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01
Fundamentos de Microbiología de alimentos
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PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA
MANUAL DE PRACTICAS DE
LABORATORIO
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
PROGRAMA DE NUTRICIÓN Y DIETÉTICA
UNIVERSIDAD DE PAMPLONA.
2015
Guía de Laboratorios Código FLA-23 V. 01
Fundamentos de Microbiología de alimentos
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PRACTICA 1.
MUESTREO, DILUCIONES Y RECUENTO MICROBIANO
INTRODUCCION
Número de Muestras: Para que el muestreo tenga utilidad estadística, se debe realizar
sobre un número apreciable de unidades de un lote. El número de muestras esta en
relación con la precisión que se desee obtener de los resultados.
El número de muestras es el igual a la raíz cuadrada del número total de unidades que
conforman el lote, o tomando el 1 %, del total cuando este es grande y el 10%, cuando el
lote es pequeño. Cuando los productos se controlan con regularidad, es suficiente
analizar de 5 a 10 muestras de cada lote.
- Inspección
- Tamaño del lote (N)
- Tamaño de la muestra(n)
- Muestra
- Toma de muestra
- Muestra defectuosa
- Riesgo del comprador
- Riesgo del vendedor
- Nivel de calidad Aceptable (NCA): Es el porcentaje máximo de unidades defectuosas
(número máximo de unidades defectuosas por cada 100), que se considera
satisfactorio o que se admite en un lote.
Para obtener una muestra representativa se deben cumplir las siguientes condiciones:
Caso General:
El resultado obtenido se redondea a dos cifras significativas. Para esto, si la última cifra
es inferior a 5, la cifra anterior no se modifica, pero, si la última cifra es mayor o igual a 5,
la cifra anterior se incrementa en una unidad y se prosigue así hasta obtener las dos cifras
significativas.
Los resultados se expresan en ufc/g o ml, de producto, según la naturaleza del mismo y
expresado como un número entre 10 y 99 (dos cifras significativas enteras), multiplicado
por 10x donde x es la potencia apropiada de 10.
N = 168+215/2 x100
N = 19150
N= 35+45/2 x 1000
N= 40000
Casos especiales:
CASO 1: Cuando el número de ufc se encuentra por debajo del rango mínimo en ambas
cajas de una o de las dos diluciones consecutivas, se informará de la siguiente manera:
Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilución y se calcula la media aritmética de
las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilución, multiplicándose por el
inverso de la dilución, e informando el resultado así:
Conteo Estimado de ufc/g o ml, expresado con las dos cifras significativas enteras.
Primera dilución retenida 10-2: > 300 ufc en las dos cajas
Segunda dilución retenida 10-3> 300 ufc en las dos cajas
Al dividir las cajas de 10-2 en 4, se contó en un solo cuadrante 180 y 150 colonias
respectivamente. Y al dividir las cajas de 10-3 en 4, se contó en un solo cuadrante 100 y
120 colonias respectivamente.
NOTA: Cuando el conteo de colonias exceda de 200 en 1/8 de la caja, se reportará como
Conteo Estimado > 1600 ufc/g o ml, multiplicado por el inverso de la mayor dilución.
PROCEDIMIENTO
Para muestras sólidas pesar 11 g o 10 g del total del alimento, en un frasco de dilución
que contenga 99 ml o 90 ml de diluyente, tratando de coger de la superficie e interior del
alimento (no debe olvidar que este procedimiento se debe hacer en condiciones de
esterilidad). Guardar una contramuestra para eventuales verificaciones, en condiciones de
refrigeración, congelación o medio ambiento de acuerdo con las características de
almacenamiento del producto.
PRACTICA 2.
RECUENTO DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS, MOHOS Y LEVADURAS
INTRODUCCION
Los aerobios mesófilos, los mohos y las levaduras constituyen un grupo de interés en la
microbiología de los alimentos puesto que tienen múltiples usos, uno de ellos es el de
constituir grupos indicadores de población que se asocian directamente a la calidad o
estado del alimento, su exposición su manipulación y almacenamiento, la mayoría de los
alimentos industrializados (excepto, los productos fermentados), deben ser considerados
como inadecuados para el consumo, cuando contienen un gran número de estos
microorganismos, aun cuando la mayoría no sean conocidos como patógenos y no hayan
alterado de forma inapreciable las características organolépticas del alimento.
