UNIVERSIDAD DE C

GUANAJUATO

AISLAMIENTO,
EXTRACCION Y
ANALISIS DE
LIPIDOS
LABORATORIO DE ESTRUCTURA DE BIOMOLECULAS Y
CINETICA ENZIMATICA

DOCENTE: LUIS FELIPE PADILLA VACA

 INTRODUCCIÒN

ANTECEDENTES HISTÓRICOS
La palabra lípido, se origina del griego "lipos", que significa "grasas para alimentarse" o "grasas
para funciones sagradas".

Históricamente, fue el médico inglés William Prout quien en 1827 reconoció la importancia de
las materias grasas en la nutrición, además del ya aceptado rol de las proteínas y de los
carbohidratos. Prout dividió los componentes orgánicos de la dieta humana en carbohidratos,
lípidos, y sustancias con alto contenido de nitrógeno, las que más tarde serían llamadas
proteínas.

La comprensión sobre la estructura química de las grasas y aceites comenzó con el trabajo del
químico francés Michel-Eugéne Chevreul pocos años antes de la revolución en 1789 de Francia.
El tratamiento de grasas animales con un álcali (hidróxido de sodio o de potasio) le permitió
obtener un producto al que llamó "glicerina" (derivado del griego, que significa "dulce") y que
pudo extraer con agua. Además, obtuvo jabones formados por la reacción del sodio o del potasio
con los ácidos grasos. Años más tarde, a este proceso lo conoceremos como "saponificación".

Los estudios sobre aspectos metabólicos de las grasas y aceites fueron iniciados en 1841 por
otro francés, Jean Baptiste Dumas, quien postuló que las "grasas animales" podrían provenir de
las "grasas vegetales", y que las transformaciones ocurrían a través de procesos de oxidación.
Dumas propuso que la composición de nuestro organismo refleja de alguna forma nuestra
alimentación, esto es el concepto aún aceptado de "somos lo que comemos".

CLASIFICACIÓN DE LOS LÍPIDOS.

Existen dos tipos de Clasificación de los lípidos, en base a su propiedad de hidrolizarse
(saponificarse) y su estructura.

A) Ácidos grasos: son ácidos carboxílicos con grupos laterales hidrocarbonados de cadena
larga. Su estructura se basa en u grupo carboxilato hidrófilo unido a una cadena larga
hidrocarbonada que habitualmente contiene entre 12 a 24 carbonos.

1
En los ácidos grasos existe una subclasificación dependiendo si contienen instauraciones. Ácidos
grasos saturados: es aquel en el que todos los carbonos de su cola se encuentran saturados de
átomos de hidrógeno. Ácidos grasos insaturados: son aquellos que contienen uno o más dobles
enlaces en la cola hidrocarbonada.

Un ejemplo de ácido graso es el ácido mirístico:

B) Triacilgliceroles: llamados también triglicéridos o simplemente

grasas, son triesteres de ácidos grasos y glicerol teniendo como
fórmula general la siguiente.

Triagilceroles simples: los triacilgliceroles con el mismo ácido graso que esterifica cada posición
se denominan “grasas simples”.

Triacilgliceroles mixtos: la mayoría de los triacilgliceroles son “grasas mixtas” que contienen una
mezcla de ácidos grasos, entre ellos algunos insaturados

Un ejemplo de triglicérido es el triglicérido trimidistina:

2
 C) Glicerofosfolípidos.

También denominados fosfoglicéridos son lípidos que contienen una cabeza con un grupo
fosfato. Presentan sn-glicerol-3-fosfato esterificado en sus posiciones C1 y C2 a ácidos grasos
yen su grupo fosforilo a u grupo R3 que puede ser variable, esta variabilidad le confiere una
variedad de glicerofosfolípidos con características para cada una.

3
 D) Ceras: En las ceras naturales, un ácido graso de cadena larga se esterifica con un alcohol
de cadena larga para dar lugar a un grupo carbetoxi que es débilmente polar, unido a
dos cadenas hidrocarbonadas.

E) Colesterol.

Pertenece a un grupo grande deniminado esteroides, que incluyen una gran variedad de
hormonas. En concreto, el colestrol es precursor importante para la síntesis de otras sustancias.

DISTRIBUCION DE LIPIDOS EN
LA NATURALEZA
Los lípidos comprenden uno de los cuatro grupos de compuestos
que se encuentran en los tejidos de los seres vivos, los carbohidratos,
proteínas y ácidos nucleicos.

Los lípidos tienen muchas funciones importantes. Son componentes

estructurales de la membrana celular, un alto porcentaje de la membrana
celular y de otras membranas dentro de la célula están compuestas de lípidos.
También forman parte de las vainas que envuelven los nervios. Algunos de los lípidos son
reservas a largo plazo que las células metabolizan para producir energía. Las cubiertas
protectoras de las hojas de las plantas y la piel de los animales están compuestas de varios
lípidos. Otros se lípidos se clasifican como hormonas o vitaminas. También son
imprescindibles para otras funciones como la absorción de algunas vitaminas (las liposolubles),
la síntesis de hormonas y como material aislante y de relleno de órganos internos.

Están presentes en los aceites vegetales (oliva, maíz, girasol, cacahuete, etc.), que son ricos en
ácidos grasos insaturados, y en las grasas animales (tocino, mantequilla, manteca de cerdo, etc.),
ricas en ácidos grasos saturados. Las grasas de los pescados contienen mayoritariamente ácidos
grasos insaturados.

