocromador).

55
Espectroscopia de Emissão Molecular – Fluorescência

Espectroscopia de emissão
Técnica que analisa os λ dos fotões emitidos por
Emissão de energia
moléculas ou átomos durante a sua transição do estado
sob a forma de
excitado (de maior energia) para o estado fundamental
(de menor energia). Como é de “emissão”, então não fotão
segue a Lei de Lambert Beer.

Luminescência – Emissão de Luz por uma Molécula


Ocorre quando o electrão volta ao estado fundamental a partir de um estado excitado e perde o excesso de
energia sob a forma de fotão (sob a forma de luz).

A luminescência engloba 3 técnicas:

1. Espectroscopia de Fluorescência – Processo mais rápido e de curta duração que corresponde ao retorno
do estado singuleto para o estado fundamental.
2. Espectroscopia de Fosforescência – Processo mais longo que envolve a passagem do estado de tripleto
para o estado fundamental.
3. Espectroscopia de Quimioluminescência – Ocorre quando numa reacção química se produz uma espécie
química excitada que emite um fotão quando regressa ao estado fundamental.

Teoria da Fluorescência e da Fosforescência


O princípio da exclusão de Pauli diz que só podem existir dois electrões na mesma orbital e necessariamente
com spins opostos.
As moléculas podem ser diamagnéticas, quando possuem os spins emparelhados, ou paramagnéticos, sendo o
exemplo disso o radical livre.
Paramagnético – Materiais que possuem electrões desemparelhados e que, quando na presença de um campo
magnético, se alinha, fazendo surgir dessa forma um íman que tem a capacidade de provocar um leve aumento
da intensidade do valor do campo magnético em um ponto qualquer.
Diamagnéticos – Materiais que se colocados na presença de um campo magnético tem seus ímanes
elementares orientados no sentido contrário ao sentido do campo magnético aplicado. Assim, estabelece-se um
campo magnético na substância que possui sentido contrário ao campo aplicado.
As propriedades das moléculas no estado excitado singuleto são diferentes das moléculas no estado excitado
tripleto.
Transição singuleto (S)/tripleto (T) (transição rara) é menos provável do que a transição singuleto (S)/singuleto
(S1/S2).

Após excitação, o Após excitação, o 56


electrão mantém o seu electrão muda o seu
spin - Fluorescência spin - Fosforescência
Absorção/Fluorescência/Fosforescência
Ao expor-se uma molécula à radiação, a molécula vai absorver energia
passando a um estado energético superior, mas regressa ao estado
fundamental libertando a energia absorvida.

- Absorção: 10-14 – 10-15 s

- Fluorescência: velocidade de emissão: 10-7 – 10-9 s; T 1/2 ~10ns

- Fosforescência: velocidade de emissão: 10-3 – 100 s; T 1/2 ~ms a s

Na fosforescência, a emissão ocorre mais lentamente e o tempo de vida no estado excitado é maior (mudança
do spin do electrão para o estado tripleto), ou seja, é um fenómeno que dura mais tempo, pois a emissão ocorre
mais lentamente. Assim, a velocidade de emissão também os distingue.

Processos de Desactivação
Quando uma molécula passa para o estado excitado pode ir para s1 ou mais elevado, e a molécula só emite
fluorescência a partir do nível mais baixo, s1.
Uma molécula excitada pode voltar ao estado fundamental por combinação de processos, pois, nem as
moléculas nem os átomos gostam de estar no estado excitado, e dependendo da estrutura da molécula, ela vai
libertar energia de vários modos, sendo que escolhe a via de desactivação mais rápida.
Dois desses processos são a fluorescência e a fosforescência que envolvem a emissão de fotões (radiação). Nos
outros processos de desactivação não há emissão de radiação.
A via favorita para regressar ao estado fundamental é a que minimiza o tempo de vida no estado excitado.

57
- Relaxação Vibracional

Durante o processo de excitação electrónica a molécula pode


ser promovida a qualquer um dos estados vibracionais. Em
solução, o excesso de energia vibracional é imediatamente
perdido como consequência das colisões entre as moléculas
no estado excitado e as moléculas do solvente.
Assim, a fluorescência de uma substância em solução só
envolve o estado vibracional da mais baixa energia do estado
excitado. Uma consequência deste processo é a da banda de
fluorescência se deslocar para maiores comprimentos de
onda, em relação à banda de absorção (desvio de Stokes).

Desvio de Stokes: Quando uma molécula em solução absorve


energia, parte dessa energia é perdida em colisões entre as
moléculas no estado excitado e as moléculas de solvente.
ℎ𝑐𝑐
Assim, sendo E = , menor Energia = maior λ, desviando-se
𝜆𝜆
a banda de emissão para maiores λ em relação à de excitação.
Assim, o desvio de Stokes caracteriza-se como a diferença entre o λ de emissão e o λ de excitação, devido a
perda de energia por diversos modos que não a emissão do fotão.

58
- Conversão interna:

É um processo intermolecular no qual a molécula passa para um nível electrónico de menor energia sem que
haja emissão de radiação. Este mecanismo não é bem compreendido mas altamente eficiente, uma vez que
poucos compostos apresentam fluorescência.

- Conversão externa:

A desactivação do estado excitado pode envolver interacções e transferência de energia entre as moléculas
excitadas e o solvente ou outros solutos, processos que se denominam conversão externa. Este processo explica
o efeito do solvente na intensidade da fluorescência. Além disso, condições experimentais que diminuam o nº
de colisões, como a diminuição da temperatura ou um aumento da viscosidade, aumentam em geral a
fluorescência (menor número de colisões leva a uma maior fluorescência).

- Conversão intersistemas:

É um processo de desactivação que ocorre com inversão do spin do electrão excitado (S 1 → T 1 ), havendo uma
alteração da multiplicidade da molécula. Este tipo de mecanismo é mais vulgar em moléculas que contenham
átomos pesados (ex.: I ou Br – efeito do átomo pesado). A presença de espécies paramagnéticas (ex.: O 2
dissolvido na solução) também aumenta a conversão intersistemas com consequente diminuição da
fluorescência.

Eficiência Quântica de Fluorescência


Relação do número de moléculas que sofrem fluorescência para o número total de moléculas excitadas.
Para moléculas muito fluorescentes, tais como a fluoresceína, a eficiência quântica aproxima-se da unidade.
Ou seja, quanto maior a eficiência, maior a fluorescência.

Espectrofotometria de Emissão
Esta é uma espectroscopia de emissão molecular, sendo que o que é
analisado é o comprimento de onda emitido pela molécula ao
passar do estado excitado ao estado fundamental.
Nem todas as moléculas possuem esta propriedade, a perda de
energia sobre a forma de um fotão.
As bandas de fosforescência aparecem geralmente a maiores
comprimentos de onda do que as bandas de fluorescência, porque

59
estado excitado de tripleto é menos energético do que o estado excitado de singuleto (fluorescência)
correspondente.

1. Espectro de excitação:

1 A fluorescência é medida a um comprimento de onda fixo,


enquanto se faz variar os comprimentos de onda de excitação;
ajustando a intensidade da fonte de radiação e a resposta do
detector, este espectro é semelhante a um espectro de
absorção.
2
2. Espectro de emissão:
O comprimento de excitação mantém-se constante e faz-se
variar o comprimento de emissão.

Relação entre o Espectro de Excitação e o Espectro de Absorção


Como as diferenças de energia ente os estados vibracionais são semelhantes quer no estado fundamental, quer
no estado excitado, o espectro de excitação (ou absorção) e o espectro de fluorescência são a imagem no
espelho um do outro.

60
Estrutura da molécula
Factores Condicionantes da Fluorescência
Meio onde se encontra

- Favorecem Fluorescência (aumentam fluorescência):

 Ligações (duplas e triplas ligações)


 Grupos aromáticos e heteroaromáticos
 Rigidez da molécula (vibra menos, logo tem mais
energia, levando a uma maior fluorescência)
 Grupos electrodadores (aumenta o número de
estruturas de ressonância, logo aumenta a
estabilidade do estado excitado):
- NH 2
- OH
- OCH 3

Quando há fusão de anéis benzénicos a um


núcleo heterocíclico, produz-se um
aumento da absortividade molar do pico de
absorção, pelo que o tempo de vida do
estado excitado é menor, observando-se
fluorescência nesses compostos.

- Contrariam a Fluorescência (diminuem fluorescência):


• Moléculas pesadas – desfavorecem a fluorescência
• Grupos Electroreceptores/Eletroatratores:

- Cl, Br, I
- COOH
- NO 2
- NHCOCH 3

O tipo de substituição do anel benzénico afecta


frequentemente a fluorescência.

- Concentração:
Muito elevada contraria fluorescência (existência de
fenómenos de auto absorção – meio tão concentrado
que a radiação emitida pela molécula não chega ao
detector, acabando por atingir outra molécula). É por
isso que é preciso usar baixas concentrações.

61
- Solventes:
 Viscosidade: Elevada favorece fluorescência (porque há uma menor vibração das moléculas e
um menor choque entre as moléculas).
 Polaridade
 Presença de Átomos Pesados: como por exemplo no iodeto de etilo, favorecem mais a
conversão das moléculas a tripleto.
Favorece a fosforescência
- Temperatura:
Baixa favorece fluorescência
O aumento da temperatura aumenta a frequência das colisões e, portanto, a probabilidade de
desactivação por conversão externa.

- Presença de O 2 dissolvido:
Reduz fluorescência devido às propriedades paramagnéticas do oxigénio promovendo cruzamento
intersistema e conversão das moléculas a tripleto (mais fosforescência).
- pH: Pode modificar a estrutura da molécula, os indicadores fluorescentes são exemplo de aplicação.

A fluorescência de um composto aromático com grupos substituintes ácidos ou básicos depende do


pH.
Mais estruturas de ressonância conduzem a estados excitados mais estáveis e por isso aumentam a
fluorescência.

62
Equipamentos
Os equipamentos podem ser de dois tipos: feixe simples ou feixe duplo.
E se estes possuirem filtros são fluorímetros. Mas se possuirem monocromadores (redes ou prismas)
são espectrofluorímetros. Ambos os objetos são selecionadores de comprimento de onda.

Principais Componentes de um (Espectro) Fluorímetro


Filtro que só permite a
passagem de luz polarizada
numa direcção específica,
retirando interferências.

Quando uma amostra emite


energia, emite em todas as
direcções.
O ângulo de 90 graus permite
que apenas a radiação emitida
chegue ao detector.

- Fontes de energia:
A potência da fluorescência é diretamente proporcional à potência da radiação excitadora: Fontes de
radiação intensas.

 Lâmpada de Deutério:

- Fonteintensa
- Gama limitada: 200-350 nm

 Lâmpada de Mercúrio:

- Muito intesa e estável


- Não origina um espectro contínuo

 Lâmpada de Xénon:

- Espectro contínuo entre 250-600 nm


- Intensidade varia com o λ
- Selecionadores de λ (Monocromadores):

 Filtros (fluorímetros)
 Prismas e redes de dispersão (espectrofluorímetros)

63
- Detetores:

 Tubos fotomultiplicadores - baseia-se no principio fotoeléctrico, mas com uma amplificação de


sinal (em cascata) muito superior, pelo que tem maior sensibilidade.
 Detetores de vetores de díodos

- Células para Amostras:


Para que a luz do raio
 Forma: tubulares e quadrangulares (quatro faces transparentes)
incidente não contamine a
 Tipo de Material (depende do 𝜆𝜆): Vidro e quartzo
análise por parte do detetor.

- Equipamento:
Existem equipamentos que usam microplacas de 6, 12, 24, 48, 96 ou 384 poços, sendo que as placas
podem ser de fundo negro, transparentes ou placas negras.

É necessário escolher o filtro


“correspondente” ao 𝜆𝜆 necessário.

64
Calibração da Escala dos Aparelhos:
Necessária devido às variações de intensidade da fonte de radiação, sensibilidade dos detectores e
outras variáveis instrumentais.
Usam-se:
 Placas de vidro impregnadas de substâncias fluorescentes
 Solições de compostos fluorescentes :
- bissulfato de quinina em ácido sulfúrico 0,1N.
- triptofano em água.
- antraceno em ciclohexano, etanol ou benzeno.

Fluorescência e Aspectos Importantes a Ter em Conta na Análise Quantitativa:


- Escolha do comprimento de onda de excitação
- Escolha do comprimento de onda de emissão
- Utilização do pH ótimo
- Concentração:
a) Para a maioria das espécies químicas a eficiência quântica é máxima para baixas
concentrações: 10-4 M
b) A resposta do instrumento é linear se εbc ˂ 0,05. Como ε é da ordem de 103 e 104 então para
b=1, c deverá estar entre 10-5 M e 10-6 M

Vantagens e Desvantagens em Relação à Espectrofotometria de Absorção:

Apresenta uma maior sensibilidade e uma maior selectividade.


A intensidade da radiação fluorescente permite determinar quantitativamente vestígios de muitas
espécies orgânicas e inorgânicas, tendo o método limites de deteção muito baixos (ppb).
No entanto, esta técnica não é tão aplicada como os métodos de absorção porque só um número
mínimo de sistemas emite radição fluorescente.

65
Aplicações:
- Determinação Fluorimétrica de Espécies Inorgânicas:

1) Método Direto – Envolve a formação de quelatos fluorescentes, sendo utilizados


reagentes fluorimétricos.

2) Método Indirecto - Por diminuição da intensidade de fluorecência (mais utilizado na


análise de aniões).

- Determinação Fluorimétrica de Espécies Orgânicas:


 Produtos alimentares
 Amostras clínicas
 Produtos naturais
 Produtos Farmacêuticos (Vitaminas, Antibióticos, Esteróides, Alcalóides, Enzimas e Hormonas)

A determinação fluorométrica de espécies inorgânicas e orgânicas é possível devido a existência de


fluoróforos/fluorocromos, que é um componente da molécula que faz com que esta seja fluorescente.

66
Luminescência Química/Quimioluminescência
Ocorre quando numa reacção química se produz uma espécie química excitada que emite energia
luminosa ao regressar ao estado fundamental.
Um exemplo é a reacção do luminol com o sangue.

- Bioluminescência

Emissão de luz como resultado de uma reacção química que ocorre num organismo.

67
Métodos Espectroscópicos Atómicos – Fotometria de Emissão com Chama

Métodos Espectroscópicos:
 Moleculares – A amostra é analisada na forma de moléculas. A amostra está contida em: célula,
recipiente, suporte.
 Atómicos – A amostra é analisada na forma de átomos. A amostra está contida em: chama, plasma,
arco, faísca.

Métodos Espectroscópicos Atómicos:

1º passo antes da deteção


(“transformação” em átomos)

- Processos que ocorrem durante a atomização:

Transformação da amostra em gotículas de gás

gasoso Como a amostra está homogeneizada → gotículas


tem todas o mesmo tamanho → sofrem todas os
mesmos processos de igual forma, que levam à
atomização dos átomos em análise

68
Fotometria de Emissão com Chama:
Na fotometria de emissão com chama ocorre a excitação de átomos neutros.
Quando um átomo é excitado por absorção de energia, poderá emitir radiação que lhe é
característica. Essa emissão é consequência do retorno do átomo ao estado fundamental,
que liberta energia devido à passagem de um ou mais electrões para um nível energético
inferior.
Os átomos excitados voltam ao seu estado fundamental com emissão de um fotão de
radiação que pode ser identificado e medido.
A proporcionalidade verificada entre as intensidades das radiações emitidas e as concertações dos átomos
presentes, permite a análise quantitativa das amostras por fotometria de emissão.

Equipamento:

(Chama)

Ar

Acetileno, H2

São dois os gases que vão influenciar o tipo de chama:


comburente e combustível
O tipo e a preparação dos gases vão influenciar a
temperatura da chama:
• Ar-Acetileno: 2100 a 2400ºC
• O2-Acetileno: 3060 a 3200ºC
69
Monocromador vai apenas selecionar a radiação emitida pelo átomo
em análise, para eliminar interferências por parte de outros átomos.

É o comburente que
normalmente faz a aspiração.

Ou deflectores, para que não passem


grandes partículas de mistura/amostra que
possam interferir com a análise; partículas
que não passam a aerossóis são descartadas

Atomizador/Queimador:
 Tem como função de conduzir as gotículas mais pequenas da amostra té ao queimador.
 A regulação dos gases é muito importante para que as experiências sejam sempre reproduzidas nas
mesmas condições. As garrafas tem dois barómetros, um que indica o volume de gás que a garrafa
ainda possui e outro que permite regular a saida do gás.
 Componentes do Atomizador/queimador:
 Cilindros (garrafas) de Gases
- Comburentes (ou compressor de ar)
- Combustíveis
 Reguladores de Pressão de saída de gás – pressões usuais:
- ~10psi para combustível
- ~30psi para comburente
 Reguladores de débito de gás (fluxómetros) – completam a função dos reguladores de
pressão, de forma a manter as características da chama.
 Gases mais usuais e temperaturas das chamas:

70
 Tipos de Atomizador/Queimador:
 Queimador-atomizador turbulento ou de injecção dirata – a amostra vai diretamente à
chama sem contactar primeiro com os gases.
 Queimador-atomizador de fluxo laminar ou pré-mistura – antes de chegar à chama a
amostra mistura-se com o comburente e o combustível.

Consome menos
amostra.

Mais eficiente.

- Chama (Funções):

Deve ser constante, devendo todo o processo ocorrer na zona mais


quente da chama. Este ajuste é feito automaticamente pelo
queimador.
Funções:
1. Transformar a substância em ensaio no estado de vapor
(vaporização).
2. Converter as espécies moleculares em vapor atómico
(atomização).
3. Excitar o vapor atómico (na especrometria de emissão) até à
emissão de riscas espectrais.
As diferentes tonalidades da chama indicam diferentes temperaturas da mesma (≠ tonalidades da chama ⟶ ≠
zonas de temperatura da chama).
Diferentes temperaturas fornecem diferentes taxas de atomização e de excitação.
Para determinações quantitativas é importante ajustar a altura do feixe radiante em condições constantes e
otimizadas.

71
- Sistema ótico:
Monocromador vai apenas selecioanr a radiação emitida pelo átomo em análise (programa-se o aparelho para
selecionar a radiação com o CDO teórico do elemento). Assim, os outros átomos da amostra que também foram
excitados não vão interferir.
Como os CDO emitidos pelo átomo são muito próximos, o monocromador não os consegue distingir, o que dá
origme a uma risca de emissão.

- Escolha das Condições de Ensaio:


Deve-se optimizar:
 Natureza e débitos dos gases alimentadores da chama
 Zona de observação da chama (Temperaura)
 Natureza dos solventes
 Comprimento de onda (risca característica do elemento a analisar)

Interferênicas (Métodos Espectroscópicos Átomicos)

 Espectrais:
- Ocorrem:

1) Quando espécies interferentes absorvem ou emitem em λs muito próximos dos da espécie em


análise.
- Corrige-se:
1) Retirando o interferente
2) Usando bom sistema monocromador.
3) Selecionando outro λ de trabalho (outra risca).

 Físicas:
- Ocorrem:
1) Quando existem partículas na chama ( gotículas ou partículas sólidas) que difractam ou absorvem
radiação.
- Corrige-se:
1) Evitando viscosidades elevadas e a presença de matéria em suspensão nas soluções a analisar.
2) Utilizando bons defletores.

 Associações e Dissociações Moleculares:


- Ocorrem:
1) Por reações de oxidação dos metais na chama (O 2 ) formam novos compostos, sendo alguns destes
compostos muito estáveis e dificultando atomização (não se dissociam).
- Corrige-se:
1) Usando chamas quentes (ex. óxido nitroso-acetileno).
2) Usando solventes orgânicos.
3) Operando com chamas redutoras C+MO → CO+Mo.

72
 Ionização dos Elementos:
- Ocorrem:
1) Principalmente com metais alcalinos.
- Corrige-se:
1) Utilizando “tampões de ionização”. São elementos mais facilemnte ionizáveis que os analitos e
que, sendo adicioanis à amostra em quantidades muito superiores, vão originar um meio muito
concentrado em iões e electrões, evitando a ionização desses analitos. E estes tampões não
interferem com a análise.

 Formação de Compostos de Ponto de Ebulição Elevado:


- Ocorrem:
1) Pela reacção com certos aniões (ex. sulfato, nitrato, fosfato).
- Corrige-se:
1) Adicionando ião interferente até estabilização do sinal.
2) Adicionando “competidores” que preferencialmente se liguem ao anião (ex. lantânio) ou ao
elemento a analisar (ex. EDTA, que depois facilmente o liberta na chama).

 Auto-Absorção (Métodos de Emissão):


- Ocorrem:
1) Por absorção da radiação emitida pelos próprios átomos não excitados do elemento em análise.
Átomos no estado fundamental vão absorver radiação emitida por átomos que absorveram a
radiação da chama e passaram ao estado excitado. Ao passarem ao estado fundamental emitem
radiação que pode ser absorvida por átomos do analito em análise que estão no estado
fundamental.
- Corrige-se:
1) Trabalhando com soluções de baixas concentrações.

↓Concentrações → ↓Colisões entre átomos → ↓Auto-

Uso de Solventes Orgânicos


- Simples ou em mistura com água ou outros orgânicos.
- Em geral, actuam provocando aumento de sinal (emissão ou absorção; aumentam a sensibilidade –
concentração a partir da qual podemos começar a medir) devido:
 Efeito Físico por redução de viscosidade:
 Maior velocidade de alimentação.
 Nebulização mais eficiente (gotículas menores).
 Efeito Térmico por menor arrefecimento da chama (calor de vaporização mais baixo).

73
 Efeito Redutor, dificultando formação de óxidos.
 Efeito Quelante de certos solventes (ex. EDTA).

Vantagens da Fotometria de Emissão com Chama:


• Baixo custo - Comparativamente com outros métodos espectrofotométricos.
• Simplicidade de Operação - Método adequado a processos de rotina.
• Bom desempenho analítico - Boa exactidão, precisão, sensibilidade e limite de detecção e de
quantificação.

Análise Quantitativa (permite a determinação de concentrações em todos os métodos)


1. Método da curva de calibração:
Para várias soluções padrão de concentração
conhecida regista-se o sinal que se obtém,
construindo-se a curva de calibração.
Acerta-se o zero com o “branco” e com a
solução padrão mais concentrada acerta-se um
valor elevado.
Analisa-se a solução problema, regista-se o
sinal obtido e através da curva de calibração
tira-se a concentração da solução problema.
Por vezes podem existir pontos que “saem” –
outlier – e temos de ter sentido crítico perante
estes calores, decidindo que os incluímos na
reta ou não.
Gráfico que relaciona os sinais de um método analítico com quantidades conhecidas do
analito (substância a ser analisada).
A representação gráfica dessas curvas pode ter a configuração de:
- uma linha reta (ou muito próxima)
- uma curva

74
Análises com Calibração Simples:
• Construção da Curva de Calibração:
Poder-se-á adotar o procedimento:
1- Preparar solução branco: solução contendo todos os reagentes e solventes
usados no processo analítico exceto a substância em análise (analito), medir a
respectiva resposta (sinal do branco)
2- Preparar soluções com quantidades conhecidas do analito, soluções de padrões,
cobrindo uma gama de concentrações conveniente e medir as respectivas
respostas (sinais dos padrões)
3- Subtrair o sinal do branco aos sinais dos padrões (sinais corrigidos)
4- Construir um gráfico dos sinais corrigidos em função das quantidades conhecidas
do analito
• Leitura da Amostra Desconhecida: “problema”:
1- Em condições de ensaio o mais próximas possível das condições dos padrões,
medir o sinal da solução problema
2- Subtrair o sinal do branco ao sinal do problema (sinal corrigido)
3- Ler na curva de calibração o valor da concentração do problema em função do
seu sinal corrigido
Notar:
1) É conveniente preparar mais do que uma solução (normalmente três) de cada
um dos padrões, branco ou problema, calculando depois a linha mais provável
(recta* ou curva**) e outros parâmetros estatísticos.
*equação tipo y = mx + b **equação tipo y = ax2 + bx + c
2) Valores medidos muito dispersos deverão ser eliminados.

2. Método da Adição-Padrão:
Utiliza-se quando existam interferências devidas à matriz (tudo o que está na amostra menos
o analito) da amostra. Normalmente aplica-se este método quando temos amostras complexas,
como por exemplo a urina. O branco pode ser a amostra.
Pretende-se eliminar interferências da matriz da amostra.
Prepara-se uma solução contendo determinada quantidade da amostra problema. Uma mesma
quantidade de amostra problema é adicionada a todas as soluções contendo padrões.
Por outras palavras, todas as amostras estão submetidas às mesmas condições de matriz,
minimizando assim os erros.
Desvantagem: Vai necessitar de maior quantidade de amostra e assim, de maior tempo de
execução.

75
Construção da Curva de Calibração:

1- Pipetar o mesmo volume de amostra problema (de matriz complexa) para todos os
balões
2- A todos os balões excepto em um (balão1) adicionar à amostra volumes crescentes
de solução padrão (balões 2, 3 e 4)
3- Completar com solvente o volume dos balões e fazer a leitura das soluções
4- Construir um gráfico dos sinais obtidos em função das quantidades conhecidas do
analito (nos padrões)
- Notar:
Se a matriz da amostra interferir com o sinal analítico, afectará de igual forma tanto a
amostras dos padrões como as do problema

Exemplo de Curva e Resolução Gráfica:

3. Método do Padrão Interno:


Utiliza-se quando é difícil manter inalteráveis as condições operatórias. Este método é usado
quando durante a análise podem ocorrer alterações da análise, devido a problemas
instrumentais. O padrão interno não tem o componente a analisar e é semelhante à amostra.
Tem a finalidade de compensar erros aleatórios e sistemáticos, efeitos de matriz e preparo de
amostra.
O padrão interno é uma substância estranha, usada como auxiliar de análise, e é adicionado
na mesma proporção a todas as amostras em ensaio: padrões e problemas.
A escolha do padrão interno depende da composição da amostra em ensaio. Terá de ser
diferente de todos os constituintes originais da amostra e não deverá interferir com eles.
Quando existem alterações no padrão interno, essas alterações dar-se-ão também nos
padrões e amostra. Fazendo a razão sinal obtido/sinal do padrão interno, elimina-se as
alterações. Assim, conseguimos contornar as alterações que possam existir na amostra.

76
Construção da Curva de Calibração:

1- Pipetar o mesmo volume de amostra problema (de matriz complexa) para todos os
balões
2- A todos os balões excepto em um (balão1) adicionar à amostra volumes crescentes
de solução padrão (balões 2, 3 e 4)
3- Completar com solvente o volume dos balões e fazer a leitura das soluções
4- Construir um gráfico dos sinais obtidos em função das quantidades conhecidas do
analito (nos padrões)
- Notar:
Se a matriz da amostra interferir com o sinal analítico, afectará de igual forma tanto a
amostras dos padrões como as do problema
Exemplo de Curva e Resolução Gráfica:

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Métodos Espectroscópicos Atómicos - Espectrofotometria de Absorção
Atómica
Antes de começarmos abordar a Espectrofotometria de Absorção é bom ter a noção das diferenças
entre a Espectrofotometria de Emissão Atómica e a de Absorção Atómica.

Chama – com determinada temperatura, Em parte, o equipamento/técnica é


que vaira com a percentagem de semelhante ao da emissão atómica
comburente/combustível; tem
diferentes funções na técnica de Chama já não funciona para causar
emissão, uma delas é provocar excitação, vai realizar as restantes
excitação.

Não queremos medir a excitação, mas


Temos de usar a temperatura correta
sim a absorção. Neste caso já se pode
para que ocorra excitação e não
usar a Lei de Lambert-Beer.
ionização → leva ao aparecimento de um
elemento que não nos interessa

Vamos excitar os átomos e queremos


que eles voltem ao estado fundamental,
emitindo energia.

Na chama vão existir as duas formas:


• Átomos no estado fundamental;
• Átomos excitados.
78
Espectrofotometria de Absorção Atómica – Fundamento:
Um feixe de radiação “I o ” proveniente de uma lâmpada apropriada (do mesmo elemento em análise), vai sofrer
absorção por parte de átomos no estado fundamental existentes numa chama (ou numa câmara de grafite),
emergindo com radiação não absorvida com uma intensidade “I”, sendo que a diminuição do feixe está
relacionada com a concentração da amostra.
Um detetor vai registar a razão I/Io.
Quanto maior for o número d átomos na chama e a intensidade de emissão da lâmpada, maior é a
sensibilidade.
Existem dois métodos de atomização usuais:
• Atomização por Chama (FAAS – Flame Atomic Absorption Spectroscopy)

• Atomização por Forno de Grafite (GFAAS – Graphite Furnace Atomic Absorption


Spectroscopy)
Amostra (pequenas quantidades) é inserida no forno de grafite, ou “câmara de
grafite”, que é aquecido electricamente.
É usado para amostras sólidas e tem maior sensibilidade - amostra está mais
tempo exposta à radiação da lâmpada, havendo assim um aumento da absorção, e assim um aumento
da sensibilidade.
Todavia, é mais demorada e dispendiosa.
 Câmara de grafite:

- Substitui a chama, visto que a chama pode ter interferências de átomos/moléculas do ar e


da própria amostra.
- É um tubo cilíndrico e pequeno com um orifício onde se coloca a amostra com uma
micropipeta. O tubo é colocado num suporte onde é aquecido e arrefecido pela corrente
eléctrica (usa-se uma resistência para aquecer o tubo).
- Existe duas correntes de gás inerte (árgon, para que não haja destruição do tubo de grafite
na presença de oxigénio – árgon impede a presença de O 2 , logo impede a combustão; não se
formam óxidos – nem pelo calor), uma externa e outra interna ao tubo de grafite, isto irá
fornecer uma atmosfera inerte.

Amostra

79
- Vantagens em relação ao método com chama:
• Maior sensibilidade do que a chama (ppb), pois tem mais elemento disponível.
• Menor volume de amostra (0,5 a 10μL) gasto por análise do que o método por chama.
• Amostras líquidas ou sólidas.
• Não há formação de óxidos - são compostos muito estáveis que vão interferir com os
resultados (quando se forma um óxido com o elemento que queremos analisar, é
muito estável, o que vai diminuir o volume de amostra disponível) - pois a atmosfera é
inerte.
• A introdução directa da amostra elimina a interferência das propriedades físicas da
amostra (viscosidade, tensão superficial).
• São eliminadas algumas interferências observadas (Exemplo: a chama emite radiação
própria) com a chama.

- Desvantagens em relação ao método com chama:


• Menor precisão (a variação do resultado é maior, pode ser necessário repetir o ensaio
várias vezes). É melhorada com um sistema automático de introdução da amostra.
• Instrumentação mais dispendiosa e de operação mais complexa.
• Ao colocar a gota no interior da câmara, podemos colocar de forma diferente entre
experiências, o que vai influenciar as condições experimentais, tornando-as menos
repetíveis (pode ser ultrapassado usando um pipetador automático).

Nota:
O método da chama e o método da câmara de grafite são complementares (tudo realizado
no mesmo aparelho):
 Chama - maior precisão (concentração ppm [mg/L]) (usado quando tenho mais
quantidade de amostra).
 Câmara de grafite - maior sensibilidade (concentração ppb [𝜇𝜇𝜇𝜇/L]) (usado quando
tenho menos quantidade de amostra).

80
Equipamento:

Lâmpada de cátodo Roda dentada que


Nota:
oco, composta pela transforma o feixe de
substância a ser radiação num feixe = feixe de radiação intermitente que é
analisada. intermitente detectado pelo detector.

Diferente da emissão atómica

- O equipamento pode ser de 2 tipos:

- Permite analisar 1 solução de cada vez - Permite analisar a amostra e o


branco em simultâneo

No feixe duplo, uma parte da


- Atomização: radiação passa pela chama e
outra não, sendo que depois a
• Amostra transforma-se num aerossol no nebulizador. absorvência de uma é subtraída
• Amostra sofre uma dessolvatação e atomização. a de outra para obter o
• Átomos livres absorvem a luz emitida pela lâmpada de cátodo oco. resultado.
• Máxima sensibilidade: Permite trabalhar sem esperar
- Máximo número de átomos livres no percurso ótico. que a lâmpada aqueça e tenha
- Máxima quantidade de luz a passar pela chama. máxima intensidade – problema
das de feixe simples.

81
- Fontes de radiação:
A. Lâmpadas de cátodo oco: o elemento a analisar é o constituinte do cátodo:
- de único elemento
- multielemento – não tem interesse usar quando só se vai analisar um elemento.
- de alta intensidade – 2 pares de elétrodos.
A lâmpada está preenchida por um gás inerte, que quando sujeito a uma corrente elétrica que promove
a sua ionização, irá bombardear o cátodo. Os átomos do metal do cátodo são excitados, regressando
depois ao seu estado fundamental com libertação de radiação.
O invólucro é de vidro, expepto a janela (não é de vidro quando é emissão UV, porque o vidro absrove
no UV) que é fundida ao invólucro.

B. Lâmpadas de descarga sem eléctrodos (edl)


- Funcionamento:
Uma pequena quantidade do metal ou sal (normalmente Arsénio ou Selénio) a ser analisado é
selado num bulbo de quartzo, que é colocado dentro de uma bobine de radiofrequência. Quando
uma potência é aplicada nessa bobine, a energia vaporiza e excita os átomos dentro do bulbo,
causando a emissão do espectro característico. O interior é preenchido com ar a baixa pressão. É
mais intensa que a LCO, sendo melhor para λ ˂ 200nme tem uma maior vida útil. Tem grande
sensibilidade

82
- Modulador (“Chopper”)
1) Disco metálico circular, rotativo, com janelas em quadrantes
alternados, deixando passar a radiação intermitentemente.
2) Vai provocar feixe intermitente, causando uma corrente alternada.
3) Ao detector vão chegar dois sinais, o que foi absorvido e o sinal
que foi enviado pela lâmpada, sendo que o detector vai detectar a
diferença entre as duas. Ou seja, o detector é sintonizado de modo
a só receber a radiação alternada, e qualquer contribuição da
chama é desprezada.
4) O detector é sintonizado para poder reconhecer radiação de acordo com a frequência gerada e evitar
interferência da chama.
5) Vê a diferença entre com lâmpada e sem lâmpada.

- Amostra:
A amostra é nebulizada, dessolvatada, vaporizada e atomizada. Os átomos do elemento em análise (do
elemento da lâmpada) vão ser os únicos a absorver a radiação emitida pela fonte. A radiação alternada não
absorvida vai ser detectada e vai ser proporcional à concentração do elemento na amostra.

- Nebulizador/Queimador para Atomização com Chama:


Possui fluxo laminar (queimador).

Interferências – Métodos para correção de interferências (matriz/chama):


• Correção com “branco” de matriz semelhante à da “amostra-problema”.
• Método da adição-padrão (já apresentado).
• Correção com fonte contínua (lâmpada de deutério) :
 Lâmpada de cátodo oco emite radiação que é absorvida pelo analito e matriz.
 Lâmpada de de deutério emite radiação que só é absorvida pela matriz.
 Pela diferença entre os 2 sinais consegue-se o sinal devido apenas ao analito.
• Correção baseada no efeito de Zeeman (desdobramento das riscas do espectro quando o emissor se
coloca na presença de um campo magnético intenso):
 Analito só absorve radiações da fonte quando esta é polarizada favoravelmente, caso contrário,
só a matriz absorve. O sistema de aquisição de dados calcula a diferença entre os dois sinais,
conseguindo-se assim o sinal devido apenas ao analito.

83
Atomizações Alternativas:
 Vapor Frio (CVAAS):
O mercúrio permite medições no estado de vapor à temperatura ambiente.
Átomos de mercúrio livres num gás inerte que os arraste são excitados por luz UV colimada e
absorvem radiação, sendo a mesma detectada.
Esta técnica não necessita de atomizador pois não é necessário a evaporização dos átomos nem a sua
atomização. E também é uma técnica simples, muito sensível e relativamente livre de interferências.

 Geração de Vapor de Hidreto (HGAAS):

 Espectrofotometria de Absorção Atómica com Geração de Hidretos – Análise por Absorção


Atómica com Geração de Hidretos:

Por acção do borohidreto de sódio, alguns elementos são reduzidos a hidretos que sendo muito voláteis vão ser
arrastados na corrente de gás inerte (hélio).
Chegando a um queimador de quartzo (em vez de chama), a temperatura aqui é elevada e o elemento é
facilmente libertado do hidreto à sua forma atómica estando em condições de absorver radiação.
Este método aplica-se a elementos que sendo relativamente voláteis, tornam o tratamento da amostra difícil
como: Arsénio, Antimónio, Estanho, Selénio, Bismuto, Chumbo.
O BH 3 e a redução dos hidretos atomizam os átomos.

Campo de Aplicação da Absorção Atómica:


Mais de 60 elementos metálicos e metalóides.
OS elementos não metálicos apresentam riscas de ressonância abaixo de 200 nm, sendo necessário uso de
espectrofotómetros de vácuo.

84
Métodos Espectroscópicos Atómicos – Fotometria de Emissão com Plasma
de Árgon (ICP)
Inductively Coupled Plasma (ICP) – Plasma de Acoplamento Indutivo:
- Plasma é uma mistura gasosa condutora de electricidade com uma significativa concentração de catiões e
electrões (as concentrações dos dois são tais que a carga total se aproxima de zero).

- Neste método, a atomização faz-se num dispositivo onde se produz o plasma, seignado por TOCHA, e não
numa chama.
Produz campo
- A tocha é o dispositivo responsável pela atomização e excitação, que leva
magnético
a emissão de radiação pela amostra.

- O plasma consegue se da seguinte forma:

 A fonte é constituída por 3 tubos de quartzo, concênctricos, através


dos quais flui uma forte corrente de árgon (entre 11 a 17 L/min.).
 Rodeando o topo dos tubos, está uma bobine de indução é arrefecida
por água e alimentada por um gerador de rádio frequência de ~2kW
de potência, que produz um campo magnético.
 A ionização inicial do árgon fluente é iniciada por uma faísca (ignitor).
Estes iões e seus electrões interagem com o campo magnético
efectuando movimentos em círculos (figura). Como consequência do
grande atrito gerado por este movimento dá-se uma grande elevação
de temperatura.

Máquinas
- Zonas do Plasma e Temperaturas de “Torch”:

85
Fotometria de Emissão com Plasma de Árgon:
A amostra é aspirada de uma forma semelhante à da fotometria de chama e é introduzida no “torch” onde se
dá a atomização, excitação e emissão de radiação.

Instrumentação em ICP (Plasma de Acoplamento Induzido):


- Podem ser de 2 tipos:

Sequencial: cada elemento é analisado por sua vez (em sequência)


Multicanal, Simultâneo: vários elementos podem ser analisados em simultâneo.

86
- Campo de Aplicação:
• Metais, Semi-metais, não metais (ex. cloreto, brometo, iodeto, enxofre).~

- Técnicas de análise em ICP (semelhantes às de outro métodos atómicos):


• Curva de Calibração
• Adição do padrão
ICP – Vantagens e Inconvenientes (em relação a outros métodos atómicos estudados):
- Vantagens da Análise em ICP:
 Baixo ruído de fundo.
 Ausência de interferência da chama.
 Por se operar a temperatura muito elevadas, menores interferências devias a:
1) Compostos muito estáveis
2) Compostos pouco voláteis
 Por se operar em meio fortemente ionizado, menor interferência devido a formação de iões do
elemento de interesse.
 Campo de aplicação mais alargado.
 Tem maior sensibilidade.
 Maior rapidez, sobretudo usando aparelho tipo “simultâneo”.

- Inconvenientes da Análise em ICP:


 Equipamento mais caro.
 Custos de operação mais elevados (custo em árgon).
 Tempo de estabilização relativamente elevado (15 minutos a 2 horas).

Métodos Espectroscópicos Atómicos – Comparação de Parâmetros:

87
Métodos Espectroscópicos Atómicos – Fluorescência Atómica
Fluorescência Atómica:
Tem o mesmo fundamento da fluorescência, mas aplicado a amostras que estão na forma atómica.
Pode haver vários tipos de fluorescência:
A. Emissão do átomo ao passar do estado excitado ao fundamental (ressonância).