Los recuentos de bacterias mesófilas son de poco valor a la hora de predecir la vida útil
de un alimento conservado en refrigeración, ya que muchos microorganismos mesófilos
no crecen a temperaturas por debajo de los 5 °C. Los recuentos elevados de bacterias
mesófilas en productos crudos o no tratados, a menudo están constituidos por microflora
normal o pueden indicar alteraciones incipientes del alimento y no un peligro potencial
para la salud del consumidor.
Por otra parte, la contaminación fúngica de un alimento tiene mucha importancia, no tan
sólo por su acción deteriorante, que pudre y malogra materias primas y productos
manufacturados, sino también por la capacidad de algunos hongos para sintetizar gran
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PROCEDIMIENTO
- Prepare las diluciones 10-1,10-2 y 10-3 en agua de peptona al 0.1 % a partir de las
muestras de alimentos.
- Prepare cuatro cajas de Petri estériles por dilución y divídalas de la siguiente manera:
dos para análisis de aerobios mesófilos y dos para análisis de mohos y levaduras.
- Adicionar 1 ml de cada dilución del alimento en las cajas seleccionadas.
- Adicione 20 ml de Agar Plate Count (debe estar a una temperatura de
aproximadamente 45ºC) a las primeras dos cajas seleccionadas para los aerobios
mesófilos de cada dilución.
- Mezcle inmediatamente las cajas con el medio, de acuerdo con los movimientos de las
agujas del reloj, mínimo 5 veces.
- Adicione 20 ml de Agar Patata dextrosa o Extracto de malta (debe estar a una
temperatura de aproximadamente 45ºC) a las segunda serie de dos cajas
seleccionadas para los mohos y levaduras de cada dilución.
- Mezcle inmediatamente las cajas con el medio, de acuerdo con los movimientos de las
agujas del reloj, mínimo 5 veces.
- Deje solidificar e Incube a 35 °C durante 48 horas para los aerobios mesofilos y a
25°C durante 72 horas para mohos y levaduras
- Retire los materiales de la incubadora una vez cumplidos sus periodos y realice el
recuento en cada caso.
- Cuando se va a realizar el recuento seleccione las cajas de las diluciones para
bacterias mesófilas aerobias, que contengan entre 30 a 300 colonias y 15 a 150 para
mohos y levaduras.
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PRÁCTICA 3.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Staphylococcus aureus COAGULASA
POSITIVO
INTRODUCCIÓN.
Los cocos Gram positivos y en especial Staphylococcus aureus son los
microorganismos más aislados de cualquier muestra clínica con excepción de las
enterobacterias, la segunda causa de infecciones intrahospitalarias (nosocomiales) y una
de las causas más comunes de intoxicación alimentaria. Según la novena edición del
Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática Staphylococcus spp se ubica dentro de
su propia familia Staphylococcaceae. El género Staphylococcus se compone
actualmente de 33 especies, de las cuales 17 pueden asociarse al hombre, de estas
Staphylococcus aureus es una especie potencialmente patógena que al desarrollarse
en un alimento puede producir una “toxina” que es la causa de la intoxicación.
GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
Los estafilococos son ubicuos y se encuentran generalmente en la piel y las mucosas
nasales del hombre y otros animales. S. aureus puede distinguirse de Micrococcus por
su capacidad facultativa, resistente a la lisozima, sensible a la lisostafina y porque su
pared contiene ácidos teicoicos. S. aureus es un coco Gram positivo no esporulado,
inmóvil de 0,8 a 1 micra de diámetro, que se divide en varios planos formando
agrupaciones en forma de racimos en medios sólidos y pares, individuales o cadenas
cortas en medios líquidos, que prefieren las condiciones aeróbicas más que las
anaerobicas. Poseen una enzima _ – lactamasa lo que les confiere la resistencia a los
antibióticos como la penicilina y algunos de sus derivados. En el laboratorio las colonias
crecen lisas, convexas, resplandecientes y de borde entero, presentan pigmento que
puede ser variable de naranja a amarillo y de allí su denominación de coco dorado
(aureus). El crecimiento sobre medios de cultivo es abundante, y en caldo de cultivo se
manifiesta por la turbidez del caldo que más adelante se aclara observándose en el fondo
del tubo un sedimento fino suspendido o una película que forma un anillo en la superficie
del líquido.