En muchos organismos las grasas y los aceites son las formas principales de almacenamiento
energético, mientras que los fosfolípidos y los esteroles constituyen la masa de las
membranas biológicas. Otros lípidos, aun estando presentes en cantidades relativamente

4
pequeñas, juegan papeles cruciales como agentes emulsionantes, mensajeros intracelulares,
transportadores electrónicos.

IMPORTANCIA BIOLOGICA
Los lípidos son biomoléculas orgánicas de distribución universal tienen una función nutricional
importante y figuran en la dieta aportando alrededor del 30 % de las kilocalorías y como fuente
de los ácidos grasos indispensables: Linoléico, linolénico y araquidónico. En los seres vivos
desempeñan numerosas funciones biológicas, como son:

a) De reserva: Los lípidos tienen un elevado poder energético. La combustión de 1g de estos

compuestos genera alrededor de 9,3 kcal. Los acilgliceroles principalmente los triacilglicéridos,
son las principales sustancias de reserva del organismo. Todas las sustancias ingeridas que
exceden de las necesidades del organismo se trasforman en grasas y como tales se almacenan
en diversos tejidos hasta que son necesitadas. Estas grasas almacenadas van a cumplir varias
funciones de, protección de órganos, aislamiento del cuerpo contra la perdida de calor,
abastecimiento de energía, regulando distintas actividades fisiológicas, etc.

b) Reguladora: Las hormonas esteroideas, las prostaglandinas y las vitaminas liposolubles son
lípidos, que actúan regulando distintas actividades fisiológicas.

Las prostaglandinas intervienen en los fenómenos vasculares de la inflamación produciendo

vasodilatación y edema; en los celulares induciendo quimiotaxis de las células del sistema
inmunológico; intervienen en la percepción del dolor, en la fiebre y son utilizadas para la
inducción del parto

c) Estructural. Forman las bicapas lipídicas de las membranas citoplasmáticas y de los orgánulos
celulares. Fosfolípidos, colesterol, Glucolípidos etc. son encargados de cumplir esta función.

d) Transportadora. El transporte de lípidos, desde el intestino hasta el lugar de utilización o al

tejido adiposo (almacenaje), se realiza mediante la emulsión de los lípidos por los ácidos
biliares y los proteolípidos, asociaciones de proteínas específicas con triacilglicéridos,
colesterol, fosfolípidos, etc., que permiten su transporte por sangre y linfa .

IMPORTANCIA BIOMÉDICA:
Los lípidos juegan un papel importante en el cuerpo, una de ellas es el transporte de “grasas” en
el torrente sanguíneo ya que se efectúa mediante las HDL y LDL que son unidades de lípidos que

5
ayudan al transporte y darle las características a la sangre. Es de gran importancia el monitoreo
de estas fracciones lipídicas ya que indican problemas cardiovasculares, o enfermedades por el
exceso de grasas en el sistema.

Los esteroles son una variante de los lípidos que tienen funciones importantes en el organismo,
es por ello que se estudia directamente el efecto que realizan estos compuestos en el organismo
siendo uno de ellos el desarrollo de la píldora anticonceptiva y dispositivos hormonales. Se
estudia el efecto que realizan varias hormonas suministradas en un organismo para así poder
modificar procesos biológicos del cuerpo.

Aterosclerosis.
Se le denomina aterosclerosis a la enfermedad que provoca ensanchamiento y endurecimiento
de las arterias y venas ocasionados por la acumulación de grasas en el tejido vascular. Esto se
radica en la calcificación de grasas y la cardiopatía isquémica.

IMPORTANCIA INDUSTRIAL
Los lípidos son una amplia familia de moléculas orgánicas que se caracterizan por ser
hidrofóbicas, su importancia industrial radica en el tipo de lípido que sea; por ejemplo gran
número de aceites vegetales se usan como excipientes, sustancias incorporadas a ciertos
productos como vehículo para la asimilación corporal de principios activos, y aunque éstos no
surgen efecto por sí solos, aceites como el de almendra, aguacate, y café se utilizan para dicho
propósito. De fuentes animales solo es posible utilizar aceites de pescado y aves para lograr la
propiedad excipiente. Los fosfolípidos son lípidos con un extremo cargado negativamente
debido al grupo fosfato estos tienen largas cadenas hidrofóbicas y se aplican principalmente en
medicamentos. Los carotenoides, retinoides y tocoferoles son usados por sus propiedades
antioxidantes importantes para la salud y la medicina preventiva.

En la industria alimenticia son sumamente importantes porque mantienen a las empresas de

mantequilla, aceite, cacahuates, nuez, aguacates.

PROPIEDADES FISICAS Y QUIMICAS

PROPIEDADES FÍSICAS

Punto de fusión.

6
El punto de fusión de un ácido graso depende de la longitud de la cadena y del grado de
instauración. Al aumentar el número de átomos de carbono en la cadena, aumenta el puto de
fusión. El punto de fusión disminuye con la introducción de un doble enlace en la molécula. Al
haber más dobles enlaces más bajo es el puto de fusión.

Solubilidad.

Las reacciones bioquímicas se efectúan mayormente en un medio acuoso y la mayoría de los

compuestos bioquímicos. Las sales que solas sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos se
disuelven in restricción, pero estando libres y los glicéridos son solubles.

A medida que aumenta la longitud de la cadena también disminuye la solubilidad del ácido. La
introducción de grupos hidroxilos aumenta señaladamente la solubilidad.