O electrão pode passar a um estado de energia superior ao primeiro excitado, podendo-se verificar 2 casos:

B. Passa para este estado emitindo radiação a um maior comprimento de onda.


C. Passa do primeiro estado excitado para o fundamental emitindo radiação, também com comprimento
de onda maior que o da absorção.

O comprimento de onda da radiação emitida é característico da espécie em estudo, e a intensidade risca é


proporcional à concentração.
A intensidade da fluorescência atómica aumenta directamente com a intensidade da radiação incidente, tal
como se observa na fluorescência molecular.

Máquinas
Instrumentação:
Tem que se usar lâmpadasde alta emissão.
Temos que primeiro digerir a amostas, ou seja, retirar as substâncias orgânicas que possam existir.
Os aparelhos podem ser de dois tipos:
• Dispersivos:

• Não Dispersivos:
Não tem o orgão dispersivo, o modulador.
Não pode ser usado como fonte de radiação o laser porque se tem vários comprimentos de onda.

88
Vantagens da Fluorescência Atómica Não Dispersiva relativamente à Dispersiva:
- Vantagens:
 Maior simplicidade
 Menor custo da aparelhagem
 Maior sensibilidade (a sensibilidade e o limite de detecção do método vão depender da intensidade da
fonte)
- Para que estas vantagens se verifiquem é necessário que:
 A radiação não contenha linhas contaminantes de outros elementos.
 O atomizador não emita uma radiação de fundo significativa.

Determinação do mercúrio por CV-AFS (Cold Vapor-


Atomic Fluorescence Spectroscopy)

A atomização é feita a frio por adição de uma agente


redutor.
Os iões Hg2+ da solução vão ser reduzidos a Hg0 por acção
de uma solução de cloreto estanoso (SnCl 2 ). Os átomos de
mercúrio são arrastados por uma corrente de árgon,
passam por uma membrana secante e vão emitir
fluorescência após incidência da radiação de uma lâmpada apropriada.

Comparação da Fluorescência Atómica com os outros métodos atómicos:


 Interferências espectrais relativamente raras tal como em absorção atómica.
 Limites de deteção menores para intensidades maiores da radiação emitida pela fonte.
 Não são necessárias riscas tão estreitas como em absorção atómica (a nedição é feita a 90º da radiação
incidente).
 As retas de calibração são lineares desde o limite de detecção até 103 a 105 vezes superior. Na absorção
atómica só são até 102.
 Tal como a absorção atómica é menos dependente da temperatura da chama do que a fotometria de
chama.
 Grande sensibilidade para elementos que emitem as suas riscas de ressonância no ultravioleta, como é
o caso do mercúrio (253,7 nm).
 A aparelhagem é geralmente menos complexa do que a usada para outros métodos de chama.
 Apesar das vantagens referidas é uma técnica pouco utilizada, devido ao sucesso apresentado pelos
métodos de emissão e absorção atómica, estando muito divulgados comercialmente ao contrário deste
método.

89
Potenciometria – Introdução
Electroquímica
• Ramo da química que trata da conversão da energia eléctrica em energia química e vice-versa.
• Os processos electroquímicos envolvem reacções de oxidação-redução:

A energia libertada por reacção espontânea é convertida em electricidade é utilizada para forçar a
ocorrência de uma reacção química não espontânea.

Tipos de Métodos Eletroanalíticos

Métodos Potenciométricos
 Grandeza da medida: Força eletromotriz (fem) em função da concentração do componente em estudo.
 2 Tipos de análise:
• Medida directa de um potencial de eléctrodo a partir do qual se pode calcular a concentração de
um ião activo.
• Medida da variação da fem de uma célula em consequência da adição de um reagente titulante
(titulação).
 Células electroquímicas:
Consiste num par de condutores ou eléctrodos, normalmente metálicos, imerso numa solução de
electrólitos. Quando os eléctrodos se encontram ligados por um condutor externo (por onde fluem os
electrões), num deles ocorre oxidação (número de oxidação aumenta com a perda de electrões) e no
outro redução.
As células podem ser classificadas em:
• Galvânicas (ou voltaicas): convertem espontaneamente a energia química em energia eléctrica,
podendo fornecer essa energia a um circuito externo, ou seja, produzem eletricidade por uma
reação redox espontânea. Um exemplo é a pilha de Daniell. São sempre necessários dois eléctrodos,
um cátodo e um ânodo.
• Electrolíticas: a energia eléctrica proveniente de um gerador externo é utilizada para forçar uma
reacção química, sem essa não se dá a reacção.

90
Ânodo – Oxidação

Cátodo – Redução

 Reações de Oxidação-Redução

 Células Galvânicas ou Voltaicas


Uma célula ou pilha galvânica produz electricidade a partir
de uma reação redox espontânea.
A pilha galvânica funciona com base no princípio de que a
oxidação do zinco e a redução do cobre podem ocorrer
simultaneamente em locais separados, com transferência
de electrões através de um condutor externo.
À medida que a reacção progride, é produzido um fluxo
contínuo de electrões e, portanto, produz-se electricidade.
Por definição:
Ânodo: eléctrodo em que ocorre oxidação
Cátodo: eléctrodo em que ocorre redução

Aniões Catiões

91
e-
Ânodo – Oxidação Cátodo – Redução
Ponte salina: ligação das soluções por um meio condutor através do qual os catiões e os aniões se
podem mover. Contém um eletrólito inerte (KCl ou NH 4 NO 3 ).
A ponte salina tem como objectivos:
1) isolar as duas semi-células de modo a prevenir a reacção directa entre os iões cobre e o
eléctrodo de zinco;
2) manter a eletroneutralidade das soluções.
Células galvânicas: pilha de Daniell
O fluxo espontâneo de e- dá-se sempre do ânodo (elétrodo de Zn) para o cátodo (eléctrodo de Cu). Na
solução, os catiões movem-se na direcção do cátodo e os aniões na direcção do ânodo. O fluxo de
corrente eléctrica do ânodo para o cátodo deve-se a uma diferença de potencial entre os dois
eléctrodos.

A diferença de potencial entre o ânodo e o cátodo pode ser medida usando um


voltímetro e a leitura (volts) é chamada:

potencial de pilha ou força electromotriz (fem)

 Força Electromotriz
A força eletromotriz, ou fem., é a força eléctrica impulsionadora que empurra os electrões produzidos
na reacção do eléctrodo de oxidação de uma célula voltaica ate ao eléctrodo onde se dá a redução.
O volt (V) é a unidade SI para fem. Uma diferença de um volt na fem faz com que uma carga de um
coulomb adquira uma energia de um Joule.

1 V = 1 joule/coulomb = 1J/C
A notação convencional (IUPAC) que é utlizada para representar as pilhas galvânicas é o
diagrama de pilha.

 Diagrama de Pilha (IUPAC)

1. Os produtos da reacção devem escrever-se à direita na equação química (no caso anterior o Zn2+ e Cu).

2. A pilha deve escrever-se de modo a figurar à esquerda o eléctrodo onde se verifica a oxidação e à
direita o eléctrodo onde se dá a redução.
As barras verticais representam a interfase entre o sólido e o líquido.

 Potencias-Padrão de Redução
É impossível medir o potencial de um eléctrodo isolado, contudo pode medir-se a diferença de
potencial entre 2 eléctrodos. Se fixarmos arbitrariamente em zero o valor de potencial de um dos
eléctrodos, poderemos usá-lo para determinar os potenciais relativos de outros eléctrodos (ou seja, o
potencial é uma grandeza relativa ao potencial do eléctrodo padrão, que é o eléctrodo de H). O termo
potencial de eléctrodo (relativo) refere-se exclusivamente a semi-reacções de redução. O sinal será (+)
se a redução for espontânea e será (-) se não for espontânea (neste caso será a oxidação espontânea).

92
 Eléctrodo de Hidrogénio
Em condições padrão:
• P = 1 atm
• T = 25°C
• [HCl] = 1 M~
Constituído por um fio de platina coberto com negro de platina imerso
numa solução de HCl 1M onde vai borbulhar H 2 à pressão de 1 atm.

 E°  Potencial-Padrão de Redução
Potencial associado à reacção de redução que ocorre num eléctrodo quando todos os solutos possuem
concentração 1M e todos os gases estão a 1 atm.
O potencial-padrão de redução do eléctrodo de hidrogénio é zero.
O eléctrodo de hidrogénio é designado  Eléctrodo Normal (Padrão) de Hidrogénio (ENH ou EPH)

3. O potencial normal (ou padrão) de uma pilha (valores de redução) calcula-se subtraindo ao potencial
normal do eléctrodo da direita (cátodo), o valor do potencial normal do eléctrodo da esquerda (ânodo).

4. O potencial de um eléctrodo é considerado igual à fem de uma célula formada pela combinação do
semi-elemento de pilha que inclui o eléctrodo e de outro semi-elemento que é o eléctrodo normal (ou
padrão) de hidrogénio (por convenção = zero).
Podemos utilizar o ENH para medir os potenciais de outros eléctrodos.

93
Quando os reagentes e os produtos em condiçoes padrão, uma reacção redox é espontânea em sentido
directo, se a fem da pilha (E°) for positiva. Se for negativa, a reacção é espontânea em sentido inverso.
Por convenção, apenas se tabelam os potenciais-padrão de redução das semi-reacções.
• Os valores de E° referem-se aos potencias de meia-pilha lidas no sentido directo.
• Quanto mais positivo for E°, maior a tendência da substância para ser reduzida (melhor agente
oxidante).
• As reacções de meia-pilha são reversíveis. Qualquer eléctrodo pode funcionar com cátodo ou como
ânodo.
• E° muda de sinal sempre que se inverter a reacção da meia-pilha.
• A modificação dos coeficientes estequiométricos de uma reacção de meia-pilha, não afecta o valor de E°.
 Espontaneidade das Reações Redox

94
94
∆G0 K E0 (pilha) Reacções em condições padrão
Negativa >1 Positiva Favorece a formação dos produtos
0 =1 0 Reagentes e produtos são igualmente favorecidos
Positiva <1 Negativa Favorece a formação dos reagentes

 Equação de Nernst
A equação de Nernst relaciona a fem de uma célula galvânica e a concentração dos reagentes e
produtos numa reação de oxirredução quando as condições são diferentes das condições-padrão.

Número de
eletrões
“em jogo”

A equação de Nernst permite-nos calcular E em função das


concentrações dos reagentes e produtos, numa reação
redox.

95
Potenciométrica – Eléctrodos
Potenciométrica
Os métodos potenciométricos medem a fem de células galvânicas de tal modo constituídas, que o potencial de
um dos componentes do par electrolítico possa ser tomado como uma resposta às concentrações de espécies
iónicas presentes na solução.
Nesse sentido, as condições analíticas devem ser controladas para que a fem da célula galvânica dependa
apenas de uma única espécie iónica, a espécie em estudo.
Geralmente, na maior parte dos métodos electroquímicos utilizam-se dois eléctrodos:
• Eléctrodo indicador em cujo potencial estamos interessados (cátodo).
• Eléctrodo de referência cuja função é manter um potencial reprodutível e constante (ânodo).
A potenciometria baseia-se na medição do potencial dum eléctrodo indicador em relação a um eléctrodo de
referência, quando não passa corrente através da solução em que estão mergulhados. Esse potencial depende
das actividades das espécies que entram nas reações redox correspondentes, através da equação de Nernst.

Conceitos gerais
A potenciometria é uma técnica que se baseia na medição da fem de células galvânicas (eléctrodo indicador,
cujo potencial varia consoante a solução) relativamente a um eléctrodo de referência (potencial constante,
estável e reprodutível qualquer que seja a solução em que esteja mergulhado).
Esta técnica pode ser aplicada:
• Directamente na determinação do pH (necessita de calibração)
• Indirectamente em titulações potenciométricas (o ponto de equivalência é detectado devido à brusca
alteração do potencial do eléctrodo indicador):
 Para curvas pouco definidas recorre-se ao cálculo da 1ª e 2ª derivada.
 Apresentam a vantagem de permitirem uma determinação rigorosa do ponto de equivalência e,
por não precisarem de indicador, podem ser aplicadas a soluções muito coradas ou turvas.
 O potencial do eléctrodo indicador é consequência da concentração das espécies iónicas em
solução.
 Vantagens: sensibilidade elevada. Permite automatização.
Potenciómetro: usa-se para a determinação de potenciais das células galvânicas. É um aparelho de detecção do
ponto zero da intensidade de correte, em que o potencial desconhecido é contrabalançado por um potencial
padrão, cujo valor se conhece exactamente.
É necessário:
• Eléctrodo de referência – eléctrodo fixo.
• Eléctrodo indicador ou de trabalho – eléctrodo sensível à amostra, e seletivo.
• Dispositivo de medida do potencial (potenciómetro) – mede a diferença de potencial entre dois
eléctrodos.

96
Características ideais dos eléctrodos:
• Eléctrodo de referência: potencial constante, conhecido e insensível à composição a solução em estudo.
Potencial reprodutível e constante. É sempre o ânodo, ficando à esquerda.
• Eléctrodo indicador: resposta rápida e reprodutível, selectivo para o iao que se pretende analisar. Em
cujo potencial estamos interessados. É sempre o cátodo, ficando à direita.

Eléctrodos
Técnica electrolítica baseada na medição de potenciais desenvolvidos numa célula electroquímica, na ausência
de correntes eléctricas apreciáveis.
É necessário:
• Eléctrodo de referência
• Eléctrodo indicador ou de trabalho
• Dispositivo de medida do potencial

 Características ideias dos eléctrodos:


• Eléctrodo de referência: potencial constante, conhecido e insensível à composição da solução em
estudo.
• Eléctrodo indicador: resposta rápida e reprodutível, selectivo para o iao que se pretende analisar.

 Eléctrodos de referência
Geralmente, na maior parte dos métodos electroquímicos usa-se eléctrodo indicador em cujo potencial
estamos interessados, e um eléctrodo de referência cuja função é manter um potencial pelo menos
aproximadamente constante.
Por convenção IUPAC, um eléctrodo de referência é SEMPRE escrito como um ânodo e tem potencial
constante.

 Elétrodo normal (padrão) de


Hidrogénio
Valor e sinal do semi-elemento de
pilha: toma o valor e a grandeza que
resulta da pilha quando o semi-
elemento da esquerda (ENH) é igual
a zero.
O eléctrodo contém interiormente
uma solução de HCl (a=1) (fio de
platina está mergulhado nesta
solução hidrogeniónica), na qual vai
borbulhar o hidrogénio (muito puro)
à pressão de uma atmosfera:

O elétrodo de Pt é coberto com negro de Pt; o hidrogénio dever ser de elevada pureza; a duração
do eléctrodo é de 7-20 dias. Ao fim desse tempo deve depositar-se outra camada de negro de Pt.
O ENH usa-se principalmente para aferição de outros eléctrodos: eléctrodos de referência.
97
É um eléctrodo de referência que se pode usar com todos os elementos, permitindo calcular o
potencial de vários elementos.
 Elétrodos de Calomelanos
Constituído por uma solução saturada de cloreto de mercúrio em contacto com Hg e com uma
solução de KCl de concentração variável (0.1M; 1M; 3M e Sat.  mais comum por ser mais fácil de
preparar, mas apresenta menor rigor).

É utilizado na medida de pH, voltimétrica cíclica e electroquímica em geral em fase aquosa.


Desvantagens:
• Cl- formado pode reagir com outro electrólito formando um precipitado (por exemplo a prata)
• Cl- vai alterar a concentração de Cl- da solução em análise (pode interferir com a amostra)
Para evitar estes inconvenientes utiliza-se um eléctrodo de calomelanos modificado sempre que se
pretende um eléctrodo de referência sem iões Cl-.
• Hg | Hg 2 SO 4(sat) ,K 2 SO 4(xM)
 Eléctrodo de Prata/Cloreto de Prata
Constituído por um fio de prata (em vez de mercúrio que é volátil; deixa de ter a limitação da
temperatura e tem menor toxidade) em contacto com uma solução de AgCl saturada que contacta
com uma outra de KCl de concentração variável.

Vantagens:
• Mais fácil de construir que o anterior, também é de uso geral.
• Utilização até 250°C (Hg 2 Cl 2 80°C).
98
• Aplica-se também a soluções não aquosas.
• Menor toxicidade
 Eléctrodos indicadores

• Eléctrodo de 1ª ordem (METÁLICOS): é constituído por um metal em contacto com uma solução
contendo iões do próprio metal. Tem menor selectividade e menor
repetibilidade/reprodutibilidade.

Outros exemplos: Cu, Hg


E ind depende da atividade (ou concentração) do próprio metal.

• Eléctrodo de 2ª ordem (METÁLICOS): é constituído por um metal recoberto com um sal pouco
solúvel do metal em contacto com uma solução do anião do sal. Responde à actividade do anião na
solução. Escolhemos o eléctrodo em função do anião que queremos determinar.

• Eléctrodo de 3ª ordem (METÁLICOS): é constituído por um metal recoberto com um sal pouco
solúvel (ou um complexo fracamente ionizado) do próprio metal e um sal levemente mais solúvel
(ou um complexo levemente mais ionizado) de um segundo metal. Os sais pouco solúveis devem ter
um ião comum. Responde à actividade do ião do segundo metal.

Torna-se indispensável que HgY2- seja bastante mais estável que MY2-, o que aliás acontece num
grande número de casos. Exemplos: Ca, Mg, Co, Cu, Zn, Bi, Pb.
99
• Eléctrodos inertes (METÁLICOS): é constituído por um metal inatacável, em contacto com uma
solução contendo os estados oxidados e reduzidos de um sistema de oxidação-redução.
O metal mais usado é a platina porque não é facilmente atacado pela maioria das soluções.

O potencial do eléctrodo inerte depende da relação das actividades dos componentes do sistema
redox.

• Eléctrodos indicadores de membrana (eléctrodos específicos)

Não são eléctrodos,


mas usam-nos

Constituídos por membranas (parte final do eléctrodo) que os tornam sensíveis a determinadas
espécies da solução em análise.
Vantagens:
• Não contaminam nem destroem a amostra
• Doseamento de soluções coradas ou turvas
• Linearidade de resposta numa vasta gama de pH
Exemplos:
• Membrana de vidro
• Membrana líquida
• De precipitado ou de membrana cristalina
• Sensores para gases
• Bio-sensores

100
Cronologia do desenvolvimento dos eléctrodos de ião-selectivos:

Características das membranas:


• Solubilidade mínima – deve ser próxima de zero. As membranas são formadas por
moléculas grandes ou agregados moleculares, vidros ou resinas poliméricas.
• Condutividade eléctrica – deve ocorrer mesmo que seja baixa. A condução ocorre sob a
forma de migração de iões da membrana.
• Reactividade selectiva – a membrana deve-se ligar selectivamente ao elemento a
analisar. Podem ocorrer três tipos de ligações:
o Troca iónica
o Cristalização
o Complexação

 Eléctrodo de membrana de vidro


O mais usado é o de determinação do
pH. Os dois eléctrodos podem estar
num só tubo em bloco ou separados.
Tem que se hidratar a membrana 24h
antes de realizar leituras.
A composição dos eléctrodos de vidro
para pH é normalmente feita a partir
de silicatos com modificadores
iónicos que retardam a hidrólise do
silicato:

101
Quando se mergulha o eléctrodo em água, existe um
processo de troca iónica entre o H+ da solução externa
e o Na+ ou Li+ da membrana de vidro (troca de
hidrogeniões). Ou seja, a troca entre Na+ da
membrana e o H+ da solução provoca uma diferença
de potencial em relação ao eléctrodo de referência
externo.
O eléctrodo de vidro é constituído por um bolbo de
vidro sensível à concentração hidrogeniónica e
contém no seu interior uma solução de HCl 0,1M
saturada com AgCl.
Nesta solução está mergulhado um fio de prata
revestido de AgCl formando o elétrodo de referência
interno.
Este eléctrodo faz a ligação com o medidor de pH assim como o eléctrodo de referência
externo (fio de prata com AgCl).

Se as soluções colocadas nas duas porções separadas pela membrana tivessem as


mesmas concentrações, o potencial seria 0, considerando que ambas as faces da
membrana são iguais, no entanto isto não acontece, devido a diferenças de tensões
nas duas superfícies, número desiguais de sítios de adsorção do H+, iões estranhos
adsorvidos nessas superfícies, etc. Isso gera um potencial de assimetria que tem de
ser calibrado.
102
Um eléctrodo com o seu uso, pode criar películas, pode sofrer pancadas, entre
outros, o que altera o seu potencial.
Esquema simplificado da membrana:

O silicato de sódio, maior constituinte do vidro, pode ser hidratado, formando um gel na
superfície do vidro.

Eléctrodo de pH  Causas possíveis de erro nas leituras com o eléctrodo de vidro:


 Incerteza na calibração – Soluções tampão para calibrar
 Flutuações no Potencial de junção (resultante do contacto de 2 soluções) –
Ocorre devido à separação de cargas oriunda das diferentes mobilidades dos
iões
 Soluções fortemente alcalinas
• Erro alcalino (erro negativo) – Interferência de iões Na+
 Valores de pH muito elevados (cerca de 12) a actividade dos
iões H+ é pequena
 Podendo a actividade dos iões Na+ ser elevada
 O eléctrodo de pH começa a responder aos iões Na+

Os valores de pH medidos serão inferiores aos valores reais


 Concentração muito elevada de H+
• Erro ácido – Interferências de iões H+
 Valores de pH muito baixos (inferiores a 0,5) devido a
concentrações elevadas de iões H+

Os valores de pH medidos serão superiores aos valores reais


 Tempo de equilíbrio
 Temperatura
 Contaminações – apesar de a membrana ser muito selectiva, iões monovalentes
vão induzir erros.
Elétrodos específicos de membrana de vidro (com ≠ composições) para os seguintes iões
(além do H+): Na+, K+, NH 4 +, Rb+, Cs+, Li+, Ag+, sendo alguns bastante selectivos. Também
existem eléctrodos de membrana de vidro que são sensíveis para diferentes iões, ao
mesmo tempo.
O seu funcionamento é semelhante ao anterior.
Coeficiente de seletividade
Constitui um índice da capacidade do eléctrodo para medir determinado iao em
presença de outro. Ou seja, é a capacidade do eléctrodo para medir determinado ião na
presença de outro.
Nos eléctrodos de membrana líquida ou de vidro dá-se interferência quando o ião
estranho penetra na membrana competindo com o ião a medir.
Normalmente os elétrodos respondem a vários iões, sendo que quanto menor o
coeficiente de selectividade, melhor é a selectividade.

103
 Eléctrodos de membrana líquida
Respondem a determinados iões em solução, devido ao potencial
que se estabelece na interface da solução aquosa a ser analisada e
do composto no estado líquido incorporado no eléctrodo, que se
liga selectivamente ao ião a determinar por um mecanismo de
troca-iónica.
Membranas líquidas:
• Permutador iónico
• Composto quelantes macrocíticos que complexam certos
catiões selectivamente.
O composto orgânico em causa contém grupos funcionais ácidos,
básicos, ou quelantes, e deve ser imiscível com a água e não volátil.
Ex: eléctrodo para a determinação do Ca2+

Outro ex:
K+  O eléctrodo contém um antibiótico, a valinomicina, que forma um quelato com o ião
K+ na membrana. Interiormente está uma solução de KCl.
Memb. Líquida  Memb. Sólida (matriz polimérica de cloreto de polivinil dissolvido em
THF que é depois evaporado)

 Eléctrodos de precipitado ou de membrana cristalina


Estes eléctrodos de membrana de estado sólido, podem
permutar iões com carga e raios iguais, ou semelhantes aos
da rede cristalina.
Eléctrodo para medição de fluoreto: a membrana sólida é um
cristal de fluoreto de lantânio, com um pouco de európio (II),
para baixar a resistência eléctrica e facilitar o transporte de
iões. No interior está um eléctrodo de referência Ag/AgCl,
imerso em cloreto de sódioe fluoreto de sódio (geral/0,1 M).
Eléctrodo de I-: a membrana sólida é um cristal de AgI. No
interior está um eléctrodo de referência Ag/AgCl, imerso
numa solução de AgI (geral/ 0,1 M).
Eléctrodos de membrana sólida (outros exemplos):
• Cu(II): membrana cristalina de Ag 2 S com ião Cu(II)
• Cd(II): membrana cristalina de Ag 2 S com ião Cd(II)
• Pb(II): membrana cristalina de Ag 2 S com ião Pb(II)
Dispersão no Ag 2 S de outro sulfureto metálico, por
exemplo, CuS, CdS ou PbS, obtém-se o eléctrodo
selectivo do correspondente metal.

 Sensores para gases


São moléculas electroquímicas com um eléctrodo específico para um dado ião e um
eléctrodo de referência, imersos numa solução interna, separada da solução a analisar por
uma membrana permeável às moléculas gasosas de um determinado composto (entre o
eléctrodo específico e o eléctrodo de referência está uma mebrana permeável às moléculas
gasosas).
104
Ex: sensor para a determinação do CO 2 , NO 2

O equipamento para a determinação do oxigénio baseia-se em


medidas voltamétricas e não potenciométricas.
Sensor para a determinação de CO 2 :
Eléctrodo de pH (eléctrodo de membrana de vidro sensível ao
pH) envolvido por uma membrana permeável (porosa) ao CO 2 .
À medida que o CO 2 passa através da memebrana e se dissolve
em solução, o pH vai variar.
A variação do pH é uma medida indirecta da concentração de
CO 2 .

 Bio-sensores
Consiste num módulo com um sensor biológico com actividade catalítica (enzimas,
organismos) ou reacções de afinidade (anticorpos, receptores celulares) em íntimo contacto
com um transdutor físico. Este converte o sinal química num sinal eléctrico.
São dispositivos que combinam a selectividade de reacções catalisadas por enzimas com
transdutores electroquímicos para a determinação de compostos com interesse biológico e
bioquímico.
Transdutores mais comuns: eléctrodos de membrana, sondas sensíveis a gases, dispositivos
voltamétricos.

Reconhece e
interage com
o analito

Atividade catalítica
Mede alteração

O elemento biológico ou o elemento sensor tem a propriedade de reconhecer


selectivamente e interagir com o analito.
A interacção resulta na alteração de uma ou mais
propriedades físico-químicas (pH, trasnferências de
electrões, variação de massa, tranferência de calor,
libertação de gases ou iões) que são detectadas e
medidas pelo transdutor.
Estes dispositvos são capazes de detectar
rapidamente espécies químicas e/ou biológicas
(analito), tanto quantitativa com qualitativamente.
Os bio-sensores electroquímicos podem ser de três tipos:
• Amperométricos
• Condutimétricos
• Potenciométricos
Um bio-sensor deve apresentar as seguintes características:
• Boa estabilidade
105
• Rápido tempo de resosta
• Boa selectividade
• Baixo limite de detecção
• Boa exactidão
Normalmente é dispensado o elaborado tratamento de amostra e necessita de um consumo
mínimo de reagentes.
Aplicações: Saúde, Indústria alimentar, Monitorização ambiental, Indústria de
fermentações.

Bio-sensores ponteiométricos: as enzimas são imobilizadas num eléctrodo de pH devido à


conversão enzimática é proporcional à concentração do analito.
Vantagens: moléculas orgânicas complxas podem ser determinadas, biocatalisadores
permitem que as reacções ocorram em condições suaves, combinação da selectividade da
reacção enzimática com a resposta do eléctrodo evita interferências.
Desvantagens: alto custo das enzimas, duração do bio-sensor.
Neste exemplo (eléctrodo de ureia), um eléctrodo normal de pH é revestido com um gel
impregnado de uma enzima; urease. A ureia penetra no gel, onde a enzima a degrada,
resultando na formação de amónio. A alteração no pH é medida.
Outros exemplos são os usados para a determinação da glucose, lactose e sacarose.

106
Condutimetria
Condutimetria
Mede a condutância de uma solução iónica (importante haver iões, sendo que quanto maior é o número de
iões, maior é o efeito). A condução da electricidade através das soluções iónicas deve-se à migração de iões
positivos e negativos durante a aplicação de um potencial de corrente alternada. A condutância vai depender do
número de iões presentes na solução, das suas cargas e das respectivas mobilidades. A condutância de uma
solução é a soma das condutâncias de todas as espécies iónicas, presentes na solução. Logo é um método nada
seletivo.

Condutância
• Propriedade aditiva
Depende do número de iões por unidade de volume
• Não é específica
e da velocidade com que cada um destes iões se
• Aplicação limitada
move
• Elevada sensibilidade
Condutividade eléctrica de uma solução:
Medida da maior ou menor facilidade de passagem de corrente eléctrica numa solução, através da migração de
iões.
C = 1/R
R = V/1

A intensidade de corrente que atravessa uma solução é inversamente proporcional à resistência para um
potencial V fixo (↑intensidade → ↓ resistência).

Resistência, Condutância, Resistividade e Condutividade

Análise condutimétrica
• Condutimetria Directa
 Medida direta da condutividade.
 É necessário a determinação da constante da célula e é necessário calibrar o aparelho.
 Análise muito rápida e sensível.

• Condutimetria Indirecta ou Titulações Condutimétricas

107
 Não é necessário determinar a constante da célula nem calibrar, pois as leituras são
relativamente ao composto amterior/inicial e o pH varia ao longo do tempo, respetivamente.
 Número de pontos reduzido, titulações rápidas.
 Maior precisão do que a análise condutimétrica directa.
 A exactidão e a precisão são determinadas pelo equipamento utilizado e pelo ângulo entre duas
rectas.
 Análise relativa – Medida da condutância do eletrólito à medida que adicionamos titulante.
 Os pontos próximos do ponto de equivalência (muitas medições perto do PE) têm pouco
interesse, ao contrário do que acontece com uma titulação potenciométrica, pois o PE é a
intersecção entre as retas em vez do salto brusco da potenciometria.

Constante da célula

Para calcularmos a condutividade é necessário um cálculo utilizandp o valor da condutância dada pelo
condutivímetro.
Tabela da condutividades da solução de KCl 0,1N

Condutividade e concentração: A condutividade aumenta com a concentração. No entanto a elevadas


concetrações começa a diminuir devido às interacções iónicas.

108
Condutância Equivalente
Para um mesmo electrólito a condutância específica varia com a diluição.
Condutância equivalente: Condutividade de uma solução hipotética que contém 1 equivalente-grama de soluto
por cm3
Ou
Condutância entre dois eléctrodos planos à distância de 1cm e com uma área tal que contêm 1 equivalente-
grama de substância entre eles qualquer que seja a concentração.

Negro de platina – impede


a polarização da platina e
aumenta a área

Condutivida da solução Constante da célula (S.cm-1)

Siemen – unidde de condutância

109
Lei da Migração Independente dos Iões (Kohlrausch)
Cada ião contribui com uma quantidade definida para a condutância total de um electrólito. Ou seja, cada ião
consegue-se mexer independentemente dos outros iões.
Em diluição infinita, independentemente da natureza do outro ião.

Condutâncias equivalentes em diluição infinita de alguns iões, a 25°C

↑Iões e ↑Temperatura

↑Condutividade

O H+ e o OH- apresentam
grande mobilidade, logo
vão ter grande importância
na condutância.

Variação das Condutâncias Equivalentes em Função da


Concentração
A condutância equivalente aumenta à medida que diminui a concentração
porque:
• Electrólitos fracos – aumenta o grau de ionização.
• Electrólitos fortes – maior liberdade dos iões.

 Cálculo da condutância equivalente limite de electrólitos fracos e fortes


• Electrólitos fortes: A condutância equivalente limite pode ser medida por extrapolação directa, quando
C  0. É uma medida da condutância equivalente quando as forças inter-iónicas são desprezáveis.
• Electrólitos fracos: A condutância equivalente limite não pode ser medida por extrapolação directa,
devido à grande variação da condutância equivalente para baixas concetrações. Aplica-se a Lei da
migração independente de Kohlraush: Partindo do conhecimento do valor da condutância equivalente
para electrólitos fortes é possível calcular o valor da condutância equivalente para electrólitos fracos.
Exemplo: ácido propanóico (CH 3 CH 2 COOH)

110
 Cálculo da condutância equivalente limite de electrólitos fracos
Exemplo: ácido acético (CH 3 COOH)

Titulações Condutimétricas Ácido-base


Para determinar a concentração de um ácido ou de uma base, mede-se a variação da condutância após várias
adições, respectivamente, de uma base ou de um ácido de concentração conhecida.
Tem como vantagem o facto de precisar de poucos pontos para se obter uma curva de calibração.
Nos meios fortemente ácidos ou fortemente tamponeaods, são os iões mais fortes que definem a condumetria.
Na titulação redox não se usa condumetria porque, logo a partida, há muitos eletrólitos, logo há muito ruído de
fundo ao início, senod que é difícil ver a variação.

H+ tem uma grande


condutividade
iónica.
H+ reage com o OH- PE

111
Determina-se a linha do sal medindo um volume de H 2 O igual ao volume de solução ácida. Titula-se o volume
de H 2 O com uma solução do sal (de sódio ou potássio) respectivo, com a mesma concentração da base
previamente usada.
A linha de sal é usada quando é difícil visualizar o PE de uma titulação com um ácido fraco.
Liha de sal: Na determinação do Pe na titulação de um ácido medianamente fraco, nem sempre é fácil de ver
onde é o PE pois o gráfico parece um curva. A linha de sal é uma reta obtida medindo um volume de H 2 O igual
ao volume de solução ácida titulada e titula-se esse volume de água com uma solução do sal respetivo com a
mesma concentração da base previamente usada. A interseção entre a titulação do ácido e da água vai dar o PE
se o ácido é muito fraco, a secçãoda curva extamente antes do PE será retilínea porque coincidirá com a linha
do sal.

Titulações Condutimétricas de Precipatação

Há a formação de
um precipitado.

Quanto menor for KS


(produto de
solubilidade), mais
bem definido e
visível fica o ponto
de equivalência e a
reta (inclinação)

112
A exactidão depende de:
• Velocidade de formação do precipitado
• Pureza do precipitado
• Produto de solubilidade do precipitado
Ps ≈ 10-12 Ponto de equivalência nítido
Ps ≈ 10-6
Ponto de equivalência arredondado
Ps ≈ 10-5 Deve-se adicionar álcool

Efeito de Diluição
• Compensação por correcção da condutância observada

• Utilização de titulante pelo menos 10 vezes mais concentrado do que o titulado


• Utilização de um inicial elevado
• Utilização de microburetas de modo a aumentar a precisão e exactidão do método

Células Condutimétricas

a) Célula de imersão (constantes de 0,5 a 2)


b) Células de fluxo contínuo (constantes de 0,01 a 0,2)
c) Células de enchimento, que recebem a amostra no seu interior e podem ser mergulhadas num banho
termostático

Aplicações das Medidas Condutimétricas


• Determinação da pureza de diferentes tipos de água
• Medição da salinidade da água do mar em oceanografia
• Localização de pontos de equivalência em titulações, com excepção das redox
• Análise de reacções em que se formam iões
• Determinação da concentração de electrólitos fortes
• Determinação de grandezas físico.químicas, como produtos de solubilidade e constantes de ionização

113
Doseamento da água pelo método de Karl Fischer
A titulação Karl Fischer é provavelmente o método analítico mais usado para aferir o teor de água (humidade)
em solventes e outros produtos, incluindo produtos farmacêuticos. Sabe-se, por exemplo, que produtos como
queijo, manteiga, leite em pó, mas também papel, plásticos, petróleo são analisados por este método.

Fischer procurou tornar a reacção anterior completa no sentido directp, tendo para isso adicionado piridina,
com o objectivo de fixar o ácido.
Estudos posteriores revelaram: Piridina não está envolvida directamente na reacção, tem apenas poder
tampão, podendo ser substituída por outras bases (imidazol p. ex.).
Eugen Scholz (1984) desenvolveu um reagente de Karl-Fischer livre de piridina tendo imidazol como base,
confirmou que:
1. O metanol toma parte na reacção
2. A formação de metilsulfito

A velocidade de reacção de Karl Fischer depende do pH do meio (4-8)

pH < 4  Velocidade da reacção muito lenta


pH > 8  Velocidade da reacção muito rápida, mas ocorrem
reacções secundárias

Solventes mais comuns Tipos de amostras


Metanol Solventes: tolueno, dioxano, álcoois
Produtos orgânicos/farmacêuticos: ureia, ácido salicílico
Alimentos: mel, iogurtes, bebidas
Cosméticos: cremes, emulsões, sabonetes
Clorfórmio Produtos da petroquímica: crude, óleo hidráulico
1-decanolhexanoldodecanol Produtos da petroquímica: gasolina, diesel, kerosene
Produtos farmacêuticos: cremes gordos
Tolueno Ceras, supositórios
Formamida Produtos açucarados: geleias, caramelos, compotas
Alimentos com amido: farinhas, cereais, batatas fritas

114
No caso de aldeídos e cetonas:

O metanol foi substituído por álcoois halogenados (trifluoretano) e posteriormente por glicóis e álcoois de
cadeia longa.

Titulação volumétrica com reagente KF: são titulados mg de água.


Detecção do ponto final: no ponto final da titulação, com o consumo total da água, ocorre a presença de um
ligeiro excesso de iodo (titulante) que causa a passagem de corrente ou diminuição da resistência entre os 2 fios
de platina do eléctrodo.

Mede-se a voltagem necessária para manter a corrente constante.

Amostra Interferência Resolução


Aldeídos Acetias e Cetais Não usar metanol: álcoois halogenados
Cetonas
Forte pH >> 7 Aminas: neutralizar com ácido acético ou benzóico
alcalinidade Óxidos, hidróxidos e carbonatos metálicos: tratar
com HCl e descontar a água formada
Ácido fórmico; pH << 5 Neutralização com solução etanólica de imidazol
Ácidos fortes
Substâncias oxidantes (cromatos, dicromatos, sais de cobre (II)) e redutoras (hipossulfito,
sais de estanho (II), sulfuretos) são incompatíveis com o reagente de Karl-Fischer

115
É um método muito sensível, rigoroso e preciso que consiste na titulação da água da amostra com iodo. Tem
como desvantagem necessitar da aferição do título do reagente no ínicio de cada trabalho, o que se faz com
uma substância com uma quantidade de água conhecida e constante (por exemplo, o tartarato de sólido
dihidratado).
Padrão de aferição: Tartarato de sódio dihidratado 15,66 ± 0,05% H 2 O
p = peso do tartarato em mg
a = ml de solução KF consumidos
% água na amostra = a. t. 100/p

Volumetria:
 Reagentes:
• Reagente T (titulante)  solução metanólica de iodo
• Reagente S (solvente)  SO 2 + base (imidazol)
 À medida que se adiciona o iodo, este vai reagir com a água. Quando toda a água tiver sido consumida, o
I 2 acumula-se ficando presente em solução I 2 e I- o que leva à passagem de corrente (detectada por
bipotenciometria)
 Reacções:
• SO 2 + MeOH + B  MeSO 3 - + HB+
• MeSO 3 - + H 2 O + I 2  MeSO 4 - + 2HB+ + 2I-
 Iodo  castanho
 Iodeto  incolor
 O metal é solvente mas também reage
• Assim, a titulação termina com o aparacimento de coloração persistente (excesso de iodo em solução
quando termina a água) ou com a passagem de corrente eléctrica entre 2 eléctrodos.
• Para aldeídos e cetonas, o metanol não pode ser solvente pois reage com o carbonilo, formando água.
Este é substituído por álcoois halogenados ou de cadeia longa.
• A humidade do ar pode contaminar o reagente, é por isso necessária aferir o título do reagente antes
de cada utilização. Para tal adiciona-se ao reagente uma dada quantidade de tartarato de sódio
dihidratado, que funciona como padrão de aferição por ter uma quantidade fixa de água 15.66% +/-
0.05% (15.66g de H 2 O por 100g de tartarato).
• Susbtâncias oxidantes (cromatos, dicromatos, sais de cobre (II)) e redutoras (hipossulfito, sais de
estanho (II), sulfuretos) são incompatíveis com o reagente de Karl-Fischer.

116
Técnicas de Preparação de Amostras
O Processo Analítico
As técnicas de preparação de amostras aqui apresentada podem ser aplicadas a qualquer método de análise.
O processo analítico é um ciclo.
A análise, normalmente, não pode ser direta, logo temos de preparar a amostra, sendo que esta pode ser
demorada.