generan alguna de las seis enterotoxinas serológicamente distinguibles (A, B, C1, C2, D y
E). Las intoxicaciones causadas por Staphylococcus aureus pueden constituir un alto
porcentaje del total de los procesos de intoxicación alimentaria. Igualmente se reconoce
que del 15 a 20% de los S. aureus aislados de los humanos son enterotoxigénicos, esto
explica el porqué de la importancia de los manipuladores de alimentos en la transmisión
del microorganismo.
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
Las características bioquímicas empleadas para identificar S. aureus se resumen en la
tabla 3.
PROCEDIMIENTO.
En medio de Vogel Jhonson son de color negro rodeadas de un halo amarillo por la
fermentación del Manitol produciendo acidez en el medio la cual hace virar el
indicador.
Marcar la posición de estas colonias e incubar las placas por 18 horas adicionales.
Contar todas las colonias que presenten el aspecto mencionado y que se han
desarrollado durante las 18 horas adicionales de incubación.
Tomar un mínimo de 3 colonias típicas y realizar la prueba de coagulasa.
A) PRUEBA DE COAGULASA.
La coagulasa es una enzima proteica similar a la protrombina, capaz de transformar el
fíbrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coagulo visible en un sistema
analítico adecuado, esta prueba es útil para identificar S. aureus coagulasa positivo de
otros estafilococos coagulasa negativo. Esta enzima se puede encontrar en forma "libre" y
la mal llamada “coagulasa ligada" o “Clumping factor”, cada una de las cuales poseen
diferentes propiedades que requieren el uso de diferentes técnicas para ser demostradas.
Coagulasa fija es una enzima que debería denominársele factor de agregación, está
unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las células
suspendidas en el plasma (que contiene fíbrinógeno) provocan su aglutinación, indicada
por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos.
Prueba en portaobjetos: Para esta prueba se coloca una gota de agua destilada estéril
en un portaobjetos y con ayuda de un asa se transfiere y homogeneiza una o dos colonias
sospechosas del microorganismo, paso seguido se adiciona una gota de plasma
reconstituido junto a la gota del microorganismo, se mezcla bien y se empieza a inclinar el
portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formación inmediata de un precipitado
granular o de grumos blancos. Una reacción positiva se detecta usualmente en 15 a 20
segundos por la aparición del precipitado granular la prueba se considera negativa si no
se observa aglutinación al cabo de 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos
los cultivos negativos o positivos tardíos deben ser verificados mediante la prueba en
tubos.
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PRÁCTICA 4.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES
(Clostridium perfringens).
INTRODUCCIÓN
Las especies de Clostridium perfringens hacen parte de los bacilos anaerobios
esporulados. Pertenece a la familia de las Bacillaceae, caracterizado por su morfología en
forma de bastón con tamaño promedio de 0.9 a 1.3 por 3 a 9 micras, con esporas ovales,
subterminales no deformantes y resistentes al calor. También son microorganismos
encapsulados cuando se encuentran en las heridas, inmóviles y clasificados como
anaerobios estrictos, aunque pueden crecer en presencia de niveles bajos de oxígeno.
Presenta temperatura óptima de crecimiento de 45°C desarrollándose hasta unos 15°C.
Se encuentran distribuidos en toda la naturaleza y en el tracto intestinal de humanos, y
animales como el ganado vacuno y porcino, todos sanos.
GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
Cl. perfringens es un bacilo Gram positivo esporulado que forma parte de la biota
anaeróbica normal del ser humano. Las cepas de Cl. perfringens se clasifican en cinco
tipos (A-E) dependiendo de la clase de toxina que producen. Estas toxinas deben
diferenciarse de las enterotoxinas secretadas por las cepas de Cl. perfringens tipo A
causantes de intoxicación alimentaria. Las cepas enterotoxigénicas se consideran como
causantes de diferentes procesos diarréicos asociados al consumo de alimentos
contaminados (diarrea clásica), a ciertos casos de diarrea postantibiótica y a cuadros de
diarréicos esporádicos (comunitarios y nosocomiales) no asociados con ningún brote
alimentario. Para que se origine el crecimiento y desarrollo de Cl. perfringens en el tubo
digestivo humano es preciso la ingesta previa de una elevada concentración de
microorganismos; en general se calcula que la dosis infectiva está situada entre 106 - 108
UFC/g.