Se encuentra relacionada con la solubilidad la formación de capas en el agua. Al tener el grupo

hidrofílico o carboxilo polar, que se disuelve en agua y en segundo, una cadena de hidrocarburo
hidrófoba o no polar, que forman una capa sobre la superficie del agua y queda entonces
anclada a su grupo carboxilo soluble enagua. La capa formada tiene el espesor de una
molécula y las cadenas de hidrocarburo de los ácidos grasos se alinean paralelas
entre sí, pero perpendiculares a la superficie del agua.

Actividad óptica.

Los ácidos grasos que contienen enlaces existen en formas estereoisoméricas. En un

ácido graso con dos dobles enlaces pueden existir cuatro estereoisómeros: cisI, cisII, transI-
transII, cisi-transII y transI-cisII.

PROPIEDADES QUÍMICAS.

Las propiedades químicas de los ácidos grasos pueden dividirse en dos grupos: las que
dependen del grupo carboxilo y las que son por las cadenas de hidrocarbono.

Propiedades por el grupo carboxilo

Los ácidos grasos forman sales con iones metálicos a causa de la presencia de un carboxilo
terminal. Los jabones de sodio y potasio son solubles en agua; los que contiene calcio y magnesio
son insolubles. Las sales de magnesio se combinan con el jabón y forman jabines insolubles, que
no sirven para lavar.

7
Los ácidos grasos reaccionan con alcoholes y forman ésteres. Cuando el alcohol es glicerol, el
éster es un triglicérido.

El cuerpo tiene la capacidad de reducir un grupo carboxilo a su aldehído, alcohol oun

hidrocarburo correspondiente.

Propiedades por las cadenas de hidrocarburo

Estas propiedades son las de reacciones de hidrogenación y oxidación.

Los ácidos graos insaturados reaccionan con hidrógeno (con catalizadores metálicos,
como platino, paladio, níquel y cobre) y forman los ácidos saturados.

Las grasas vegetales dan por hidrogenación productos sólidos. Además, son susceptibles
a la oxidación por la presencia de dobles enlaces. Por combinación de oxígeno se forma
peróxidos, a la par que una mezcla de aldehídos volátiles, cetonas y ácidos.

La constante dieléctrica o permitividad relativa de un medio continuo es una propiedad

macroscópica de un medio dieléctrico relacionado con la permitividad eléctrica del medio.

El efecto de la constante dieléctrica se manifiesta en la capacidad total de un

condensador eléctrico. Cuando entre los conductores cargados o placas que lo forman se inserta
un material dieléctrico diferente del aire (cuya permitividad es prácticamente la del vacío), la
capacidad de almacenamiento de la carga del condensador aumenta.

Además, el valor de la constante dieléctrica de un material define el grado de

polarización eléctrica de la substancia cuando ésta se somete a un campo eléctrico exterior. El
valor de K es afectado por muchos factores, como el peso molecular, la forma de la molécula, la
dirección de sus enlaces (geometría de la molécula) o el tipo de interacciones que presente.

Cuando un material dieléctrico remplaza el vacío entre los conductores, puede presentarse la
polarización en el dieléctrico, permitiendo que se almacenen cargas adicionales.

Para calcular la constante dieléctrica se utiliza la siguiente formula.

EXTRACCION Y PURIFIACION
El contendio total de lípidos se determina comúnmente por métodos de extracción con
disolventes orgánicos (por ejemplo Soxhlet, Godfish, Mojonnier), sin embargo también puede

8
cuantificarse por métodos de extracción que no incluyen disolvente (Gerber, Badcock) y por
métodos instrumentales que se basan en propiedades físicas o químicas de los lípidos (inflarrojo,
densidad y absorción de rayos x).

Métodos con solventes

Soxhlet

Es el mas ampliamente utilizado, usa una extracción solida-liquida en

aparato llamado de la misma manera, se tiene un flujo constante de un un
solvente orgánico, por lo general Eter de petróleo, eter etilico o hexano-
dicrometano. Este solvente es calentado hasta ebullir, luego condensado y
dispuesto en el tubo de Soxhlet, en el cual extrae el aceite contenido en la
biomasa hasta que el tubo se llena, cuando el tubo esta lleno de solvente,
este es sifonado hasta el bàlon que contiene el resto de solvente y se repite
el proceso.

Es sencillo, no es de un trabajo intensivo y los lípidos pueden ser usados para

posteriores determinaciones. Sin embargo, los resultado son menos eficientes comparados con
los del método Bligh y Dyer, no se puede determinar los lípidos totales, se necesitan grandes
cantidades de solvente, se requiere de un equipo especial, puede tener efectos adversos en
lípidos lábiles y es difícil encontrar muchas de las condiciones.

Folch

También es altamente utilizado, se considera el método mas fiable para la recuperación de los
lípidos totales, en la extracción el perfil de los àcidos grasos permanecen estables, el método
subestima sistemáticamente concentraciones en la muestra que contiene mas de 2% de lípidos.
En algunos estudios se reporta mas bajo rendimiento en extracción comparada con Soxhlet.

Bligh and Dyer

Es un método estándar bien establecido, determina lípidos totales, se basa en un sistemabifàsico

de equilibrio Liquido-liquido. Las muestras pueden ser analizadas directamente sin necesidad de
pre-secarlas y los lípidos obtenido pueden ser usados para futuras determinaciones, sin
embargo la utilización de cloroformo es una desventaja. Pues el compuesto es toxico con el
ambiente.