A Preparação de Amostras
A preparação de amostras pode incluir vários passos:
 Extração
 Limpeza ou fraccionamento
 Concentração
 Derivatização
O tempo dispendido na preparação da amostra pode atingir 80% do tempo analítico total.
Na preparaçãp de amostras o objectivo é retirar os analitos com interesse da matriz da amostra, numa forma
mais adequada para a sua introdução no sistema cromatográfico ou outro método analítico. Faz-se uma análise
direta quando os teores são significativos. Mas quando os teores são vestigiais, faz se um enriquecimento
prévio.
As técnicas de preparação de amostras podem ser classificadas de duas formas:
 Classificação temporal:
• Técnicas clássicas
• Técnicas modernas
 Classificação tendo em conta o meio:
• Amostras gasosas
• Amostras líquidas
• Amostras sólidas

117
Preparação de Amostras – Técnicas de Preparação Convencionais ou Clássicas:
 LLE – Liquid-Liquid Extraction (Extração Líquido-Líquido)
Técnica utilizada nas últimas décadas no enriquecimento de
compostos orgânicos semi-voláteis.
Baseia-se na distribuição ou partição dos analitos entre a fase aquosa
onde normalmente se encontram e uma fase orgânica imiscível.
Para recuperar os analitos e ganhar em sensibilidade, parte-se de
volumes consideráveis de amostra (0,1 a 2L) para finalizar com
pequenos volumes de solvente orgânico (5 a 100ml).
São vulgarmente executadas extracções sucessivas com solvente
orgânico.
Decantação
Desvantagens:
-É necessário um passo de concentração;
-Elevado tempo dispendido;
-Consumo excessivo de solventes orgânicos tóxicos.

 SPE – Solid-Phase Extraction (Extração em Fase Sólida)


Técnica vulgarizada para extracção, concentração e limpeza dos analitos presentes em diversos tipos de
matrizes.
Baseia-se nas propriedades adsorptivas das superfícies sólidas
Ocorre transferência do analito para uma fase sólida, disco (tamanho de partícula é menor, o que
permite uma maior capacidade de retenção) ou cartucho (de polipropileno ou de vidro), que adsorve,
ou seja, a amostra passa pelo enchimento.
No disco ou cartucho introduz-se a amostra e elui-se com um primeiro solvente (coloca-se primeiro a
amostra e só depois o solvente), promovendo a saída das impurezas. Aplicando-se um segundo eluente,
o analito adsorvido pela fase estacionária é agora recolhido (retira o analito).
Enchimentos sólidos:
• Apolares – octadecil, octil, fenil, etc;
• Polares – cianopropil, diol, etc;
• Troca-iónica – trimetilaminopropil, carboximetil, etc;
• Adsorção – sílica-gel, florisil, etc;
• Covalentes – ácido fenilborónico.
Há dois formatos de dispositivos para esta técnica:
• Em cartuchos de polipropileno ou de vidro. Cartuchos diferentes usam solventes
diferentes. Não devemos lavar enquanto colocamos a amostra no cartucho.

+ capacidade
de retenção

• Em discos - neste caso o tamanho de partícula é menor, o que permite uma maior
capacidade de retenção.
É uma técnica selectiva e sensível, que combina a extracção com a limpeza e concentração.
É rápida, permite automatização e consoem pouco solvente.

118
A SPE é uma técnica:
• Muito poderosa – apresenta boa selectividade e sensibilidade
• Muito versátil – Combina exerção com limpeza e concentração
• Relativamente rápida e pouco onerosa
• Possibilita automatização on-line
Principais passos:

Extração em fase sólida:


Cromatografia em coluna

1. 2. 3. 4.

 LSE ou Soxhlet – Liquid-Solid Extraction (Lixiviação com solventes orgânicos)


O solvente é aquecido e vaporizado, condensando e caindo sobre a amostra,
por outras palavras, o solvente é aquecido e o vapor sobe, ao chegar ao
cimo, começa a gotejar para o cartucho que contém a amostra.
Coloca-se, constantemente, solvente limpo em contacto com a amostra. Destilação
Os analitos são lixiviados, ficando retidos à superfície do enchimento,
Fracionada
regressando o solvente ao balão de enchimento.

Comparação das técnicas LLE e SPE


LLE – Decantação SPE – Cromatografia
 Manipulação do analito várias vezes  Manipulação do analito apenas uma vez
 Tempo médio de extracção: ordem de  Tempo médio de extracção: ordem de
grandeza hora grandeza minuto
 Volume aproximado de solvente orgânico:  Volume aproximado de solvente orgânico:
ordem de grandeza centenas de mL ordem de grandeza dezenas de mL
 Aplicação restrita  Aplicação muito diversificada
 Não permite automatização  Pode ser automatizada permitindo preparar
 Ao agitar a ampola com a fase orgânica dezenas de amostras simultaneamente
podem formar-se emulsões, que são difíceis  Não formar emulsões
de remover  Mais rápida e de fácil execução
 Exata e precisa
 Consome quantidades pequenas de
solventes orgânicos
 Não necessita de material de elevado custo
 Tem bons níveis de recuperação

Nos últimos anos a SEP, por ser mais vantajosa, tem vindo a substituir a LLE.
119
Preparação de Amostras – Novas técnicas de Preparação por Extração Sorptiva
(Métodos Adsortivos):
 SPME – Solid-Phase Microextration (Micro-Extração em Fase Sólida)
SPME – Fibra
SPME foi introduzida no início da década de 90 por j.Pawliszyn.
A quantidade total do polímero participa no processo, enquanto que na SPE (extracção de fase sólida)
os analitos são retidos na superfície do enchimento.
Na extração sorptiva os analitos são extraídos de uma matriz líquida ou gasosa, para um polímero
líquido imiscível. Ocorre a transferência do analito da matriz da amostra para a película de revestimento
da fibra. A agulha perfura o septo da cápsula com a amostra, colocando-se a fibra em contacto com a
amostra (líquida ou gasosa). Os analitos são então retidos pelo polímero da fibra. Por outras palavras,
põem-se um polímero em contacto com a amostra (líquida ou gasosa), que vai se ligar aos analitos.
Dentro da agulha sai uma fibra, onde se encontra o polímero (revestimento da fibra, tem que ser bem
escolhido) que vai reagir com o analito.
A principal vantagem da SPME é o bom desempenho analítico, combinado com a sensibilidade e relativo
baixo custo.
A SPME produz extractos relativamente limpos e concentrados, ideais para aplicação em espectrometria
de massa.
A SPME é uma técnica de equilíbrio na qual os analitos Porque queremos analisar
sofrem uma partição entre o revestimento da fibra e a um analito volátil
matriz da amostra.
Conforme a amostra seja líquida ou gasosa, assim a fibra
é colocada no interior da solução ou fica no espaço de
cabeça, como se mostra nesta figura.
A eficiência da extracção vai depender:
• Características da fase de revestimento

Fibra revestida com uma


fase extratora que pode
extrair diferentes tipos de
analitos

• Polaridade dos analitos


• Volume da amostra
• Temperatura da amostra
• Tempo de extracção
• Velocidade de agitação
• pH
• Força iónica
A grande limitação da técnica de SPME é o facto da quantidade do material polimérico envolvido ser
muito pequena. Para a fibra mais vulgarmente utilizada, 100 µm em PDMS (Polidimetilsiloxano), o
correspondente volume é de cerca de 0,5 µL. A eficiência da extracção pode ser comprometida devido a
esta limitação (Limite da quantidade de analito extraído).

120
 SBSE – Stir Bar Sorptive Extration (Extração Sorptiva em Barra de Agitação)
SBSB – Barra
SBSE foi proposta no final dos anos 90.
Ocorre a transferência do analito da matriz da amostra para o polímero que reveste o agitador
magnético.
A principal diferença desta técnica em relação à anterior baseia-se no volume de PDMS da barra ser
substancialmente superior (24 e 126 µL) ao volume de PDMS da fibra (0,5µL), ou seja, consegue extrair
maiores quantidades de analito.
A maior relação de fase entre a matriz da amostra e o PDMS, aumenta a capacidade extractiva e,
portanto, a sensibilidade – SBSE tem uma sensibilidade 50 a 250 vezes maior do que SPME.
Temos maior volume de fase extratora + barra de agitação magnética revestida com PDMS
(Polidimetilsiloxano), tendo como consequências:
• Significativamente maior
quantidade de PDMS do que por
SPME
• Sensibilidade significativamente
maior do que por SPME
• Extração eficiente, melhorada
pela agitação
• Técnica bastante robusta
• Possibilidade de adaptação a sistemas
automáticos, tal como a SPME

 A selecção da técnica de extração sorptiva vai


depender de:
• Matriz da amostra
• Volatilidade dos analitos
• Solubilidade dos analitos, etc.

 Quechers – Extração em Fase Sólida Dispersiva


Quick, Easy, Cheap, Effetive, Rugged, Safe
Amostra vai directamente para o cartucho sem passar pelo enchimento,
É um método de preparação de amostra que apresenta várias vantagens.
Tem sido muito explorado na análise de estígios de pesticidas.
Baseia-se nos seguintes passos:
• Extração/Partição – com adição de um solvente orgânico
• Limpeza :
 SPE dispersivo
 PSA
 ENVI-Carb
 DSC-18

Preparação de Amostras
 Técnicas de preparação  Técnicas de preparação  Técnicas de preparação
de amostras gasosas: de amostras líquida: de amostras sólidas:
• SHS • LLE • LSE
• DHS • SPE • SFE
• SPME • SPME • ASE,
• HSSE • SBSE • MASE
• QuEChERS • EU
• QuEChERS

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Técnicas de Preparação de Amostras Gasosas:
 SHS – “Static Headspace” (Espaço de cabeça estático)
A amostra é aquecida num frasco fechado e uma amostra da atmosfera à volta da
amostra é removida e usada em GC. Por outras palavras, a amostra é recolhida e vai
logo para o cromatograma.

 DHS – “Dynamic Headspace” ou “Purge & Trap” (Espaço de cabeça dinâmico)


Usa um fluxo de gás que vai arrastar a amostra gasosa constantemente em vez de
permitir o equilíbrio entre o estado líquido e o estado gasoso. A amostra é
aquecida e a sua atmosfera constantemente removida através de uma “ratoeira”,
aumentando a quantidade da amostra e, assim, a sua sensibilidade.
Por outras palavras, fazemos borbulhar o gás inerte, que vai levar a amostra atrás
até uma “ratoeira”. Aquecendo a “ratoeira”, a amostra volátil vai para o
cromatograma.

 SPME – “Solid Phase Micro Extraction” (Micro-Extrção em Fase Sólida)


 HSSE – “HeadspaceSorptive Extration” (Espaço de cabeça com Extração Sorptiva)

Técnicas de Preparação de Amostras Líquidas:


 LLE – “Liquid-Liquid Extraction ” (Extração Líquido-Líquido)
 SPE – “Solid Phase Extraction” (Extrção em Fase Sólida)
 SPME – “Solid Phase Micro Extraction” (Micro-Extrção em Fase Sólida)
 SBSE – “Stir Bar Sorptive Extraction” (Extração Sorptiva em Barra de Agitação)
 QuEChERS – Extração em Fase Sólida Dispersiva

Técnicas de Preparação de Amostras Sólidas:


 LSE ou Soxhlet – “Liquid-Solid Extraction ” (Lixiviação com Solventes Orgânicos)
 SFE – “Supercritical Fluid Extractio” (Extração super-crítica)
Separar amostras da matriz usando fluidos supercríticos como extractor.
A alteração fácil das propriedades de fluidos supercríticos permite maior selectividade e a capacidade
de difusão é maior em fluídos supercríticos, aumentando a velocidade.
O solvente supercrítico tem características de líquido e de gás.
 ASE – “Accelerated Solvent Extraction” (Extração por Solventes Acelerada)
↑Temperatura da amostras → ↑Pressão → Processo Acelerado.
 MASE – “Microwave-Assisted Solvent Extraction” (Extração Assistida por Microondas)
 UE – “Ultrasonic Extraction” (Extração Ultra-sónica)
Para rebentar as membranas.
 QuEChERS – Extração em Fase Sólida Dispersiva

122
Derivatização
O principal objetivo da derivatização consiste na transformação química do composto a analisar, de modo que
seja mais adequado ao método analítico seleccionado. É um passo que deve, sempre que possível ser evitado,
pois encarece o processo de preparação da amostra. Quando usado, é porque não conseguimos analisar de
outra forma.
 Converter um composto noutro mais estável
 Aumentar a volatilidade e/ou reduzir a polaridade
 Melhorar a eficiência da extracção, selectividade e detecção
 Aumentar a sensibilidade do método
A derivatização não é um processo de preparação de amostra de primeira escolha. Normalmente está associado
a outro(os) processo(os) de preparação, podendo ocorrer em simultâneo, antes ou após.
Existe uma grande variedade de produtos de derivatização, sendo a sua selecção feita de acordo com os
compostos ou grupo de compostos a serem derivatizados.
Representação esquemática da automização do método SPME incorporado num cromatógrafo com posterior
derivatização.

Automatização do método SBSE para posterior aplicação em LC e GC-MS

123
Métodos Cromatográficos – Introdução aos Métodos
Cromatográficos
Introdução aos Métodos Cromatográficos

Nos métodos cromatográficos ocorre a separação dos componentes de uma mistura devido à diferente
afinidade desses componentes para duas fases em presença:
Fase Estacionária e Fase móvel
No processo cromatográfico, os analitos da amostra são transportados por intermédio de uma fase móvel
através de uma fase estacionária imiscível, num processo denominado eluição.
A cromatografia tem como objetivo:
 Separação – dos componentes da amostra devido as diferentes afinidades entre esses componentes e
as fases móvel e estacionária
• Analítica – pequenas amostras (para quantificação de um dado analito)
• Preparativa – grandes amostras (recolha de todos os analitos separados)
 Identificação – através do tempo de retenção desses componentes (comparação com um padrão) ou
com a ajuda de um espectrofotómetro de massa.
 Quantificação – através da área do pico, que é directamente proporcional à concentração desse
componente na amostra.
Devido as várias possibilidades que a cromatografia permite, torna-a um método com grande potencialidade e
extremamente completo.
A cromatografia pode ser de fase gasosa ou de fase líquida, consoante a fase móvel seja um gás ou um líquido,
respectivamente.
Existe uma grande variedade de detetores em função dos compostos que queremos analisar.
Vamos ter duas fases, uma fase dizemos que é estacionária porque ela está imóvel (coluna, papel, placa de TLC)
e vamos ter uma fase que vai percorrer a fase estacionária e que vai arrastar os nossos compostos de formas
diferentes, possibilitando a separação – fase móvel.
Em função dos meus analitos e em função das fases que vou utilizar, posso ter diferentes tipos de
cromatografia, sendo que para os diferentes tipos de cromatografia, existem colunas diferentes e temos de
escolher o tipo de separação em função dos analitos que a nossa amostra possui.

Tipos de Cromatografia
Atendendo à natureza da fase móvel, a cromatografia pode ser classificada como:
 Cromatografia de Fase Gasosa
 Cromatografia de Fase Líquida
 Cromatografia de Fluido supercrítico – um equilíbrio entre as características de um gás e de um líquido,
ou seja, difunde-se tão bem como um gás, mas tem as propriedades de solubilidade de um líquido.

Atendendo ao equipamento utilizado (modo físico como a fase estacionária contacta com a fase móvel),
podemos falar em:
 Leito aberto – não é coluna
• Cromatografia Papel
• Cromatografia de Camada Fina (TLC)
 Coluna
• Cromatografia Clássica – em coluna de enchimento – temos uma amostra e colocamos no cimo
da coluna, depois coloca-se um solvente.
• Cromatografia de Alta Eficiência (HPLC)
• Cromatografia Gasosa

124
Atendendo à natureza do Equilíbrio Químico, ou seja, as interações entre o soluto e as fases móvel e
estacionária, podemos ter:
 Cromatografia de Partição:
Fase móvel e estacionária são líquidas.
Os analitos solubilizam-se entre as duas fases, consoante a afinidade
para cada uma delas.
Das mais utilizadas.
O soluto dissolvido liga-se à superfície da coluna.
Na parede interna da coluna vai estar a minha fase estacionária (que
pode ser ou não líquida) e a fase móvel. Supondo que a fase móvel é
gasosa e a fase estacionária é líquida, os meus analitos vão
apresentar uma partição diferente entre as duas fases em função de
serem mais solúveis numa fase ou noutra, terem mais afinidade
para uma fase ou para outra.
Se ficarem retidos na fase estacionária, quer dizer que vão demorar
mias tempo a serem arrastados e a serem detetados pelo detetor do
que outro analito que não tenha qualquer interacção com a fase
estacionária.

 Cromatografia de Adsorção :
Fase móvel é um líquido ou gás e a estacionária é um
sólido.
Os analitos são mais ou menos adsorvidos pela fase
estacionária.
Soluto é adsorvido à superfície da fase estacionária.
A fase estacionária tem características adsorventes em
relação a um determinado analito e que se adsorve,
significa que o analito vai ficar ligado na superfície da fase
estacionária.

 Cromatografia de Permuta (iónica ou de ligandos):


Na cromatografia de permuta iónica, têm se uma fase móvel líquida e
uma fase estacionária sólida.
A fase estacionária encontra-se carregada, estabelecendo interações
eletrostáticas com os analitos de carga oposta.
Quanto maior dor a carga oposta, maior será a afinidade do analito
para a fase estacionária.
Moléculas pequenas penetram os poros.
A coluna (fase estacionária) terá determinada carga (postiva ou
negativa), que vai ser escolhido de acordo com o que quero
separar/analito.
Os que não interrargirem com estas cargas serão eluídos logo e os que
se vão ligae vão ter tempos de retenção mais longos.

 Cromatografia de Exclusão:
A separação é feita com base no tamanho das partículas,
ficando as mais pequenas retidas nos poros da fase
estacionária e as de maior dimensão são eluídas com a fase
móvel.
Moléculas grandes são excluídas.
Separação de analitos em função do tamanho. Se temos
uma rede com um espaço que permite que entre um
125
determinado analito de menor dimensão e os analitos de maior dimensão não entram.
O que fica retido mais tempo é o de menores dimensões. Assim, a separação faz se com base no
tamanho das moléculas que estamos a analisar.

 Cromatografia de Afinidade:
Fase estacionária apresenta uma molécula
com grande afinidade para um dado analito,
que fica retido enquanto os outros que não
tem afinidade para essa mesma molécula são
eluídos. O analito só será eluído com alteração
do pH do meio.
Moléculas complexas (um certo tipo) ligam-se
a moléculas ligadas à fase estacionária. Outras
moléculas são excluídas.
É das mais selectivas/específicas porque estamos a ter uma reacção tipo anticorpo-antigénio. A fase
estacionária tem uma composição tal que só se vai ligar a um analito específico e não se liga a todos os
outros analitos que são arrastados pela fase móvel.

O Cromatograma e os Parâmetros
Os parâmetros da cromatografia permitem nos quantificar e identificar o analito.
Uma mesma substância tem sempre o mesmo tempo de retenção se estiver sempre nas mesmas condições
analíticas, ou seja, um determinado analito vai ter um tempo que vai ficar retido na coluna, que vai ser sempre
igual se mantivermos as condições sempre iguais.
O tempo de retenção vai ser um parâmetro que vai servir para identificar, visto que vai servir para diferenciar
um analito, pois é específico para o analito.
O sinal que vamos ler será tanto maior quanto maior for a concentração do meu analito. E isso vai ter influência
na área, porque o que vamos obter nestes tipos de cromatografia é um cromatograma – é um traçado em que
começa no ponto de introdução da amostra (tempo 0 – tempo de injeção) e depois vai originar um
cromatograma, a medida que são detetados os analitos.
No cromatograma:
1.º Tenho a fase móvel a passar e nenhum analito a sair.
2.º Detetor deteta composto, o sinal que estava inicialmente (sinal de fundo da fase móvel) vai
aumentar até ter um máximo e depois quando começa a diminuir (banda do analito), temos a
diminuição do pico.
Picos cromatográficos (aparecem no cromatograma) possuem uma área. Se queremos quantificar,
normalmente opta-se por áreas. Só escolhemos alturas quando temos cromatograma em que tempo de
retenção é pequeno, logo temos picos muito finos.
O pico vai ter o tempo de retenção quando for o seu máximo, quer dizer que o tempo de retenção vai ser
considerado desde o tempo de injecção/ponto de injecção até ao máximo deste pico cromatográfico.
Tem maior afinidade para a fase móvel o que tiver menor tempo de retenção e tem maior afinidade para a fase
estacionária o que tiver maior tempo de retenção (tempo que o composto está dentro da coluna).
No cromato grama ainda esta representado um pico que diz que é do ar, ou seja, desde que nos introduzimos a
amostra até que chega o sinal ao detetor, há um tempo, que é o tempo que a fase móvel leva a arrastar o
analito desde a coluna até ao detetor.
Este tempo, que é o tempo de um composto que é inerte e não reage com a nossa coluna definimos como
tempo morto, ou seja, é o tempo que a fase móvel leva desde o tempo em que fizemos a injecção até ao ponto
que está no detetor e temos uma resposta/sinal.
Entre o injetor e a coluna e entre a coluna e o detetor temos tubos metálicos de ligação de curto calibre.

126
O tempo de retenção que medimos está sempre a ser influenciado por um tempo morto, portanto, se
quisermos calcular o tempo de retenção corrigido temos de subtrair ao tempo de retenção o tempo morto.
Também podemos falar de volume de retenção, mas ai temos de entrar com o débito/fluxo.

Os parâmetros temporais são:


 Tempo morto (t m ):
Tempo que a fase móvel leva a sair da coluna desde que foi aplicada, sabendo que não apresenta
qualquer afinidade para a fase estacionária.

 Tempo de retenção (t r ):
Tempo que decorre desde a aplicação da amostra até atingir o máximo de um pico.

 Tempo de retenção corrigido (t’ r ):


É dado pela diferença ente o tempo de retenção e o tempo morto (t’ r = t r - t m ).

 Volume de retenção:
O volume de retenção de um composto é dado epla razão entre o tempo de retenção e o débito da fase
móvel (u), que é o volume eluídpo por unidade de tempo ( V r = t r . u).
Onde u = débito da fase móvel (volume por unidade de tempo)

Parâmetros que avaliam a retenção de um certo composto:


 O fator de capacidade (k') é a razão entre o tempo do soluto na fase estacionária e tempo do soluto na
fase móvel. Dá o grau de retenção de certo composto, ou seja, avalia a retenção de um determinado
composto.
Descreve a velocidade com que um dado composto migra ao longo da coluna.

Razão entre os moles de soluto na fase estacionária e os moles de soluto na fase móvel
Cs e Cm são concentrações nas fases estacionária e móvel
Vs e Vm são volumes das fases estacionária e móvel

Se k’ ˂˂ 1 – eluição rápida, onde não há separação.


Se k’ ˃ 20 – eluição muito demorada.

 O coeficiente de partição (K) é a razão entre a concentração na fase estacionária e a concentração na


fase móvel.

127
Separação de Componentes – Parâmetros que avaliam a capacidade de separaçºao
dos compostos da amostra
 Diferença de tempos de retenção
Para dois componentes 1 e 2:
• Retenção relativa (α):

Quando se fala em retenção relativa, estamos a falar de dois compostos, e é o tempo de retenção
em relação a outro.
O numerador é o composto que possui maior tempo de retenção e o denominador é o composto
que possui menor tempos de retenção.
K2 e K1 são coeficientes de partição dos 2 componentes para as 2 fases (Cs/Cm).
Se α = 1 – não há separação.

 Resolução Cromatográfica
A resolução (R s ) entre dois picos num cromatograma é dada por:

2∆Z 2[(t R )B − (t R )A ]
Rs = =
WA + WB WA + WB
Em que ΔZ é a separação entre os picos A e B. Wa e Wb correspondem à largura das bases dos picos A e
B, respetivamente. E t B é superior a t A .
A resolução dá-nos a separação entre os picos, ou seja, se estão bem separados/resolvidos.
Se os picos estiverem bem separados, temos que ver o pico a ir a linha de base e depois subir. E estão
mal separados se o pico não for a linha de base e começar logo a surgir outro pico.
R s ≥ 1 – Separação 98% - aceitável
R s ≥ 1,5 – Separação 100% - ideal

Tanto a retenção relativa (α) como a resolução cromatográfica (R) dão informação quanto à capacidade
de separação de uma amostra. A separação é tanto maior quanto maior for a retenção relativa e quanto
menor for a largura dos picos.
São necessários o parâmetro do tempo de retenção e da largura da base do pico pois posso ter picos
que estão muito bem separados, mas podem ser muito largos, ou posso ter picos que se encontram
mais próximos, mas são mais finos.

128
Representação de uma distribuição gaussiana

Um pico cromatográfico corresponde, idealmente a uma curva do tipo gaussiano. Contudo existem fatores extra
e intra-coluna que levam ao alargamento dos picos, ou seja, ao afastamento da idealidade. Esses factores serão
por exemplo:
 Introdução lenta da amostra
 Tempo que o detetor necessita que a amostra leve a percorre-lo, de modo a detetar
 Fenómenos inerentes à coluna:
• Diferentes percursos: Tamanho desigual das partículas da fase estacionária faz com que moléculas
iguais tenham de atravessar percursos mais ou menos longos, demorando mais ou menos tempo a
sair da coluna.
• Difusão longitudinal: moléculas da amostra difundem-se de uma zona mais concentrada para outra
menos concentrada
• Transferência de massas: fluxo de fase móvel demasiado rápido
A figura mostra a determinação da largura a meia altura (W1/2) e da largura do pico na base (W). A largura da
base é determinada prolongando os lados do pico e medindo. Já a largura a meia altura é determinada ao fazer
um traço, que depois será medido, a meia altura do pico. Esta técnica é importante porque por vezes é difícil
determinar a largura.

Eficiência de uma separação cromatográfica


A separação cromatográfica de dois compostos é tanto maior (mais eficiente) quanto:
 maior a diferença do tempo de eluição dos dois picos referentes aos compostos a separar:
 menor a largura dos picos correspondentes aos dois compostos;
 maior número de pratos teóricos.

Para uma análise quantitativa é desejável que a resolução seja superior a 1,5.
129
A Eficiência de uma coluna cromatográfica e os Pratos teóricos
A eficiência de uma coluna pode ser expressa em termos de número de pratos teóricos, N, ou seja, a eficiência
de uma coluna mede-se por pratos teóricos, e é como se a coluna fosse dividida em pequenos torços de coluna
em que se vai estabelecendo uma relação entre a fase estacionária e a fase móvel, sendo que, quanto maior for
o número de pratos teóricos, maior será a eficiência, logo vou ter picos mais estreitos.
Este número depende do comprimento da coluna e traduz o alargamento relativo da "banda" durante o
processo cromatográfico.
Um processo de destilação, pode ser conduzido através de um número de estádios discretos, cada um
constituindo um processo elementar em que se estabelece um perfeito equilíbrio entre as fases opostas.
Numa coluna o estabelecimento de um equilíbrio é impossível. Sendo assim, o prato teórico de uma coluna é
uma camada imaginária da coluna com tal espessura que a solução provinda dela, tem a mesma composição
que seria obtida se, efetivamente, existisse equilíbrio entre as fases, ou seja, um prato teórico de uma coluna é
a camada imaginária da coluna em que há um equilíbrio entre a fase estacionária e o eluente. A adição de mais
fase móvel desloca o equilíbrio que se estabeleceu.
Como se calcula o número de pratos teóricos?
Para uma distribuição aproximadamente gaussiana N pode ser obtido por uma das seguintes equações.

W = largura da base do pico


W 1/2 = largura da base do pico a meia altura
Menor altura do prato teórico:
 Picos mais estreitos
 Melhor separação
Como o número de pratos teóricos influencia a resolução
da cromatografia, pode relacionar-se diretamente
diferentes valores de resolução com diferentes números
de pratos teóricos pela seguinte fórmula:

A coluna vai ter um tamanho diferentes dependendo se estamos a trabalhar em cromatografia gasosa (cujas
colunas vão dos 30 aos 100 m) ou líquida (cujas colunas vão dos 5 aos 25 cm). Como tem dimensões diferentes,
o número de pratos também vai ser diferente.
A coluna tem um limite (comprimento desta) e vamos querer que para esse comprimento tenha o maior
número possível de pratos teóricos, ou seja, a dimensão de cada prato teórico tem que ser a menor possível,
para caber o maior número de pratos teóricos na coluna.
O número de pratos teóricos acaba por ser um parâmetro importante que nos indica o estado de conservação
da colina, ou seja, se está apeta a realizar trabalho ou se temos de comprar uma nova.
Um maior número de pratos acelera a análise, diminuindo o tempo de análise.

Altura Equivalente a um Prato Teórico


A eficiência de uma cromatografia é tanto maior quanto maior for o número de pratos teóricos e quanto menor
a altura de cada prato. O número de pratos teóricos é diretamente proporcional ao comprimento da coluna (L)
130
(quanto maior o tamanho da coluna, maior o número de pratos) e inversamente proporcional ao diâmetro das
partículas (dp) (quanto menor for o tamanho da partícula, maior é a eficiência/resolução).
Quanto menor a altura de cada prato teórico, maior é o número de pratos teóricos, sendo menor a largura dos
picos e melhor a separação.
A qualidade das colunas pode ser comparada através de (H) AEPT o qual é dado por:
𝐿𝐿
𝐻𝐻 =
𝑁𝑁
Unidade: cm/prato
H – altura do prato teórico
L – comprimento da coluna
A altura equivalente a um prato teórico (AEPT), corresponde ao comprimento da coluna a dividir pelo número
de pratos teóricos.

Sumário das Equações Cromatográficas

131
Parâmetros que caracterizam um composto desconhecido em análise
A partir do índice de retenção (I), é possível tirar conclusões acerca do número de carbonos que um composto
desconhecido possui. Esse índice é dado pela expressão seguinte onde n é o número de átomos de carbono do
composto menor, N é o número de átomos de carbono do composto maior e t’ r é o tempo de retenção
corrigido.

Fatores/Parâmetros que afetam a resolução cromatográfica

A resolução de uma cromatografia é influenciada pelo número de pratos teóricos da coluna, pela retenção
relativa e pelo fator de capacidade.
Na prática, como optimizar estes parâmetros (diminuir o tempo de análise, ter picos mais separados e estreitos,
ou seja, maior eficiência)?
 Eficiência:
• Aumentar o comprimento das colunas, para melhorar a eficiência;
• Uniformizar percursos possíveis para as partículas, ou seja, se a coluna for de enchimento, ter as
partículas mais uniformemente distribuídas;
• Optimizar o fluxo, ao alterar a velocidade da fase móvel.
 Seletividade/Capacidade:
• Natureza das fases (alterar a polaridade do solvente ou da coluna);
• Temperatura (na cromatografia gasosa é muito importante a selecção da temperatura a que
realizamos a análise, mas na cromatografia líquida já não é tão importante, fazendo se a
temperatura ambiente).
A que é devido o alargamento dos picos?
I- Na introdução da amostra (largura de banda da aplicação) – se introduzirmos com lentidão, a amostra
alastra-se, levando ao alargamento;
II- Tempo de passagem no detetor – se levar muito tempo a passar ou se levar pouco tempo a passar,
sendo que basta uma passagem mais lenta para fazer um pico largo.
III- Fenómenos na coluna
A) Diferentes Percursos (Anisotropia):
Analito ou moléculas do analito dentro da coluna percorrem trajectos diferentes. Este
fenómeno não ocorre nas colunas que não são de enchimento. Nas colunas de enchimento,
as partículas tem irregularidades, apesar de entrarem ao mesmo tempo, chegam ao detetor
132
a tempos diferentes, pois ficam retidas na coluna tempos diferentes. Aqui o fluxo não
interfere, o que interfere é o percurso que as partículas vão tomar ao longo da coluna.

B) Difusão Longitudinal:
Atendendo que no centro temos uma
maior concentração do analito e dos
lados não temos, vai ocorrer a
difusão do centro para as laterias (há
tendência para se espalhar). Se
dermos tempo (fluxo baixo), esta
difusão vai ocorrer ainda mais. Temos
que ter uma velocidade o maior
possível para termos a menor difusão
possível (não damos tempo para que
o fenómeno ocorra).

C) Processos de Transferência de Massa:


Colocamos o analito dentro da coluna e vai
ser arrastado pela fase móvel e vai fazendo
ligações com a fase estacionária. Vai
havendo um desfasamento entre a
quantidade de analito que é arrastada pela
fase móvel e a quantidade de analito que é
retirada pela fase estacionária. Quanto
maior for a velocidade da fase móvel, maior
vai ser o desfasamento, ou seja a fase móvel
desloca-se com uma grande velocidade
enquanto ainda estamos a fazer trocas com
a fase estacionária.

133
Equação de van Deemter
A equação de Van Deemter relaciona a altura
dos pratos teóricos com os factores que
condicionam o alargamento do pico. Ou seja,
o eixo das abcissas é a velocidade linear, ou
fluxo, e o eixo das ordenadas é a altura
equivalente do prato teórico.
Este gráfico permite nos escolher as
melhores condições para ter a melhor
resolução possível, tendo em conta que
quero ter o maior número de teóricos
possível (ou seja, tem de ter menor altura
para a coluna ter maior eficiência). E também queremos ter o fluxo mais rápido para a análise ser o mais rápido
possível.

Quanto menor a altura do prato teórico (H), maior o N,


logo a rentabilidade é maior. Neste caso, o H2 é o mais
rentável, mas é pouco usado por ser altamente explosivo.
Resume os fatores que na coluna contribuem para a altura
de um prato teórico:
A – Diferentes percursos (anisotropia) -
Independente do fluxo (linear e constante)
B/u - Difusão longitudinal – Inversamente
proporcional ao fluxo
C.u - Transferência de massa – Diretamente
proporcional ao fluxo (linear e crescente)
HETP – altura do prato teórico
U - fluxo

134
Métodos Cromatográficos – Cromatografia em Fase Gasosa
- Cromatografia em Fase Gasosa
A fase móvel é um gás e a fase estacionária é um sólido ou um líquido fixado num sólido.
Aplica-se à análise de composto gasosos ou facilmente volatizáveis, termicamente estáveis e não reativos nas
condições de ensaio.
Os componentes básicos de um instrumento para cromatografia em fase gasosa encontram se na figura abaixo:

Temos um local onde colocamos a amostra e esta injecta a amostra para uma coluna através de uma seringa.
Vai injectar para uma coluna de cromatografia gasosa, que está enrolada possui entre 30 a 60 m.
A amostra vai ser arrastada pela fase móvel para a coluna que está a uma determinada temperatura (um
parâmetro muito importante que tem de ser controlado). No fim da coluna, sai desta e vai de encontro ao
detetor, que deve estar de acordo com a nossa análise, ou seja, tem que ser sensível para a nossa análise (o
analito a analisar) e por fim temos um registador/computador/integrador, consoante a diferente forma de
tratar o sinal.
Temos de controlar a temperatura do forno (temperatura da coluna), a temperatura da zona de injecção
(injector) e a temperatura da zona de deteção (detetor). Normalmente, o injetor e o detetor são aquecidos a
temperaturas superiores às do forno.
A amostra está numa solução que é colocada numa seringa que é colocada no injector. Se este estiver frio, não
há volatização da amostra, logo vão ficar gotas no injector. Por isso temos de aquecer o injector para que a
amostra quando é colocada no injector volatilize logo, sendo arrastada pela fase móvel.
O detetor também tem de ser aquecido, pois se estamos a analisar analitos com a coluna a determinada
temperatura, se o detetor estiver frio, ele não vai conseguir ler nada porque automaticamente condensa os
analitos.

135
Com este controlo de temperatura, podemos aplicar este método para analisar amostras líquidas ou gasosas. A
grande maioria das amostras analisadas são liquidas, sendo que as gasosas necessitam de seringas especiais que
controlam o fluxo.
- Equipamento:
 Botijas de Gás – Gases Transportadores
As botijas de gás contêm gases transportadores (também pode ser
chamado móvel ou de arraste). Estes podem ser o azoto (N 2 ), o
hidrogénio (H 2 ), o hélio (He), o árgon (Ar) e o dióxido de carbono (C O 2 ).
Vamos ter reguladores de fluxo tanto junto da garrafa como junto do
cromatografo, e mesmo no interior do cromatógrafo. Todos eles
contribuem para a regulação do fluxo.
O fluxo, ou seja, a velocidade a que a fase móvel vai passar pela fase
estacionária tem que estar muito bem controlada e conhecida, pois o
tempo de retenção vai depnder do fluxo.
Se o detetor também precisar de gases, também temos de controlar o
fluxo destes.
Tendo em conta o gráfico ao lado, a melhor escolha para um gás movel
seria o hidrogénio, porque vai permitir analises rápidas (menor tempo possível) e com uma maior eficiência
(maior número de pratos teóricos, pois tem pequenas alturas), Todavia,apresenta alguns inconvenientes como:
• Quando aumenta a velociade de fluxo para diminuir o tempode análise, diminui o número de pratos
teóricos (aumenta o tamanho destes), o que vai diminuir a eficiência/resolução/separação;
• Altamente perigoso quando há uma fuga na coluna.
Assim, pode ser substituido por outros gases como o hélio e o azoto (mais barato).

 Sistemas de Injecção de Amostra – Injector


Temos um local onde colocamos a amostra e esta injecta a amostra para uma coluna através de uma seringa.
Como a amostra é um gás, é necessário que seja tudo estanque, caso contrário ao colocar a amostra, ela
difunde-se rapidamente para o exterior.
Ao injectar a amostra, tenho de perfurar um septo, que é constituído por vários materiais, dependendo da
análise e das temperaturas que vou usar.
Existe um fluxo de fase móvel que vai entrar no injector e vaia arrastar a minha amostra.
É composto por uma pequena câmara onde a amostra é volatizada e misturada com o gás vector da fase móvel.
Existem vários sistemas de injecção:
• Split – é o modo mais comum de introduzir os pequenos volumes de amostra.
O analito tem uma concentração inferior a 0,1% da amostra, sendo apenas 0,2-2% da amostra é
introduzida na coluna (sendo o resto libertado para o exterior, pela fuga do septo).
O injector deve estar a uma temperatura elevada.
Possui a “split vent”, que é um septo que separa a coluna do local onde vou colocar a amostra.
Como a agulha +e muito fina, após ser retirada o septo fecha, impedindo que a amostra sai do local de
injecção.
Não aproveita grande parte da amostras, que difunde para o exterior e obriga a limpezas entre adição.

• Splitless – O analito em uma concentração inferior a 0,01% da amostra, sendo que 80% da amostra é
aplicada na coluna.
O injector está a uma temperatura elevada, mas inferior à injecção por split.
Tudo o que pipeto vai para a coluna, é usado ara baixas concentrações, daí essa necessidade de ir toda a
amostra para a coluna.

• On-column – A solução é injectada directamente na coluna a uma baixa temperatura.


A temperatura inicial da coluna é baixa.
Utiliza seringas especiais, que são mais finas e mais compridas. Esta é colocada no interior da coluna.
136
Sem fuga de septo.
Não é muito comum, é usado quando temos substâncias que se alteram coma temperatura, logo temos
de fazer a injecção baixas temperaturas porque as substâncias podem degradarem-se.
Temos de usar concentrações muito baixas porque os métodos são muito sensíveis.
Captura e
filtra
contaminantes

 Forno da Coluna
Regula a temperatura da coluna (temperatura do forno) de forma a optimizar a separação, que pode
ocorrer em:
• Meio Isotérmico: análise feita toda à mesma temperatura.
• Meio com Temperatura programável: para separação de compostos com pontos de ebulição
muito diferentes, que a temperatura constante seria muito demorada. Permite uma melhor
resolução, eficiência (picos estreitos) e melhor separação dos analitos, visto que separa picos que
na isotérmica iriam sair juntos no início. Como neste a temperatura começa baixa e vai
aumentando, consegue fazer a análise num menor tempo.

 Colunas para Cromatografia gás-líquido


As colunas de cromatografia gasosa são de grandes dimensões, enrolada sobre si mesma de forma a
ocupar pouco espaço.