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
Las características bioquímicas empleadas para identificar Cl. perfringens se resumen en
la tabla 7.
PROCEDIMIENTO.
Esta técnica es utilizada cuando se sospecha que el alimento a analizar contiene una gran
población de este microorganismo (>a 100 UFC/ gr o ml).
· Tomar como mínimo 3 colonias negras a ensayar, e inocular en caldo Tioglicolato por 4
horas a 46°C en baño de María, o toda la noche a 35 – 37º°C.
Una vez comprobada la morfología, se procede a sembrar tubos con caldo nitrato, Agar
gelatina, Agar SIM, Agar sangre, y las bioquímicas a disposición.
Los medios se incuban en anaerobiosis a 43ºC +/- 2ºC por 18-24 horas.
Realizar la prueba de catalasa adicionando a una colonia o una emulsión de la colonia
peróxido de hidrógeno al 3%.
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PRÁCTICA 5.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Bacillus cereus.
INTRODUCCION
Desde mediados de 1970 B. cereus se ha reconocido de manera creciente como Una
causa significativa de intoxicación alimentaria, por ejemplo, en países como Estados
Unidos el 1% de todas las epidemias alimentarias son causadas por este microorganismo,
los datos de otros países aún son poco escasos. Bacillus cereus es un microorganismo
esporulado que una vez ha invadido un alimento por intermedio de estas estructuras y
encuentra las condiciones óptimas, las esporas empiezan a germinar dando lugar a la
proliferación y multiplicación de este microorganismo y por lo tanto la producción de una o
las dos toxinas implicadas en las ETA.
Bacillus cereus causa intoxicaciones alimentarias a través de la ingesta de alimentos
contaminados. En general se admite que, debido a la levedad del cuadro y a que la
detección microbiológica de esta bacteria no se realiza rutinariamente en pacientes
diarreicos, la incidencia real puede ser superior a la estimada.
GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
El género Bacillus está constituido por unas 34 especies que pertenecen a la familia
Bacillaceae según la 8va Edición del Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Este
grupo se caracteriza por su gran heterogeneidad entre sus especies no solo a nivel
constitutivo de G-C en el DNA sino por su diversidad metabólica, requerimientos
nutricionales y estructura de sus paredes. El género incluye especies psicrófilas,
mesófilas y termófilas, alcalófilas, neutrófilas y acidófilas, aerobias estrictas hasta
facultativas. Casi todas las especies actualmente conocidas secretan una variedad de
enzimas hidrolíticas extracelulares (solubles) que degradad polisacáridos, ácidos
nucléicos, lípidos. Son productores de antibióticos como bacitracina, polimixina, tirocidina,
gramicidina circulina, esta producción de antibióticos está relacionado con la
esporulación, la liberación de estos metabolitos empieza cuando la esporulación
comienza cerca de la fase estacionaria de crecimiento.
Bacillus cereus se caracteriza por presentar morfología bacilar (bacilos grandes); Gram
positivos de aproximadamente 3 a 5 micras de largo por 1 a 1,2 micras de ancho y
formadores de esporas. Se pueden agrupar en cadenas, pares o encontrarse aislados, así
como contener glóbulos intracelulares que no se tiñen fácilmente, con movilidad variable,
y pueden desarrollarse fácilmente en agar glucosa.
Las características de sus esporas pueden ser cilíndricas u ovaladas con ubicación
central y no deformante, son menos resistentes que las de Clostridium perfringens ya
que se destruyen a 100ºC en 5 a 30 minutos. B. cereus es anaerobio facultativo y puede
crecer entre los 5ºC – 10ºC y 48ºC – 55ºC, aunque presentan temperaturas óptimas de
30ºC a 35ºC, aproximadamente el 80% de las cepas de B. cereus producen durante su
esporulación sustancias con actividad antibiótica y elaboran durante la fase logarítmica
una toxina termoresistente y durante la germinación de sus esporas otra termolábil que
originan dos síndromes o patologías distintas relacionadas con alimentos, el síndrome
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CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
Las características bioquímicas empleadas para identificar B. cereus se resumen
en la tabla 1.