9
El procedimiento consiste en realizar una cuantificación gravimétrica, en la cual se tienen en
cuenta tres pasos para la extracción: 1)Methanol+cloroformo, 2)Cloroformo y 3)Agua. Después
de la separación de fases lípidos totales se determinad en la fase de cloroformo por análisis
gravimétrico seguido de la evaporación del solvente.

Schmid-Bondzski-Razlaff

Es un método muy empleado para determinar los lípidos totales en queso y en leche en polvo.
Económico, extrae lípidos totales y las muestras pueden ser estabilizadas sin secado previo, in
embargo los lípidos no pueden ser usados para determinaciones posteriores. El procedimiento
consiste en ubicar en un vaso de precipitados de 100 ml la cantidad adecuada de muestra,
agregar HCl y calentar. Dejar enfriar, transferir el contenido a una probeta graduada con tapa
esmerilada y luego agregar 50-60 ml de eter. Dejar en reposo 24 horas y leer el volumen de fase
etérea. Tomar una alícuota exactamente medida y evaporada el èter en un vaso de precipitado
pequeño previamente tarado. Una vez evaporada el èter pesar nuevamente y determinar el
contenido de lípidos po diferencia, teniendo en cuenta la àliuota tomada para realizar los
cálculos.

Extracción por instrumentos.

Extracción asistidos por microondas

Consiste en el calentamiento de un solvente en

contacto con la muestra. El proceso implica la
perturbación de los enlaces por puentes de
hidrogeno, como resultado de la rotación de dipolos
por la radiación en las moléculas y la migración de
iones; con la consiguiente penetración del solvente
en la matriz, y transporte al seno del liquido de los
componentes.

La rapidez en el calentamiento en la principal ventaja de las microondas fente a los métodos

tradicionalmente empleados en la extracción con disolventes, que causan el calentamiento a
partir de la transmisión de la energía al material de forma indirecta. El empleo de las microondas
permite, por tanto, significativos ahorros de tiempo; disminución de los volúmenes de

10
disolventes necesarios en los tratamientos y, en consecuencia, de energía en el proceso; no
contamina el medio ambiente, lo cual se manifienta en la reducción de los costos en general,
que constituyen aspectos deseables de alcanzar en todo proceso de extracción, además de que
permite obtener altos recobrados de los compuestos de interés.

ESPECTROSCOPIA DE INFRARROJO CERCANO

Algunas clases de lípidos muestran bandas fuertes de absorción de grupos carbonilo en la región
infrarroja, lo que quiere decir que cada uno de ellos, tiene su espectroscopia. Por consiguiente,
para establecer un complemento a las técnicas tradicionales surge el uso de refractancia en el
infrarrojo cercano, que consiste en irradiar un haz de luz monocromática los materiales
orgánicos, que en función de la naturaleza de los enlaces y cargas electrostáticas existentes
entre sus átomos y moléculas, absorben una determinada cantidad de energía (reflectanica).
Con esta técnica se generan modelos matemáticos que relacionen la composición química con
cambios de energía en la región correspondiente al rango infrarrojo cercano. Este método no es
destructivo, requiere un mínimo o nulo tratamiento de la muestra, minimiza el daño ambiental
y en una técnica multianalitica de alta precisión que permite predecir varios factores
simultáneamente. Una vez calibrado el espectrometrofotometro, el uso de NIR es de bajo
costos. El NIR esta establecido para medir la composición lipídica en cereales como granos de
maíz.

ENSAYOS DE CARACTERIZACIÒN
Algunas de las propiedades de los lípidos pueden ser usadas para su reconocimiento, ya que
pueden reaccionar con una variedad de agentes originándose productos coloreados,
desprendimiento de vapores y/o formación de jabones.

PRUEBA DE ACROLEÍNA.

La positividad de esta reacción indica la presencia de glicerina y se manifiesta por el

desprendimiento de vapores blancos irritantes de olor desagradable, cuya reacción se muestra
en la siguiente figura:

11
 PRUEBA DE IODO.

La prueba de yodo indica la presencia de ácidos grasos de la serie etilénica. La reacción positiva
se manifiesta por la desaparición del color del Yodo, debido a que enlaza en el doble enlace. El
índice de yodo de los lípidos depende de su grado de instauración. La grasa disuelta se hace
reaccionar con monobromuro de yodo en exceso. La cantidad de monobromuro de yodo que no
se adiciona a los dobles enlaces oxida una disolución de yoduro a yodo, y éste se determina por
valoración con una disolución de tiosulfato de sodio.

PRUEBA DE LIEBERMANN.

La prueba de Liebermann se basa en la reacción coloreada (verde) que dan aquellas sustancias
que tienen como núcleo el ciclo pentanoperhidrofenantreno. El método químico de
Liebermann-Burchard para la determinación de colesterol en una muestra lipídica se basa en el
desarrollo de una coloración verde en presencia de anhídrido acético y ácido sulfúrico
concentrado con temperatura, después de 30 min de reacción.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC).

Aunque la incluyamos en este apartado, la TLC puede ser, de acuerdo con la composición de la
capa cromatográfica y de su forma de preparación, bien de reparto o de adsorción. Así, si la capa
de adsorbente se deposita como una suspensión acuosa que se deja secar a temperatura
ambiente (caso más frecuente), será la película de agua depositada sobre las partículas de
adsorbente quien actuará de fase estacionaria, por lo que con solventes orgánicos la partición
supondrá, al menos mayoritariamente, equilibrios de reparto líquido-líquido (cromatografía de
reparto). Por el contrario, si la capa de adsorbente se seca por calentamiento en estufa, la
partición supondrá equilibrios de adsorción sólidolíquido (cromatografía de adsorción).