Classificação clássica de
colunas usadas em
cromatografia Gás-
Líquido:

137
Há diferentes tipos de coluna:
• Enchimento:
 2 a 3 metros de comprimento (curtas);
 2 a 4 mm de diâmetro (relativamente grande);
 Vidro, aço ou alumínio;
 Suporte sólido;
 Tem suporte sólido (onde está a fase estacionária) como enchimento, ou seja, o
enchimento constitui a fase estacionária sendo normalmente de Terra de diatomáceas
(é muito polar, pelo que a sua polaridade pode ser alterada consoante as
características do analito);
 Têm pior eficiência e resolução

• Tubulares abertas (não tem enchimento; tubo de sílica revestido de poliamida


podem ser de dois tipos, depende do diâmetro interno):
 Semi-capilares
 Tem entre 10 a 30 m de comprimento.
 Diâmetro interno vai dos 0,35 aos 0,53 mm.
 Capilares
 São de sílica e revestidas com poliacrilamida, com 15 a 100 m de comprimento e 0,10 a
0, 53 mm de diâmetro interno.
 Dimensões de uma coluna tubular aberta para cromatografia em fase gasosa

A fase estacionária vai ter diferentes composições (estrutura e polaridade) consoante a amostra a
analisar:
• Não polar • Polaridade • Fortemente
intermédia polar

Existem diversos tipos de colunas tubulares abertas consoante a fase estacionária se liga à parede da
coluna:
• WCOT – a fase estacionária, líquida liga-se directamente à parede da
coluna;
• SCOT – a fase estacionária, líquida, liga-se a um suporte sólido que
se liga à coluna;
• PLOT – as partículas da fase estacionária, sólida, ligam-se à parede
da coluna.

138
Na imagem abaixo temos a secção de diferentes tipos de colunas tubulares abertas

Aro à volta é a coluna (tubo de sílica) e a


fase estacionária está ligada à parede
interna.
No primeiro, a fase estacionária é líquida.
No segundo temos um suporte sólido
que contém a fase estacionária (líquida),
o que aumenta a área de contacto.
No terceiro, a fase estacionária é sólida.

A fase estacionária liga-se à coluna por ligações covalentes (Fase ligada – “Bonded”) podendo ainda
apresentar ligações covalentes entre as próprias moléculas da fase estacionária (Ligação cruzada –
“Crosslinked”), evitando o seu arrastamento. Assim as colunas podem ser :
• Fase ligada – “Bonded”: ligadas covalentemente à superfície da tubagem;
• Ligação cruzada – “Crosslinked”: cadeias de polímeros individuais ligadas por ligações
covalentes.

 Detectores para cromatografia em fase gasosa


Na coluna ocorre a separação dos analitos e no final da coluna tenho o detetor que vai detetar os analitos
que por ele passam. Inicialmente, enquanto não passarem os analitos, o detetor apenas deteta um sinal
contínuo que advém da fase móvel.
Principais características do detetor ideal:
• Sensibilidade adequada
• Boas estabilidade reprodutibilidade
• Linearidade de resposta
• Utilizável a temperaturas elevadas (400ºC)
• Tempos de resposta curto
• Não destruidor da amostra

Tipos de detetores:
• FID (ionização de chama):
Fundamento: Formação de iões pela combustão da
amostra na presença de H 2 e O 2 . Origina corrente
eléctrica no colector gerando um sinal do qual a
combustão do gás de arraste é descontada. Por
outras palavras, sempre que o analito (gás) chega ao
fim da coluna, vai entrar na chama e é queimando
numa chama de ar e hidrogénio, o que provoca a
ionização dos compostos orgânicos (forma-se um ou
vários iões, depende da amostra a analisar),
permitindo a passagem de corrente eléctrica através
da chama, entre 2 eléctrodos. A intensidade da
corrente é proporcional à concentração desse composto orgânico na amostra, ou seja, quanto
maior for a quantidade de analito, maior é o número de iões, sendo que maior será o sinal lido.
Fase móvel: Azoto ou hélio.
Aplicações: Deteção de compostos orgânicos em geral.
139
Vantagens: Alta sensibilidade, grande linearidade de resposta, pouco sensível à variação de
velocidade do gás e pode se usar a água como solvente, pois não é detetado.
Desvantagem: Destrói a amostra e baixa sensibilidade.
Nota: Existe em todos os equipamentos deste tipo, visto que tem um campo de aplicação muito
grande – consegue ler/ser sensível a todos os compostos que tenham o átomo de carbono. Vem
sempre com a máquina, depois podem ser acrescentados outros detetores.

• FTIR (infravermelho)

• TCD (condutividade térmica)


Fundamento: O gás vindo da coluna é aquecido
sendo a sua condutividade térmica diferente
consoante o analito transportando pelo gás.
Fase móvel: Hidrogénio, hélio.
Aplicações: Detecção de compostos orgânicos e
inorgânicos.
Vantagens: Simplicidade, não destrói a amostra.
Desvantagens: Baixa sensibilidade e baixa
selectividade.

• ECD (captura electrónica)


Fundamento: O gás vindo da coluna atravessa um feixe de electrões,
captando-os ou não, o que vai diminuir mais ou menos a intensidade
desse feixe.
Fase móvel: Azoto.
Aplicações: Detecção de compostos contendo halogéneos.
Vantagens: Alta sensibilidade, alta selectividade, pouco destrutivo da
amostra.
Desvantagens: Baixa linearidade.

• NPD (termoiónico)
Fundamento: Utiliza uma pastilha de um sal de Na, Rb ou Cs, normalmente numa matriz cerâmica
ou vidro e é colocada junto ao bico de queima.
Muito mais sensível para fósforo (104 a 106) e para o azoto (103) que para o carbono.
Chama provoca a excitação dos átomos, que ao regressarem ao estado fundamental emitem
energia.
Aplicações: Detecção de compostos com azoto ou fósforo (ex. pesticidas fosforados).
Vantagens: Alta sensibilidade e selectividade.
Desvantagens: Destrói a amostra.

• MSD (espectrometria de massa)

 Detetores de Cromatografia de fase gasosa – Sensibilidade e gama de linearidade

140
↑linear range

↓distorção do sinal

- Métodos hifenados
Métodos hifenados quer dizer que estamos a ligar dois métodos que são perfeitamente independentes, mas
quando ligados acabam por nos permitir uma maior potencialidade de hipóteses.

- Cromatografia em Fase Gasosa – Campo de Aplicação


 Análise Qualitativa
• Identificação de um ou mais compostos:
 Acoplar um detetor de espectrometria de massa ou um FTIR, comparar os espectros obtidos
com uma biblioteca (prático para amostras mais complexas, com analitos que podem ter o
mesmo tempo de retenção). Se não possuir nenhum dos dois e precisar de fazer uma
análise de um composto complexo, posso fazer o seguinte: passo numa primeira coluna e
depois mudo para outra coluna e verifico se continuam a ter o mesmo tempo de retenção.
Se o tempo de retenção do padrão e da amostra coincidirem, podemos garantir com mais
confiança que aquele é o nosso analito – o mesmo parão e amostra darem, em condições
diferentes, o mesmo tempo de retenção, confirma-me qual o analito que estou a analisar;
 Comparar o tempo de retenção com um padrão – O modo mais correto é adicionar o padrão
à amostra e analisar simultaneamente (prático para amostras simples, compara se o tempo
de retenção do padrão com o tempo de retenção do analito em análise);
 Confirmação dos tempos de retenção da amostra e do padrão numa segunda coluna ( com ≠
fase estacionária).
Mantendo invariáveis as condições cromatográficas, um composto puro apresenta sempre o mesmo
tempo de retenção
 Análise Quantitativa – Método do padrão interno
• Quantificação de um ou mais compostos:
Método do padrão interno – devido á dificuldade em manter as condições operatórias
inalteráveis/compensa erros aleatórios e sistemáticos de perda de analito na preparação ou input
da amostra.
 Curva de calibração;
 Comparação com padrão igual à amostra e de concentração semelhante.
No intervalo de linearidade do detetor, a área do pico é proporcional à quantidade do composto que se está a
detetar, podendo ser substituída pela altura do pico.
141
Métodos Cromatográficos – Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (HPLC)
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Alta Pressão
Alto Desempenho
Alta Performance
Do inglês HLPC – High Performance Liquid Chromatography
É uma técnica cromatográfica que utiliza como fase móvel
um líquido e equipamentos sofisticados para separar os
componentes de uma amostra pela interacção entre a fase
estacionária (pode ser líquida ou sólida) e a fase móvel.
A HPLC aplica-se à análise de compostos não voláteis ou
dificilmente volatizáveis (há amostras que não são
volatizáveis, e como o aumento da temperatura do forno,
podem ou destruir a amostra ou destruir a coluna). Tem
diversas aplicações, nomeadamente no estudo de fármacos,
toxicologia, proteínas, aminoácidos, pesticidas, cosméticos,
corantes, alimentos, polímeros, vitaminas.
Na cromatografia de fase gasosa a separação dá-se na coluna
e a fase móvel só arrasta os componentes, podendo ser a
mesma para várias amostras.
Já na cromatografia líquida, temos de ter em conta a fase
móvel e a coluna que vou usar, sendo que tal é determinante
para uma boa separação. É necessário que a amostra seja
solúvel na fase móvel.

Componentes de um equipamento de HPLC

Principais constituintes:
 Reservatório
 Bomba – vai introduzir eluente a
alta pressão coluna, o que acelera o
processo
 Injector – injecta amostra
 Pré-coluna
 Coluna
 Detetor
 Periférico de saída

142
 Reservatório para fase móvel
• Filtro do reservatório – Filtros de 10 a 40
µm; impedir a passagem de partícula que
possam danificar a coluna ou a bomba
• Fase móvel – É constituída por eluentes
de elevada pureza, próprios para HPLC. Os
eluentes devem ser desarejados antes de
serem utilizados, de modo a impedir a
libertação de bolhas de ar dentro do
sistema (pois poderiam interferir na detecção ou no
funcionamento da bomba).
À fase móvel podem ainda ser adicionadas soluções tampão (de
fosfato, citratos, ácido acético) de forma a manter o pH constante.
Tendo em conta o detetor utlizado, o eluente não deve ter
características muito próximas dos compostos em análise (por
exemplo, com o detetor de UV-Vis o eluente não deve absorver no
mesmo cdo do analito).
• Fase móvel – Solventes
 Deve ter alto grau de pureza
 Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes
 Ter polaridade e viscosidade adequadas
 Não degradar a fase estacionária
 Ser compatível com o detector utilizado
• Fase móvel – Água
Água mono-destilada e desionizada comum são inadequadas-
Água deve ser grau HPLC: purificada com resinas de troca iónica, carvão activado ou
filtros de membrana (isentos de bactérias)
Deve ser produzida no momento do uso pois é facilmente contaminável.
Normalmente não se usa apenas o solvente orgânicos, na maioria dos casos utiliza se
água de grande qualidade (água desionizada na hora) com solventes orgânicos.

 Desgaseificação da Fase móvel


Indispensável para o bom funcionamento do sistema:
• Reduz “som de fundo”;
• Remove O 2 dissolvido que podia danificar a amostra;
• Reduz fluxo errático por flutuações de pressão (uniformiza o fluxo);
• Reprodutibilidade do fluxo;
• Estabilidade da linha de base.
Para desgaseificação, os eluentes podem ser submetidos à acção de:
• Ultra-sons (sem vácuo)
• Vácuo+ultra-sons (com vácuo)
• Purga com hélio (borbulhagem com gás inerte)
• Desgaseificador “on-line”

 Bombas de Alta Pressão


É um sistema que provoca a aspiração da fase móvel e a sua
introdução no sistema de capilares do injector, coluna e detetor
a uma pressão elevada.
Esta pressão é necessária para acelerar a eluição da amostra
através da coluna, que devido ao seu fino enchimento,
aumentaria o tempo de análise, se a pressão não fosse elevada.

143
O bombeamento da fase móvel é feito por um êmbolo, cujo
movimento provoca a entrada do eluente a alta pressão no
injector de uma forma pulsátil. De forma a evitar alterações
na linha de base, existe um sistema de amortecimento que
controla o pulsar.
Têm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutível
de fase móvel para o sistema.
Na imagem anterior temos um exemplo esquemático de
uma bomba de deslocamento recíproco, que são as mais
vulgares e as mais utilizadas.
Maiores problemas na bomba:
• Check valves;
• Pump seals;
• Blockage;
• Air bubbles.

 Eluição
O eluente entra na coluna e nela dá-se a eluição.
A eluição é o desenvolvimento da amostra no sistema cromatográfico, sendo que pode ocorrer de duas
formas diferentes:
• Isocrática – Mesma composição de fase móvel durante a eluição, ouse já, a polaridade da fase
móvel não varia ao longo da coluna.
Programo a bomba para adicionar X% de fase orgânica e Y% de fase aquosa.
É o modo normal de trabalho para separar amostras simples.
Acetonitrilo/Água (60:40) v/v
• Gradiente – Composição da fase móvel varia durante a eluição.
Programo a coluna de modo a que ao longo da corrida a bomba vai variando o gradiente da fase
móvel, ou seja, ao longo do tempo a proporção dos eluentes vai variando, o que varia a
polaridade da coluna.
Utilizado na separação de misturas complexas com diferentes funções químicas.
Exemplo: A fase móvel é constituída por
A = Acetonitrilo e B = Água.
1- Tempo de análise encurtado
2- Resolução melhorada
3- Aumento de sensibilidade

 Sistema de Injecção de Amostras


É um sistema de capilares que recebe a amostra e só depois a
mistura de maneira a ser arrastada para a coluna.
Na posição de carga (60º para a esquerda) introduz-se a amostra
com uma micro-seringa. Essa amostra é armazenada no loop (de
capacidade rigorosa), estando isolada do eluente bombeado. Ao
rodar o manípulo 60º para a direita, o eluente é bombeado para
dentro do loop, provocando o rápido e simultâneo arrastamento
de toda a amostra para dentro da coluna
Válvula de injecção para HPLC:

144
144
O sistema de injecção pode ser:
• Injecção manual – As amostras são introduzidas com seringas-
Após virar o manípulo, a amostra é transportada pela fase móvel até ao
início da coluna.
• Amostrador automático – As amostras são postas num frasco localizado
dentro do amostrador.
O amostrador automático:
 Mede o volume correto para injeção
 Injecta a amostra
 Prepara o injetor para uma próxima amostra

 Sobrecarga de Volume da Amostra


Para obter a máxima eficiência da coluna não se deve injectar um volume maior que 1% do volume da
coluna vazia.

 Colunas para cromatografia em fase líquida


• Pré-colunas
É coloca-se entre o sistema de
injecção e a coluna e tem a esma
constituição da última.
Está é importante pois:
 Previne a entrada de
partículas estranhas
provenientes do eluente ou da
amostra, pois retém-nas.
 Aumenta a duração da coluna
 Deve ter a mesma constituição da coluna analítica
Sendo mais pequena e, por isso, mais barata, é substituída regularmente devido
à sua danificação (por reter partículas estranhas ou da amostra, impedindo a sua
passagem para a coluna, ouse já, qualquer substâncias que danifique a coluna já
não faz porque fica retida nesta).

• Colunas de separação
Cilindro pequeno de aço inoxidável, cheio de
enchimento que constitui a fase estacionária. Esta
é formada por partículas uniformes e de pequeno
diâmetro (3,5 a 10 µm), o que torna a separação
mais eficaz e mais demorada, caso a eluição não
fosse feita a pressão elevada.

145
Condicionamento da coluna – para haver equilíbrio entre fase móvel e fase estacionária, a coluna
deve ser guardada em solvente orgânico ou fase móvel, coluna nova: 4-8h, sem uso de alguns dias –
2h, uso diário: 15min.

 Partículas de Enchimento – Partículas da fase Estacionária


• Porosas (3 a 10 µm)
• Não porosas (1-2 µm) – separação de benzodiazepínicos
• Monolíticas (forma cilíndrica em forma de haste) – As colunas
monolíticas apresentam poros com diferentes tamanhos.
Separações rápidas, possibilidade de utilizar fluxos elevados sem
aumento de pressão na coluna.

 Fases Estacionárias
As colunas mais usuais são colunas de enchimento cheias de sílica, à
qual se ligou (por ligações covalentes) um composto orgânico.
Consoante a polaridade do R do composto orgânico posso ter:

• Fase Normal: • Fase Inversa:


Quando o grupo R é polar, ou seja, a Quando o grupo R é apolar, ou seja, a
coluna é polar. coluna é apolar.
Solvente apolar. Solvente polar.
Fases polares mais comuns: Dá melhores resultados.
Fases apolares mais comuns:

Significado de RP-C18: É uma fase estacionária de uma coluna de uma cromatografia de fase reversa
composta de uma fase de suporte (geralmente SiO 2 ) e um líquido estacionário composto por uma
cadeia carbonada de 18 átomos de carbono. É a coluna mais vulgar.

146
 Cromatografia Líquida de fase ligada
Fase estacionária:
Suporte (SiO 2 ) + Líquido estacionário → reacção química
Ou seja, o analito é imobilizado na fase estacionária por
ligações químicas.
Vantagens:
• Alta estabilidade química
• Eluição por gradiente

 Especificações de uma coluna – Exemplo:

 Fases Móveis
• Fase Normal:
 Fase estacionária é polar.
 Fase móvel é apolar – Hexano, diclorometano.
 Polaridade alterada com – Isopropanol, acetato de etilo.
 O componente menos polar é eluído primeiro.
 O aumento da polaridade da fase móvel diminui o tempo de eluição.

• Fase Reversa:
 Fase estacionária é apolar.
 Fase móvel é polar – Metanol, Acetonitrilo, Tetrahidrofurano.
 O componente mais polar é eluído primeiro.
 O aumento da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.
 Polaridade alterada com – Água ou tampão
 Vantagens:
 Fases móveis menos tóxicas e de menor custo;
 Boa estabilidade frente aos vários solventes;
 Rápido equilíbrio após troca de solvente;
 Compatível com gradiente;
 Análises rápidas;
 Vasto campo de aplicação.
 Desvantagens: Intervalo de pH: 2 ˂ pH ˂ 8 (devido ao uso da sílica)

• Fase normal VS Fase reversa: Semelhante dissolve Semelhante

147
 Propriedades dos eluentes mais comuns
• Ajuste da força cromatográfica – O eluente é tanto
mais forte quanto menor for o tempo de retenção.
Tendo em conta figura ao lado:
1.º – Picos estão mal separados
2.º – O segundo e o terceiro picos estão mal
separados
3.º – Picos estão bem separados
4.º – Os picos estão bem separados, mas tem
tempos de retenção muito elevados, análise demora
muito tempo

148
• Optimizaçao das condiçoes de separação – O objetivo é obter picos estretiso, pois são mais
facilmente analisados pelo detetor e não dão tantos erros.

• Efeito do tramanho da partícula de enchiemnto na altura do prato teórico – Quanto mais pequeno é
o tamanho da partícula, maior é a eficiência.

• Ajuste da Força Cromatográfica com Gradiente

149
 Detetores
Aparelho colocado à saída da coluna que vai produzir
um determinado sinal consoante o composto que vai
sair da coluna.
Dispositivos que examinam continuamente o material
eluído, dando origem a um sinal quando há passagem
de compostos.
Idealmente: cada substância separada aparece com um
PICO no cromatograma.
Principais características do detetor ideal:
• Sensibilidade adequada;
• Boa estabilidade e boa reprodutibilidade;
• Linearidade de resposta;
• Tempo de resposta curto;
• Não destruidor da amostra.

 Detetores – Tipos de detetores para HPLC


• Absorção molecular UV-Visível – Detetor de Ultravioleta-Visível:
 70% das análises publicadas utilizam HPLC com detetores UV/Vis – mais comum por ter um
campo de aplicação vasto;
 Baseado na Absorção molecular;
 Obedece à lei de Lambert-Beer – A = K.c.l;
 Percurso em Z – o percurso ótico é feito em Z, o que
aumenta a sensibilidade do método, pois aumenta o l;
 Os detetores de UV-Visível podem ser de dois tipos:
 Comprimento de onda variável

 Arranjo de díodos (λ variável) – Consegue, para além de dar o cromatograma, dar o


espectro completo da amostra. Pode também dar a pureza do pico

150
• Emissão de fluorescência – Detetor de fluorescência:
 É um dos detetores mais sensíveis (vantagem);
 10-1000 x mais sensível que o UV-Visível;
 Cerca de 15% das moléculas apresentam fluorescência: ligações
duplas, grupos aromáticos (desvantagem – nem todas as
moléculas emitem energia, tem de ter grupos cromóforos).

• Eletroquímicos – Detetor eletroquímico:


 Sinal resultante da variação na corrente devido a um processo de oxidação/redução no
eléctrodo;
 Corrente desenvolvida é proporcional à concentração, de acordo com a lei de Faraday;
 Requer fase móvel que conduza a corrente eléctrica;
 Requer muito cuidado nos ajustes do pH;
 Alta sensibilidade e especificidade;
 Muito útil em matrizes complexas;
 Aplicações típicas para a detecção
amperométrica; açúcares, assim como
muitos aniões (cianeto, sulfeto, iodeto,
brometo), catiões (aminas, ácido amino
aromáticos), e substâncias orgânicas
como fenóis, catecolaminas, vitaminas ,
etc.

No mesmo HPLC podemos


ter diferentes tipos de
detetores, como mostra o
exemplo abaixo:
Uso simultâneo de
diferentes detetores; dyode
array, detetor de
fluorescência e detetor
eletroquímico.

• Índice de refracção – Detetor de Índice de refracção:

 É o único detetor universal do HPLC;


 Medida da alteração do índice de refracção;
 Procurar fase móvel com índice de refracção
diferente da amostra (sensibilidade);
 Se não estiver a sair nada da coluna, a radiação não
sofre desvio e o detetor não deteta nada. Quando sai

151
algo da coluna, há desvio da concentração, havendo um desvio do raio, que é proporcional à
concentração (luz passa nas duas metades, como o índice de refracção é diferentes, a luz é
desviada);
 Pouca sensibilidade e só se aplica a análises isocráticas - Fase móvel de composição constante
(em contraste com a eluição por gradiente).

• Condutividade – Detetor de Condutividade:


 Usado na cromatografia iónica;
 Muito sensível;
 Quanto maior o número de iões, maior a condutividade.
 Só pode ser aplicado a análises isocráticas e o controlo da temperatura é muito importante.

• Medida da condução eléctrica:


 Medida de espécies carregadas electricamente
 Catiões, aniões e moléculas com carga
 Alta sensibilidade (cromatografia iónica)
 Modo isocrático – mesma composição de fase móvel
 Determinante o controlo da temperatura

• Dispersão de luz evaporativo – Detetor Dispersão de luz evaporativo:


 Aplica -se a substâncias semi e não voláteis
 Sinal proporcional à concentração
 Quase universal.
 Mais sensível que o de índice de refracção, mas mais caro

1. Nebulização
Somente
solventes
voláteis
2. Evaporação

3. Deteção

Mede a luz dispersada

• Espectrómetro de massa – Detetor


de Espectrometria de Massa
Determinação da massa de solutos
através da ionização e
determinação da relação massa-
carga (m/z).

152
 Periférico de saída
Recebe sinais eléctricos do detetor e transforma-os num cromatograma. No cromatograma, o tempo de
retenção do analito identifica o composto analisado, enquanto que a área do pico indica a quantidade
desse composto existente na amostra.

Cromatografia Líquida (HPLC) – Tipos de cromatografia HPLC


 Cromatografia de partição:
• Fase normal
• Fase reversa
• Força dos solventes
Aplicações:
• Derivatização: detecção, selectividade
• Cromatografia de pares iónicos
• Cromatografia com fase estacionária quiral
 Cromatografia de adsorção
 Cromatografia iónica
 Cromatografia de exclusão

 Derivatização
Derivatização – Transformação de uma substância em outra de estrutura semelhantes, com alteração
de algumas propriedades para facilitar a separação, ou seja, faço reagir os compostos da minha amostra
com um composto de modo a aumentar a sensibilidade do meio.
Derivatização normalmente é pré-coluna, mas por vezes é pós-coluna.
Existem diversas reacções de derivatização.

 Cromatografia de Pares iónicos (para cromatografia de fase reversa)


A cromatografia de par iónico é um tipo de cromatografia de partição em fase reversa, usada para
separar espécies iónicas.
A fase móvel, neste caso, é constituída por um tampão aquoso e por um solvente orgânico polar, como
por exemplo, acetonitrilo ou metanol, à qual se adiciona um contra-ião de carga oposta ao analito. O
contra-ião vai ligar-se ao ião que pretendemos separar, formando uma espécie neutra que já é retida
pela fase estacionária.
Por exemplo, os ácidos carboxílicos têm tendência a ser ionizados, ficando apolares e saem todos ao
mesmo tempo, mas se adicionarmos um par iónico, neutralizamos a molécula, o que aumenta o tempo
de retenção.
Exemplos:
153
 Cromatografia com Fase Estacionária Quiral
Vai ter mais afinidade para um enantiómero R ou S.
Consiste em imobilizar um enantiómero singular na fase estacionária.
A resolução depende da forma de diastereoisómeros de transição na superfície interior da coluna. O
composto que formar o diastereoisómero mais estável será mais retido, enquanto que o enantiómero
oposto formaram um diastereoisómero menos estável e será eluído primeiro.

 Cromatografia de Adsorção
Cromatografia líquido-sólido – Fases estacionárias usadas são a sílica e alumina. Os analitos ficam mais
ou menos retidos na sílica.
A única variável a optimizar é a composição da fase móvel.
Ordem dos tempos de retenção:

Aplicações:
• Compostos não-polares com massas
moleculares menores que 5000
• Separação de isómeros (TLC)

 Cromatografia Iónica
Permuta iónica: consiste num processo em que se utiliza uma
fase estacionária constituída pelo denominado permutador
iónico, o qual está em contacto com os iões dissolvidos na fase
móvel sendo estas duas fases imiscíveis.
A fase estacionária é constituída por um permutador iónico
que contem grupos ionizáveis capazes de trocar iões destes
grupos com outros iões de carga similar que ocorram no meio.
São resinas, polímeros, ao qual se ligam os permutadores.
É utlizada para iões e tem que estar preparado para pHs
agressivos (extremos).
154
Consoante os iões que vou separar (aniões ou catiões) tenho de usar colunas diferentes, ou seja, se vou
separar aniões, tenho de usar uma coluna de troca aniónica, mas se vou separar catiões, tenho de usar
uma coluna de troca catiónica.
Ao variar o pH do eluente tenho eluições diferentes.

• Resinas para cromatografia de troca-iónica

Sendo Mx+ um catião de carga x

≠ catiões têm ≠ valores de Keq (constantes de equilíbrio, relacionado com a carga e tamanho do
ião) , logo ≠ afinidades para a fase estacionária, ouse já, tem diferentes tempos de retenção.
O tempo de eluição para cada catião pode ser ajustado através do pH

• Supressor de micro-membrana
UV-Visível
O supressor encontra se entre
a coluna e o detetor e vai
suprimir o sinal do eluente,
que também conduz a corrente
eléctrica.
É necessário pois o eluente
tem um sinal elevado que
retira a sensibilidade do Condutimetria
método.

155
Antigamente tinha que se fornecer ácido.
Funciona com um sistema de regeneração.
Funciona paralelamente e em contra corrente.

Aumentar a capacidade de
detecção, diminuído ruído
de fundo do eluente
• Mecanismo de supressão electrolítica
Atualmente usa se a supressão eletrolíticos (H 2 O + cátodo + ânodo). Neste só é necessário
fornecer água, que oxida no ânodo, ocorrendo a libertação de H+, que se junta no eluente. Já o
cátodo liberta OH-. Basicamente, se o nosso eluente for NaOH, o H+ do supressor, sai do ânodo
para a coluna, onde troca como o Na+, ligando-se ao OH- deste, formando um composto que não
conduz a corrente elétrica e que também aumenta o sinal dos analitos da amostra. Por fim, o Na+
vai para o cátodo, que produz OH-, que se vai ligar ao Na+.

NaOH – base – diminuição do sinal de H2SO4 – ácido


background do eluente
e- vão para o ânodo formando H+ 156
H+ vão para o cátodo, formando OH-
• Cromatógrafo iónico com gerador de eluente
É ainda possível que o próprio cromatógrafo gere o eluente, sendo que o que passa pela bomba é
H 2 O, o que aumenta o seu tempo de vida.

• Eluentes mais utilizados para cromatografia de permuta aniónica

• Aplicações da Cromatografia Iónica


Maior tolerância de matriz pois só ocorre uma interacção
durante a separação.
Detetor espectrofotométrico também pode ser utilizado no caso
da amostra conter iões moleculares, compor exemplo proteínas,
que absorvem no ulta-violeta ou visível.

157
• Cromatografia Iónica – HCO 3 -/CO 3 - Eluente

• Cromatografia Iónica – HO- Eluente

158
• Iões com pK a˃7
Detetor amperométrico (método de impulsos), não usa supressor.
Medida da alteração da corrente eléctrica durante a oxidação,
redução ou formação de complexos de uma espécie à superfície do
eléctrodo.
Análise de: açúcares, álcoois, nitroaromáticos, etc.

 Cromatografia de Exclusão
Aplica-se a grandes moléculas.
Permite a determinação do peso molecular, a
identificação e a separação.
É a única em que não há qualquer interacção entre o
analito e os componentes da fase estacionária.
Fase estacionária apresenta poros (porosa, tamanho
regulado) que retêm as moléculas mais pequenas e as
médias. As grandes não penetram nos poros, pelo que
são eluídas primeiro.
A fase estacionária é um gel formado por cadeias
poliméricas que estabelecem ligações cruzadas,
formando poros.
A filtração em gel é uma cromatografia de exclusão
em que a fase móvel é aquosa, e usa se para
substâncias muito polares.
Na permeabilidade em gel, é uma cromatografia de
exclusão em que a fase móvel é orgânica e usa se para
substâncias apolares.
Esquema da estrutura química de um tipo de gel

Nome comercial – Sephadex. A fase estacionária mais usada é um gel de dextrano, um polissacarídeo
com unidades de glicose.

159
• Equação de Eluição
A coluna pode ser vista como sendo composta por três
volumes diferentes:
1. Volume do eluente fora das partículas porosas do
gel (V 0 );
2. Volume do eluente que se encontra dentro dos
poros do gel (V i );
3. Volume ocupado pela matriz sólida do gel (V g ).

Todas as moléculas, indiferentemente do tamanho, têm acesso ao volume 1 (V 0 ), e nenhuma tem


acesso ao volume 3 (V g ), que corresponde à fase estacionária.
O acesso ao volume 2 (V i ) depende do tamanho das moléculas e do tamanho dos poros do gel:
 Moléculas de grandes dimensões: V e = V 0 (K = 0)
 Moléculas de dimensões suficientemente pequenas para penetrarem livremente nos
poros: V e = V 0 + V i (K = 1)
 Moléculas de dimensões intermédias: V e = V 0 + V i (0 ˂ K ˂ 1)

Se considerarmos a fase estacionária - V i V e = V 0 + V i .K → K = V e - V 0 / V i


Se considerarmos a fase estacionária - V i + V g

Constante de distribuição (K):

K = concentração média do soluto dentro/concentração do soluto fora

Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de dimensões


diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de MW. Este também permite verificar se
estou a fazer boas separações, ao comparar entre colunas.
V 0 é calculado normalmente com moléculas de grandes
dimensões (ex. azul dextrano 2000).
Moléculas de tamanho intermédio: 0 ˂ Kav ˂ 1

Se a porosidade da fase estacionária não for a adequada à


amostra, moléculas de tamanhos diferentes passam a ter
igual dificuldade em penetrar nos poros pelo que são eluídas
ao mesmo tempo.
Assim o tamanho dos poros tem que ser muito bem escolhido
para fazer uma boa separação. Tomando como exemplo a

160
160
figura ao lado, no primeiro caso, como o poro é muito grande, as moléculas pequenas e
intermédias entram quase ao mesmo tempo no gel. Já no último caso, como os poros são muito
pequenos, as moléculas grandes e pequenas não entram nos poros do gel.
Pode ocorrer por filtração em gel (fase móvel aquosa, aplica-se a amostras polares) ou por
permeação em gel (fase móvel orgânica, aplica-se a amostras apolares).
• Curva de Permeabilidade
A separação de acordo com o tamanho das moléculas ocorre
entre o volume de exclusão e o volume de permeação total.

Tipos de separação HPLC

Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UPLC)


Com uma fase estacionária com partículas de 1,7 µm, capazes de suportar ainda mais altas pressões, a UPLC
estende a teoria e os princípios do HPLC.
Maior velocidade
Maior resolução
Maior sensibilidade
Mais económica em eluente e tempo.
Menor gasto de reagentes e solventes ultra-purificados

161
162
Eletroforese Capilar
- Eletroforese. Em que consiste?
Baseia-se no facto das espécies químicas migrarem com uma velocidade que é função da sua carga e tamanho
quando um campo eléctrico é aplicado.
A electroforese é uma técnica que permite a separação de espécies químicas ionizadas ou não, presentes nas
amostras em estudo.

- Eletroforese Clássica
Exemplo: A Eletroforese das Proteínas séricas separa as proteínas em 5 zonas bem diferenciadas:
albumina, alfa-1-globulina, alfa-2-globulina, beta globulina e gamaglobulinas.

Os géis de poliacrilamida são comumente utilizados na separação de proteínas.


Os géis de agarose são utilizados para macromoléculas com massa molecular a superior a 200 kD (ácidos
nucleicos).

- Desenvolvimentos na Técnica de Eletroforese


• 1930 - Tiselius, primeiro aparelho de
electroforese com algum grau de
aperfeiçoamento;
• 1948 - Tiselius recebe o prémio Nobel
pelo trabalho desenvolvido;
• 1948.... Electroforese utilizada por
bioquímicos e biólogos no estudo de
proteínas, polinucleótidos e outros
biopolímeros.

(Eletroforese Capilar - EC)

• 1967 - Hjerten utilizou pela primeira vez tubos de vidro com um diâmetro interno (d.i.) de
aproximadamente 3 mm.
• 1979 - Mikkers utilizou tubos capilares de politetrafluoretileno (PTFE) com d.i. de 200 μm para a
separação de iões orgânicos e inorgânicos.
• 1981 - Jorgenson e Lukacs descreveram as vantagens da utilização da EC, também denominada
por alguns de eletroforese capilar de zona (ECZ) ou eletroforese capilar de alta eficiência (HPCE).
163
Nas separações efetuadas utilizaram capilares de vidro com d.i. de 75-100 μm e o potencial
máximo aplicado nos extremos do capilar era de 30kV.
• 1989 - foi comercializado pela primeira vez um aparelho de eletroforese capilar.

- Fundamento do Método de Separação por EC


Se for aplicada uma diferença de potencial entre os extremos de um capilar cheio com uma solução tampão (pH
definido), desenvolve-se uma corrente (i) através do capilar a qual é definida pela expressão:

𝑖𝑖 = 𝜋𝜋 ∙ 𝑟𝑟 2 ∙ 𝑘𝑘 ∙ 𝐸𝐸
Legenda:
 K - condutividade elétrica do tampão (Ω-1 m-1)
 r - raio do capilar (m)
𝑽𝑽
 E - campo elétrico aplicado (V m-1) 𝑬𝑬 =
𝑳𝑳

Em que:
V - potencial aplicado
L - comprimento do capilar

O valor da intensidade de corrente ao longo do capilar deverá ser constante em qualquer secção do capilar.

- Mobilidade Iónica (μ)


Quando se introduz uma partícula carregada no interior do capilar, esta fica sujeita a duas forças: Força
eletrostática (F) e Força de Atrito (F at ).

Legenda:
 F - força eletrostática que se faz sentir numa partícula (i) carregada,
 E - campo elétrico aplicado
 q i - carga da partícula

A partícula ao movimentar-se no sentido do elétrodo de sinal contrário ao da sua carga, provoca uma
força de atrito (F at ) que se opõe ao seu movimento, e cuja intensidade é dada pela equação de Stokes:

𝐹𝐹𝑎𝑎𝑎𝑎 = −6𝜋𝜋 ∙ 𝜂𝜂 ∙ 𝑟𝑟𝑖𝑖 ∙ 𝑣𝑣𝑖𝑖


η - viscosidade da solução; r i - raio da partícula I; v i - velocidade da partícula

Quando a força de aceleração (F) é contrabalançada pela força retardadora (F at ) a carga elétrica adquire
uma determinada velocidade estacionária:

𝑞𝑞𝑖𝑖 ∙ 𝐸𝐸 164
𝑣𝑣𝑖𝑖 =
6𝜋𝜋 ∙ 𝜂𝜂 ∙ 𝑟𝑟𝑖𝑖
Considerando que a mobilidade iónica (μ i ):

𝑣𝑣𝑖𝑖
𝜇𝜇𝑖𝑖 =
𝐸𝐸
𝑽𝑽
E que 𝑬𝑬 = ( V é o potencial aplicado e L é o comprimento do capilar utilizado na análise). Obtemos a
𝑳𝑳
seguinte expressão através da junção das 2 últimas fórmulas:

𝑞𝑞𝑖𝑖
𝜇𝜇𝑖𝑖 =
6𝜋𝜋 ∙ 𝜂𝜂 ∙ 𝑟𝑟𝑖𝑖
- Mecanismo de Separação em Eletroforese Capilar (ECZ)
A separação dos diferentes constituintes da amostra dá-se dentro de um capilar com 75-100μm de
diâmetro interno, entre as extremidades do qual se aplica uma diferença de potencial de 30 KV.

- Mecanismo de Separação em Eletroforese Capilar (ECZ)


A velocidade de migração de cada espécie e, consequentemente, a eficácia de separação, depende de
diversos factores das:
 Características do Ião
 Tamanho → Quanto maior, menor a velocidade de migração.
 Carga → Quanto maior for, maior a eficácia da separação.

165
 Características do Meio
1. pH
Ao condicionar a ionização da parede do capilar, condicionam o número de cargas positivas
a que ela se ligam, o que condiciona o fluxo eletroosmótico. Por outro lado, o pH condiciona
o grau de ionização das espécies da amostra, o que interfere com a sua carga.
(Regra geral: quando o pH baixa o tempo de migração diminui)
2. Temperatura
Ocorre um aumento da mobilidade do ião com o aumento da temperatura (1 ˚C = 0.5 a
3%), por diminuição da viscosidade do meio.
3. Força Iónica
Corresponde ao número de cargas do meio que se dispõem em torno da espécie carregada
da amostra, o que dificulta a sua migração.
4. Viscosidade
Quanto menor for, maior a velocidade de migração.
5. Fluxo Eletroosmótico

1. Efeito da Variação do pH do Tampão no Tempo de Migração Médio de Vários Padrões

Quanto maior é o pH (menor a [H+], maior é o tempo de migração.

2. Efeito da Variação da Temperatura no Tempo de Migração Médio de Vários Padrões

A mobilidade para a maioria dos iões aumenta 0.5 a 3% quando a temperatura varia 1ºC.

166
Quanto maior é a temperatura do meio, menor é o tempo de migração.

A viscosidade altera-se 2% por ºC de variação de temperatura.


3. Efeito da Força Iónica do Tampão no Tempo de Migração

Aumento da força iónica, diminui a


mobilidade do ião. Logo, a carga efetiva
diminui levando ao aumento do tempo de
migração.

Atmosfera iónica em torno de um ião de carga negativa.


Quando aumenta a força iónica (I) vai diminuir a mobilidade do ião por diminuir a sua carga efetiva.

1
𝑖𝑖 = � 𝑐𝑐𝑖𝑖 ⋅ 𝑞𝑞𝑖𝑖2
2
4. Efeito da Variação da Viscosidade do Tampão no Tempo de Migração
• Se aumenta a viscosidade do meio diminui a mobilidade iónica do ião.
• A adição de modificadores orgânicos (como o alcool) ao tampão pode provocar alterações da
viscosidade das soluções.

Variação da viscosidade relativa de


uma solução constituída por
concentração crescente de etanol,
medida a uma temperatura de 20ºC
relativamente à viscosidade da água.

167
- Electroforegramas da mesma mistura de padrões em ensaios repetidos no tempo

Qual poderá ser a razão para este efeito?


Não, repetibilidade dos tempos de migração em EC.