PROCEDIMIENTO.
En agar Mossel (Rosado) las colonias típicas son de color rosado cremosas rodeadas de
un halo de precipitación blanco denso y una gama de tono rojo violeta al fondo.
En agar selectivo para Bacillus cereus (verde azulado) las colonias típicas aparecen de
color azul crenadas con halo denso al rededor (lecitinasa +).
Sembrar por estría de tres a cinco colonias típicas sobre agar nutritivo para hacer la
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CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
Partiendo del crecimiento obtenido en agar nutritivo se realizan las siguientes pruebas:
PRÁCTICA 6.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Salmonella spp
INTRODUCCIÓN.
La salmonelosis es el nombre genérico empleado para designar las infecciones humanas
y animales originadas por diferentes miembros de Salmonella spp. Actualmente en
Colombia los casos reportados como enfermedades (intoxicaciones o infecciones)
transmitidas por alimentos (ETA) indican que los principales microorganismos patógenos
causantes de estas pertenecen a Staphylococcus aureus y Salmonella pullorum y
Salmonella gallinarum; es decir, los colombianos estamos más expuestos a estas
intoxicaciones mas que por cualquier otro agente causal, pero este hecho no indica que
se descuide la vigilancia y control epidemiológico de los otros agentes causantes de
ETAS. El mismo hecho contrasta en el ámbito mundial donde las salmonelosis
(Salmonella enteritidis) son las enfermedades transmitidas por alimentos que más
predominan, por lo menos en la teoria. Se admite generalmente que la salmonelosis es
una infección alimentaria, pruebas más recientes sugieren que algunas salmonelas
aisladas de alimentos producen enterotoxinas bajo condiciones de laboratorio, esto ha
creado algún tipo de controversia sobre si la salmonelosis se puede clasificar como
intoxicación o infección. Esta duda será resuelta cuando se demuestre claramente si las
enterotoxinas juegan un papel importante en la enfermedad y si se producen en los
alimentos ya sea antes de ingerirse o después de esto.
GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
Salmonella spp.
Las Salmonelas son bacilos cortos Gram negativos, móviles y no esporulados, 0xidasa
negativos no fermentadores de lactosa pero sí de glucosa con producción
o no de gas y productoras de ácido sulfhídrico, anaerobios facultativos, ampliamente
distribuidos en diferentes ambientes. Su temperatura óptima está alrededor de los 37°C y
se destruyen a temperaturas mayores de 60°C por 5 minutos mínimo, no crecen por
debajo de 5°C. Producen principalmente cuadros gastrointestinales, fundamentalmente
asociados a infecciones alimentarias con una alta incidencia en los países desarrollados.
La dosis infectante de las salmonelas oscila entre 105 y 109 ufc/ gr o ml, aunque se han
descrito casos de infecciones por concentraciones de 10². Las salmonelas son
consideradas bacterias invasivas, pero solamente superan las barreras mucosa y linfática,
invadiendo el torrente sanguíneo, las productoras de fiebre tifoidea y excepcionalmente
algún otro serotipo ocasionando una septicemia y en los casos más extremos el paciente
puede entrar en shock.
1. Enriquecimiento no selectivo:
· Pesar 25 gramos de la muestra y homogenizarlos con 225 ml de agua peptonada
tamponada.
· lncubar el homogenizado a 35ºC +/- 2ºC por 18 a 24 horas.
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2. Enriquecimiento selectivo:
· Pipetear 1 ml del homogenizado a un tubo que contiene 10 ml de Caldo Rappaport-
Vasiliadis.
· Pipetear 1 ml del homogenizado a un tubo que contiene 10 ml de Caldo Tetrationate.
· Pipetear 1 ml del homogenizado a un tubo que contiene 10 ml de Caldo Selenito de
cisteína.
· lncubar a 43ºC +/- 0,5ºC por 24 horas.