En este método se utilizan como soporte placas de vidrio, plástico, aluminio, etc. en las que se
deposita una fina capa de adsorbente (gel de sílice, almidón, polvo de celulosa, etc.) cuyo
espesor puede ajustarse a conveniencia. En el mercado se encuentran disponibles ya fabricadas
placas comerciales.

A la altura de 1,5 cm (aproximadamente) de una de las bases se marca débilmente con un lápiz
fino una línea teniendo cuidado de no romper la capa adsorbente. Esta línea servirá de base
para situar las muestras a analizar. Con una micropipeta de vaciado automático se depositan 5
µl sobre un punto o varios en la línea de base (línea de aplicación) teniendo siempre cuidado de
no tocar la placa con la punta de la pipeta para no dañarla.

12
Tras aplicación de la muestra, se deja secar a temperatura ambiente o con ayuda de un pequeño
secador. A continuación, la placa se introduce en una cubeta que contiene el disolvente de
desarrollo adecuado en cada caso, cuyo nivel no debe nunca llegar a la línea de siembra. Su
ascenso por capilaridad produce el efecto cromatográfico. Si se realizan dos desarrollos
consecutivos con eluyentes apropiados en cada caso, se habla de cromatografía bidimensional.
Las sustancias se visualizan en la placa una vez desarrollada mediante su color, absorción
ultravioleta o revelado específico que produce una reacción coloreada.

Para su cuantificación, se raspa la parte donde se ubique el componente que se quiere medir,
se extrae con los disolventes adecuados y se analiza según el método empleado.

La diversidad de adsorbentes y eluyentes disponibles, permiten que esta técnica sea de utilidad
para separar e identificar un amplio repertorio de biomoléculas: aminoácidos, hidratos de
carbono, lípidos, proteínas, etc.

Una vez revelada la placa se puede establecer un coeficiente de relación entre la distancia
alcanzada por el frente y la distancia alcanzada por una sustancia específica, a esta relación se
conoce con el nombre de Rf (Rf = distancia de la sustancia/frente de la fase móvil).

OTRO MÉTODO DE SEPARACIÓN DE LÍPIDOS POR CAPA FINA ES:

Fase estacionaria:

Sílica Gel 60 (granulometría menor de 10 a 40 um de diámetro) G (con agregado de yeso al 12%

que permite que el adsorbente se adhiera al soporte).

Fase móvil:

Mezcla de solventes tal que los componentes de la muestra no corran con el frente del solvente,
ni queden retenidos en el lugar de siembra. Los Rf ideales serán entre 0,25 y 0,75. Es
fundamental el uso de solventes anhidros y miscibles. La cuba cromatográfica deberá estar
saturada con la fase móvil antes de introducir la placa, de lo contrario el solvente en vez de
ascender por capilaridad continuamente, tenderá a evaporarse de la capa de adsorbente para
equilibrar al líquido con su presión de vapor. Eso implicaría un ascenso no homogéneo del frente
del solvente.

ETAPAS DEL PROCESO

Siembra: Se disuelve la muestra en un solvente adecuado y volátil y la siembra se efectúa con

un capilar cargado a 2 cm del borde inferior y de los bordes laterales de la placa. Se hace un

13
toque, se seca, se hace otro toque, cuidando de que el diámetro no supere los 3mm. Las
muestras deben estar separadas 1 cm entre sí.

Desarrollo: La placa sembrada se introduce en la cuba previamente saturada con el solvente (15
minutos), de modo que el solvente toque la placa, pero no la zona de siembra. La cuba se tapa
y se deja que el solvente ascienda por capilaridad hasta 2cm antes del borde superior de la placa.
Se retira y se deja secar.

Revelado: Si las manchas no son visibles hay que revelarlas.

Luz UV: se observará fluorescencia.

Yodo: revelador universal. Se observarán manchas marrones o amarillas. Al quitar la placa del
contacto con los vapores las manchas se decoloran. Sulfúrico con calor: método destructivo. Se
rocía la placa con sulfúrico al 50% y se coloca en estufa a 120 °C por unos minutos. Aparecerán
manchas marrones, pardas, rojizas, opacas. Reactivos de color: específicos para cada grupo
químico o compuesto.

Azul de Bromotimol al 0,1% en NaOH 0,01M (ácidos carboxílicos)

K2Cr2O7 en H2SO4 al 4% (compuestos orgánicos no volátiles)

Cl3Sb al 50% en ácido acético (Esteroides, vitaminas, carotenoides)

Ninhidrina al 0,3% en n-butanol (Aminoácidos y aminas)

Si la placa es preparativa no pueden usarse reveladores destructivos.

Evaluación: Calculando los Rf característicos para cada sustancia en idénticos sistemas

cromatográficos.

Parte Experimental:

Se extrae el colesterol sérico mediante una mezcla de solventes orgánicos simples, en caliente,
que lo separan de su unión con las globulinas. Sobre una pequeña alícuota del extracto
evaporado se practica una corrida cromatográfica en microplacas de Silicagel F254 mediante un
sistema de disolventes adecuados. El colesterol libre y esterificado resultan separados con
respectivos Rf muy distanciados entre sí, lo que permite su identificación y posterior
cuantificación por una modificación del método del cloruro férrico de Zack y Boyle.

Reactivos y materiales:

1. Alcohol-acetona (reactivo precipitante de las proteínas). Se mezclan alcohol etílico absoluto y

acetona en la proporción 1:1 (v/v).