- Componentes de um Equipamento de Electroforese Capilar (EC)

168
- Componentes de um Equipamento de Electroforese Capilar (EC)

1- Fonte de alta voltagem; 2- frasco de entrada do tampão/amostra; 3- tampa de acesso ao forno;


4- módulo de programação das condições de análise; 5- manga para manter a temperatura no
interior do capilar; 6- detetor; 7- zona da janela de deteção no capilar; 8- elétrodo; 9- frasco de
saída do tampão; 10- capilar de sílica.

Fonte de Alta Voltagem


• 30KV
• Eléctrodos de platina imersos no recipiente de partida e de recolha
Capilares
• São constituídos por sílica e revestidos por poliamida, o que lhes confere alguma
flexibilidade e resistência.
• A superfície interna do capilar é formada por grupos silanol Si-OH.
- A pH inferior a 2 a sílica é protonada a Si-OH 2 +
- A pH superior a 2 a sílica é desprotonada a SiO-. É sob esta forma que a parede de sílica do
capilar se encontra quando se pretende efectuar EC.
• Como a parede tem um excesso de cargas negativas, os catiões do tampão dispõem-se junto à
parede, de forma a revesti-la, formando uma dupla camada eléctrica.
• Ao aplicar uma diferença de potencial, os catiões do tampão vão deslocar-se em direcção ao
cátodo, o que provoca a migração de todo o conteúdo do capilar nessa direcção.
• Esta migração forçada de todas as moléculas em direcção ao cátodo, por acção do campo
eléctrico que provoca a deslocação das moléculas positivas do tampão, é designada por fluxo
electroosmótico (µeo) o Introduzindo a amostra a analisar no capilar (junto ao ânodo), os
diferentes componentes vão ser separados devido às suas diferentes velocidades de migração:
169
1) Catiões: deslocam-se por acção do fluxo electroosmótico e pela mobilidade do próprio
ião, que migraria por si só para o cátodo. São as espécies que migram mais rapidamente,
sendo as primeiras a atingir ao detector.
2) Moléculas neutras: descolam-se apenas por acção do fluxo electroosmótico
3) Aniões: descolam-se por acção do µeo que contraria a mobilidade do próprio-ião, que
migraria para o ânodo (µeo é sempre superior a µ ). São as últimas espécies a atingir o
detector.

- Como pode ser feita a injecção da amostra?


 Hidrodinâmica:
 Diferença de alturas;
 Aplicação de pressão;
 Vácuo;
 Eletrocinética

- Funcões do Tampão para a EC:


 Ionizar a sílica do capilar
 Ionizar as espécies da amostra

- Um Tampão para EC deve Satisfazer as Seguintes Condições:


1. Ser estável.
2. Originar uma separação satisfatória dos diferentes componentes da amostra.
3. Deve assegurar condições de separação reprodutíveis ao longo do capilar e após várias análises.

170
- Tampões mais utilizados em EC:
 Químicos:
• Citrato (pH=2.1-7.7)
• Fosfato
• Acetato (pH=3.8-5.8)
• Borato (pH=8.1-10.1)

 Biológicos:
• MES (pH=5.5-6.7) e TRIS (pH=7.3-9.3)

MES - Ácido 2-morfolinoetanosulfónico monohidratado


TRIS - tris(hidroximetil)aminometano

A escolha do tampão depende do pH a que se vai trabalhar, o que depende do pKa dos componentes
da amostra.
Aos tampões podem ainda ser adicionados solventes orgânicos ou surfactantes, que alteram as
características da análise:
• Solventes orgânicos, como o etanol, modificam a mobilidade do ião;
• Surfactantes (acima da concentração micelar critica) formam micelas que incorporam os
compostos neutros e facilitam ou dificultam a sua migração, promovendo uma separação mais
eficaz destes compostos.

- Mecanismo de Separação em Electroforese Capilar (ECZ)

171
- Cromatografia Electrocinética Capilar por Micelas

- Exemplo: Eletroforegramas de extratos de plantas com (A) e sem adição de micelas de SDS (B) ao tampão
utilizado na análise.

172
- Efeito da Adição de Surfactante
Alteração da velocidade eletroforética de diferentes analitos por adição de SDS a uma solução tampão.

- Detetores
 UV-visível
a) Para conseguir detectar os compostos no
capilar é necessário remover o
revestimento de poliamida numa pequena
secção do capilar, a fim de formar a janela
de detecção.
b) É muito utilizado mas apresenta uma grande limitação, possui baixa sensibilidade devido ao
pequeno percurso óptico do capilar. Para solucionar este problema foram desenvolvidos
capilares com uma zona onde o percurso óptico é maior:
 Célula em bolha
 Célula em Z

 Fluorescência
 Electroquímicos (potenciométricos, condutividade, amperométricos)
 Espectrometria de massa
173
1) Detetores: Capilar com “bolha”

2) Detetores: Célula em Z

- Sistema de Aquisição de Dados


 Sistemas de aquisição de dados aplicados exclusivamente à técnica de electroforese capilar
são ainda raros, utilizando-se habitualmente “software” de cromatografia.
 Dadas as características próprias da técnica vantagem em criar sistemas de tratamento de dados
mais dirigidos:

- Por exemplo um composto separado por HPLC pode dar origem a um pico com uma
largura de base entre 10 a 60 segundos, e a velocidade de aquisição de dados deverá ser da
ordem de 1 a 0.2 pontos/segundo. Na electroforese capilar as larguras de pico variam entre
0.2 e 5 segundos e requerem uma velocidade de aquisição da ordem de 2 a
50 pontos/segundo.

- Cuidados e Controle do Funcionamento dos Capilares:


 Lavar com base durante 30min antes da análise
 Lavar com base e tampão durante 1min entre análises
 Acondicionamento em novo;
 Acondicionamento diário;
 Controle do fluxo electroosmótico:
• Análise de um composto neutro: acetona
174
• Análise de um composto que migre no interior das micelas (MEKC): Sudan III

- Determinação da Mobilidade Electroforética:

𝐿𝐿𝑑𝑑
� � 𝐿𝐿𝑑𝑑 ∙ 𝐿𝐿𝑡𝑡
𝜇𝜇𝑎𝑎𝑎𝑎 = 𝑡𝑡 =
𝑉𝑉 𝑡𝑡 ∙ 𝑉𝑉
� �
𝐿𝐿𝑡𝑡
Legenda:
L d - distância do local de injeção ao detetor (m)
t - tempo de migração do composto (s)
V - potencial aplicado (V)
L t - comprimento do capilar (m)
Exemplo:

- Eficiência: A Equação de Van Deemter em Electroforese Capilar

175
- Eficiência das Separações: Factores Condicionantes do Alargamento das Bandas
 Difusão Molecular
 Aquecimento Joule

- A passagem da corrente promove um aquecimento do capilar


- Causa alargamento dos picos
- Para evitar: - Usar voltagem e tampão em concentrações adequadas

 Comprimento de “injeção”
- Comprimentos na ordem de mm podem ser grandes, pois a janela de detecção é da
ordem de 0,1 mm
- Causa alargamento dos picos
- Para evitar: - Usar um solvente com força iónica menor que a do tampão

(a corrente atua mais sobre os analitos, que chegarão mais rápido na outra extremidade do
capilar)

- Conceito de Prato Teórico

1. A utilização de potenciais mais elevados aumenta a eficiência (N), mas está condicionada
pela produção de calor;
2. Para uma razão Ld/Lt no valor de N é independente do tamanho do capilar;
3. N depende de factores intrínsecos à espécie em análise.

176
- Diferentes Modos de Electroforese Capilar
 Electroforese Capilar de Zona
 Electroforese Capilar em Gel
Separa as moléculas tendo em conta o seu tamanho.
1. Utilizada na análise de : oligonucleótidos, fragmentos de DNA e proteínas.
2. A separação ocorre quando se enche o capilar com uma matriz por exemplo,
poliacrilamida ou agarose ou outros polímeros.
3. As vantagens relativamente à electroforese em gel clássica:
a) Utilização de uma maior gama de matrizes de gel de diferente composição
b) Detecção on-line
c) Melhor quantificação
d) Possibilidade de automatização.
 Focagem Isoeléctrica Capilar
1. CIEF é utilizada para separar principalmente proteínas, e baseia-se nos valores diferentes
para os seus pontos isoeléctricos (pI).
2. O capilar é cheio com uma mistura de anfólitos e a amostra, formando-se um gradiente
de pH.
3. Aplica-se um campo eléctrico através do capilar o qual está em contacto com uma
solução básica no cátodo e uma solução ácida no ânodo, os anfólitos e solutos migram
até encontrar a região onde a sua carga é neutra (pH=pI). As zonas dos anfólitos e dos
solutos são muito estreitas porque a difusão para uma zona de pH diferente resulta no
aparecimento de carga e subsequente migração para a sua própria zona.
 Cromatografia Electrocinética Capilar por Micelas
1. Amostras separadas pela partição diferencial entre as micelas (fase pseudoestacionária)
e a solução aquosa envolvente (fase móvel).
2. A solução aquosa contém uma concentração de surfactante acima da concentração
micelar critica.
 Isotacoforese
177
- Comparação EC/HPLC
A. Vantagens da EC:
1. Baixos volumes de amostra
2. Baixos volumes de solução tampão
3. Tempos de análise mais curtos
4. Mecanismo de separação diferente
5. Campos de aplicação
B. Desvantagens da EC:
1. Irreprodutibilidade dos tempos de migração
2. Dependente da temperatura
3. Deteção

- Campo de Aplicação
 Análise clínicas, biomédicas e forênsicas;
 Análise de DNA e ácidos nucleicos;
 Análise de açúcares;
 Metais e moléculas orgânicas pequenas (por exemplo ácidos);
 Produtos farmacêuticos- tem sido aplicada numa variedade grande de drogas nomeadamente
antibióticos e sulfonamidas:
- produtos protonados a baixo pH (2.5)- tampão fosfato
- drogas ácidas utilizam tampão borato e fosfato (pH 7-10)
- compostos neutros utilizam micelas
 Separação de compostos quirais;

- Conclusão: EC versus HPLC

178
179
Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

O objetivo do RMN é a identificação estrutural.


A palavra RMN vem de ressonância, porque existe um efeito de ressonância, vêm de campo magnético
pois é aplicado um campo magnético externo e de nuclear vêm de núcleo, não de energia nuclear ao
contrário que muita gente pensa, mas do núcleo dos átomos nomeadamente os átomos de hidrogénio
(RMN do Protão) e do carbono (RMN do Carbono) entre outros.

O que podemos obter com o RMN?


Obtemos espetros de RMN a partir dos quais nós podemos analisar os sinais, construir um “puzzle” e
chegar à identificação estrutural se for esse o nosso objetivo.

Mas muito importante, a nível médico, foi o desenvolvimento técnicas de imagiológicas por RMN, que
levou à atribuição do prémio nobel da Fisiologia e Medicina em 2003.
(É interessante salientar que isto não foi assim há tanto tempo. E a ressonância magnética nuclear, é
vista apenas como ressonância magnética, retirou-se a palavra “nuclear” porque as pessoas tinham
medo… só pelo simples facto de ouvirem a palavra “nuclear”.)

A ressonância magnética é uma das ferramentas de diagnóstico mais poderosas que existe.

180
Existe várias ténicas para analisar a estrutura molecular:

1) Espectroscopia de RX
2) Espectroscopia de UV- Vísivel
3) Espectroscopia de Infravermelho
4) Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

São técnicas para analisar a estrutura molecular, destas todas só não estudamos a espectroscopia de
RX. Mas também podemos fazer análise de RX para fazer identificação estrutural, aliás é uma técnica
comum e as substâncias têm que estar no estado cristalino.

Focando-nos apena na Espetroscopia de Ressonância Magnética Nuclear, e como é uma técnica


espetroscópica utiliza-se radiações do espetro eletromagnético. Mas desta vez, as radiações do espetro
eletromagnético que vamos usar ficam situadas no extremo direito do espetro, ou seja nas ondas de
radiofrequência. E, portanto, como nós sabemos estas radiações são pouco energéticas.
Resumindo, o RMN utiliza radiação eletromagnética, mas é uma radiação pouco energética e fica situada
na zona da radiofrequência.

Como é o RMN?

É uma técnica espectroscópica na qual, como resultado das propriedades magnéticas do


núcleo atómico, devidas ao seu movimento axial de rotação (spin), se dá a absorção de
radiações de radiofrequência, sob influência de um campo magnético externo.

181
- História do RMN

O primeiro espetro de ressonância magnética foi feito com o espetro da água através de um osciloscópio
e como é possível verificar, é possível notar que é bastante rudimentar e foi em 1946.
Em 1951, já havia um equipamento de
ressonância magnética e traçou-se o
primeiro espectro de RMN do etanol - 3
sinais característicos (CH 3 + CH 2 + OH)
logo 3 ondas. Por fim, o 1º
espectrómetro a 40 MHz foi feito pela
Varian e ocupava uma sala inteira.

Por causa disto, foi atribuído o prémio nobel da Física em 1952 ao Bloch e ao Purcell. E depois disto
houve vários prémios nobel devidos ás técnicas de RMN em 1991, em 2002 (aplicação do RMN ao estudo
da biologia estrutural) e em 2003 (das técnicas imagiológicas por RMN, como já foi referido
anteriormente).

182
- A origem do sinal de RMN: spin nuclear
Porque é que existe o RMN? Quais são as propriedades dos núcleos que nos permitem que se façam
uma experiência de RMN?

Os eletrões se deslocam a nível da nuvem eletrónica e eles têm


movimento.
E o núcleo por si tem também movimento, isto é, tem movimento rotação
e é esse movimento rotação ao longo do seu eixo se chama “spin nuclear”.
Quando as cargas estão em movimento, vai haver a produção de uma
corrente elétrica e essa corrente elétrica vai induzir um campo magnético,
é por isso que se chama campo magnético induzido. Como temos um
campo magnético induzido podemos dizer que alguns núcleos (nem todos),
comportam-se como pequenos imanes.
É esse facto que faz com que possa haver interação com o campo
magnético externo que é aplicado no equipamento de RMN.
Nem todos os núcleos têm estas propriedades, apenas os núcleos que têm
número ímpar de protões ou de neutrões têm estas propriedades a que se
chamam propriedades magnéticas ou giromagnéticas.
Como é o exemplo do protão, do carbono 13, o azoto, Fluor 19 e fósforo,
todos estes que têm número quântico spin ½, eles têm propriedades
magnéticas o que nos possibilita fazer RMNs de qualquer destes núcleos
(com os números ímpares). (Ver Tabela a baixo)

Para isso é preciso ter uma sonda adequada, a maior parte das sondas dos equipamentos de RMN são
sondas de protão e de carbono logo conseguimos fazes espetros de protão e de carbono, mas se
quisermos por exemplo fazer um espetro de flúor ou de fósforo, temos de ter uma sonda adequada. Por
exemplo, não se consegue fazer RMNs com o carbono 11 ou deutério… também não aparece…. porque
estes são “pares”, então não dão sinal no RMN.

Por outro lado, o RMN é uma técnica pouco sensível. A sensibilidade para o protão é de 100 %, porque
existe em grande quantidade, isto é, a abundância natural é de 99,98 %. Mas, por exemplo, no caso do
carbono, se quisermos fazer um espetro de carbono precisamos de ter muito mais amostra ou então

183
temos que fazer uma experiência durante muito mais tempo dado que a abundância do carbono é 1,1
% e isto vai fazer com que a sensibilidade seja 1,59 %.

Como já vimos, o próprio núcleo com o seu movimento de spin ele gera um campo magnético induzido.
Na ausência do campo magnético externo (B 0 ou H 0 ), os núcleos não têm uma orientação definida, eles
orientam-se aleatoriamente, isto é, não há orientação dos núcleos.

Quando se aplica a amostra no equipamento, e a amostra tanto pode ser tanto líquida como podemos
ser nós próprios a entrar para o equipamento de ressonância magnética. Na presença de um campo
magnético externo, os núcleos deixam ter orientação aleatória e passam a orientar-se de duas maneiras:

1) Ou eles se orientam a favor do campo e quando se orientam a favor do campo (paralelos ao


campo magnético externo) diz-se que estão no estado alfa.

2) Ou então o contrário, eles orientam-se contra o campo magnético externo (antiparalelos ao


campo magnético externo), diz-se estão no estado beta.

184
Há uma diferença de energia entre dois estados (alfa e beta), o estado alfa é menos energético que o
estado beta (mais energético) e essa energia é dada por a seguinte equação:

Na equação, temos a diferença de energia de dois estados a favor ou contra o campo vai ser diretamente
proporcional à razão giromagnética do núcleo e ao campo magnético externo.
Quanto maior for o campo magnético externo, maior será a diferença de energia entre dois estados,
como maior vai ser a diferença de energia maior será a dificuldade em passar do estado alfa para o
estado beta.
Nos espectrómetros comerciais, o campo magnético é dado em unidades de Tesla (T) e a ressonância
correspondente do protão é dada em MHz. Por exemplo, quando o campo magnético num equipamento
é de 1,41 T isso significa que este RMN é a 60 MHz, se por acaso for um equipamento a 7,04 T temos um
espectrómetro que trabalha a 300 MHz.

Quando se aplica o campo magnético para além


do movimento de spin dos núcleos, os núcleos
ganham outro movimento chamado de
movimento de precessão, isto quer dizer que
para além do spin eles vão a rodar sobre o seu
eixo, mas vão estar a rodar ligeiramente
inclinados.
Este movimento de precessão é caraterizado
por uma certa frequência, a que nós chamamos
frequência de precessão. E essa frequência de
precessão é dada pela equação de Larmor.

185
Nesta equação diz-nos que a frequência de precessão é diretamente proporcional à razão giromagnética
e ao campo magnético aplicado.
Esta frequência de precessão é importante pois explica o porquê de os núcleos entrarem em
ressonância.

O passo seguinte é irradiar a nossa amostra que está sujeita ao campo magnético externo com uma
certa energia, e esta energia é da zona das radiofrequências. Portanto, vai-se irradiar a amostra com um
intervalo de energias na zona das radiofrequências.

Quando uma certa radiofrequência com uma determinada frequência e estas duas coincidem, ou seja,
a frequência de precessão do núcleo coincide com a frequência da energia que lhe chega, essas duas
frequências vão acoplar (coincidem) e vai ser absorvida energia e quando vai ser absorvida energia o
núcleo vai mudar de spin, isto é, o núcleo que estava no estado alfa vão inverter o spin e passando assim
para o estado beta e diz-se que entrou em ressonância.

Resumo:
Porque é que ele entrou em ressonância?

Porque as duas frequências coincidiram, ele absorveu energia e inverteu o spin.

186
Neste esquema, quando o estado se chama “equilíbrio térmico”, ou seja, a amostra está sujeita ao
campo magnético temos alguns núcleos a favor do campo, outros contra.
Quando é incidida uma certa radiação radiofrequência, estes núcleos invertem o spin, passam a ficar
contra o campo magnético. Mas eles não ficam assim para sempre, eles mantêm-se assim quando a
radiação de radiofrequência se mantiver, quando ela acabar...os núcleos têm que voltar ao estado onde
estavam, ao estado alfa que é o de menor energia, e ao voltarem (ao estado alfa) eles vão emitir essa
energia – atenção isto não é uma técnica de emissão – ou seja, vai haver um relaxamento o que vai levar
à emissão de um sinal na gama das radiofrequências.

A esse sinal chama-se sinal FID (Free Induction Decay), o sinal FID representa conjunto de sinais de
radiofrequência emitidos pela amostra (Sinal vs Tempo) depois de acabar a irradiação de
radiofrequência lhe fornecemos; esse sinal aparece assim:

187
E fica cada vez mais ténue. Mas infelizmente não se consegue interpretar isto, então aplicando a
Transformada de Fourier, o sinal FID é transformado num sinal que se consiga interpretar, ou seja,
obtém-se o espectro que nos relaciona os sinais com as frequências.

Como já foi referido, o RMN é uma técnica pouco sensível, portanto teve que haver maneira aumentar
essa sensibilidade na técnica. Para se conseguir aumentar a sensibilidade, aumentou-se o campo
magnético aplicado. Quanto maior for o campo magnético aplicado, maior será a sensibilidade da
técnica. Tendo por isso existido um esforço para produzir magnetes mais fortes.

Vantagens de um magnete mais forte:

• Menores quantidades de amostra


• Conseguimos fazer experiências muito mais complexas
• Melhor razão Sinal/Ruído (porque há uma maior sensibilidade, logo maior resolução)
• Diminuição da sobreposição dos sinais

É claro que o aumento do magnete é diretamente proporcional ao preço.

188
- Componentes dos Espectrómetros de RMN

Todos espectrómetros de RMN são compostos por:

 Estação de Trabalho (computador)


 Consola
- Gerador de radiofrequências
- Detetor de radiofrequências
- Amplificador do sinal
 Sonda
 Magnete

- Uma Estação de Trabalho computorizada, é no computador que nós selecionamos as experiências que
queremos fazer e selecionamos todos os parâmetros que queremos selecionar para fazer essas
experiências;
- Depois temos uma parte que se chama a consola é o gerador de radiofrequências, vai gerar as
radiofrequências que vão ser emitidas para amostra, ou seja, vão irradiar a amostra; após a sonda
transmitir o sinal de radiofrequência que provêm da amostra para a consola, a consola vai detetar e em
seguida vai amplificá-lo esse sinal que é fraco;
- Também temos uma sonda (“probe” em inglês) que pode ser de carbono ou de protão ou de qualquer
núcleo; a sonda vai atuar com antena, isto é, vai ser a antena que recebe as radiofrequências que provêm
da consola e depois a radiofrequência que provêm da amostra, a sonda irá transmitir para a consola.
- Por fim, o magnete.

189
Existem dois espectrómetros de RMN:

1) Onda Contínua (CW – Continuous Wave), que foi utilizado até meados de 1970
2) Com Transformada de Fourier (FT)

Ambos os espectrómetros têm um magnete, isto é, têm um campo magnético externo.

• Onda Contínua (CW – Continuous Wave) até meados de 1970

No espectrómetro de onda contínua, a amostra era radiada com radiações de radiofrequências, mas era
uma radiação monocromática. Ou seja, a amostra era irradiada com um comprimento de onda com uma
radiação de cada vez. Originado assim, um impulso de cada vez, sabendo que existem várias frequências
de radiação na zona das radiofrequências, até cobrir todas as frequências possíveis demorava imenso
tempo (desvantagem). Por exemplo, para traçar um espetro de protão era imenso tempo despendido;
e portanto, cada sinal era colocado em ressonância um de cada vez, visto que era apenas um frequência
de cada vez que era incidia na amostra.

- Funcionamento:

Estes equipamentos funcionam colocando a amostra entre os dois polos de um magnete (eletomagnete
ou magnetes permanentes) rodeado por uma bobine de fio condutor. Pode-se então promover um
varrimento de frequências (varrimentos monocromáticos, 1 frequência de cada vez) ou em alternativa
o magnete pode ter bobines extra que podem ser utilizadas para fazer o varrimento do campo a uma
frequência fixa. O processo de aquisição de um espectro usando um equipamento CW demora
aproximadamente 5 min. Cada sinal é colocado em ressonância sequencialmente.

190
• Com Transformada de Fourier (FT)

Nos espectrómetros modernos (com transformada de


Fourier), é uma técnica muito mais rápida e a amostra
vai ser irradiada com um impulso, mas em intervalos
de frequências, com isto a amostra é irradiada com
várias frequências de cada vez. Por isso, isto faz com
que os sinais que me interessam entrem em
ressonância, todos ao mesmo tempo.

Por outras palavras:

Os espectrómetros modernos utilizam uma técnica


muito mais rápida – impulsos policromáticos que
cobrem todas as frequências desejadas obtendo-se
instantaneamente todo o espectro.
Para além disso também são registados os sinais de
radiofrequência emitidos pela amostra, ou seja, o
decaimento da absorção da radiação ao longo do
tempo (FID - Free Induction Decay). Este
procedimento requer uma análise computacional mais
elaborada denominada Transformada de Fourier (FT).

Para além da maior rapidez de análise, acumulação de múltiplos impulsos no mesmo espectro origina
uma maior sensibilidade. Isto significa que num intervalo de radiofrequências em que se tem de se fazer
a radiação da amostra, basta irradiá-la um vez e obtêm-se um sinal que vem da amostra e se irradiar a
amostra mais vezes o sinal será maior, logo vai aumentar a sensibilidade; a este número de impulsos
chamam-se experiências de varrimento, isto é, tendo a amostra vamos dar-lhe várias experiências de
varrimento que se chamam de “scans”, e pode-se variar o número de scans consoante a quantidade de
amostra que se tem. Quanto maior o número de scans maior a sensibilidade.

Por outras palavras:


FT- NMR - utilizam impulsos policromáticos - contendo um intervalo finito de frequências;
Todos os sinais que interessam são excitados simultaneamente e a aquisição do espectro pode ser
feita de uma só vez (alguns segundos).

O nº de experiências de varrimento chama-se nº de scans e a razão sinal /ruído é melhorada quando


aumentamos o nº de scans (embora não seja uma razão linear: o S é proporcional raiz quadrada do nº
de scans).
A seguir a cada impulso, o núcleo irá perder a sua energia e então dá-se inicio à aquisição dos sinais de
radiofrequência emitidos pela amostra, o que dá origem ao sinal FID – Free Induction Decay.

191
1. O campo magnético mantém-se constante.
2. A amostra é irradiada com um pequeno impulso de radiação da região da radiofrequência
3. Esta energia de radiofrequência dá origem à inversão simultânea dos spins dos núcleos suscetíveis.
4. Quando o impulso é descontinuado, descontinuado, isto é, quando amostra deixa de receber
energia, ela vai começar a emitir a sua própria radiação/ a sua própria frequência; os núcleos
começam a perder a sua energia e voltam ao estado de spin original; como as moléculas contêm
núcleos diferentes, muitas frequências de radiação são emitidas simultaneamente; A esta emissão
dá-se o nome de FREE-INDUCTION DECAY e origina o sinal FID;
5. A intensidade do sinal FID diminui com o tempo e tende para zero à medida que os núcleos voltam
ao estado de equilíbrio (estado alfa).

192
- Tipos de Magnetes
• Espectrómetros CW

 Magnete Permanente (não são suficientemente fortes a campos superiores a 90 MHz)


 Eletromagnete (consomem demasiada eletricidade, seriam de enorme tamanho para
manter uma resistência baixa e necessitariam de arrefecimento para contrariar o efeito
térmico da passagem da corrente elétrica)

• Espectrómetros FT

 Magnete Supercondutor (a evolução dos materiais supercondutores possibilitou o


desenvolvimento de espectrómetros de RMN a campos magnéticos superiores).

Para que se mantenham as propriedades de supercondutor, é preciso que a resistência a passagem da


corrente seja mínima e para que a resistência á passagem da frequência seja mínima estes
supercondutores precisam de ser arrefecidos a uma temperatura muito baixa na ordem dos -269 graus.
Para que isto seja cumprido, envolve-se os magnetes num “termo” com hélio líquido.

193
No interior temos as bobinas supercondutoras (“superconducting coil”) para manter a sua resistência
mínima á passagem da corrente elétrica, ou seja, para manter as suas propriedades supercondutoras
elas precisam de estar envolvidas em hélio líquido.
Para se manter o hélio, envolve-se o hélio com azoto líquido que tem uma temperatura de -196 graus e
isto e minimiza as evaporizações do hélio. E senão fizermos isto, o magnete deixa de ter as suas
propriedades superindutoras.

É importante referir que a temperatura da amostra não pode estar numa temperatura tão baixa como
por exemplo a temperatura do hélio, tem que haver um bom isolamento
térmico entre a parte do hélio, ou seja, tem que haver vácuo; se a amostra está menos -269 graus
(temperatura) não se consegue fazer RMN.

194
- Preparação das amostras

Um RMN apesar de ser uma técnica pouco sensível, tem a propriedade de mostrar tudo o que é existe
na amostra, portanto estamos a fazer uma síntese ou um isolamento e queremos ter uma amostra pura
e afinal não é…. O RMN fica mal.

1) Tubos de RMN e tampas limpas

São tubos de vidros, finos, com vários diâmetros (a maior parte


das vezes usa-se com 5 mm) e têm uma tampa. Eles devem ser
sempre bem limpos e secos.
Depois de utilizados, os tubos de RMN devem ser lavados com
acetona ou outro solvente apropriado e bem secos com uma
corrente de ar ou N2 de modo a remover qualquer vestígio de
solvente; As tampas devem ser limpas do mesmo modo. Não utilizar tubos partidos.

2) Solventes deuterado

Devemos usar solventes deuterado, ou seja, a amostra não pode ser dissolvida num solvente
qualquer. Pois estes solventes não vão aparecer no RMN, porque deutério não tem RMN pois
não tem spin;
Entao, as amostras devem ser dissolvidas num solvente deuterado apropriado; O sinal do núcleo
de deutério é chamado “lock” e é utilizado para compensar os pequenos desvios do campo
magnético do espectrómetro.

3) Quantidade de amostra

Pode variar depende do equipamento que temos, por exemplo se tivermos um equipamento
com 900 MHz consegue-se fazer um espectro com menor quantidade de amostra em
comparação com um de 300 MHz. Se não houver amostra suficiente aumentasse o número de
“scans” / varrimentos que tem a contrapartida de aumentar o tempo da experiência.

Dependente do peso molecular da amostra, mas em regra:


1H-RMN: 5 - 25 mg
13C-RMN: o 13C é 6000 vezes menos sensível logo é necessária maior quantidade de amostra;
amostras menos concentradas é necessário proceder a um maior tempo de análise;
195
Atenção: amostras muito concentradas podem originar sinais 1H mais alargados e com menor
definição devido ao aumento da viscosidade da amostra.

4) Remoção de Partículas Sólidas

Temos que remover as partículas sólidas, porque estas alteram a homogeneidade do campo
magnético originando sinais mal definidos. Ou seja, o campo magnético vem de baixo para cima
e se ele encontrar uma partícula sólida, ele deixa de ser homogéneo e começa a ter variações, o
que vai fazer com que o espetro fique mal resolvido, isto é, os picos não aparecem bem
separados.
As soluções devem estar límpidas; no caso de terem partículas em suspensão devem ser filtradas.

5) Altura correta da amostra

Também temos de ter cuidado com a quantidade de solvente deuterado que metemos, porque
amostra tem que ficar inserida no meio da sonda. Se não ficar em cima não chega nada à amostra
e esta não emite nada. É por isso que a amostra tem que ficar numa altura correta.
É por isso que se utilizasse um calibrador de alturas da altura do tubo, mete-se um tubo dentro
do “spinner” e depois ajustamos a altura de maneira que a amostra fique situada a meio da
sonda.

No magneto, a direção principal do campo magnético é vertical, ao longo do comprimento da


amostra. Cada extremidade da amostra provoca uma distorção da homogeneidade do campo
que é corrigida controlando o parâmetro “shim” do espectrómetro. Uma correção parcial é feita
para cada amostra e demora alguns minutos. A correção completa demora muitas horas usando

196
uma amostra de teste de alta qualidade. Assim, as amostras devem ser preparadas com uma
profundidade semelhante, de forma a que se assemelham fisicamente à amostra teste (~ 4 cm;
0,6 mL).

- Medidas de Segurança
Presença de fortes campos magnéticos
 Não colocar objetos de metal perto do magnete
 Manter cartões magnéticos, telemóveis, relógios analógicos afastados
 Proibida a aproximação de pessoas com pacemaker

Nunca colocar a amostra sem ouvir o ruído do elevador de ar comprimido.

197
- Os espectros de RMN

- Por que razão aparecem diversos sinais em várias posições do espectro?

Por causa da blindagem, esta depende dos vizinhos que existem (da nuvem eletrónica que existe). Por
exemplo, se tiver ao pé de um protão um átomo muito eletronegativo, o protão vai ficar desblindado
pois os eletrões foram puxados para ao pé do átomo eletronegativo, então, ao ficar desblindado vai
aparecer a valores mais altos do RMN.
Se ficar mais blindado aparece a valores mais baixos. A isto chamamos de Desvio químico

Desvio Químico: A posição do sinal de RMN depende do ambiente (nuvem) eletrónico(a) que envolve o
núcleo.

198
De modo a normalizar a escala de RMN (não dependente da frequência do equipamento) os desvios
químicos são calculados em relação a um valor de referência: desvio químico do tetrametilsilano [TMS:
(CH 3 ) 4 Si] que se assume como 0.

199
- Integração

A intensidade do sinal é diretamente proporcional ao nº de núcleos que originam esse sinal.

200
- Multiplicidade do sinal: acoplamento spin-spin

Acoplamento spin-spin: interação entre o spin nuclear de um átomo com o spin dos núcleos vizinho
através das ligações;
Multiplicidade: Depende do spin (I) e do nº de núcleos vizinhos
Regra da multiplicidade: m = 2nI+1

201
- Ressonância Magnética em Medicina

IRM – Imagens por Ressonância Magnética


MRI – Magnetic Resonance Imaging

 Técnica imagiológica não invasiva


 Não utiliza raios X nem outras radiações ionizantes e
é considerado inócuo para o organismo.
 Obtém imagens do corpo humano nos vários planos.
 Tem indicações vastas, de que são exemplos mais
frequentes a patologia articular (joelho, tornozelo,
ombro, anca), a patologia do Sistema Nervoso Central
(cérebro e medula espinal), e a patologia abdominal,
entre outras.
 Antes do exame ser-lhe-á pedido que retire qualquer
objeto que possa interferir com o campo magnético, tais como carteiras e moedas, jóias,
aparelhos auditivos, próteses dentárias com metal, chaves, relógios, cartões de crédito, objetos
metálicos ou magnetizados.
 Se tiver qualquer dos implantes ou condições indicadas abaixo poderá ser impedido de fazer o
exame de Ressonância Magnética:

 Pacemaker;
 Clip de aneurisma cerebral;
 Limalhas de ferro intraoculares;
 Próteses metálicas. Desta lista, apenas os dois primeiros casos constituem um impedimento
absoluto.

202
Espectrometria de Massa

Espetrometria de Massa é uma técnica que é utilizada junto com outras metodologias para nos ajudar a
identificar compostos.
Nota: O objetivo não é interpretar os espectros.

Esta imagem mostra-nos


vários métodos que podem
ser utilizados para uma
estrutura de um composto,
isto é, o que acontece
quando se está no
laboratório e se tem de
sintetizar algo… Após a
obtenção do pó sintetizado, é
necessário saber a sua
constituição e o seu grau de
pureza.
Para isso tem se de se fazer
um conjunto de ensaios para
avaliar esse pó.
Para esse fim, utiliza-se
diferentes metodologias
algumas delas que já foram
abordadas e outras não.
Por exemplo, a análise
elementar consiste na
determinação da
percentagem de carbono,
hidrogénio, oxigénio e azoto
no composto. Desta forma,
ficasse com uma noção se as
proporções que estes
elementos estão a aparecer
no pó correspondem ao
composto que se quer
sintetizar.
Por outro lado, pode-se fazer Espectros de Infravermelho para se identificar os grupos funcionais e
assim sabe-se se o composto do pó tem os mesmos grupos funcionais que substâncias que se pretende
sintetizar.
203
Também se têm o Espectro do RMN que foi falado anteriormente… E por fim, tem se a espectrometria
de Massa.

Na Espectrometria de Massa o que se está a fazer no fundo, na maioria das vezes, é a partir do traçar
de um espectro da interação da energia com a própria molécula que se quer analisar, vão se produzir
iões (ou radicais), e esses podem de alguma forma em função dessa energia sofrer fragmentação.

Qual é a informação que se retira do espectro de Massa?

Retira-se muita informação sobre o ião molecular, o ião percussor.


Atualmente utiliza-se mais a designação de “ião percursor”. Ou seja, a molécula que se está a analisar
forma um ião, e quando se analisa esse composto o valor m/z (relação massa-carga) que se vai ver no
espectro de massa pode corresponder ao peso molecular do composto que se está a analisar.
Isto é muito importante, porque nos dá logo a ideia se de facto estamos a sintetizar aquele composto
que queremos ou não.
Contudo, existe muitos compostos com a mesma massa molecular, e por isso o facto de se obter a
mesma massa molecular, não significa eu exatamente seja o composto que que se quer.

Por isso, pode-se fazer por exemplo experiências de fragmentação, ou seja, aplica-se mais energia à
molécula e assim começa-se a obter fragmentos, e há regras relativamente à maneira como as moléculas
se vão partindo. E são esses fragmentos que permitem confirmar se estamos na presença da molécula
que se quer analisar.
Porque a partir dos fragmentos consegue-se reconstituir a estrutura da molécula, como se fosse um
puzzle, ou seja, no espectro a molécula está partida em vários fragmentos e esses fragmentos na sua
totalidade vão dar origem à molécula inicial.
Isto significa que se tivermos, por exemplo, um anel benzeno com um grupo CH 3 e tiver a massa
correspondente a esse composto; um primeiro fragmento que se pode ver é a massa do composto
menos o grupo CH 3 . Significa que há determinadas diferenças em termos de massa no espetro de massa
que nós já sabemos que correspondem à saída de determinados grupos funcionais ou determinadas
partes da molécula.

A espectrometria de Massa é uma técnica que estuda as massas de átomo ou moléculas após a formação
de iões na fase gasosa e separação de acordo com massa/carga (m/z). Ou seja, em espectrometria de
Massa partirmos átomos e moléculas, formamos iões (estes têm que estar a fase gasosa) e esses iões
vão ser separados. Essa separação vai ocorrer de acordo com a sua relação m/z.

Quais serão os Passos Importantes desta Técnica?


São gerar os iões, separá-los (e eventualmente fragmentá-los; “eventualmente” porque nem todos os
equipamentos têm esta função de fragmentação) e depois detetar esses mesmos iões. O que acorre em
cada passo:

 Gerar os iões: as moléculas/átomos são ionizados. O processo de ionização pode envolver


energia suficiente para se formarem vários iões fragmento.
204
 Separar os iões: Os iões são acelerados (campo eléctrico/magnético) e depois separados de
acordo com o seu valor de m/z. Todo o processo decorre em alto vácuo.
 Deteção dos iões e medição da sua abundância.

Por isso, dentro do equipamento tem que existir componentes que vão permitir a realização de cada
um destes passos. O equipamento de Espectrometria de Massa é constituído por:
1. Um “Local de Introdução da Amostra”
2. A Fonte de Ionização é a peça do equipamento onde se vão gerar os iões na fase gasosa a partir
dos átomos ou moléculas. Há equipamentos com diferentes tipos de fontes de ionização;
3. O Analisador de Massa é onde irá ocorrer a separação dos iões na fase gasosa;
4. O Detetor onde vamos detetar esses mesmos iões e medir a sua abundância relativa;
5. Sistema de Vácuo
6. Um Periférico de Saída

Atenção:
Parte destes componentes estão em vácuo, nuns equipamentos o “vácuo” inclui a Fonte de Ionização,
Analisador e o Detetor....noutros a fonte de ionização está excluída.

No fim, vamos ter aquilo que se chama um Espectro de Massa, não é mais que uma representação
gráfica em que temos valores m/z no eixo das abcissas e a abundância relativa no eixo das ordenadas.
Um valor de m/z mais intenso possui maior abundância relativa em relação a outro valor m/z menos
intenso e vice-versa.
E é com base nestes espectros de massa que conseguimos fazer as identificações. Para isso, recorre-se
muito às tabelas das massas isotópicas – cada elemento possui diferentes isótopos com abundâncias
relativas completamente diferentes.
205
Tabela de Massas Isotópicas

Por exemplo, no hidrogénio o 1H a sua abundância é de 99,9885 %. Isto significa que a contribuição do
1H para o peso molecular de um composto é muito maior que os restantes isótopos (2H e 3H). Logo, se
pensarmos na contribuição no eixo dos yy para a abundância, a abundância do 1H será muito superior
em relação aos restantes.

Vejamos agora o exemplo do cloro, no caso do cloro este existe em 2 formas: 35Cl e 37 Cl.
No 35Cl a sua abundância é 75,78 % e no 37Cl é de 24,22 %. Isto significa num Espetro de Massa do Cloro
existe um valor (m/z) = 35 com um determinado valor de intensidade e no valor (m/z) = 37 terá um terço
do valor de intensidade do 35.
Ou seja, no espectro de massa de um composto qualquer se vê aparecer dois sinais que diferem 2
unidades e cuja intensidade do sinal é um terço do outro. Podemos supor que a molécula possua cloro.