4. Confirmación bioquímica:
· Tomar de cada uno de los medios selectivos tres colonias típicas de Salmonella spp y
sembrar por punción y estría sobre la superficie de tubos que contienen agar TSI,
LIA, SIM y Citrato.
· Sembrar por suspención los caldos de RM-VP.
· Incubar a 35ºC +/- 2ºC por 24 - 48 horas.
· Leer las pruebas bioquímicas así:
¨ TSI: Salmonella fermenta la glucosa con o sin producción de H2S y gas. No fermenta
la lactosa. Es decir, parte inferior del tubo amarillo y la parte inclinada roja.
Salmonella spp = K/A + H2S.
¨ LIA: Salmonella spp cambia todo el medio del tubo a un color púrpura más intenso
con o sin producción de gas y H2S. Salmonella spp = LIA +
¨ SIM: Salmonella spp. no hidroliza el triptófano y por lo tanto no produce indol, ácido
pirúvico y amoníaco. En este medio se puede observar Motilidad y producción de
H2S. Salmonella spp = indol - y motilidad +
¨ Citrato de Simmons: Salmonella spp utiliza el citrato de Sodio como fuente única de
carbono, por lo tanto el medio vira de verde a un color azul.
¨ RM-VP: Salmonella spp se caracteriza por ser RM positivo y VP negativo, es decir,
utiliza la vía de fermentación ácido mixta durante la fermentación de la glucosa y no
la vía del 2,3-butanodiol.
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PRÁCTICA 7.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Vibrio cholerae y Vibrio Parahaemolyticus,
INTRODUCCIÓN.
La familia Vibrionaceae está constituido por un conjunto de bacilos Gram negativos
curvados no entéricos, fermentadores, aerobios y anaerobios facultativos, móviles (por
flagelos polares) y oxidasa positivos que forman parte del medio ambiente hídrico,
preferentemente marino. Este agrupamiento se originó por la búsqueda de una forma
conveniente para diferenciar estos microorganismos de las Enterobacteriaceae y no
implicaba necesariamente una relación taxonómica entre las especies que incluía. El
principal modulador de su presencia en estos ecosistemas lo constituye la temperatura y
el grado de salinidad. A esta familia pertenecen según el Manual de Bergey’s los géneros
Vibrio spp (27 especies), Photobacterium spp (3 especies), Aeromonas spp (4 especies) y
Plesiomonas spp (1 especie). Sin embargo, en los últimos años debido a la revolución
filogenética y análisis de
GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
Los miembros del género Vibrio spp están constituidos por bacilos Gram negativos
curvados, generalmente no entéricos, fermentadores, aerobios y anaerobios facultativos,
móviles (por flagelos polares) y oxidasa positivos que forman parte del medio ambiente
hídrico, preferentemente marino.
La especie de mayor interés del género Vibrio para la ciencia médica es sin duda V.
cholerae. Esta especie se ha dividido en dos grupos de acuerdo a la glutinación o no con
el antisuero anti O1. Las cepas que no se aglutinan con este antisuero se denominan V.
cholerae no O1 (si se determina bioquímicamente la especie) o se las designa con una
variedad de nombres de otras especies de vibriones, como V. parahaemolyticus, V.
mimicus, etc.
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN.
El tratamiento de la diarrea coleriforme consiste fundamentalmente en la reposición de las
pérdidas hidroelectrolíticas; la adición de antibióticos parece incrementar la tasa de
curaciones, acortar el tiempo de eliminación de los microorganismos, disminuir el volumen
líquido perdido y mejorar la evolución clínica de los pacientes. En general las cepas de V.
cholerae se muestran sensibles a ampicilina, tetraciclinas, cloranfenicol y aminoglicósidos,
aunque en ciertas zonas de Asia predominan las cepas multirresistentes frente a estos
antimicrobianos y cotrimoxazol. En estos casos el empleo de las fluoroquinolonas en los
adultos o el ácido nalidíxico en los niños podrían ser altemativas terapéuticas válidas. Las
diarreas causadas por otros Vibrios son generalmente autolimitadas y no precisan de
tratamiento antibiótico.