14
2. Cloroformo.

3. Fase móvil: n-hexano:cloroformo:acido acético glacial 1,25.3,45:0,30 (v/v).

4. Revelador: solución de ácido fosfotùngstico 20 % en etanol (p/v).

5. Reactivo férrico el cual se prepara de la siguiente manera:

Sulfato férrico amónico 0,17 g.

Ácido clorhídrico conc. 0,5 ml.

Ácido cítrico 0,9 g.

Ácido acético glacial csp. 100 ml.

El reactivo resulta habitualmente de lenta disolución, si bien se aclara dejándolo reposar durante
la noche. Conservado en frasco oscuro permanece estable a temperatura ambiente durante
meses. Es fundamental que el ácido acético sea totalmente anhidro.

6. Ácido sulfúrico concentrado.

7. Cromatofolios o placas de silicagel F254 de 2,5 x 7,5 cm. Se traza la línea de siembra a 1,5 cm
del borde inferior.

8. Cámara cromatografica: se emplea vaso de Coplin de los usados en tecnología histológica.

9. Suero testigo de colesterol conteniendo colesterol libre y esterificado. Química Biológica I T.P.
Cromatografía planar capa fina TLC 4

10. Testigo de colesterol (concentración 200 mg % p/v).

Metodología

1. Extracción de colesterol. Se miden 0,5 ml del suero recientemente extraído y libre de

hemolisis y se colocan en un tubo de centrifuga. Se agregan 4,5 ml del precipitante alcohol:
acetona (1:1), se mezcla y se lleva a baño de agua caliente hasta ebullición incipiente. Se retira
del baño y se deja reposar 10 minutos. A continuación, centrifugar durante 5 minutos a 3000
rpm, separándose luego el sobrenadante en un vaso de precipitados pequeños. Se repite una
nueva extracción con 5 ml de la mezcla extractante. Juntar los sobrenadantes y evaporar a
sequedad. El residuo se disuelve en 0,5 ml de cloroformo y se centrifuga hasta que el
sobrenadante quede límpido. Se evapora hasta volumen de una gota.

2. Corrida cromatografica. Se activan las placas de calor a 100 ºC durante 30 minutos. Luego se
colocan en desecador con silicagel hasta ser usadas. Sembrar 5º ul del extracto en la línea de
siembra mediante varios toques con un capilar o micro pipeta. Previamente se vierten 5 ml de
la fase móvil en el vaso de Colpin para saturar la cuba. Se realiza la corrida colocando la placa
dentro del vaso. Se tapa herméticamente y se deja que el disolvente ascienda hasta la marca
superior, situada a 5 cm del punto de siembra. Resulta práctico retirar por raspado la línea de
capa adsorbente coincidente con el frente del disolvente a efectos de que la corrida se detenga
espontáneamente a los 5 cm exactos.

15
3. Revelado de las placas. Una vez aplicado el reactivo revelador, se invalida el uso de la placa
con fines cuantitativos. Consiste en pulverizar la solución de ácido fosfotungstico sobre la
corrida. Colocar en estufa a 100 ºC hasta que se visualicen las manchas. El colesterol libre ocupa
el primer lugar a partir de la siembra y los esteres del último.

4. Evolución y cuantificación. Se realiza dividiendo en partes iguales la longitud de la corrida. Se

raspan ambas mitades y se colocan respectivamente en 2 tubos que se rotulan CE y CL. Se
agregan 4,5 ml de reactivo férrico, se agita enérgicamente, se reposa unos minutos y se
centrifuga a 2500 rpm. Se separan los sobrenadantes y se pasan a 2 tubos rotulados como los
anteriores. Preparar un testigo de colesterol colocando 50 ul de solución de Química Biológica I
T.P. Cromatografía planar capa fina TLC 5 testigo de 200 mg% en un tubo marcado T. se agregan
4,5 ml del reactivo férrico y se mezcla. Efectuar un blanco de reactivos en igual forma. A todos
los tubos anteriores (CE, CL, T y B) se le agrega 3 ml de ácido sulfúrico concentrado y se agitan
con muchísimo cuidado. Se reposan 20 minutos hasta que alcancen la temperatura ambiente y
se leen las absorbancias a 530 nm.

Para elegir algunos disolventes, se tiene que tomar en cuenta su polaridad, para lo cual puede
ser útil una tabla como la siguiente:

Ahora bien, para separar mezclas de lípidos, se puede hacer de la siguiente manera:

16
1.- Utilizando hexano: éter etílico 90:10

Separando la fracción no polar

 Esteres alquílicos  Ceras

 Esteres de esteroles  Triglicéridos

2.-Èter etílico

Separar la fracción polar:

 Ácidos grasos
 Tocofenoles
 Esteroles
 Diglicéridos
 Monoglicéridos

17
MÉTODOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE
LÍPIDOS.
ENZIMÁTICOS.

Determinación de triacilgliceroles:

Los triacilgliceroles pueden ser hidrolizados dando como resultado una molécula de glicerol y 3
moléculas de ácidos grasos mediante una enzima llamada lipasa. El glicerol formado es un sustrato
para otra enzima; la glicerol quinasa la cual genera glicerol-3-P. La oxidación enzimática del glicerol-
3-P produce peróxido de hidrogeno el cual puede reaccionar con cromógeno 1-aminofenazona que
otorga un compuesto colorido que puede ser medido por absorbancia a 505nm.

Determinación de colesterol.