206
Por isso, é através das razões isotópicas que chegamos à conclusão que existe um determinado
elemento. Outro exemplo é o bromo em que os dois isótopos aparecem na proporção de 50%.

Campos de Aplicação
Existem estes campos de aplicação:

 Biotecnologia: análise de proteínas, péptidos


 Farmácia: princípios ativos, farmacocinética, metabolismo de fármacos;
 Toxicologia: Identificação de drogas de abuso, análise de dopping
 Clínica: teste de novos medicamentos, screening neonatal
 Ambiente: PAH´s, qualidade da água;
 Alimentos: biomarcadores de consumo, contaminantes.
 Entre outros…

Hoje em dia quem faz cromatografia quer ter no fim um espectrómetro de massa, pelas mais várias
razões: porque a técnica é sensível; porque nos dá muita informação: identificação de compostos, em
termos de quantificação pode ser muito seletiva o que é muito importante, principalmente para
matrizes muito complexas esta técnica de espectrometria de massa permite-nos quantificar compostos
em quantidades/concentrações muito baixas (em matrizes muito complexas – urina, plasma, etc…).

- Técnica analítica utilizada para:


 Determinação das massas moleculares e composição elementar
 Identificação estrutural
 Determinação de massas isotópicas
 Identificação de compostos desconhecidos em misturas complexas
 Quantificação de compostos conhecidos

- Características:
 Técnica qualitativa e quantitativa, capaz de analisar misturas complexas

207
 Alta sensibilidade
 Universal e específica
 Técnica rápida

Introdução da Amostra
Existem várias formas de introduzir a amostra no sistema:

1. Introdução direta da amostra: gases, líquidos ou sólidos


a) Gases ou líquidos voláteis (ponto ebulição inferior a 500ºC)
b) Sólidos ou líquidos não voláteis (fixos)
Exemplo: É quando se tem um pó que foi sintetizado, não é preciso fazer técnica separativa; basta ver o
espetro de massa introduzindo a amostra no equipamento.

208
2. Introdução de amostra proveniente de um método separativo: dispositivos especiais de interligação
mais complexos

Diferentes Modos de Ionização

Aspetos a serem considerados na escolha do método de ionização:

 Volatilidade da substância
 Massa molecular
 Amostra pura ou mistura (gás, líquido ou sólido)
 Grau de fragmentação desejado
 Sensibilidade

Depois a seguir temos que ionizar o composto, e para ionizá-lo existem diversas metodologias, tais
como:
Hard ou
A. Impacto Eletrónico (EI)
Duras
B. Ionização Química (CI)
C. FAB (Fast Atom Bombardment)
D. Ionização à pressão atmosférica (API)
Solf ou
1) Electrospray (ESI)
suaves ou
brandas 2) Ionização Química à Pressão atmosférica (APCI)
3) APPI (Fotoionização à Pressão Atmosférica)

E. Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) = Ionização e dessorção a laser


assistida por matriz

209
A. Impacto Eletrónico (EI)

Geralmente é designa por “Hard”, porque é


muito destrutiva da amostra havendo uma
grande fragmentação quando se utiliza esta
fonte; a molécula é fragmentada,
originando muitos fragmentos e nem
sempre se reconhece o ião molecular. Este
facto dificulta a interpretação do espectro.
A câmara de ionização é mantida em vácuo
para minimizar as colisões ião-molécula.
Este Impacto Eletrónico (EI) é muitas vezes
utilizado associado á cromatografia de fase
gasosa.
Por isso, a maior parte dos equipamentos de cromatografia de fase gasosa utilizam como fonte de
ionização o Impacto eletrónico, que é a mais violenta…onde teremos um espectro mais complicado
(muitos fragmentos).

Resumindo:

Depois existem outras metodologias que foram já enumeradas anteriormente (B a E) que são mais
“soft”, não há tanta fragmentação, então o espectro é mais simples. E assim, é mais fácil ver o ião
molecular, por isso dá-nos logo a informação sobre a massa do composto.
Se por exemplos estivermos a analisar compostos com uma massa muito elevada e que são difíceis de
evaporizar. Normalmente, utiliza-se a técnica de MALDI.

Em suma, existem diferentes metodologias de ionização e têm-se que optar por qual é a mais adequada
para o tipo de compostos que se quer analisar no laboratório.

Quando estamos a falar do impacto eletrónico, existe um filamento de tungsténio que é aquecido a alta
temperatura que vai libertar eletrões que vão colidir com a amostra e vão ionizá-la. Estes iões que são
ionizados, depois vão para o analisador e que em seguida se vai detetar.
O que é caraterístico destes espectros é o aparecimento de muitos fragmentos - técnica de ionização
“dura/hard”.

210
B. Ionização Química (CI)
É também uma metodologia muito utilizada.
Consiste na colisão com iões a que são produzidos a partir de gases, ou seja, no próprio meio a que
vamos introduzir a amostra há gases; gases estes que estão ionizados, como por exemplo o metano,
isobutano e a amónia, e é do choque entre as moléculas que se quer analisar e estes gases que vão
resultar os iões que se vai analisar no espectro.
Neste caso, espectros por ionização química apresentam poucos fragmentos em à ionização por impacto
eletrónico.

O espectro de ionização química está associado à Cromatografia em fase liquida.


Enquanto o espectro de ionização por Impacto eletrónico está associado à Cromatografia em fase
gasosa.
Pico mais intenso no espectro de massa é chamado de “Pico base”.

211
C. FAB (Fast Atom Bombardment)
FAB = Bombardeamento por Átomos Rápidos

Técnica introduzida em 1981 por Barber e possibilitou pela 1ª vez a análise de moléculas polares e
termolábeis, com pesos moleculares na ordem dos KDa.

A amostra é dissolvida numa matriz (solvente polar e viscoso com baixo ponto de ebulição) e introduzida
no espectrómetro de massa, onde é analisada sob vácuo. A mistura “matriz + amostra” é então
bombardeada com átomos rápidos (Xe, Ar ou outro gás, 8 KeV), cuja energia é transferida para a mistura
tendo como resultado a vaporização de iões cuja massa é posteriormente analisada.

D. Fontes de Ionização à Pressão Atmosférica (API):


A escolha da fonte mais adequada não é fácil de prever;
As Fontes de ionização mais comuns são:

a) Electrospray (ESI)
b) APCI (Ionização Química à Pressão Atmosférica)
c) APPI (Fotoionização à Pressão Atmosférica)
Todas estas são fontes soft. Logo, o espetro será mais simples.

212
Este gráfico ajuda-nos a escolher qual é a melhor fonte para se usar. Por exemplo, a fonte electrospray
é normalmente utilizada para análise de compostos mais polares e com massas moleculares maiores.
No caso das outras fontes, principalmente o APCI (Ionização Química à Pressão atmosférica) que é
também bastante utilizada, já a gama de polaridades é maior que a fonte electrospray e devem ser
utilizadas para compostos com menores massas moleculares.
A massa molecular é algo que vai condicionar o tipo de equipamento que se vai escolher. E deve-se ao
analisador, porque uma das caraterísticas/especificações do analisador é a gama de massas que ele pode
consegue detetar. Por isso, há analisadores que só detetam até 2000 de massa e depois há outros que
vão de 2000 até muitos mil…

Isto significa que se estivermos um equipamento que só vai até 2000 de massa, o peso molecular do
composto tem que ter no máximo 2000?

Não, porque o analisador deteta a razão massa/ carga, ou seja, o (M/z). Logo sendo, o M = o peso
molecular e z = a carga …então podemos ter um M muito variável (diferente de 2000). Desde que a razão
seja até 2000, o analisador “funciona”.

213
D. a) ElectroSpray (ESI) – Mais informação

ESI vs APCI

214
E. Dessorção e Ionização a Laser Assistida Por Matriz (MALDI)
Técnica utilizada principalmente para biomoléculas de elevado peso molecular. Apresentada em
1988 por Karas e Hillenkamp, que descreveram esta técnica aplicada a proteínas cujos pesos
moleculares excediam os 10 kDa.
No método MALDI a amostra é dispersa numa matriz originando uma “solução sólida”, produto
da co-cristalização do analito com a matriz, de modo que as moléculas do analito estejam
completamente separadas umas das outras.

215
Analisadores de Massa
O Analisador de Massa é considerado o coração do espectrómetro de massa. Os analisadores de
Massa diferenciam-se através das seguintes caraterísticas:

• Gama de massas
• Resolução
• Exatidão (mass accuracy)
• Tipo de experiências
• Rapidez da análise
216
Vão separar os iões que se formaram na fonte de ionização do espectrómetro, de acordo com a razão
massa carga (m/z).
Essa separação tem haver com:

1) Gama de Massas
2) Exactidão (mass accuracy)
3) Resolução

Ou seja, estes são parâmetros que permitem “construir” as tais especificações do analisador.

- Resolução
Capacidade de um espectrómetro de massa para separar iões de massas distintas.

Quanto maior a resolução do


equipamento, maior é a
separação de massas.

217
- Exatidão

A Exatidão da massa depende da resolução do equipamento. Maior resolução, logo maior exatidão.

Analisadores de Massa: Diferentes Tipos


Em termos de analisadores, podemos utilizar diferentes tipos: Analisador de Sector Magnético,
Analisador de Quadrupolo, Analisador de Tempo de Voo, Analisador de ratoeira de iões “Ion-trap” e
Analisador de ressonância ciclotrónica (FT-ICR).

Todos eles se baseiam na mesma coisa. Vão fazer os iões moverem-se no meio de um detetor e para os
mover usa-se radiofrequências ou campos elétricos.

218
- Caraterísticas de Cada Tipo de Analisador de Massa:
Analisador de Sector Magnético (Magnetic Sector Analyzer, MAS)

- Alta resolução, massa exata


- Emprega um magnete ou eletromagnete para separação dos iões

Analisador de Quadrupolo (Quadrupole Analyzer, Q)

- Aplicação de campo elétrioco entre as barras do quadrupolo: os iões adquirem diferentes trajetórias
permitindo fazer a sua seleção de acordo coma estabilidade dessa trajetória: filtradores de massas.

- Baixa resolução (1 uma), rápido e barato;

219
Analisador de Tempo de Voo

- Não tem limite superior de m/z


- Alta resolução

Analisador de ratoeira de iões “Ion-trap”

- Os iões podem ser retidos por períodos relativamente longos por ação de campos elétricos e/ou
magnéticos.

Analisador de ressonância ciclotrónica (FT-ICR)

- Usam uma combinação de campos elétricos


e magnéticos para capturar os iões no
interior do analisador.
- Resolução mais elevada, massa exata, muito
caro

220
Validação do Método
A validação de um método é um processo contínuo que começa no planeamento da
estratégia analítica e continua ao longo de todo o seu desenvolvimento.

No caso da Indústria Farmacêutica, para o registro de novos produtos, os órgãos


regulares em Portugal e em outros países exigem a validação da metodologia analítica e, para
isso, a maioria deles tem estabelecido documentos oficiais que são directrizes a serem
adoptadas no processo de validação.

Com um processo de validação bem definido, bem executado e bem documentado, é


possível proporcionar às agências reguladoras a evidência necessária para demonstrar que os
métodos e os sistemas analíticos utilizados, são adequados ao objectivo para o qual foram
delineados.

Definições de validação

• “Confirmação por testes e apresentação de evidências objectivas de que determinados


requisitos são preenchidos para um dado uso intencional” (ISO/IEC 17025)
• A validação de métodos assegura a credibilidade destes durante o seu uso em rotina,
sendo algumas vezes mencionado como o “processo que fornece uma evidência
documentada de que o método realiza aquilo para o qual é indicado” (USP)
• “Avaliação sistemática de um procedimento analítico para demonstrar que está sob as
condições nas quais deve ser aplicado” (WHO)
• “Validação é o processo de definir uma exigência analítica e confirmar que o método
sob investigação tem capacidade de desempenho consistente com o que a aplicação
requer” (Eurachem Working Group)

É fundamental que os Laboratórios disponham de meios e critérios objectivos, para


demonstrarem, através da Validação, que os métodos internos de ensaio que executam,
conduzem a resultados credíveis e adequados à qualidade pretendida. (Comissão Técnica 03 da
RELACRE 13)

Estudos de Validação devem incluir a comparação com métodos de referência


reconhecidos, de modo a demonstrarem uma performance equivalente ou superior, e a
significância deve ser demonstrada estatisticamente. Todos os novos métodos, devem ser
validados, se possível em concordância com um método de referência já existente. (FDA)

221
Organizações regulamentares europeias e internacionais

Qual a diferença entre Validação e Verificação?

Um laboratório pode adoptar um procedimento validado que, por exemplo, foi


publicado como uma norma, ou comprar um sistema de medicação completo para ser utilizado
para uma aplicação especifica de um fabricante. Em ambos os casos, o trabalho de validação já
foi levado a cabo mas o laboratório ainda terá de confirmar a sua capacidade de aplicação do
método. Isto é a verificação.

Isto significa que algum trabalho experimental deve ser feito para demonstrar que o
método funciona no laboratório onde vai ser utilizado. No entanto, o trabalho a desenvolver
será consideravelmente menor em comparação com a validação de um método a ser
desenvolvido na totalidade no laboratório.

Quando se deve validar ou verificar um método?


Um método de ser validado, quando é Para os métodos normalizados, não é
necessário demonstrar que o seu necessário fazer a validação do método. O
desempenho é adequado para um propósito laboratório precisa verificar o desempenho
particular: do método. O laboratório deve confirmar
que pode operar adequadamente métodos
• Métodos não normalizados
padronizados antes de os introduzir.
• Métodos desenvolvidos/concebidos Verificação também é necessária quando há
no laboratório mudanças importantes, tais como:
• Métodos normalizados utilizados
fora do seu objectivo • Um novo mas semelhante
• Ampliações e modificações de instrumento
métodos normalizados • Deslocalização com novo software
• Ou quando o controlo de qualidade
A validação também é necessária quando é
indica que o desempenho de um
preciso demonstrar a equivalência dos
método vai mudando com o tempo.
resultados obtidos através de dois métodos.

222
Quais as vantagens de proceder à validação de um método?

• Avaliar conformidade com critérios pré-estabelecidos.


• Ter a certeza que os resultados obtidos são de confiança e que podem ser reproduzidos
nas mesmas condições e com as mesmas amostras.
• É uma segurança para o próprio analista.

Como deve ser validado um método?

1. No laboratório
2. Em diferentes laboratórios

O que permite a validação de um método?

• Averiguar se o método é aceitável para o fim em vista (doseamento ou identificação).


• Provar que o método pode ser usado para tomar decisões relativamente às amostras
analisadas.
• Identificação de causas de erro e sua quantificação.
• Satisfazer requisitos de regulamentação interna ou externa (por exemplo FDA).

Critérios de aceitação

• O responsável pelo estudo/ensaio estabelece os critérios de aceitação, caso não exista


regulamentação a aplicar.
• Os critérios de aceitação devem basear-se:
o Experiência com o método
o Utilização a dar ao método

Parâmetros de validação

• Especificidade/selectividade
• Limite de detecção
• Limite de quantificação
• Gama de trabalho
• Linearidade
• Precisão
o Repetibilidade
o Precisão intermédia
o reprodutibilidade
• Exactidão
• Robustez

Especificidade/Selectividade

• Especificidade – capacidade de um método analítico determinar inequivocamente um


analito em presença de outros componentes, como por exemplo, impurezas, produtos
de degradação ou excipientes.

223
• Selectividade – capacidade de um método analítico responder preferencialmente a um
certo analito, identificando-o numa mistura complexa sem interferência de outros
componentes.

Um método analítico pode ser considerado aplicável (específico e selectivo) quando na


prática, e após a realização de testes de recuperação, se verificar que as taxas de recuperação
são próximas de 100%.

Limite de Detecção

• É a menor quantidade de analito na amostra que pode ser detectada mas não
necessariamente quantificada como valor exacto.
• O branco deve ter, sempre que possível, uma matriz semelhante à amostra.
• O limite de detecção corresponde à concentração mínima que é possível distinguir do
branco (ausência do analito).
• Estimado por uma razão sinal:ruído (3:1)

Limite de Quantificação

• É a menor quantidade de analito numa amostra que pode ser determinada com uma
precisão e exactidão aceitáveis.
• Estimado por razão sinal:ruído (10:1)

224
Linearidade

Refere-se à capacidade do método de gerar resultados linearmente proporcionais à


concentração do analito, enquadrados em faixa analítica especificada.

Se R2 = 0.9966, significa que o modelo aplicado explica 99.66% da variância total

225
Gama de Trabalho

• Quando se utiliza uma metodologia que envolve o traçado de uma curva de calibração,
a gama de trabalho pode ser avaliada pelo teste de homogeneidade das variâncias.
• ISSO 8466-1 para modelos lineares
ISSO 8466-2 para modelos polinomiais de 2º grau.

O recurso a ajustes polinomiais deverá ser devidamente fundamentado.

226
Precisão

Representa a dispersão dos resultados obtidos e correspondentes a várias análises sobre


uma mesma amostra ou amostras semelhantes, em condições definidas. Será preferível a
precisão sobre amostras, para minimizar efeitos de matriz.

É expressa em termos de:

Geralmente a Precisão varia com a gama de concentrações.

Precisão VS Exactidão

A relação entre a exactidão e precisão em testes de diagnósticos. O centro do alvo


representa o valor verdadeiro da substância testada.

227
A: um teste diagnostico que é preciso, mas não exacto; em medições repetidas, o teste
origina resultados muito similares, porém todos os resultados estão distantes do valor
verdadeiro.

B: um teste que é impreciso e não exacto; repetidas medições originam resultados


largamente diferentes e os resultados estão distantes do valor verdadeiro.

C: um teste ideal que é preciso e acurado.

Precisão

Consideram-se 3 níveis:

• Repetibilidade
o Repetibilidade do equipamento
o Repetibilidade do método
• Precisão intermédia
o Por vezes, designada por variabilidade intralaboratorial
• Reprodutibilidade

Repetibilidade

• Expressa a precisão usando as mesmas condições de análise, o mesmo analista e o


mesmo equipamento, num curto intervalo de tempo

Precisão Intermédia

É a precisão avaliada sobre a mesma amostra, amostras idênticas ou padrões, utilizando


o mesmo método, no mesmo laboratório, mas definido exactamente qual ou quais as condições
a variar, como por exemplo:

• Analistas diferentes
• Equipamentos diferentes
• Dias diferentes
• Diferentes lotes de reagente e colunas

Os resultados obtidos permitem identificar quais os factores que contribuem para uma
maior variabilidade dos resultados.

Resultados obtidos com diferentes operadores em dias diferentes.

228
Reprodutibilidade

• A reprodutibilidade é obtida a partir de ENSAIOS INTERLABORATORIAIS. Refere-se à


precisão do mesmo método analítico, mas em diferentes laboratórios, é obtida a partir
de ensaios interlaboratoriais.
• É enviada uma série de amostras iguais aos laboratórios participantes.
• É expressa em termos de CV R (coeficiente de variação de reprodutibilidade)
CV R (%) = (S Rj /média) * 100
o S Rj é o desvio padrão de reprodutibilidade
o Média dos valores considerados

Exemplo de resultados de ensaios interlaboratoriais (date of report) para doseamento


de sódio (assigned value) com n participantes em diferentes matrizes (test material)

Exactidão

É a concordância entre o resultado obtido numa análise e o valor de referência aceite


como convencionalmente verdadeiro.

• Pode ser determinada:


o Percentagens de recuperação do analito, juntamente com os intervalos
de confiança e a precisão.
o Com MRC – Materiais de Referência Certificados

229
 Um MRC possui um valor de concentração (ou outra grandeza)
para cada parâmetro e uma incerteza associada.
 O uso correcto dos MRC consiste na sua análise para avaliar o
desempenho do Laboratório.
 O valor obtido com um MRC deve ser comparado com o valor
certificado, determinando-se o erro e exactidão da análise.
 O MRC é uma excelente ferramenta no Controlo Externo de
Qualidade de uma análise química.

230
Robustez

• Mede a sensibilidade do método a pequenas variações.


• Método diz-se robusto se for praticamente insensível a pequenas variações de
determinados parâmetros de análise.
• Deve-se escolher quais os parâmetros que mais poderão influenciar a qualidade dos
resultados.

Adequabilidade do sistema

• Compete ao analista decidir o conjunto de testes a efectuar para se assegurar que o


método está a ser eficiente para os finas a que se destina.
• O número de testes e resultados obtidos vai depender da aplicação.
• Deve ser feito um número mínimo de testes.
• Os testes de adequabilidade do sistema devem testar todo o sistema de análise e não
módulos individuais.
o A adequabilidade do sistema serve para verificar que todo o sistema está a
funcionar de modo apropriado durante o decurso das análises.
• Deve ser considerado como uma minivalidação antes de começar diariamente a analisar
amostras.
o Quanto utilizado de modo adequado deve permitir poupar tempo e dinheiro.
Não se vai perder tempo a analisar amostras com um método que não está a
funcionar de um modo correcto.

Exemplo: Adequabilidade do Sistema Cromatográfico

• Factor de capacidade
• Factor de separação ou de selectividade
• Resolução
• Factor de assimetria (Tailing factor)
• Números de pratos teóricos
• Repetibilidade

Classificação dos Métodos de Análise (USP26)

• Categoria I – métodos analíticos para quantificação de analitos ou princípio(s) activo(s)


no produto final.
• Categoria II – métodos analíticos para determinação de impurezas em matéria prima ou
produtos de degradação no produto final. (ensaios quantitativos e testes limite).
• Categoria III – métodos analíticos para ensaios específicos (ex. ensaio de dissolução).
• Categoria IV – testes de identificação.

231
Seleção dos Parâmetros de Validação

232
Validação do Equipamento

• Processo pelo qual se confirma se o equipamento está em boas condições de utilização


(qualificação) para o fim em vista, ou seja, é adequado para efectuar análises e produzir
resultados de confiança (precisos, exactos, repetíveis), ou seja, de acordo com o plano
de testes pré-determinados e critérios de aceitação definidos:
o Contractos com empresas fornecedoras
o Criar procedimentos internos do laboratório

233
Qualificação de Equipamentos
Qualificação Vs Validação

A Qualificação é o procedimento que garante que equipamentos e instalações estejam


adequados ao uso pretendido de acordo com o plano de testes pré-determinados e critérios de
aceitação definidos. Aplica-se a equipamentos.

A Validação garante que as necessidades dos utilizadores podem ser atingidas de forma
consistente. Aplica-se a processos ou métodos analíticos.

A qualificação é uma parte da validação.

- Contratos com empresas fornecedoras

- Criar procedimentos internos do laboratório

Tipos de qualificações:

• Qualificação de design (DQ): Permite a detecção de falhas no design antes da


implementação ou construção do sistema. É um exercício documental – não inclui
verificações feitas ao equipamento, mas apenas à documentação de design (projecto).
o Indicar:
 Descrição do equipamento
 Especificações
• Eléctricas
• Desempenho
• Manutenção/limpeza
• Outras
o Critérios de selecção
o Pessoa responsável pela selecção
• Qualificação de instalação (IQ): Qualificação da instalação: evidência documentada,
fornecida pelo fabricante ou distribuidor, de que o equipamento foi entregue e
instalado de acordo com as suas especificações.

234
• Qualificação de operação (OQ): Evidência documentada, fornecida pelo fabricante ou
distribuidor, de que o equipamento, após qualificação da instalação, opera dentro dos
parâmetros originais de fabricação.
o O equipamento funciona conforme descrito pelo fabricante?
o Exemplo para uma centrifuga:
 A centrifuga liga e desliga
 Centrifuga à velocidade e temperatura programada
 Mantem a programação
o Especificações a testar
o Calibração do equipamento (por quem e resultados da calibração)
o Produzir PO para utilização do equipamento
• Qualificação de desempenho: evidência documentada de que o equipamento, após as
qualificações de instalação e operação, apresenta desempenho consistente.
o Avaliar se o equipamento funciona bem
o Escrever um PO onde se descrevem:
 Testes a efectuar
 Condições
 Critérios de aceitação
 Periocidade

Exemplos de verificação de Espectrofotómetros:

• Espectrofotometria de Absorção Molecular na zona do Ultravioleta-Vísivel


Alguns testes de Verificação de Equipamento
1. Verificação da escala de comprimentos de onda
 Soluções de hólmio (III) em ácido perclórico
 Filtros de vidro com hólmio ou didímio
 Riscas de emissão da lâmpada de deutério

235
Uso de filtro de holmium ou didímio (mistura em partes iguais de
neodímio e praseodímio)

2. Verificação dos valores de absorvência


 Zona do visível: solução de sulfato de cobre em ácido sulfúrico

Absorção uma solução de CuSO 4 .5H 2 O (20g/L) em ácido sulfúrico a


1%, numa célula de 1 cm de percurso óptico
Critério de aceitação: 2% (ver especificações do equipamento)
 Zona do ultra-violeta: solução de dicromato de potássio em +acido
sulfúrico

Solução A e B: dicromato de potássio (50mg/L e 100mg/L,


respectivamente) em ácido sulfúrico 5mM
Critério de aceitação: 1% (ver especificações do equipamento)

• Espectrofotometria de Absorção Molecular na zona do Infravermelho


1. Verificação da escala de comprimentos de onda de um espectrofotómetro
com pelicula de polistireno

236
2. Poder de resolução do equipamento

• Espectroscopia de Infravermelho
1. Controlo do poder de resolução

2. Verificação da escala de comprimentos de onda

237
Qualidade

238
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Determinação do Teor de Quinino em Água Tónica Por
Espectrofotometria UV-VIS

 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:


- A Quinina (C20H24N2O2) é um alcalóide quinolínico
extraído da casca de Cinchona spp (família das
Rubiaceas). É um pó branco, inodoro e de sabor
amargo, com atividade antimalárica, antipirética e
analgésica.

- O sulfato de quinina é denominado quinino.


- A água tónica é um refrigerante que contém cerca de 10% de açúcar e até 80
mg/L de quinino.
- O teor de quinino no refrigerante “água tónica” está definido no Decreto-Lei n.º
93/89 de 28 de Março, teor de quinino de 45 mg/l a 80 mg/l, expresso em
hidrocloreto de quinino.
- Atenção: No laboratório considera se que Hidrocloreto de quinino = Quinino.

 Teoria:
A espetrofotometria UV-Visível é um Método de Absorção.

Aplica-se a lei de Lambert-Beer:

Constante de Percurso ótico,


Absortividade espessura da tina

𝐴𝐴 = 𝐾𝐾 ∙ 𝑐𝑐 ∙ 𝑙𝑙
Absorvância da Concentração de
Amostra Solução
Permite analisar qualitativamente e quantitativamente a solução em estudo através
da radiação absorvida por esta.
Vamos recorrer a um espectrofotómetro e trabalhar num λ que corresponde ao
máximo de absorção. O λ onde a sensibilidade é máxima corresponde àquele onde o
coeficiente de absortividade é mais elevado.

 UV-próximo: 200-380 nm
 Células de Quartzo
 Lâmpada de Deutério
Método da Curva de Calibração: Utilização de um conjunto de soluções padrão com
concentrações exatamente conhecidas → Curva de Calibração. Através da equação
da reta que mais se ajusta a esses valores e com o valor da absorvância da amostra
obtém-se a respetiva concentração.

• O valor da absorvância da amostra deve estar contido no intervalo de valores


das soluções padrão.

239
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Nota: Para se aplicar a Lei de Lambert-Beer, a absorvância deve estar entre 0,1 e 1; a
absorvância ótima é 0,43.

 Técnica Operatória:

1) Preparação das soluções padrão a partir de uma solução-mãe de 1000 ppm.


Isto irá servir para traçar a curva de calibração.

C1 = 1000 ppm

C final = 10, 25, 50, 100 ppm

v final = 50 ml
V inicial = 100

2) Preparação da solução problema (solução de água tónica sobre a qual


queremos descobrir a concentração).

15 ml Filtrar Remove bolhas de gás que interferem na leitura da Abs.

3) Determinação do Teor de Quinino na Amostra.

a) Determinar o 𝜆𝜆máx.

- Comprimento de onda para o qual a absorção do quinino é máximo,


fornece resultados mais precisos.

b) Curva de Concentração.

- Determinar a concentração de quinino da amostra por intrapolação.

c) Absorvância da amostra

 Cálculos:

1. Cálculo do Massa de Hidrocloreto de Quinino Dihidratado para obter uma


solução com uma concentração de 1000 ppm de Hidrocloreto de quinino

1000 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- 1000 mL de solução


x mg --------------- 100 mL de solução
x = 100 mg de Hidrocloreto de quinino = 0,1 g de H. de Quinino

240
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Uma vez que o quinino está no Hidrocloreto de Quinino Dihidratado, então
temos que determinar a massa que temos de pesar de Hidrocloreto de
Quinino Dihidratado.

- Sabemos que:

PM (Hidrocloreto de Quinino Dihidratado) = 396,91 g/mol


PM (Hidrocloreto de Quinino) = 396,91-(2x18,02) = 360,87 g/mol

396,91 g de Hidrocloreto de Quinino Dihidratado --------------- 360,87 g de H. Quinino


x g --------------- 0,1 g de H. Quinino

x = 0,110 g de Hidrocloreto de Quinino Dihidratado

2. Preparação dos Padrões

 10 ppm (10 mg/L)

10 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- 1000 mL


x mg --------------- 50 mL
x = 0,5 mg de Hidrocloreto de quinino

1000 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- 1000 mL


0,5 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- x mL
x = 0,5 mL da Solução Mãe

 25 ppm

25 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- 1000 mL


x mg --------------- 50 mL
x = 1,25 mg de Hidrocloreto de quinino

1000 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- 1000 mL


1,25 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- x mL
x = 1,25 mL da Solução Mãe

 50 ppm

50 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- 1000 mL


x mg --------------- 50 mL
x = 2,5 mg de Hidrocloreto de quinino

1000 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- 1000 mL


2,5 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- x mL
x = 2,5 mL da Solução Mãe
241
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 75 ppm
75 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- 1000 mL
x mg --------------- 50 mL
x = 3,75 mg de Hidrocloreto de quinino

1000 mg de Quinino --------------- 1000 mL


3,75 mg de Quinino --------------- x mL
x = 3,75 mL da Solução Mãe
 1
00 ppm

100 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- 1000 mL


x mg --------------- 50 mL
x = 5 mg de Hidrocloreto de quinino

1000 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- 1000 mL


5 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- x mL

x = 5 mL da Solução Mãe
Resumo:
Concentração (ppm) Volume da Solução Mãe (mL)

10 0,5

25 1,25

50 2,5

75 3,75

100 5

3. Cálculo da Concentração de Hidrocloreto de quinino na Amostra de Água


Tónica

Ensaio (E) Absorvância


Equação da reta: 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 = 0,011𝑐𝑐 + 0,0396
Padrão (10 ppm) 0,168
Padrão (25 ppm) 0,294
Padrão (50 ppm) 0,589 0,741 = 0,011c+0,0396 ⇔ c = 64,32 ppm de Quinino
Padrão (75 ppm) 0,875
Dentro dos limites previstos
Padrão (100 ppm) 1,262
Intervalo: [45 -80 mg/L]
Amostra 0,741

242
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Determinação do Teor de Cafeína e Ácido Acetilsalicílico (AAS) em
Comprimidos

 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:


- Espectrofotometria de absorção molecular substâncias em mistura
- Os espectros de absorção de soluções contendo isoladamente ácido acetilsalicílico
(aspirina) e cafeína, mostram que cada uma destas soluções apresenta absorção em
comprimentos de onda em que é máxima a absorção da outra, λmax1 e λmax2
(valores próximos de 270nm e de 295nm)
- Existindo esta interferência mútua, é possível no caso de uma mistura de dois
compostos, estabelecer um sistema de duas equações a duas incógnitas e determinar
o valor da concentração de cada um deles.
- Amax1 e Amax2 representam as absorvências da solução da mistura
- Acafmax1 Aaspmax1 Acafmax2 Aaspmax2 representam as absorvências dos
componentes isolados
- 𝐴𝐴1% 1%
1𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚1 e 𝐴𝐴1𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚2 as absorvências específicas da cafeína nos λmax1 e
λmax2
1𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚1 e 𝐴𝐴1𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚2 as absorvências específicas da aspirina nos λmax1 e
- 𝐴𝐴1% 1%

λmax2
- Ccaf e Casp as concentrações (g/100mL) de cafeína e de aspirina na solução
problema lida

 Teoria:

Espetrofotometria de absorção molecular para mistura de substâncias:

• Se os máximos de absorção de cada substância interferirem, ou seja, no máximo de


absorção da cafeína existe também absorção (embora pouca) do AAS e vice-versa,
então pode-se determinar o valor de absorvância de cada uma das soluções.
• Se os máximos de absorção das substâncias forem próximas um do outro.
Aditividade de Lei de Lambert-Beer – Ambas as substâncias
contribuem aditivamente para a absorvância total.

Os espectros de absorção de soluções contendo cafeína e AAS mostram que estas


substâncias têm máximos de absorção próximos, existindo interferências nos valores
de absorvâncias de ambos os compostos quando misturados.

243
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Para se determinar o teor de cafeína e de AAS (asp) num comprimento, aplica-se um
sistema de 2 equações a duas incógnitas:

𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴1 = 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚1 + 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚1


1

𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴2 = 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚2 + 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚2

Lambert-Beer: A = K ∙ c ∙ l
Quando c → g /100 ml e l = 1 cm, K = 𝐴𝐴1%
1𝑐𝑐𝑐𝑐

𝐴𝐴 = 𝐴𝐴1%
1𝑐𝑐𝑐𝑐

𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴1 = 𝐴𝐴1% 1%
1𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚1 ∙ 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 + 𝐴𝐴1𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚1 ∙ 𝑐𝑐𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎

1

1% 1%
⎩𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴2 = 𝐴𝐴1𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚2 ∙ 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 + 𝐴𝐴1𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚2 ∙ 𝑐𝑐𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎
Resolvendo o Sistema de Equações em ordem a Ccaf e a Casp teremos:

 Técnica Operatória:
1) Preparação das Soluções Padrão

a) AAS
- 100 mg AAS - 40 ml NaOH
- 10 ml metanol - Água
- Água Retirar 5 ml Esperar 10 min.
(Para assegurar que toda
a aspirina é hidrolisada a
ácido salicílico)

v = 100 ml
V = 100 ml

244
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
b) Caf.
- 40 ml NaOH
- 100 mg Caf
- Água
- 10 ml metanol
- Água Retirar 3 ml

v = 100 ml
V = 100 ml

2) Preparação da Solução Problema

- Pesar 10 comprimidos Melhoral (massa total - m total ), logo 1 comprimido é x


gramas (dividir por 10).
- A seguir:
- Água
- Água
- 120 mg amostra pulverizada - 40 ml NaOH
Agitar durante Esperar 10 min.
- 10 ml metanol
alguns minutos 3ml após Filtração! (Para assegurar que toda
a aspirina é hidrolisada a
ácido salicílico)

V = 100 ml V = 100 ml

3) Determinações espetrofotométricas:
 Determinação do 𝜆𝜆𝜆𝜆á𝑥𝑥 da cafeína e do AAS (𝜆𝜆𝜆𝜆á𝑥𝑥1 e 𝜆𝜆𝜆𝜆á𝑥𝑥2)
 Determinação das Absorvâncias de cafeína e do AAS aos 2 𝜆𝜆𝜆𝜆á𝑥𝑥
 Determinação da Absorvância da amostra aos 2 𝜆𝜆𝜆𝜆á𝑥𝑥

 Cálculos:

1. Cálculo da Concentração de Ácido Acetilsalicílico (Padrão)

0,100 g AAS --------------- 100 mL de solução


x g --------------- 5 mL de solução
x = 0,005 g

Estas 0,005g como vão estar num balão de 100 ml, a concentração desse balão será
0,005 g / 100 ml.

245
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
2. Cálculo da Concentração de Cafeína (Padrão)

0,100 g Caf. --------------- 100 mL de solução


x g --------------- 3 mL de solução
x = 0,003 g

Estas 0,003g como vão estar num balão de 100 ml, a concentração desse balão será
0,003 g / 100 ml.

3. Pesagem dos Comprimidos

Massa de 10 comprimidos = 5,8336 g


5,8336
Logo, a massa de 1 comprimido é = 0,58336 𝑔𝑔 = 583,36 mg
10

4. Determinações espectrofotométricas

a) Traçado dos espectros da cafeína e ácido salicílico e determinação dos


λmax1 e λmax2.
Para cada uma das soluções padrão de cafeína e ácido salicílico, trace os
espectros na zona do UV (350 – 200nm), usando como referência
água/hidróxido sódio 0,1 M e determine os valores do comprimento de
onda para o qual a absorção de cada uma das soluções tem um valor
máximo:

λmax1= 273,2 nm λmax2= 296,2 nm

b) Absorvências de cafeína e ácido salicílico e solução problema diluída


Determine os valores das absorvências, nos λmax1 e λmax2 para:
Cada uma das soluções padrão:

• Abs cafmax1 = 1,462


• Abs cafmax2 = 0,044
• Abs aspmax1 = 0,234
• Abs aspmax2 = 0,889

Para a solução problema diluída:

• Abs max1 = 0,394


• Abs max2 = 0,889

246
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
5. Cálculo das Absortividades Específicas da Cafeína e Ácido Salicílico

𝐴𝐴
𝐴𝐴 = 𝐴𝐴1% 1%
1𝑐𝑐𝑐𝑐 ∙ 𝑐𝑐 ⟺ 𝐴𝐴1𝑐𝑐𝑐𝑐 = 𝑐𝑐

𝐴𝐴1%
1,462
• 1𝑐𝑐𝑐𝑐 Caf max1 = 0,003 = 487,3

𝐴𝐴1%
0,044
• 1𝑐𝑐𝑐𝑐 Caf max2 =0,003 = 14,7

𝐴𝐴1%
0,234
• 1𝑐𝑐𝑐𝑐 Asp max1 =0,005 = 46,8

𝐴𝐴1%
0,889
• 1𝑐𝑐𝑐𝑐 Asp max2 =0,005 = 177,8

6. Cálculo das concentrações de Cafeína (Caf.) e Ácido Salicílico (Asp)


 C Caf.

46,8 ∙ 0,889 − 177,8 ∙ 0,394


𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 = = 3,3 × 10−4 𝑔𝑔 / 100 𝑚𝑚𝑚𝑚 = 0,33𝑚𝑚𝑚𝑚 / 100𝑚𝑚𝑚𝑚
14,7 ∙ 46,8 − 177,8

 C Asp.

14,7 ∙ 0,394−487,3 ∙0,889


𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 = 14,7∙46,8−177,8
= 4,97 𝑚𝑚𝑚𝑚 / 100𝑚𝑚𝑚𝑚

7. Cálculo do Teor das Substâncias por Comprimido

 Cafeína: 0, 33 mg em 100 ml que antes estavam em 3 ml

0,33 mg Caf. --------------- 3 mL de solução


x mg --------------- 100 mL de solução
x = 11 mg / 100 ml

120,6 mg Caf. --------------- 11 mg


583,36 mg --------------- y
y = 53,2 mg por comprimido = 0,0532 g/comp.

247
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Ácido Acetilsalicílico: 4,97 mg em 100 ml que antes estavam em 3
ml
4,97 mg Asp --------------- 3 mL de solução
x mg --------------- 100 mL de solução
x = 165,7 mg / 100 ml

120,6 mg Caf. --------------- 165,7 mg


583,36 mg --------------- y
y = 801,5 mg por comprimido = 0,8015 g/comp.

8. Cálculo de % de Caf. e AAS na mistura problema original

0,0532
 % 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 = × 100 = 9,1 %
0,58336
0,8015
 % 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 = × 100 = 137,4 %
0,58336

248
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Análise Quantitativa do Cloridrato de Piridoxina (Vit. B6) por
Colorimetria Indireta

 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:

- A adição de 2,6-dicloroquinona-cloroimida a soluções tamponadas de


piridoxina que contenham isopropanol produz a coloração azul (máximo de
absorção em 650 nm).
Este composto corado não é estável atingindo-se um máximo de intensidade
de coloração cerca de 90 segundos após o início da reação (adição do reagente
e agitação) pelo que a reação tem que ser cronometrada.