Una de las causas de la diseminación del cólera por O1 y O139 es por portadores que
contraen estas enfermedades durante sus viajes a zonas endémicas y lo trasmiten luego
en las deposiciones en sus países de origen. Por ello se recomienda a los viajeros evitar:
¨ Consumir agua cruda (sin hervir o procesar) ni hielo fabricado con esa agua;
Presuntiva:
Interpretación
Las colonias de Vibrio parahaemolyticus en Agar TCBS son redondeadas, con un
diámetro aproximado de 2 a 3 mm y de color verde, azul o verde azulado.
Las colonias de Vibrio cholerae son amarillas. Las colonias de Vibrio alginolyticus y
otros Vibrios son más grandes y de tonos amarillos.
Las colonias de otros géneros como Coliformes, Proteus spp, Enterococos son más
pequeñas y translúcidas
Prueba Confirmativa.
Las colonias sospechosas se confirman mediante pruebas bioquímicas sembrando en
medios: TSI, SIM (motilidad), RM-VP. LIA.
RESULTADOS.
En la actualidad las normas sanitarias Colombianas sobre alimentos exige un resultado
negativo de V. parahaemolyticus como de V. cholerae en 25 gramos de producto, por lo
tanto este procedimiento está basado para arrojar estos resultados.
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PRÁCTICA 8.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Listeria monocytogenes.
INTRODUCCIÓN.
L monocytogenes es un importante agente causal de septicemias y meningitis
principalmente entre los niños, ancianos y personas inmunocomprometidas por drogas o
enfermedades. Sin embargo, también ocurren casos de Listeriosis en niños y adultos
aparentemente sanos. Especialmente importantes son las infecciones durante el
embarazo, ya que pueden provocar abortos o muerte prematura del feto.
GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
El género Listeria incluye bacilos cortos Gram positivos, con los extremos redondeados.
Algunas células pueden ser curvadas. Se disponen aislados, en cortas cadenas o
formando una V, L, T (antiguamente se incluían dentro de las corinebacterias). En cultivos
viejos pueden formar filamentos de 6-20 mm de longitud o más y una reacción de Gram
variable. A 20ºC – 25ºC son móviles por unos pocos flagelos perítricos, pero a 37ºC
pierden la movilidad. No son esporulados ni capsulares. Son aerobios y anaerobios
facultativos. Crecen entre 1ºC y 45ºC. Temperatura óptima, 30ºC a 37ºC.
No resisten un calentamiento a 60°C durante 30 minutos. Crecen entre pH 6 y 9.
La Listeriosis humana es una infección muy extendida por todo el mundo, habiendo
aumentado recientemente el número de casos declarados. Así, la incidencia de la
infección humana en Inglaterra se estima en el orden de 1 caso por cada 30.000
habitantes, y 1 caso de Listeriosis perinatal por cada 20.000 nacimientos. Estos datos son
similares en otros países del Norte de Europa y en EE.UU.; pero la incidencia en Francia
es cuatro veces más alta. En conjunto, los porcentajes de mortalidad son del 46% de los
casos estudiados, lo que indica que la Listeriosis, aunque es una infección de incidencia
relativamente baja, su alta mortalidad la convierte en una seria infección. La Listeriosis
también es importante en veterinaria. En diversos países ha habido un incremento
progresivo en el número de casos declarados de Listeriosis en el ganado, generalmente
asociados a cambios en las prácticas agrícolas como en la pobre calidad del forraje o
piensos utilizados y también la utilización de excrementos animales como fertilizantes de
la tierra. Muy pocas veces se ha demostrado que exista una transmisión directa de
Listeriosis de los animales al hombre, en cambio, la transmisión indirecta, a través de los
alimentos sí que es un vinculo muy importante.
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
Las características bioquímicas empleadas para identificar L. monocytogenes se
resumen en la tabla 1.
Todas las cepas toleran una presión osmótica alta, crecen en presencia de: 10% NaCI,
40% bilis. 0.025% acetato de talio, 3.75% de tíocianato potásico, 0.01 % de Cloruro de
2,3,5-trifeniltetrazolio, resisten la desecación, congelación, refrigeración, y se coloca en
duda su termorresistencia. No crecen en presencia de un 0.02% de ázida sódica.