Los esteres de colesterol pueden ser hidrolizados a colesterol y ácidos grasos libres por una enzima
llamada colesterol esterasa. El colesterol generado por la esterasa es sustrato de otra enzima, el
colesterol oxidasa, que entre sus productos de reacción genera peróxido de hidrógeno. Finalmente
la peroxidasa cataliza la oxidación con peróxido de hidrogeno formado de la 4-aminofenazona, el
cual es colorante quinoneimina el cual absorbe a 505nm.

Determinación de fosfolípidos.

Los fosfolípidos lectina, isolectina, esfingomielina resultan ser hidrolizables por la enzima fosfolipasa
D para producir colina. La colina se oxida por la colina oxidasa para dar betaína y peróxido de
hidrógeno. El peróxido de hidrógeno causa una oxidación cuantitativa catalizada por una enzima

1
peroxidasa la cual condensa la 4-aminoantipirina y el N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-
dimetoxianilina DAOS el cual da una coloración azul.

MÉTODO QUÍMICO.

Reacción Liebermann-Buchard.

El colesterol reacciona con anhídrido acético en condiciones ausentes de agua, también pueden
reaccionar otros esteroles para formar el complejo coloreado verde-azul que puede determinarse
por absorbancia.

2
 RESULTADOS Y OBSERVACIONES

Durante el desarrollo experimental, se extrajeron un total de cuatro lípidos, entre los cuales se
encuentran los triglicéridos, colesterol. fosfolípidos y glucolípidos, donde el primer producto se
extrajo a partir de un fruto seco (nuez moscada) y el resto se extrajo a partir de un órgano animal
(cerebro de pollo).

Se obtuvieron triglicéridos a partir del aceite natural de la nuez moscada, el cual se pudo extraer
gracias a la técnica de reflujo, el triglicérido obtenido fue la trimiristina, el cual se obtuvo en forma
de un polvo blanquecino muy fino y en cantidades pequeñas.

En el proceso de la extracción de lípidos de cerebro de pollo, se obtuvo (colesterol, fosfolípidos y

glucolípidos), esto se logró gracias a las diferentes solubilidades de cada muestra. Es así como
mediante el uso de acetona se obtuvo colesterol (producto amarillento levemente solido), con éter
se obtuvo una mezcla de fosfolípidos (solución levemente amarillenta) y con el etanol se extrajeron
diversas clases de glucolípidos (solución levemente amarillenta). Nuevamente los productos
obtenidos se destacaron por ser mínimos, por lo cual su peso para la obtención de rendimiento fue
considerado innecesario.

Después de esto se procedió a caracterizarlos para comprobar de cada muestra su pureza y su tipo.
Para ello se empleó la cromatografía en capa fina. En esta etapa se tomaron como controles de
colesterol, esfingomielina y fosfatidilserina.

3
las muestras y controles se corrieron en dos placas cromatográficas diferentes. Donde la placa
A, la cual, conteniendo lípidos poco polares, se corrió empleando como eluyente una solución
hexano, éter y ácido acético. Mientras que la placa B, la cual conteniendo lípido polares, se
corrió utilizando como eluyente una solución Cloroformo:Etanol:Agua.

Tabla 1. Carga de a cuerdo a la placa

Letra de Placa Solución Muestras Controles

A Hexano Glucolipidos Colesterol

Eter Colesterol Esfingomielina

Ac.Acetico Trimiristina Fosfatidilserina

B Cloroformo Fosfolípidos Colesterol

Metanol Glucolípidos Esfingomielina

Agua Trimiristina Fosfatidilserina

PLACA B PLACA A

4
 En las siguientes tablas se incluyen las distancias recorridas por cada una de las muestras y el
eluyente (presente en el encabezado de las distancias recorridas).

Tabla 2. Distancia obtenida en la placa A.

# Solución Distancia (cm)

1 Colesterol puro 1.2, 2.5, 3

2 Esfingomielina 0

3 Fosfatidilcolina 2.5

4 Colesterol obtenido 1.5, 2.5

5 Triministina 1.4, 1.6, 3

6 Glucolípidos 1.5, 2.5

Tabla 3. Distancias obtenidas de la placa B.

# Solución Distancia

(7.5)

1 Colesterol 7

2 Esfingomielina 4, 6.5

3 Fosfatidilcolina 2

4 Trimiristina 6.5

5 Glucolípidos 4.5, 6.5

6 Fosfolípidos 6.5

CÁLCULOS

Para la caracterización de cada una de las muestras se obtuvieron los siguientes Rf a partir de la
fórmula:

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒

5
Cálculos de la placa a

Colesterol (control)
𝟏.𝟐 𝟐.𝟓 𝟑
𝑹𝒇 = 𝟕
= 0.1714 𝑹𝒇 = 𝟕
= 0.3571 𝑹𝒇 = 𝟕= 0.4286

Esfingomielina
𝟎
𝑹𝒇 = 𝟕= 0

Fosfatidilcolina (control)
𝟐.𝟓
𝑹𝒇 = =
𝟕

Colesterol (obtenido)
𝟏.𝟓 𝟐.𝟓
𝑹𝒇 = 𝟕
=0.2143 𝑹𝒇 = 𝟕
=0.3571

Trimiristina
𝟏.𝟒 𝟑 𝟏.𝟔
𝑹𝒇 = =0.2 𝑹𝒇 = = 0.4286 𝑹𝒇 = = 0.2286
𝟕 𝟕 𝟕

Fosfatidilcolina (Obtenida)

𝟏.𝟓 𝟐.𝟓
𝑹𝒇 = 𝟕
=𝟎. 𝟐𝟏𝟒𝟑 𝑹𝒇 = 𝟕
=0.3

Tabla 4. Rf obtenidos en la placa A.