- O ácido bórico inibe a reação com a piridoxina, o que não acontece com os
outros fenóis, cujos valores de absorvência são descontados aos dos ensaios da
reação sem ácido bórico.
- Irá usar se um espectrofotómetro do visível, ou seja, a fonte luminosa é uma
lâmpada de tungsténio e a cuvete tem de ser de vidro ou de plástico.
- Irá usar se a lei de Lambert-Beer que é cumulativa, ou seja, soma as absorvâncias
a determinado comprimento de onda.

 Teoria

Colorimetria Indireta

Faz-se reagir a 2,6-dicloro-


Utiliza-se um colorímetro Utiliza-se um composto que reage com
quinona-4-cloroamida com a
(Região do visível) a substância que queremos analisar. vitamina B6

A reação de dicloroquinona com a vitamina B6 não é específica; A dicloroquinona


reage com todos os fenóis que têm livre a posição “para” relativamente ao grupo OH
fenólico. Por este motivo, não temos a certeza se o valor da absorvância lido no
colorímetro se deve apenas ao complexo vitamina B6 – Dicloroquinona ou à reação de
dicloroquinona com outros fenóis em solução.
Para contornar este problema, faz-se reagir a vitamina B6 com ácido bórico, para que
ocorra inibição da reação com a dicloroquinona. Ao medir-se a absorvância da
amostra, subtrai-se a absorvância da amostra + ácido bórico, obtendo-se apenas a
absorvância do complexo dicloroquinona-Vit.B6.

Vitamina B6 inibida com Ácido


Reação dicloroquinona com Complexo
Bórico, dicloroquinona reage com
todos os fenóis (“para”) Dicloroquinona-
todos os fenóis (“para”) excepto a
inclui a B6. Vit.B6
B6.
249
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018

Nota: O complexo dicloroquinona-Vit. B6 é pouco estável (tem máximo de absorvância


aos 90s a 650 nm), e tem cor azul
 Técnica Operatória

Regente Solução Álcool Tampão Cloreto Ácido


Água
Ensaio Isopropílico de Amónia Bórico
Problema Padrão

A
(amostra; não 1 ml ------ 5 ml 2 ml 1 ml ------
bloqueia B6)

B
(amostra; 1 ml ------ 5 ml 2 ml ------ 1 ml
bloqueia B6)

C
(padrão; não ------ 1 ml 5 ml 2 ml 1 ml ------
bloqueia B6)

D
(padrão; ------ 1 ml 5 ml 2 ml ------ 1 ml
bloqueia B6)

250
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Cálculos
Nota: Cada ampola de solução injetável (3 ml) contém 100 mg de cloridrato de
piridoxina.

- Cálculo do Volume correspondente a 33,34 mg de Clorohidrato de Piridoxina

100 mg de Clorohidrato de Piridoxina --------------- 3 ml (por ampola)


33,34 mg de Clorohidrato de Piridoxina --------------- x ml

x = 1,00 mL (de uma ampola com o medicamento)

- Parte 1: Cálculo da Concentração de Clorohidrato de Piridoxina no medicamento


em estudo

1) Padrão - Concentração Inicial de Padrão:


- Esquema: 25 𝑚𝑚𝑚𝑚
C = = 0,1 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
1 250 𝑚𝑚𝑚𝑚
25 mg -------- 250 mL
C1 a) Diluição do Padrão:

10 mL -------- 100 mL C ⋅V =C ⋅V
1 1 2 2 0,1 ⋅ 10 = C2 ⋅100
C2 0,1 ⋅ 10
C = = 0,01 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
2 100

- Parte 2: Cálculo da Concentração de Clorohidrato de Piridoxina no medicamento


em estudo

2) Solução Problema

Ensaio (E) Absorvância

A (problema + água) 0,371 - Esquema:

B (problema + ácido bórico) 0,031 1ml (amostra inicial) -------- 100 mL

C (padrão + água) 0,303 C3


3 mL -------- 100 mL
D (padrão + ácido bórico) 0,044
C4
E -E 0,340
A B

E -E 0,259
C D

251
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
0,01 mg/mL --------------- 0,259 Absorvância
C4 mg/mL --------------- 0,340 Absorvância

C4 = 0,013 mg/mL

0,013 mg --------------- 1 mL
x mg --------------- 100 mL
x = 1,3 mg Vit B6

1,3 mg --------------- 3 mL
y mg --------------- 100 mL
y = 43,3 mg Vit. B6

43,3 mg --------------- 1 mL
z mg --------------- 3 mL (ampola)
z = 129,9 mg Vit. B6
Fora dos limites previstos
Intervalo 10% de erro: [90 -110 mg]

252
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Determinação do Teor de Benzocaína num Medicamento por
Espectrofotometria UV-Vis

 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:


- Determinação de benzocaína num medicamento, o Dentispray (50 mg/mL),
utilizando a espectrofotometria de Absorção Molecular.

 Técnica Operatória:

1. Preparação de soluções padrão

a) Prepare uma solução de benzocaína a 400 ppm pesando a quantidade


necessária para um vidro de relógio. Transfira o pó para um balão de 250
mL, adicione umas gotas de etanol e complete o volume com água
destilada.
b) A partir desta solução transferir 10 mL para um balão de 100 mL e
completar o volume com água destilada.
c) Para balões de 50 mL pipete da solução anterior os volumes 1,5; 2,5; 5; 7,5
e 10 mL. Complete o volume com água destilada. Determine as
concentrações das soluções padrão.

- ?? mg Benzocaína - Água
- Umas gotas etanol até
Retirar 10 ml
dissolver o pó
v = 50 ml v = 50 ml
- Água

v = 100 ml
v = 50 ml v = 50 ml v = 50 ml
V = 250 ml

Pipetar para balões diferentes os seguintes


volumes: 1,5 ml; 2,5 ml; 5 ml; 7,5 ml e 10 ml.

Solução Padrão Intermédia,


traçar espetro de absorção.

2. Preparação da solução problema

a) Meça rigorosamente 1mL da amostra (solução Dentispray) para um


balão de 100mL e complete o volume com água destilada. A partir
desta solução retire 1 mL para um balão de 100 mL e complete o
volume com água destilada.
b) Com a solução padrão de concentração intermédia, trace o espectro
de absorção de modo a determinar o comprimento de onda que
apresenta uma maior absorvência (maior sensibilidade).

253
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
c) Após verificação do comprimento de onda de trabalho, ler todas as
soluções padrão e a solução problema contra o branco.
d) Utilizando a curva de calibração, calcule o teor de benzocaína no
medicamento tendo em conta as diluições efetuadas. Apresente o
valor em mg/mL. Comente o resultado obtido.

- Esquema 2. a):

1ml da amostra (solução Dentispray) -------- 100 mL


C1
1 mL -------- 100 mL
C2

 Cálculos:
- Parte 1. a) - Quantidade de Benzocaína a Pesar

400 mg --------------- 1000 ml


x mg --------------- 250 ml
x = 100 mg

- Parte 1. c) - As Concentrações das Soluções Padrão

Antes da Preparação dos Padrões

- Saber quantas gramas de Benzocaína existem nos 10 ml do balão de 100 ml


[Passo 1. b)].

100 mg --------------- 250 ml


4 𝑚𝑚𝑚𝑚
x mg --------------- 10 ml Ou seja, concentração de 100 𝑚𝑚𝑚𝑚 = 0,04 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
x = 4 mg

Preparação dos Padrões

 1,5 ml Ou

4 mg --------------- 100 ml
x mg --------------- 1,5 mL
x = 0,06 mg 0,04 ∙ 1,5 = 50 ∙ 𝐶𝐶𝑓𝑓

0,06 mg --------------- 50 mL ⟺ 𝐶𝐶𝑓𝑓 = 0,0012 mg/ml


y mg --------------- 1 mL
y = 0,0012 mg/mL

254
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 2,5 ml Ou

4 mg --------------- 100 ml
x mg --------------- 2,5 mL
x = 0,1 mg 0,04 ∙ 2,5 = 50 ∙ 𝐶𝐶𝑓𝑓

0,1 mg --------------- 50 mL ⟺ 𝐶𝐶𝑓𝑓 = 0,002 mg/ml


y mg --------------- 1 mL
y = 0,002 mg/mL

 5 ml Ou
4 mg --------------- 100 ml
x mg --------------- 5 mL
x = 0,2 mg
0,04 ∙ 5 = 50 ∙ 𝐶𝐶𝑓𝑓
0,2 mg --------------- 50 mL
y mg --------------- 1 mL ⟺ 𝐶𝐶𝑓𝑓 = 0,004 mg/ml
y = 0,004 mg/mL

 7,5 ml Ou

4 mg --------------- 100 ml
x mg --------------- 7,5 mL
x = 0,3 mg 0,04 ∙ 7,5 = 50 ∙ 𝐶𝐶𝑓𝑓
0,3 mg --------------- 50 mL ⟺ 𝐶𝐶𝑓𝑓 = 0,006 mg/ml
y mg --------------- 1 mL
y = 0,006 mg/mL

Ou
 10 ml

4 mg --------------- 100 ml
x mg --------------- 10 mL
x = 0,4 mg 0,04 ∙ 10 = 50 ∙ 𝐶𝐶𝑓𝑓
0,4 mg --------------- 50 mL
y mg --------------- 1 mL
⟺ 𝐶𝐶𝑓𝑓 = 0,008 mg/ml
y = 0,008 mg/mL

255
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Resumo:

Volumes a pipetar
Concentrações das Soluções Padrão (mg/ml) Concentração em ppm
(ml)

1,5 0,0012 1,2

2,5 0,002 2

5 0,004 4

7,5 0,006 6

10 0,008 8

- Parte 2. b) - Espectro de Absorção da Solução Intermédia

Comprimento de
Absorvância
Onda (nm)
Este é o comprimento de onda que apresenta uma
284,4 0,419
maior absorvência (maior sensibilidade).
216,4 0,295

- Parte 2. c)

Soluções Absorvância

1,2 ppm 0,120

2 ppm 0,184

4 ppm 0,380

6 ppm 0,596

8 ppm 0,794

Amostra 0,530

- Parte 2. d) - Curva de Calibração e Teor de Benzocaína no Medicamento

Abs = 0,1003 c – 0,0107

𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 = 0,530
� 1 ⇔ 0,530 = 0,1003 ∙ c – 0,0107 ⇔
𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 = 0,1003 ∙ 𝑐𝑐 – 0,0107
⇔ 𝑐𝑐 = 5,39 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝐿𝐿

256
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
- Esquema 2. a):

1ml da amostra (solução Dentispray) -------- 100 mL


C1
1 mL -------- 100 mL
C2 = 5,39 mg/L
Teor de Benzocaína no Medicamento:

5,39 --------------- 1000 ml


x mg --------------- 100 mL
x = 0,539 mg

0,539 mg --------------- 1 mL
y mg --------------- 100 mL
y = 53,9 mg que estão em 1 ml de amostra de (solução de Dentispray)

257
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Análise Quantitativa do Quinino em Água Tónica Por
Espectrofluorimetria

 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:


- Vamos analisar as potencialidades da fluorescência molécula como método
analítico.
- Numa solução de H 2 SO 4 (0,05M) o quinino apresenta duas bandas de
absorção centradas em 250 e 350 nm.
- Qualquer que seja o comprimento de onda de excitação, o máximo da
emissão situa-se sempre a 450 nm.
- A única interferência que pode aparecer na dosagem do quinino na água
tónica é o ião cloreto, pois atua como agente de extinção da fluorescência do
quinino.
- Efeito desprezado devido a baixa concentração do ião cloreto, sendo que o
erro cometido é inferior a 0,4%.

 Teoria:
A espectrofluorimetria é uma técnica de espectroscopia de emissão molecular
é um método de quantificação de substâncias que têm como base a emissão de
radiação pelas mesmas (fluorescência) que ocorre quando um eletrão excitado
volta ao estado fundamental uma vez que a energia de transição é libertada
sob a forma de fotão, a radiação emitida é proporcional à concentração de
analito. Utiliza um espetrofluorímetro.
Ter em atenção que esta é uma espectroscopia de emissão logo não tem como
base a lei de Lambert- Beer.
A Teoria da Fluorescência baseia-se no princípio de Exclusão de Pauli: Só
podem existir 2 eletrões na mesma orbital e necessariamente com spin
opostos.

258
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Processos de Desativação

São formas que as moléculas têm de passar do estado excitado ao estado


fundamental, sendo a via favorita a que minimiza o tempo de vida no
estado excitado.
 Fluorescência
Emissão de Radiação Espetro de Emissão
 Fosforescência
 Outros (Sem Emissão) O comprimento de onda de
excitação mantem-se constante,
Conversão Interna
fazendo-se variar o de emissão.
Conversão Externa
É a imagem no espelho do
Conversão Intersistemas
espetro de absorção porque as
diferenças de energia entre
estados vibracionais são iguais
(Mecânica Quântica).

Relaxação Vibracional ⟶ A Fluorescência de uma substância só envolve o


estado vibracional de mais baixa energia do estado excitado, pelo que há uma
“perda” de energia e consequentemente um deslocamento da banda de
fluorescência para maiores comprimentos de onda – Desvio de Stokes.

- Vantagens e Desvantagens:
• Sensibilidade - Deteta a concentrações muito baixas
• Especificidade - Nem todas as substâncias emitem fluorescência, ou
seja, não é universal.
• Apresenta alguns factores condicionantes como a estrutura molecular
das substâncias – as ligações duplas e triplas, aromáticas e grupos
eletrodadores vão favorecer a fluorescência e os grupos eletrorecetores
como o cloro, iodo, nitro e bromo vão contrariar a fluorescência.

259
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
- Equipamento:

 Os equipamentos podem ser de 2 tipos:


 Fluorimetros (Filtros)
 Espectrofluorimetros (Monocromadores)
São usadas tinas de vidro
Fonte de Monocromador (visível) ou quartzo (UV)
Amostra de faces todas
Radiação Excitatório
transparentes.

90 graus
A potência de fluorescência Selecionam o comprimento Monocromador
é diretamente proporcional de onda de excitação e de
à potência da radiação de emissão, respetivamente.
de Emissão
excitação. Forma-se um ângulo de 90º
Lâmpadas: entre eles para que o detetor Tubos fotomultiplicadores
• Deutério não detete o comprimento ou detetores de vetores de
Detetor
• Mercúrio de onda excitação. Assim, ao díodos.
• Xénon ← detetor chega apenas o Estes detetam a radiação.
comprimento de onda da
amostra que foi
seleccionado.

 Técnica Operatória:
1. Solução mãe: pesar a quantidade de hidrocloreto de quinino dihidratado
necessária para preparar uma solução padrão (100 ppm de quinino) num
balão de 100 mL. Juntar 5 mL de H2SO4 1M e perfazer até ao traço com água
destilada.
2. Solução intermédia: diluir a solução mãe de modo a obter uma solução de 10
ppm de quinino. Completar o volume com H2S04 0,05 M.
3. Soluções padrão: a partir desta solução intermédia preparar soluções padrão
(balões de 50 mL) nas concentrações: 0,2, 0,5, 0,8, 1,2, 1,6 e 2,0 ppm.
Completar o volume com H2S04 0,05M. Preparar também o branco.
4. Amostra (água tónica): fazer uma toma de 5 mL de amostra para um balão de
250 mL e perfazer com H2S04 0,05M
5. Utilize a curva de calibração para determinar a concentração de hidrocloreto
de quinino na amostra analisada tendo em conta as diluições efetuadas.
Comente o resultado obtido.
 Cálculos:
- Parte 1. - Quantidade de Hidrocloreto de Quinino Dihidratado a Pesar
Dados:
- PM Hidrocloreto de Quinino Dihidratado = 396,91 g/mol
- PM Hidrocloreto de Quinino = 396,91 - 2∙(18,02)= 360,87 g/mol
- Solução padrão 100 ppm (100 mg/L)

260
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018

100 mg de Hidrocloreto de quinino --------------- 1000 mL de Solução


x mg --------------- 100 mL de Solução
x = 10 mg = 0,01g de Hidrocloreto de Quinino

396,91 g de Hidrocloreto de Quinino Dihidratado --------------- 360,87 g de H. de Quinino


y g de Hidrocloreto de Quinino Dihidratado --------------- 0,01 g de H. de Quinino
y = 0,0110 g

Deve pesar 0,0110 g de Hidrocloreto de Quinino Dihidratado para pesar uma


solução com 100 ppm de Hidrocloreto de Quinino.

- Parte 2. - Solução Intermédia

100 ppm --------------- 100 ml


10 ppm --------------- x mL
x = 10 ml

Prepara uma solução de 100 ml com 10 ml de solução mãe.

- Parte 3. – Soluções Padrão

0,2 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 ×50 𝑚𝑚𝑚𝑚


① 𝑉𝑉𝑖𝑖 = = 1 𝑚𝑚𝑚𝑚
𝑐𝑐𝑓𝑓∙ 𝑉𝑉𝑓𝑓 10 𝑚𝑚𝑚𝑚
𝑉𝑉𝑖𝑖 =
𝑐𝑐𝑖𝑖 ② 𝑉𝑉𝑖𝑖 =
0,5 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 ×50 𝑚𝑚𝑚𝑚
= 2,5 𝑚𝑚𝑚𝑚
10 𝑚𝑚𝑚𝑚

0,8 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 ×50 𝑚𝑚𝑚𝑚


Volume a retirar da ③ 𝑉𝑉𝑖𝑖 = = 4 𝑚𝑚𝑚𝑚
Solução Intermédia 10 𝑚𝑚𝑚𝑚
(Volume Inicial)
1,2 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 ×50 𝑚𝑚𝑚𝑚
④ 𝑉𝑉𝑖𝑖 = = 6 𝑚𝑚𝑚𝑚
10 𝑚𝑚𝑚𝑚

1,6 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 ×50 𝑚𝑚𝑚𝑚


⑤ 𝑉𝑉𝑖𝑖 = = 8 𝑚𝑚𝑚𝑚
10 𝑚𝑚𝑚𝑚

2,0 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 ×50 𝑚𝑚𝑚𝑚


⑥ 𝑉𝑉𝑖𝑖 = = 10 𝑚𝑚𝑚𝑚
- Parte 4. – Amostra 10 𝑚𝑚𝑚𝑚

5 ml (Água Tónica)
H2SO4 0,05 M

V = 250 ml

261
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Cálculos:
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
PPM (C) 0,2 0,5 0,8 1,2 1,6 2,0
Volume 1 2,5 4 6 8 10
E 287,37 654,15 1014,4 1015,6 1015,6 1015,6

- Equação da reta: E = 468,72 c + 299,24


- E Amostra = 1015,593
- Pela equação da reta, a C Amostra : 1,5283 𝜇𝜇𝜇𝜇/ml = 1,5283 ppm

1,5283 mg --------------- 1000 ml


x mg --------------- 250 mL
x = 0,3821 mg

0,3921mg --------------- 5 ml
x mg --------------- 1000 mL
x = 76,415 mg

Dentro dos limites previstos (45-80ppm).

262
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Análise Quantitativa do Potássio em Ampolas por Fotometria de Chama

 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:


- Na Fotometria de chama, os átomos são excitados por meio de uma chama.
- Após excitação do átomo, devido à absorção de energia da chama, este ao
regressar ao estado fundamental poderá emitir uma radiação característica.

 Teoria:
Na fotometria de emissão ocorre a excitação de átomos neutros. Os átomos
excitados voltam ao seu estado fundamental com emissão de fotão de
radiação que pode ser identificado e medido.

Amostra Spray da Amostra Aerossol Moléculas no


Átomos
em Solução Neutralizada Sólido/Gás estado gasoso

Nebulização Dessolvatação Voltilização Dissociação

(transformação da amostra em

Excitação
gotículas de gás)
Fotometria de
Emissão Com
Chama

Átomos
Excitados

 Equipamento

Amostra em
Solução
Atomizador
Queimador Sistema Ótico Detetor

Gases:
- Comburente
- Combustível
Lentes e fendas que
Turbulento Fluxo laminar selecionam o
comprimento de onda. Periférico de
Toda a amostra é A amostra é nebulizada; Saída
utilizada na chama. só as gotículas mais
Menos eficaz, pequenas passam o tubo
consome mais para serem aquecidas
amostra. pela chama. É mais 263
eficaz.
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Chama
• Vaporização da substância
• Atomização das espécies moleculares
• Excitação dos átomos até à emissão

 Diferentes temperaturas fornecem diferentes taxas de atomização


e excitação. (≠ Temperaturas → ≠ Tonalidades)
 Determinações quantitativas: é importante ajustar a altura do feixe
radiante

 Condições de Ensaio

 Natureza e Débito dos gases alimentares da chama


 Zona de Observação da Chama
 Comprimento de onda (risca)
 Natureza dos Solventes

 Interferentes
 Espectrais (Comprimento de onda dos interferentes próximos do em
análise, logo usar bons monocromadores)
 Físicos (Partículas na chama que difratam ou refletem, logo menor
viscosidade)
 Associações (solventes orgânicos; chamas Redutores ou quentes)
/dissociações moleculares (Oxidação de metais na chama)
 Ionização dos elementos (Por metais alcalinos  tampões de Ionização)
 Compostos dos elementos
 Compostos com p.e elevado
 Auto Absorção (A baixas concentrações)

 Vantagens

• Baixo custo
• Bom desempenho
• Simplicidade de Operação

264
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Técnica Operatória:
1. Preparação de soluções padrão para calibração: Para cinco balões
volumétricos de 50 mL meça 0 mL, 2,5 mL, 5,0 mL, 7,5mL, e 10,0 mL da
solução padrão de cloreto de potássio diluída. Adicione a todas as
concentrações da curva de calibração, 2 mL da solução de tampão
(constituído por um elemento que é muito fácil para ionizar. Assim protege
o outro) de ionização. Complete o volume com água desionizada. Calcule
as concentrações de todas as soluções padrão em ppm.
2. Preparação da solução problema: De acordo com concentração de
potássio prevista na amostra problema, processa a diluição desta de modo
a obter uma solução de concentração compreendida entre os valores das
soluções dos padrões (próxima da solução de padrão média).
3. Leitura no fotómetro de chama.

 Cálculos:
- Cálculo da massa de potássio presente nos 4,6 mg de citrato tribásico em
cada ampola
Dados:
- PM Citrato de potássio = 306,46 g/mol
- PM Potássio = 39,1 g/mol
- m = 3 x 39,1 = 117,3 g

306 g (citrato de potássio) --------------- 117,3 g (potássio)


4,6 g --------------- x
x = 1,761 g/ 10 mL (valor teórico)
= 176,1 mg/L (concentração de potássio na solução problema)

10 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 ×0 𝑚𝑚𝑚𝑚
Padrão ① 𝑐𝑐𝑓𝑓 = = 0 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
50 𝑚𝑚𝑚𝑚

10 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 ×2,5 𝑚𝑚𝑚𝑚


Padrão ② 𝑐𝑐𝑓𝑓 = = 0,5 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
50 𝑚𝑚𝑚𝑚
176,1 x 2 = C f x 50  C f = 7 ppm
10 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 ×5 𝑚𝑚𝑚𝑚
7 x 10 = C f x 50  C f = 1,4 ppm Padrão ③ 𝑐𝑐𝑓𝑓 = = 1 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
50 𝑚𝑚𝑚𝑚

10 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 ×7,5 𝑚𝑚𝑚𝑚


Padrão ④ 𝑐𝑐𝑓𝑓 = = 1,5 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
50 𝑚𝑚𝑚𝑚

10 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 ×10 𝑚𝑚𝑚𝑚


Padrão ⑤ 𝑐𝑐𝑓𝑓 = = 2 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
50 𝑚𝑚𝑚𝑚

265
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Solução inicial

2 mL ---- 50 mL (7 ppm)

10 mL ---- 50 mL (1,4 ppm)

[Amostra] = 0,943

C i x 10 = 0,943 x 50  C i = 4,715 ppm

C i x 2 = 4,715 x 50  C i = 117,88 ppm

117,88 mg --------------- 1000 mL


m --------------- 10 mL
m = 1,1788 mg potássio

306,4 g --------------- 117,3 g potássio


x --------------- 1,1788x10-3 g potássio
xcitrato de potássio = 0,00308 g = 3,08 mg
(fora dos limites previstos)

266
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Análise Quantitativa do Cálcio numa Solução por Espetrofotometria de
Absorção Atómica com Chama

 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:


- Os princípios da espectrofotometria de absorção atómica são iguais aos da
espectrofotometria de absorção molecular, verificando se a lei de Lamber-Beer.
- A diferença está em estudarmos os elementos no estado atómico
fundamental.
- As radiações absorvidas pelos átomos são de energia idêntica às que estes
emitem quando se processa um fenómeno de emissão.
- A absorção será tanto maior quanto mais elevada for a concentração de
átomos do elemento no estado fundamental.
- Usa se como fonte luminosa uma lâmpada de cátodo oco de cálcio.
- A radiação emitida vai ser absorvida por átomos que estejam no estado
energético fundamental.
- Pode haver interferências minerais devidas à presença de sódio, potássio e
fosfatos.
- Interferências são minimizadas pelo uso de uma quelação protectora com
EDTA.
- O EDTA tem grande capacidade de se combinar com o cálcio presente na
amostra, e liberta o facilmente na chama, ou seja, conduz a uma fácil
atomização.

 Teoria:
Os princípios da espetroscopia de absorção atómica são os mesmo que os da
espetroscopia de absorção molecular (aplica-se a Lei de Lambert-Beer, no
entanto neste método um feixe de radiação proveniente de uma fonte
adequada vai sofrer absorção por parte de átomos no estado fundamental
existentes numa chama, emergindo um feixe de radiação de menor
intensidade.

267
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Equipamento

Gases:
Amostra em • Comburente
Solução • Combustível

Fonte de Modelador Chama Sistema Ótico Detetor


Radiação

Lâmpada de Cátodo Disco circular, rotativo, Funções:


Oco com janelas em • Evaporação do Reconhece apenas a
quadrantes alternados solvente (EDTA) radiação gerada pelo
1. Bombardeamento que deixa passar a • Atomização modelador evitando
pelo árgon radiação de forma
assim a interferência
2. Excitação a M* intermitente.
da chama.
(mesmo metal
que se quer
analisar).
3. Emissão (M*→ M) Quanto maior a concentração de átomos no estado
de um
comprimento de fundamental, maior a absorvância.
onda (c.d.o)
definido.

 Métodos para a Correção de Interferências


• Correção com branco de matriz semelhante à da amostra-problema
• Método de adição-padrão
• Correção com fonte contínua (Lâmpada de Deutério)
• Correção baseada no efeito de Zeeman

 Técnica Operatória:
1. Preparação de soluções padrão para calibração: Para sete balões
volumétricos de 50 mL meça respectivamente 0mL, 0,5mL, 1mL, 2mL, 3mL,
4mL e 5mL da solução padrão de cálcio. Adicione a cada balão 10mL de
solução concentrada de EDTA completando o volume de água desionizada.
Calcule as concentrações de todas as soluções padrão em ppm.

268
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
2. Preparação da solução problema: Solução Ácida Concentrada para
Hemodiálise.
Coloque X mL da solução problema em balão de 100 mL completando o
volume com água desionizada. Após homogeneização, retirar Y mL desta
solução para um balão de 25 mL completando o volume com solução
diluída de EDTA. O valor X e de Y mL deverá ser calculado tendo em conta a
concentração prevista na amostra e de modo a que o valor da absorvência
lida se situe no meio da recta de calibração construída com as soluções de
padrões.
Ter em atenção que nas soluções padrões utiliza se EDTA
concentrado e na solução problema utiliza se EDTA diluído

 Cálculos:
- Cálculo das [ ] das soluções padrão:
[P 1 ] = 100 mg L-1 x 0,5 mL = c f x 50 mL  c f = 1 mg L-1
[P 0 ] = 0 mg L-1
[P 1 ] = 1 mg L-1
[P 2 ] = 2 mg L-1
[P 3 ] = 4 mg L-1
[P 4 ] = 6 mg L-1
[P 5 ] = 8 mg L-1
[P 6 ] = 10 mg L-1

- Preparação da solução problema:


- Concentração final pressuposto = 5,4 mg/L (por tentativa)
- Tendo em contas as diluições, temos:

X mL ----- 100 mL
Y mL ----- 25 mL (EDTA)
Dados:
- PM (CaCl2 . H2O) = 146,98 g/mol
- PM (Ca) = 40,08 g/mol
- [CaCl2 . H2O] = 9 g/L = 9,0x103 mg/L

1,5 mL ----- 100 mL (135 mg/L)


1 mL ----- 25 mL (5,4 mg/L) --> [ ] intermédia, ou seja, encontra-se
entre as [ ] dos padrões
X = 1,5 mL Y = 1 mL

269
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018

1,5 mL --------------- 100 mL 1 mL --------------- 25 mL


1 mL --------------- x Fd2 = 25 mL
x = 66,7 (Fd1)
[Amostra] = 3,256 mg/L

[Amostra] inicial = [Amostra] F x Fd 1 x Fd 2


= 3,256 x 66,7 x 25
= 5429,38 = 5,429 g/L

5,429 g/L --------------- 146,98 g/mol (CaCl2)


x g/L --------------- 40,08 g/mol (Ca)
x = 1,48 g Ca

270
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Análise Quantitativa do Sódio numa Solução de Ringer por
Potenciométrica Direta

 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:

O elétrodo seletivo de sódio é sensível à atividade dos iões sódio nas soluções.
A membrana é em vidro de silicato de alumínio especial. É particularmente
seletiva aos iões sódio. Este elétrodo aplica-se à determinação potenciométrica
direta da atividade dos iões sódio ou da concentração dos iões sódio. Em
situações de elevadas concentrações de sódio pode-se utilizar este elétrodo
como indicador para titulações potenciométricas. Como todos os elétrodos
iónicos específicos, o elétrodo de sódio apresenta interferência à presença de
outros iões, em particular catiões monovalentes. Os iões interferentes mais
importantes são: H+, Li+, K+, Ca2+, NH4+. A interferência mais importante é a do
H+. Para evitar erros de medida, o valor de pH deve ultrapassar, pelo menos 4
unidades o valor do pNa da solução. Para controlar o pH devem-se usar bases
fortes com catiões orgânicos grandes, como a trietanolamina, diisopropilamina,
etc. O ião K+ não perturba a precisão das medidas, mesmo que se encontre
numa concentração 10 vezes superior.

 Teoria:
Potenciométrica – técnica eletroanalítica baseada na medição dos potenciais desenvolvidos
numa célula eletroquímica na ausência de correntes elétricas apreciáveis.

Os métodos potenciométricos medem a força eletromotriz (FEM) que varia com a concentração
do componente em estudo.

Força elétrica impulsionadora que empurra os


eletrões produzidos na reação do elétrodo de
oxidação de uma célula voltaica até ao elétrodo
onde se dá a redução.

Dois tipos de análise:


• Medição direta de um potencial de elétrodo a partir do qual se pode calcular a
concentração de um ião ativo (Potenciométrica Direta).
• Medição da variação da força eletromotriz (FEM) de uma célula em
consequência da adição de um reagente titulante (Titulações
Potenciométricas).

271
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018

Potenciométrica e elétrodos → Baseia-se na medição de um potencial de um elétrodo


indicador em relação a um elétrodo de referência quando não passa corrente através
da solução em que estão mergulhados. Este potencial depende das atividades das
espécies que entram nas reações redox correspondentes através da equação de Nerst.

0,0592
𝐸𝐸 = 𝐸𝐸 0 − log(𝑄𝑄)
𝑛𝑛

- Elétrodo Indicador (seletivo ao Na+) – Resposta rápida e reprodutível, seletivo para o


ião que se pretende analisar. Podem ser utilizados vários tipos de elétrodos
indicadores (hidrogénio, quinidrona, antimónio), mas na prática o mais utilizado é o
elétrodo de vidro.
- Elétrodo de Referência (Ag/AgCl) – Potencial constante e conhecido, e insensível à
composição da solução em estudo.

 Técnica Operatória:
A determinação da concentração do ião sódio é feita com base no emprego de uma
curva de calibração de soluções padrão de concentração conhecida em sódio.

1. A partir da solução mãe de NaCl 1M, prepare usando balões volumétricos de 50


mL, soluções nas seguintes concentrações: 0,01M, 0,05M, 0,1M, 0,5M.

C1 = 1 M

C final = 0,01M, 0,05M, 0,1M, 0,5M

v final = 50 ml
v inicial = ??

2. Medir o potencial do elétrodo para cada solução padrão, não esquecendo a


solução mãe. Comece as leituras pela solução mais diluída, anotando os valores
dos potenciais respetivos logo que estejam constantes. Tome em atenção que a
resposta do elétrodo é lenta, pelo que se deve aguardar a sua estabilização, a
qual demora cerca de 1 minuto.

Nota: As soluções padrão executadas têm valores de pNa compreendidas entre


0 e 2, pelo que o valor mínimo de pH, para não se verificar interferência do ião
H+, deverá o pH ser superior a 6, o que se verifica nas presentes soluções. Não
se justifica, portanto, a adição de bases orgânicas.

3. Entre as leituras lavar e limpar os elétrodos convenientemente.

272
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018

4. Introduzir a solução problema (Solução de Ringer) e ler o valor do respetivo


potencial.

5. Executar a curva de calibração, colocando em ordenadas o potencial (mV) dado


pelo elétrodo e em abcissas o log das concentrações correspondentes em NaCl.

6. A partir do potencial do problema determinar a concentração em ião Na+,


utilizando a curva padrão.

 Cálculos:

[P 1 ] → 1 x V inicial = 0,01 x 50 mL ⇔ V inicial = 0,5 mL


[P 2 ] → 1 x V inicial = 0,05 x 50 mL ⇔ V inicial = 2,5 mL
[P 3 ] → 1 x V inicial = 0,10 x 50 mL ⇔ V inicial = 5 mL
[P 4 ] → 1 x V inicial = 0,50 x 50 mL ⇔ V inicial = 25 mL

Solução Potencial Log []


0,01 M 138 mV -2,00
0,05 M 167 mV -1,30
0,1 M 182 mV -1
0,5 M 217 mV -0,30
1M 235 mV 0
Ringer 180 mV

- Equação: y = 48,54 x + 232,46

180 = 48,54 x + 232,46 ⟺ x = -1,08

[Ringer] = 10 -1,08 = 0,083 M (Na+ )

- Teor de NaCl na solução em moles/L e em g/L

Solução de Ringer:
• Em moles/L: 0,083 M 8,6g de NaCl
• Em g/L: 0,3g de KCl
0,496g de CaCl2, 6 H2O
H2O bidestilada q.b. para 1000mL
PM(NaCl) = 58,5 g/mol

1 mol --------------- 58,5 g (NaCl)


0,083 mol --------------- x (NaCl)
x = 4,86 g/L – Abaixo dos valores previstos
273
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Análise Quantitativa de Cloretos e Iodetos numa Solução por Titulação
Potenciométrica

 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:


O ponto final de uma titulação é determinado pela variação brusca de potencial
(salto de potencial).
Na prática, adicionam-se volumes pequenos de reagente à solução a titular,
sendo mais reduzidos na zona de viragem, fazendo-se leituras ou registando-se
os valores de potencial ou de pH correspondentes.
O método baseia-se, igualmente, na equação de NERNST, sendo, portanto,
logarítmica a relação entre valores de potencial e de concentração do elemento
a dosear, o que explica a variação brusca de potencial no P.E. da reação.
Os resultados representam-se graficamente, marcando em ordenadas o E ou
pH e em abcissas o volume de titulante, resultando uma curva potenciométrica
que permite localizar o ponto final da reação (P.E.).
As titulações potenciométricas aplicam-se às seguintes determinações:

a. Ácido-Base
b. Precipitação (nesta experiência)
c. Oxi-Redução
d. Complexação

O ponto de equivalência duma reação de precipitação é determinado pelo


produto de solubilidade do composto pouco solúvel que se forma no decorrer
da reação. No caso da titulação de cloretos ou de iodetos com nitrato de prata,
usando o elétrodo de prata como indicador, o potencial deste elétrodo está
relacionado com a concentração iónica pela expressão:

E= E0 + 0,0592 log [Ag+] (T= 25ºC)

Dado que o produto de solubilidade do iodeto de prata é menor do que o do


cloreto, é possível observar um aumento de potencial do elétrodo quando
numa mistura termina a precipitação do iodeto e se inicia a precipitação do
cloreto, pelo nitrato de prata.
Assim, no decorrer da titulação potenciométrica, verificam-se dois saltos de
potencial, correspondentes à precipitação dos dois halogenetos.

274
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Teoria:
Uma titulação potenciométrica é um método potenciométrico indireto que se
baseia na medição de diferenças de potenciais entre dois elétrodos.
O ponto de equivalência é dado por uma variação brusca de potencial.
Para se determinar o ponto de equivalência, utiliza-se um de 2 métodos:
1. Método do gráfico = Método de Tangentes Paralelas
2. Método Matemático = Método das Derivadas (+ rigoroso)

Neste trabalho, titulação potenciométrica de precipitação, para se quantificar


os iões de iodeto e cloreto, faz-se uma reação em que se faz precipitar o Cl- e I-
fazendo-os reagir com nitrato de prata (AgNO 3 ).

Usando o elétrodo de prata como indicador e como elétrodo de referência uma


solução.

O Cl- e I- têm produtos de solubilidade diferentes pelo que podem ser


quantificados na mesma titulação [(Kps (AgI) <<< Kps (AgCl)]; o iodeto é quem
reage primeiro com a prata porque é o que tem o produto de solubilidade
menor.

Ag+ + Cl- ⟶ AgCl ↓ (cor branca)

Ag+ + Cl- ⟶ AgI ↓ (cor amarela)

Curva de Titulação O elétrodo de prata só reage


300 quando houver Ag+ no meio
200 quando deixar de haver I- e
100 Cl-.
0 Δ E2
Potencial (E)

-100 0 5 10 15 20 do AgCl; 2º patamar é - plano, porque a reação é


Precipitação
reversível, ou seja, o AgCl formado se dissolve, isto é, solúvel.
-200
Reação: KCl + AgNO3 ⇆ KNO3 + AgCl (↓)
-300 Δ E1
-400
Precipitação do AgI; 1º patamar é + plano, porque a reação é
-500 irreversível, ou seja, o AgI formado não se dissolve, isto é, insolúvel.
-600 Reação: KI + AgNO3 ⟶ KNO3 + AgI (↓)

Volume Titulante (AgNo3 / ml)

Δ E 1 >> Δ E 2, porque o salto de potencial é inversamente proporcional ao produto de


solubilidade.

275
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Técnica Operatória:

1. Para o copo de titulação meça 10 mL de solução de iodeto de potássio e 5


mL de solução de cloreto de potássio. Adicione água destilada de modo a
que o elétrodo fique suficientemente mergulhado.

2. Ligue o agitador magnético e ligue o potenciómetro.

3. Rode o seletor para a escala de mV, fixando este em 500 mV.

4. Proceda à titulação tomando nota das variações de potencial após cada


adição de titulante. Inicialmente os volumes de titulante adicionados
devem ser da ordem de 1 mL ou 0,5 mL. Quando começar a ocorrer uma
certa variação do valor do potencial deve adicionar volumes de titulante da
ordem de 0,1 ou 0,2 mL de forma a ter o maior número de valores possível
junto do ponto de equivalência. Ultrapassando o ponto de equivalência, ou
seja, quando os valores de potencial começam novamente a estabilizar
deve adicionar volumes maiores de titulante.

5. Com os valores de potencial lidos elabore uma curva de titulação e


determine o ponto de equivalência.

Elétrodos utilizados:

- Elétrodo indicador - prata


- Elétrodo de referência - Hg/ Hg 2 SO 4 , K 2 SO 4 sat.

Reagentes:
- Solução de cloreto de potássio (sol. Problema)
- Solução de iodeto de potássio (sol. Problema)
- Solução de nitrato de prata N/10.