# Solución Rf

1 Colesterol puro 0.1714, 0.3571, 0.4286

2 Esfingomielina -

3 Fosfatidilcolina 0.3571

4 Colesterol obtenido 0.2143, 0.3571

5 Triministina 0.2, 0.2286, 0.4286

6 Glucolípidos 0.2143, 0.3571

6
Cálculos de la placa B

Colesterol (control)
𝟕
𝑹𝒇 = 𝟕.𝟓= 0.9333

Esfingomielina

𝟒 𝟔.𝟓
𝑹𝒇 = 𝟕.𝟓= 0.5335 𝑹𝒇 = 𝟕.𝟓=0.8667

Fosfatidilcolina (control)
𝟐
𝑹𝒇 = 𝟕.𝟓=0.2667

Triministina
𝟔.𝟓
𝑹𝒇 = 𝟕.𝟓=0.8667

Fosfatidilcolina (Obtenida)
4.5 6.5
𝑅𝑓 = 7.5=0.6 𝑅𝑓 = 7.5= 0.8667

Fosfolípidos

𝟔.𝟓
𝑹𝒇 = 𝟕.𝟓=0.8

Tabla 5. Rf obtenidos en la placa B.

# Solución Distancia

7.5

1 Colesterol 0.9333

2 Esfingomielina 0.5333, 0.8667

3 Fosfatidilcolina 0.2667, 0.8667

4 Triministina 0.8667

5 Glucolípidos 0.6, 0.8667

6 Fosfolípidos 0.8667

7
A partir de los resultados anteriormente descritos puede llegarse a las siguientes conclusiones:

ANALISIS DE RESULTADOS

En base a las propiedades físicas y químicas que presentan los lípidos se llevo a cabo la extracción
por polaridad, y la precipitación en solventes poco polares.

 Aislamiento de triglicéridos:

Se realizó el aislamiento del triglicérido trimiristina, de la nuez moscada a partir de la obtención

de su aceite mediante la técnica de reflujo. Debido a deficiencias en el proceso del reflujo se
dificultó la cristalización y en consecuencia se obtuvo un bajo rendimiento de la extracción del
triglicérido

 Extracción de lípidos del cerebro:

Se realizó la extracción de los lípidos colesterol, fosfolípidos y glucolípidos de un cerebro de pollo

a partir del uso de solventes como acetona, para el colesterol, éter, para los fosfolípidos y etanol,
para los glucolípidos. Nuevamente los productos obtenidos se destacaron por ser cantidades
muy pequeñas.

 Análisis de lípidos:

Se obtuvieron cuatro compuestos lipídicos, triglicérido, colesterol, fosfolípido y glucolípido, los

cuales fueron corridos junto con los estándares: colesterol, esfingomielina y fosfatidilcolina esto
se logró de acuerdo la polaridad de cada lípido.

El Rf es único para cada compuesto y con el que se mide el desplazamiento de cada sustancia.
Los lípidos en los que solo hay un valor de Rf es por que son puros y no hay otra especie lipídica,
como por ejemplo en la placa A se encontraron: fosfatidilcolina y es la placa A se encontraron
colesterol, fosfatidilcolina, trimiristina y fosfolípidos.

Los compuestos más polares presentaron una menor distancia recorrida ya que son menos
afines a la mezcla de soluciones y es más difícil que se mueva.

Se demostró mediante la cromatografía de capa fina que las muestras obtenidas si presentan
características similares de acuerdo con los estándares proporcionados en el laboratorio, sin
embargo, se aprecian fracciones no correspondientes en la muestra de colesterol control donde
se aprecia de mejor manera en la placa A, lo cual establece que probablemente haya una ligera
contaminación de la muestra, esto debido a la manipulación y técnicas erróneas que se usaron
en el laboratorio. Sin embargo, se logró una cromatografía satisfactoria para la identificación de
los tipos de lípidos.

CUESTIONARIO:

1. Escribe la estructura del ácido mirístico y del triglicérido trimiristina. Señala con
colores las subunidades que los constituyen. Páginas: 2 y 3
2. Cita las principales propiedades físicas y químicas que deben de tenerse en cuenta
en el aislamiento de un lípido. Página: 15 y 16 .
3. Ilustra con un esquema los procedimientos usados actualmente en la extracción,
separación e identificación de lípidos. Páginas: 11-16
4. Elabora una lista de disolventes orgánicos en orden de polaridad. Página: 16
5. ¿Qué es la constante dieléctrica? Página: 8
6. Una mezcla de lípidos que contiene fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina,
fosfatidilcolina, esfingomielina, palmitato, n-tetradecano, triacilglicerol y
colesterol se aplica a una columna de sílica gel. La columna se lava con disolventes
de polaridad creciente a) ¿Que disolventes emplearías para fluir estos lípidos? b)
¿En qué orden esperas que los lípidos se vayan obteniendo en la salida de la
columna? Páginas: 16 y 17
7. Describe dos métodos para identificar lípidos en la cromatografía en capa fina.
Páginas: 12, 13 y 14
8. Describe dos métodos para cuantificar lípidos. Páginas:18, 19 y 20

BIBLIOGRAFIA:

Rodney Boyer; Conceptos de bioquímica; International Thompson Editores; págs. 238-

261,553-583.

1
2