 Cálculos/ Tabela e Gráfico da Curva de Titulação / Pontos de


Equivalência:
- Tabela da Curva de Titulação

Volume de AgNO 3 Volume de AgNO 3 Potencial (E) /


Potencial (E) / mV
0,1 N (ml) 0,1 N (ml) mV
0 -500 9 -120
1 -500 10 -110
2 -500 10,2 -110
3 -495 10,4 -100
4 -480 10,6 -100

276
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
4,2 -480 10,8 -100
4,4 -480 11 -100
4,6 -480 11,2 -100
4,8 -480 11,4 -90
5 -480 11,6 -80
5,2 -475 11,8 -80
5,4 -465 12 -70
5,6 -465 12,2 -10
5,8 -440 12,4 110
6 -420 12,6 140
6,2 -370 12,8 150
6,4 -170 13 150
6,6 -160 13,2 150
6,8 -150 13,4 150
7 -150 13,6 160
7,2 -140 13,8 160
7,4 -140 14 160
7,6 -130 15 160
7,8 -130 16 170

- Gráfico da Curva de Titulação

Curva de Titulação
300

200

100

0
Potencial (E)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
-100

-200

-300

-400

-500

-600
Volume Titulante (AgNo3 / ml)

277
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
- Fazemos a primeira derivada do gráfico da Curva de Titulação obtido para se obter os
pontos de equivalência; para fazermos o gráfico da 1ª derivada, aplicamos nas abcissas a
𝑉𝑉 + 𝑉𝑉 𝐸𝐸 − 𝐸𝐸
seguinte fórmula: 𝑥𝑥 = 2 2 1 . E nas ordenadas utilizamos esta fórmula: 𝑦𝑦 = 𝑉𝑉2 − 𝑉𝑉1.
2 1

- Gráfico da 1ª Derivada

Gráfico 1ª Derivada
1200

1000 6,3; 1000

800

600 12,3; 600

400

200

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
-200

- Cálculo do Teor em Iodetos na Solução:

• Primeiro P.E corresponde ao Iodeto.


• Volume gasto no P.E do Iodeto: 6,3 ml
• [AgNO 3 ] = 0,1 N = 1 eq L-1

0,1 eq --------------- 1000 ml


x eq --------------- 6,3 ml
x = 6,3 x 10-4 eq (KI)

• Volume de KI usado na Técnica Operatória: 10 ml

6,3 x 10-4 eq --------------- 10 ml


y eq --------------- 1000 ml
y = 6,3 x 10-2 eq L-1 (KI)

278
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
- Cálculo do Teor em Cloretos na Solução:

• Segundo P.E corresponde ao cloreto.


• Volume gasto no P.E do Iodeto: 12,3 – 6,3 = 6 ml
• [AgNo3] = 0,1 N = 1 eq L-1

0,1 eq --------------- 1000 ml


x eq --------------- 6 ml
x = 6 x 10-4 eq (KCl)

• Volume de KI usado na Técnica Operatória: 10 ml

6 x 10-4 eq --------------- 5 ml
y eq --------------- 1000 ml
y = 0,12 eq L-1 (KCl)

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Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Análise Quantitativa de Água numa Amostra pelo Método de Karl
Fischer com Deteção por Bipotenciometria

 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:


Pretende-se dosear água num produto farmacêutico, usando o método de Karl Fischer com
deteção por bipotenciometria.
A Bipotenciometria mede a variação de potencial entre dois elétrodos indicadores metálicos e
idênticos enquanto se aplica uma corrente constante (de 1 a 5 μA) entre eles. Neste método
que pode ser denominado de potenciometria de corrente controlada com dois elétrodos
indicadores, fixa-se a intensidade de corrente e deixa-se variar o potencial. A bipotenciometria
também pode acompanhar titulações em que exista um par redox reversível no sistema do
titulado ou do titulante ou de ambos.
No caso da titulação da água pelo método de Karl Fisher o sistema reversível é a solução de
iodo, isto é o titulante. Nestas condições a f.e.m. entre os dois elétrodos permanece constante
até ao ponto final, e a partir daí decai bruscamente.
Em muitos aparelhos esta titulação é automática, sendo a adição de reagente suspensa no
ponto final da mesma.

 Teoria:
A Titulação de Karl-Fischer é o método analítico mais utilizado para aferir o teor de
água (humidade) em solventes e outros produtos.

- Método Volumétrico
I 2 + SO 2 + 2H 2 O ⇄ 2 HI + H 2 SO 4 ⇒ Reação de Bunsen
R

I2 + SO2 + 2H2O + 2 Py → 2 HIPy + H2SO4 ⇒ Reação de Karl-Fischer

Py = Pirimida → Não está envolvida diretamente na


reação; tem poder tampão e faz com
que a reação seja irreversível podendo
ser substituída por outras bases.

- Titulação por Bipotenciometria

Aferição: Determinar rigorosamente a quantidade de água com a qual a solução


pode reagir.

Utilizam-se dois elétrodos iguais (de platina), mantendo-se a corrente elétrica


constante, o potencial elétrico só varia quando estiverem ambos os pares redox
em solução.

280
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
- Titulante: Solução de Iodo
- Titulado: Solução problema contendo H2O; solvente é o metanol porque
estamos a dosear água.

Quando toda a água reagir com o Iodo, o potencial varia porque as duas
espécies de par redox estão em solução. Ou seja, cada molécula de I2 vai reagir
com H2O enquanto houver. No momento em que toda a H2O reagir com I2 a
próxima molécula de I2 vai formar 2I-. Estes iões vão ser detetados pelos
elétrodos, através da diferença de potencial que corresponderá ao nosso ponto
de equivalência.

 Técnica Operatória:

1. Aferição do reagente titulante

É necessário proceder periodicamente à aferição do reagente titulante pois não


é possível evitar por completo a entrada de humidade no sistema, mesmo
usando de precauções especiais. Como "amostra padrão de aferição" utiliza-se
uma substância cujo conteúdo em água se mantem inalterado por longo
tempo, por exemplo, tartarato de sódio di-hidratado (num grau elevado de
pureza, contém 15,66±0,05% de água).

Processo de aferição:

- Introduzir reagente solvente no copo de titulação até cobrir os elétrodos


de platina (15 a 20mL).
- Pesar com exatidão, e em condições anidras, cerca de 50mg de tartarato
de sódio di-hidratado registando rigorosamente o peso do recipiente +
tartarato.
- Selecionar MODE e escolher modo KFT.
- Selecionar PARAM para estabelecer condições.
- Carregar QUIT, as vezes necessárias até aparecer ´KFT I(pol) D0a ......´
- Carregar no START.

Vai sendo adicionado automaticamente reagente titulante até eliminação


da água existente no solvente (ensaio a branco) e o valor de ‘drift’ vai
baixando e aparece OK (o drift atingiu o valor selecionado em
‘parameters’).

- Quando aparecer OK carregar novamente START.


- (Pesar rigorosamente a amostra, neste caso o tartarato).

281
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
- A bureta enche automaticamente e aparece a mensagem para adicionar
amostra (add sample).
- Introduzir rapidamente o tartarato no vaso de titulação (e pesar de novo
o recipiente; por diferença calcular a quantidade do tartarato ensaiado).
- Vai sendo adicionado automaticamente reagente titulante até reação da
água existente no tartarato. Aparece então um gráfico de volume de
reagente adicionado em função do tempo, e o valor de EP1 = volume
gasto até ao ponto de equivalência.
- Carregar STOP.
- Tendo em conta o volume de reagente titulante gasto (EP1), e a
quantidade de tartarato ensaiado, calcular o fator de aferição do
reagente titulante, em miligramas de água por mililitro do reagente.

2. Titulação da amostra

Proceder de modo idêntico ao descrito anteriormente, substituindo o


tartarato (padrão de aferição) por uma quantidade (cerca de 50mg) de
amostra problema.

 Equipamento, Material e Reagentes:


- Conjunto de titulação automático Metrohm “Titrino 751 GPD”, constituído por
módulo de comando com visor e microbureta, agitador magnético, copo de
titulação e recipientes com reagentes.
- Balança de precisão.
- Reagente solvente: solução de dióxido de enxofre e imidazol em metanol
anidro
- Reagente titulante: solução de iodo aferida
- Tartarato de sódio di-hidratado (num grau elevado de pureza, contém 15,66
± 0,05% de água).

 Cálculos:
- Padrão de Aferição (Tartarato de sódio di-hidratado)
 m (tartarato + recipiente) = 12,1872 g
 m (recipiente) = 12, 1301 g
 m (tartarato) = 0,0571 g = 57,1 mg
 Volume Gasto na Titulação: 1,56 ml

- Padrão de Amostra
 m (amostra + recipiente) = 12,1966 g
 m (recipiente) = 12, 1699 g

282
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 m (amostra) = 0,0267 g = 26,7 mg
 Volume Gasto na Titulação: 0,604 ml

- Cálculo do Fator de Aferição do Titulante

• Tartarato de sódio di-hidratado contém 15,66 ± 0,05 % de água

15,66 mg H2O --------------- 100 mg Tartarato


x mg H2O --------------- 57,1 mg Tartarato
x = 8,94 mg H2O

8,94 mg H2O --------------- 1,56 mL de Titulante


y mg H2O --------------- 1mL de Titulante
y = 5,73 mg/mL (fator de aferição)

- Cálculo da Percentagem de Água na Amostra

5,73 mg H2O --------------- 1 mL de Titulante


x mg H2O --------------- 0,604 mL de Titulante
x = 3,46 mg H2O na amostra

3,46 mg H2O --------------- 26,7 mg amostra


y mg H2O --------------- 100 mg amostra
y = 12,96 %

283
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Determinação da Condutividade de Diferentes Tipos de Água por
Condutimetria Direta
 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:
A condutividade é uma propriedade que se aplica principalmente a soluções
simples de eletrólitos, possibilitando em condições controladas proceder a
análises quantitativas.
O campo de aplicação estende-se desde os sistemas de baixa condutividade e
baixa concentração iónica, como o cloreto de prata na água a 25ºC, aos de
condutividade e concentrações iónicas elevadas, como a mistura de cloretos de
sódio e potássio a elevadas temperaturas.
Sendo a condutividade uma grandeza sensível à presença de impurezas,
existem poucos dados sobre a condutividade de substâncias puras, não tendo
utilidade na identificação de substâncias.
A condutividade de uma solução decresce com o aumento da sua pureza o que
permite utilizá-la como um índice de pureza.
Em soluções eletrolíticas, a eletricidade é conduzida por um processo de
transferência de massa. A condutividade depende linearmente, para um
determinado ião, da concentração em equivalentes por litro e da condutividade
iónica, esta por sua vez depende da carga e da mobilidade do ião.
A condutividade (χ), está relacionada com a condutância (C) pela seguinte
expressão:
𝑠𝑠
𝑐𝑐 = 𝜒𝜒 ⋅

Em que l/s é denominada constante da célula.
Nota:
l → comprimento do condutor (cm);
s → área ou secção do condutor (cm2)

284
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Nos equipamentos usados nas aulas, as leituras fazem-se em condutância,
passando-se os resultados para condutividade por uma simples operação
algébrica.
A escala de condutâncias está graduada de 0 a 3 μS.

S = siemen = Ohm-1 = mho


mS = 10-3 mho
μS = 10-6 mho

A condutimetria engloba dois tipos de determinações:


- Condutimetria direta
- Titulações condutimétricas

 Teoria:

Direta
Condutimetria • Análise muito rápida e sensível
Indireta • É necessária a determinação da
constante da célula (K).

 Constante da Célula (K)

Condutância (movimento dos iões)


ℓ mede-se no condutivimetro (Ohm-1).
𝐾𝐾 =
𝑠𝑠
1
𝑐𝑐 = 𝜒𝜒 ⋅
𝐾𝐾
⟺ 𝜒𝜒 = 𝑐𝑐 ⋅ 𝐾𝐾
𝑠𝑠
𝑐𝑐 = 𝜒𝜒 ⋅
ℓ Constante da célula, calcula-se
Condutividade (Ohm )-1
para cada célula.
↳ Obtêm-se por cálculo.

Também designada por Condutância Específica → medida da


maior ou menor facilidade de passagem da corrente elétrica
numa solução através da migração de iões.

Nota: Ao longo do tempo a contante da célula tende a aumentar, porque a área (s)
tende a diminuir.

285
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018

 Técnica Operatória:
O primeiro passo é determinar a constante da célula. Só depois é que se determina
as condutividades dos diferentes tipos de água. Para calcular a constante utiliza-se
uma solução de cloreto de potássio com concentração e temperatura conhecidas.

1. Determinação da constante da célula:

- Mergulhar a célula numa solução de calibração de KCl 0,1M.


- Ligar o interruptor geral
- Introduzir no quadrante da constante da célula o valor “1.00” × “1”.
- Regular a frequência de 2KHz e “temp” para “man”.
- Medir a temperatura da solução com um termómetro.
- Introduzir o valor da temperatura medida, no quadrante respetivo.
- Deixar o valor do coeficiente de temperatura em 2.0.
- Premir o botão “cond” para efetuar a leitura do valor de condutância.
- Ler no mostrador de leitura o valor da condutância “C”. Ter em atenção as
unidades em que é feita a leitura (μS ou mS).
- Premir o botão “St. By”.
- A partir do valor da condutividade “χ” expresso na tabela para a
temperatura de trabalho lida, calcule a constante da célula.

No laboratório obteve-se:
Temperatura = 21,6 °𝐶𝐶 ⟶ 𝜒𝜒 = 0,01215
C = 14, 71 ms/cm

286
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018

2. Determinação da condutividade de diferentes tipos de água

- Antes de mergulhar a célula na água cuja condutividade se pretende ler, lavar


muito bem a célula com essa água de modo que se retire qualquer interferência
resultante da solução de KCI.
- Mergulhar a célula na água a analisar.
- Introduzir o valor da constante da célula no quadrante respetivo.
- Regular o botão "freq" para 300 Hz (valor para soluções muito diluídas).
- Premir o botão "cond" para efetuar a leitura da condutividade da água no
quadrante respetivo.
- Proceder do mesmo modo para determinar a condutividade das outras águas.

 Cálculos:

 Cálculo da constante da célula:

Tendo em conta à tabela, o valor de condutividade para é de 0,01215.

𝑠𝑠 ℓ
𝑐𝑐 = 𝜒𝜒 ⋅ ⟺ 𝜒𝜒 = 𝐶𝐶 ⋅
ℓ 𝑠𝑠

ℓ 𝜒𝜒 0,01215
= ⇒ = 0,83
𝑠𝑠 𝐶𝐶 14,71 ∙10−3

Tipos de Água Condutividade Condutância


Água Desionizada 𝜒𝜒 = 4,41 ∙ 0,83 = 3,66 𝜇𝜇𝜇𝜇/𝑐𝑐𝑐𝑐 4,41 𝜇𝜇𝜇𝜇/𝑐𝑐𝑐𝑐
Água Destilada 𝜒𝜒 = 6,11 ∙ 0,83 = 5,071 𝜇𝜇𝜇𝜇/𝑐𝑐𝑐𝑐 6,11 𝜇𝜇𝜇𝜇/𝑐𝑐𝑐𝑐
Água da Torneira 𝜒𝜒 = 0,204 ∙ 0,83 = 0,204 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑐𝑐𝑐𝑐 0,204 𝜇𝜇𝜇𝜇/𝑐𝑐𝑐𝑐

287
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Análise Quantitativa de uma Solução Ácida por Titulação Condutimétrica
 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:
As reações químicas em soluções que implicam pelo menos um eletrólito, são
sempre acompanhadas de uma variação da condutividade da solução. Quanto
maior for esta variação, mais facilmente se determina o ponto final de uma
titulação condutimétrica.
Neste tipo de titulações é aconselhável utilizar uma solução titulante 10 a 20
vezes mais concentrada do que a solução a titular. Não conhecendo a ordem de
grandeza da solução problema, o melhor será fazer uma titulação experimental
de modo a determinar a gama mais favorável segundo os resultados medidos.
Atendendo à elevada concentração da solução titulante em relação ao titulado,
as medições de volumes devem ser muito rigorosas, de modo que o perfil
retilíneo do gráfico, não seja perturbado pela variação de volume da solução
final. Mesmo assim, será também conveniente introduzir uma correção nas
condutividades lidas, multiplicando-as pelo seguinte fator:
𝑽𝑽𝟎𝟎 + 𝑽𝑽′
𝑽𝑽𝟎𝟎
Em que V0 é o volume inicial e V é o volume de titulante adicionado.
Como o ponto de equivalência é determinado pela interceção das duas retas
antes e depois, não é necessário diminuir os volumes adicionados junto deste
ponto.
Outro aspeto importante a ter em atenção nas titulações condutimétricas, é o
facto de não ser necessário determinar a constante da célula, como acontece
nas determinações diretas.

 Teoria:

Direta → Determinação da constante da célula


Condutimetria
Indireta → Titulações Condutimétricas

Mede a Condutância
Variação da condutância ou condutividade
de uma solução iónica.
à medida que se vai adicionando titulante.
A condução da
eletricidade através
das soluções iónicas Condutância → depende do nº de iões presentes na solução,
deve-se à migração de das suas cargas e das respetivas mobilidades; é dada pela soma
iões positivos e das condutâncias de todas as espécies iónicas presentes na
negativos durante a solução.
aplicação de um
potencial de corrente
alternada.
288
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- Leis de Ohm

- 1ª Lei de Ohm

𝑉𝑉
𝑅𝑅 =
𝐼𝐼

Legenda:
R – Resistência de um condutor (Ohm)
V – Diferença de potencial (Volt)
I – Intensidade da corrente (Ampere)

- 2ª Lei de Ohm

𝑙𝑙
𝑅𝑅 = 𝜌𝜌 ∙
𝑠𝑠

Legenda:
R – Resistência de um condutor (Ohm)
1
𝜌𝜌 – Resistência específica ou Resistividade (Ohm cm)  𝜌𝜌 =
𝜒𝜒
l – Comprimento do condutor (cm)
s – Área/secção do condutor (cm2) Condutância específica
(Ohm -1 cm-1)

Sabendo que…

1 𝑙𝑙 1 𝑠𝑠 𝑠𝑠
𝐶𝐶 = 𝑅𝑅 = 𝜌𝜌 ∙ 𝐶𝐶 = ∙ = 𝜒𝜒 ∙
𝑅𝑅 𝑠𝑠 𝜌𝜌 𝑙𝑙 𝑙𝑙

Quanto maior a resistência, menor a condutância.

Neste trabalho pretende-se quantificar a acidez de uma solução:

H+ + Cl- + Na+ + OH- ⟶ H2O + Na+Cl-

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 Técnica Operatória:
1) Medir rigorosamente 20 mL da solução de HCl para a célula de medida.
2) Introduza com cuidado a barra de agitação dentro da célula.
3) Encha a bureta com hidróxido de sódio 0,1M.
4) Ligue o agitador, numa posição intermédia (próximo do ponto indicado junto ao
botão).
5) Ligue o condutivímetro.
6) Leia a condutividade inicial e após cada adição de titulante.
7) Deve fazer adições de 0,5 mL de cada vez e esperar 1 minuto antes de ler.
8) Trace a curva de titulação.
9) Determine o ponto de equivalência e calcule a concentração do ácido.

 Cálculos:
 V0 = 20 ml de solução HCl
 V’ = V. Titulante

V. Titulante V. Corrigido C C corrigido


Vcorrig. =
𝑽𝑽𝟎𝟎 +𝑽𝑽′ 𝜇𝜇𝜇𝜇/𝑐𝑐𝑐𝑐 C Corrig. = C ⋅ Vcorrig.
𝑽𝑽𝟎𝟎

0 1 109,6 109,6
0,5 1,025 88,27 90,48
1 1,05 60,33 63,35
1,5 1,075 34,86 37,47
2 1,100 38,86 42,75
2,5 1,125 48,38 54,43
3 1,15 65,06 74,82
3,5 1,175 76,06 90,005
4 1,2 89,45 107,36

200
y = 32,959x - 25,004
R² = 0,9951
150
y = -48,704x + 111,75
100 R² = 0,9947

50

0
0 1 2 3 4 5 6 7
-50

-100

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Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Agora fazemos a interseção das suas equações para encontrarmos o ponto de equivalência
(P.E):

−48,704 𝓍𝓍 + 111,75 = 32,959𝓍𝓍 − 25,004 ⟺ 𝑥𝑥 = 1,748 𝑚𝑚𝑚𝑚

Equação: HCl +NaOH ⟶ H2O + NaCl

Hidróxido de sódio 0,1 M, logo:

0,1 mol --------------- 1000 ml


x mol --------------- 1,748 ml
x = 1,748 x 10-4 mol

Volume de HCl: 20 ml, então:

1,748 x 10-4 mol --------------- 20 ml


y mol --------------- 1000 ml
y = 8,74 x 10-4 mol /L de HCl

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Identificação e Quantificação do Mentol e do Salicilato de Metilo num
Elixir por Cromatografia Gasosa
 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:
Esta análise vai ser efetuada comparando os cromatogramas obtidos na análise de uma
amostra de elixir com os cromatogramas obtidos quando se analisa uma solução padrão
constituída por cada uma das essências em estudo. A quantificação das essências é feita
utilizando o método do padrão interno por comparação com as soluções padrão de
essências de concentração próxima.
A cromatografia gasosa é usada como técnica analítica em que se utiliza um gradiente de
temperatura no forno do equipamento para conseguir melhores resultados na análise.
A composição química teórica da amostra (elixir) em estudo é a seguinte:
- Salicilato de metilo 0,75 mL
- Cloreto de Zinco 0,4 g
- Mentol 0,126 g

 Teoria:
Consiste na separação dos componentes de uma mistura devido à diferente
Cromatografia
afinidade desses componentes para duas fases: móvel e estacionária.

Tem como objetivo:

 Separação
 Identificação de componentes
 Quantificação

Obtêm-se cromatogramas, que são gráficos com nº de picos correspondente ao nº de


componentes da amostra.
Tm → Tempo morto; Tempo até sair o solvente

Tr → Tempo de retenção: tempo que um composto


demora a eluir na coluna

T’r → Tempo de retenção corrigido: Tr- Tm

K’ → Fator de capacidade: razão entre o tempo do


soluto na fase estacionária e o tempo do soluto na
fase móvel; Descreve a velocidade com que um dado
composto migra ao longo da coluna.

K → Coeficiente de partição: razão entre a


Tr − Tm Cs ∙ Vs concentração na fase estacionária (Cs) e a
𝐾𝐾 ′ = 𝐾𝐾 ′ = concentração na fase móvel (Cm).
Tm Cm ∙ Vm

Cs
𝐾𝐾 =
Cm
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- Separação de Componentes

 Diferença nos Tempos de Retenção:

𝑇𝑇 ′ 𝑟𝑟2 𝐾𝐾 ′ 2 𝐾𝐾2
𝛼𝛼 = = =
𝑇𝑇 ′ 𝑟𝑟1 𝐾𝐾′1 𝐾𝐾1

 Resolução Cromatográfica:

2Δ𝑍𝑍 2(𝑇𝑇𝑇𝑇𝐵𝐵 − 𝑇𝑇𝑇𝑇𝐴𝐴 )


𝑅𝑅𝑅𝑅 = =
𝑊𝑊𝐴𝐴 + 𝑊𝑊𝐵𝐵 𝑊𝑊𝐴𝐴 + 𝑊𝑊𝐵𝐵

 Número de pratos Teóricos:

𝑇𝑇𝑇𝑇 2 𝑇𝑇𝑟𝑟 2
𝑁𝑁 = 16 � � = 5,55 2
𝑊𝑊 𝑊𝑊1
2

Um pico cromatográfico corresponde, idealmente, a uma curva do tipo gaussiana. No


entanto, existem fatores que levam ao alargamento dos picos.

- Eficiência de uma Separação Cromatográfica

A separação cromatográfica de dois compostos é tanto maior quanto maior é a


diferença do tempo de eluição dos dois picos referentes aos compostos a separar e
menor a largura dos picos correspondentes aos dois compostos.
Para uma análise quantitativa é desejável que a resolução seja superior a 1,5.
A eficiência de uma coluna pode ser expressa em número de pratos teóricos:

• Pratos Teóricos

- Depende do comprimento da coluna e traduz o alargamento relativo da


“banda” durante o processo cromatográfico.

- Camada imaginária da coluna com tal espessura que solução provinda dela
têm a mesma composição que seria obtida se existisse equilíbrio entre as fases.

√𝑁𝑁 𝛼𝛼 − 1 𝐾𝐾 ′ 2
𝑅𝑅 = ∙ ∙
4 𝛼𝛼 1 + 𝐾𝐾′𝑎𝑎𝑎𝑎 Média dos Fatores de Capacidade

- É diretamente proporcional ao comprimento da coluna (L) e inversamente


proporcional ao diâmetro das partículas.
• AEPT – Altura equivalente a um prato teórico.
Comprimento da coluna
𝐿𝐿
𝐻𝐻 =
𝑁𝑁 Nº de pratos teóricos

293
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
- Para se otimizar a cromatografia

 Aumentar o comprimento da coluna


 Uniformizar os percursos possíveis para as partículas
 Otimizar o fluxo

Fatores que afetam a Resolução (alargamento dos Picos):


1) Introdução da Amostra
2) Tempo de Passagem no Detetor
3) Fenómenos da coluna
a. Diferentes percursos (anisotropia)
b. Difusão longitudinal
c. Transferência de massa

Cromatografia
 Fluido Supercrítico
 Fase Líquida Quanto à natureza da fase móvel
 Fase Gasosa

A amostra é volatilizada e injetada na coluna; a eluição é levada a cabo por um gás inerte
(fase móvel) que não interage com a espécie que está a ser analisada.

- Equipamento

Botija de Controlador
Coluna Detetor ③
Gás de Fluxo

Forno Tipos:
Gás Transportadores:  FID *
 N2, H2, He e Ar Injetor ①
 Enchimento  FTID
 Inerte e puro
 Semi-capilares e  TCD
capilares, são  ECD
tubulares abertos  NPD
 MSD

A amostra é injetada ① e arrastada pela fase móvel (gás arrastador) através da coluna
② que contêm a fase estacionária, onde ocorre a separação da mistura. As
substâncias separadas saem da coluna dissolvidos na fase móvel e passam pelo detetor
③ que gera um sinal elétrico proporcional à quantidade de matéria separada. O
primeiro composto a chegar ao detetor é o que tem menor afinidade para a coluna.

294
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Nota: A temperatura do injetor deve ser suficientemente alta para que a amostra se
vaporize imediatamente, mas sem se decompor.

*FID – Detetor de Ionização com Chama


Formam-se iões pela combustão da amostra na presença de H2 (combustível) e O2
(comburente), originando corrente elétrica no corretor, o que origina um sinal do qual
a combustão do gás de arrasto é desconhecida.
- Vantagens: elevada sensibilidade; grande linearidade de respostas; pouco sensível
à variação da velocidade.
- Desvantagens: destrói a amostra

- Método do Padrão Interno

Utiliza-se quando é difícil manter inalteráveis as condições operatórias.

Se não é possível Há variação Os sinais do Padrão Interno (P.I)


manter estáveis as das condições variam da mesma forma que o
soluções em análise. da amostra. composto a analisar.

O padrão interno é uma substância estranha usada como auxiliar de análise e é


adicionado na mesma proporção a todos as amostras em ensaio, tendo padrões como
problema.
A escolha do padrão interno depende da composição da amostra, tendo que ser
diferente de todos os componentes da amostra e não deverá interferir com eles.
Na prática, para quantificar a solução problema, traça-se uma curva de calibração em
que no eixo das ordenadas colocamos a razão entre os sinais obtidos e no eixo das
abcissas, as concentrações dos padrões.
O valor da solução problema é retirado por intrapolação.

 Equipamento, Material e Reagentes:

- Cromatógrafo de fase gasosa equipado com detetor de ionização de chama;


- Sistema de aquisição e tratamento de dados: TCNAV
- Garrafas de gases: N2, ar, hidrogénio
- Coluna cromatográfica: Tubular aberta (capilar)
- Solução de padrão interno: cânfora
- Pipetas de diferentes graduações (2, 5, 10 mL)
- Balões volumétricos de 50 mL
- Microseringa para injeção de 2μL

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Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Técnica Operatória:
1) Preparação da solução de padrão interno (p.i.):

Dissolva 1,6 g de cânfora em 100mL de etanol.


Preparação das soluções de padrões:
A. Salicilato de metilo
Pesar rigorosamente para um copo de 50mL cerca de 45 mg de salicilato de
metilo (massa pesada = 46,8mg). Dissolva em etanol, deite para um balão de
50mL, adicione 2mL da solução de padrão interno e perfaça o volume com
etanol.
B. Mentol
Pesar rigorosamente para um copo de 50 mL cerca de 120 mg de mentol
(massa pesada = 10,2 mg). Dissolva em etanol, deite para um balão de 50mL e
perfaça o volume com o mesmo solvente. Desta solução retire 5 mL para um
balão de 50mL, adicione 2mL da solução de padrão interno e perfaça o volume
com etanol.
2) Preparação da amostra:
Medir 5mL de amostra para um balão de 50mL. Adicione 2mL da solução de
padrão interno (e perfazer com etanol).
(Amostra: Kemphor, solução bucal)

3) Análise cromatográfica:
Com uma seringa de volume adequado injetar 2 L de cada uma das soluções
padrão e por fim a amostra.

 Resultados /Cálculos

- Padrões

Mentol Salicilato de Metilo


Tempo de retenção: 7,04 Tempo de retenção: 6,985
Padrão interno
Área: 118573,59 Área: 92763,73
Tempo de retenção 7,596 8,166
Área 45349,87 115470,39

- Amostra
Mentol Salicilato de Metilo
Tempo de retenção: 6,954
Padrão interno
Área: 84441,31
Tempo de retenção 7,414 8,151
Área 61351,78 114329,67

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Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
- Razão das áreas dos vários picos:
• Mentol:

Á𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒅𝒅𝒅𝒅 𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴 45349,87


= = 0,382
Á𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝑪𝑪â𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏 (𝑷𝑷. 𝑰𝑰) 118573,59

Á𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒅𝒅𝒅𝒅 𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴 (𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂) 61351,78


= = 0, 727
Á𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝑪𝑪â𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏 (𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂) 84441,31

• Salicilato de Metilo:

Á𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒅𝒅𝒅𝒅 𝑺𝑺𝑺𝑺𝑺𝑺. 𝒅𝒅𝒅𝒅 𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴 115470,39


= = 1,245
Á𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝑪𝑪â𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏 (𝑷𝑷. 𝑰𝑰) 92763,73

Á𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒅𝒅𝒅𝒅 𝑺𝑺𝑺𝑺𝑺𝑺. 𝒅𝒅𝒅𝒅 𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴𝑴 (𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂) 114329,67


= = 1,354
Á𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝑪𝑪â𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏𝒏 (𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂) 84441,31

- Concentração de Mentol
120,2 mg -------- 50 mL
C1
5 mL -------- 50 mL
C2

120,2 mg --------------- 50 ml
x mg --------------- 5 ml
x = 12,02 mg em 50 ml

12,02 mg --------------- 50 ml
x mg --------------- 1000 ml
x = 240,04 mg/L (C2)

Razão das áreas:

240,4 mg --------------- 0,382


x mg --------------- 0,727
x = 457,52 mg

457,52 mg --------------- 1000 ml


x mg --------------- 50 ml
x = 22,88 mg

297
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018

22,88 mg --------------- 5 ml
x mg --------------- 100 ml
x = 447,6 mg

- Concentração de Salicilato de Metilo


Esquema: 46,8 mg -------- 50 mL

46,8 mg --------------- 50 ml
x mg --------------- 1000 ml
x = 936 mg/L

Razão das áreas:

936 mg --------------- 1,245


x mg --------------- 1,354
x = 1017,9 mg

1017,9 mg --------------- 1000 ml


x mg --------------- 50 ml
x = 50,89 mg

50,89 mg --------------- 5 ml
x mg --------------- 100 ml
x = 1017,8 mg
Converter em ML para comparar com o valor teórico:
Sabemos que a densidade é 1,174 g/mL (protocolo - informações)

1,174 --------------- 1 ml
1,0178 --------------- x ml
x = 0,867 mL/100 mL

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Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
Análise Quantitativa de Cafeína numa Bebida por HPLC (Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência)

 Ideias a Reter do Texto do Protocolo:


Este trabalho tem como objetivos a identificação e quantificação da cafeína na
coca-cola utilizando a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência. Para tal,
proceder-se-á à comparação dos tempos de retenção e das áreas dos picos
cromatográficos obtidos na análise da amostra com o cromatograma obtido na
análise de soluções de cafeína padrão.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) é uma técnica analítica com um
vasto campo de aplicação, quer seja para o controle de qualidade em diversos
tipos de indústria, quer como uma importante ferramenta para a investigação pura
e aplicada. Este tipo de cromatografia consiste num método analítico que tem por
objetivo a separação de distintas espécies químicas presentes numa amostra.

Figura 1 - Representação esquemática dos elementos constituintes do


equipamento para análise por HPLC.

A separação processa-se por meio de um mecanismo de interação seletiva entre as


moléculas do soluto (amostra) e duas fases, uma estacionária e outra móvel. A fase
estacionária refere-se à coluna cromatográfica, ou seja, um cilindro rígido
normalmente de aço, no interior do qual se encontra um material de enchimento
formado por pequenas partículas. A fase móvel ou eluente flui continuamente
através do sistema, arrastando a amostra injetada pela coluna e pelo detetor.
Devido às suas diferentes estruturas moleculares e grupos funcionais, as
substâncias presentes na amostra dispõem de distintos graus de «afinidade» com
as fases móvel e estacionária e, portanto, as suas velocidades de migração serão
igualmente distintas, permitindo o desenvolvimento da separação cromatográfica.
Como conclusão, a Cromatografia de Líquida separa as espécies químicas
consoante as suas funções moleculares sendo um método que pode ser utilizado
para separar, identificar e quantificar substâncias presentes em diferentes tipos de
produtos.

299
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
A cafeína é um alcalóide do grupo das xantinas e designa-se quimicamente como
1,3,7-trimetilxantina. Entre o grupo das xantinas (que incluem a teofilina e a
teobromina) a cafeína é a que mais atua sobre o sistema nervoso central. Atua
ainda sobre o metabolismo basal e aumenta a produção de suco gástrico.

 Teoria:
HPLC (cromatografia Líquida de Alta Eficiência) é uma técnica cromatográfica que
utiliza como fase móvel um líquido e equipamentos sofisticados para separar os
componentes de uma amostra pela interação entre a fase estacionária e a fase móvel.

- Análise de compostos que não podem ser analisados por cromatografia em fase
gasosa por não serem voláteis ou suscetíveis de tornar voláteis.

- Equipamento:

Reservatório dos
solventes e sistemas Bomba Injetor
de desgaseificação

Faz com que o eluente Injeção da amostra


entre a alta pressão na
Indispensável para o bom coluna (fluxo constante).
funcionamento do sistema:
 Reprodutibilidade do Coluna
fluxo; Fase Móvel:
 Estabilidade da linha de - elevado grau de pureza
base - dissolver a amostra sem decompor os
compostos
- polaridade e viscosidade adequadas
- não degrada a fase estacionária
- ser compatível com o detetor Detetor
Fase Estacionária:
- Fase normal (fase polar)
Deteção e quantificação
- Fase reversa (fase apolar)
dos analitos.
Podem ser de vários
tipos:
 UV-Visível
 Emissão
Fluorescência
 Eletroquímica
 Índice de Refração
 Espectrómetro de
massa

300
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
 Equipamento, Material e Reagentes:
Em relação ao Cromatógrafo HPLC anote os seguintes dados:

Detetor de espectrofotometria de absorção molecular (UV-visível) λ= 225 nm;


“loop”: 20 μL; Coluna cromatográfica de fase inversa ou reversa (anotar as
características da coluna usada): dimensão: 125 mm (comprimento) x 4
mm(diâmetro); tipo: RP18; granulometria do enchimento: 5 micras (μ).

 Técnica Operatória:
A partir de uma solução mãe de cafeína contendo 1g/L prepare, usando balões
volumétricos de 100 mL, soluções nas seguintes concentrações: 0,01 g/L, 0,02
g/L, 0,025 g/L, 0,03 g/L e 0,04 g/L (para completar o volume nos balões utilize
água desionizada).
A amostra (coca-cola) deve ser previamente desarejada recorrendo a um banho
de ultra-sons. Em seguida retirar 20 mL para um balão de 100 mL e completar
com água desionizada.

1) Condições operatórias gerais

Fase móvel (polar): metanol/ 0,1 % de ácido fosfórico (solução aquosa)


Fluxo do eluente: 1,0mL/min
Comprimento de onda de deteção: 225nm (máximo de absorção para a
cafeína)

2) Identificação da cafeína

Analisar as soluções padrão, injetando volumes de 20 μL (ou outro volume) e


anotar os tempos de retenção.
Ensaiar a amostra problema nas mesmas condições e identificar o pico
correspondente à cafeína.

 Cálculos:
- Preparação das Soluções Padrão
[Solução mãe] = 1 g /L

[P1] → 1 x V inicial= 0,01 x 100 mL ⇔ V inicial = 1 mL retirar da sol. mãe de cafeína


[P2] → 1 x V inicial= 0,05 x 100 mL ⇔ V inicial = 2 mL retirar da sol. mãe de cafeína
[P3] → 1 x V inicial= 0,10 x 100 mL ⇔ V inicial = 2,5 mL retirar da sol. mãe de cafeína
[P4] → 1 x V inicial= 0,50 x 100 mL ⇔ V inicial = 3 mL retirar da sol. mãe de cafeína
[P5] → 1 x V inicial= 0,50 x 100 mL ⇔ V inicial = 4 mL retirar da sol. mãe de cafeína

E perfazer os balões com água desionizada.

301
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018
- Calcular a Quantidade de Cafeína presente na Amostra

Concentrações
dos Padrões Áreas Tr
(mg/L)
Cafeína 1 10 508419,97 2,084
Cafeína 2 20 1251398,53 2,085
Cafeína 3 25 1386266,71 2,085
Cafeína 4 30 1843064,78 2,053
Cafeína 5 40 2094944,30 2,055
Amostra ?? 1283356,27 2,074

Fazer o gráfico “Áreas vs Concentrações” e a equação da reta foi:


y = 53512 x + 79009

- Sabendo que área da amostra é 1283356,27 então:

1283356,27 = 53512 x + 79009 ⇔ x = 22, 506 mg /L

- Como usamos um balão de 100 ml, logo:

22, 506 mg --------------- 1000 ml


x mg --------------- 100 ml
x = 2,2506 mg

- Como nesse balão de 100 ml colocamos 20 ml de amostra, então essa


massa corresponde a 20 ml. Para sabermos a concentração da amostra
basta fazer:

2,2506 mg --------------- 20 ml
x mg --------------- 1000 ml
x = 112, 53 mg (por 1000 ml) = 112,53 ppm – Teor de cafeína na amostra

- Na lata da Coca-cola temos:

112, 53 mg --------------- 1000 ml


x mg --------------- 330 ml
x = 37,13 mg

Sabendo que o intervalo de tolerância é de 10%, ou seja, o limite é entre [30,6 mg


- 37,4 mg] sabendo que o valor de cafeína tabelado é de 34 mg. Então, a nossa
amostra está dentro do limite.

302
Teoria e Cálculos do Laboratório de MIA 2017/2018

Para informação:
- Quantidade de cafeína no café:
 Café americano (1 chávena – 240 ml): 60-120 mg
 Café instantâneo (1 chávena – 240 ml): 70 mg
 Descafeínado (1 chávena – 240 ml): 1-5 mg
 Espresso (1 chávena – 60 ml): 45-100 mg

- Quantidade de cafeína nas bebidas à base de café


 Coca-Cola (1 lata – 330 ml): 34 mg
 Coca-Cola Light (1 lata – 330 ml): 45 mg
 Coca-Cola Zero (1 lata – 330 ml): 35 mg
 Pepsi (1 lata – 330 ml): 38 mg
 Pepsi Light (1 lata – 330 ml): 36 mg
 Red Bull (1 lata – 330 ml): 80 mg

- Quantidade de cafeína noutras bebidas


 Chá preto (1 chávena – 240 ml): 45 mg
 Chá verde (1 chávena – 240 ml): 20 mg
 Chá branco (1 chávena – 240 ml): 15 mg
 Iced Tea (1 lata – 330 ml): 26 mg
 Leite achocolatado (1 chávena – 240 ml): 4 mg

303