PROCEDIMIENTO.
Técnica de aislamiento de la FDA modificado:
Partiendo del crecimiento obtenido en agar Palcam (Oxford o Mc Bride), se realizan las
siguientes pruebas:
Los resultados de las pruebas bioquímicas son:
· hemólisis de Agar Sangre de Caballo (+).
· Reducción de Nitratos (-).
· Test de CAMP con Staphylococcus aureus (+).
· Test de CAMP con Rodococcus eaqui (-).
· Producción de ácidos a partir de Manosa y Xilosa (-).
· Producción de ácidos a partir de glucosa, Ramnosa y Metil Manosido (+).
· Catalasa +
· Oxidasa –
· Indol –
· Citratos –
· H2S –
RESULTADOS.
En la actualidad las normas sanitarias Colombianas sobre alimentos exige un resultado
negativo de L. monocytogenes en 25 gramos de producto, por lo tanto este procedimiento
está basado en ese resultado.
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PRACTICA 9.
ANALISIS DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES.
INTRODUCCIÓN.
El grupo de los Coliformes incluye todas las bacterias de forma bacilar, aerobia y
anaerobia facultativa, oxidasa negativa y Gram negativas, no formadoras de esporas que
fermentan la lactosa con formación de gas en 48 horas a temperatura de 35ºC. El grupo
de los Coliformes contienen especies individuales que habitan en el intestino y otras no
intestinales que están en el suelo, agua y cereales. Los microorganismos Coliformes son
los más reconocidos indicadores de contaminación fecal y se constituyen en una de las
herramientas de trabajo más utilizadas en el área de microbiología de alimentos.
GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo, móvil por flagelos perítricos, algunos
forman microcápsulas otros macrocápsulas, no esporulados (asporógenos) con tamaño
promedio de 2 a 3 micras. Aero/anaerobio facultativo, mesófilos; posen 170 antígenos
somáticos (Ag O), 100 Ag H y 50 Ag K. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se
agrupan en la tribu Escherichiae. La clasificación serológica se basa en los antígenos H y
O. La clasificación en grupos se basa en los síndromes clínicos por 6 mecanismos
diferentes y causan enteritis o gastroenteritis. El grupo de los Coliformes está formado
por especies de E. coli, Citrobacter spp, Enterobacter spp, Klebsiella spp, y Serratia
spp. Los medios de cultivo utilizados para su detección contienen lactosa y al fermentarla
producen ácido y gas y estos criterios son usados para su clasificación Dentro del grupo
de los Coliformes se habla de Coliformes totales y Coliformes fecales. Los primeros hacen
relación a los Coliformes diferentes de E. coli que pueden vivir en el suelo y en gran
diversidad de hábitats, por consiguiente los Coliformes no siempre indican contaminación
de origen fecal por contacto directo con este material; sin embargo los Coliformes totales
son indicadores útiles de procesos y saneamiento inadecuado. Su presencia en un
número alto en un alimento procesado indica que la probabilidad de crecimiento de
bacterias patógenas como Salmonella spp, Shigella spp, S. aureus, etc., es alta.
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
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PROCEDIMIENTO.
RESULTADOS.
· Calcular el número total de E. coli teniendo en cuenta el número total de colonias típicas
crecidas en cada una de las placas, el número de colonias examinadas y el número de
colonias positivas así:
Donde:
N: Número total de UFC de E. coli por gramo o mililitro de muestra.
Σa: Sumatoria del número de colonias típicas en cada caja retenida.
V: Volumen de muestra inoculada.
n1: Número de cajas retenidas en la primera dilución.
N2: Número de cajas retenidas en la segunda dilución.
d: Factor de dilución de la primera dilución retenida.
Donde:
b: Número de colonias identificadas como positivas de acuerdo al criterio microbiológico.
A: Número de colonias examinadas
C: Número total de colonias contadas en cada una de las cajas retenidas.
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PRACTICA 10.
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE EQUIPOS, SUPERFICIES, AMBIENTES Y
MANIPULADORES
INTRODUCCIÓN.
Para garantizar la calidad sanitaria de los productos alimenticios que se procesan en las
fábricas de alimentos, estas deben tener implementados procedimientos adecuados de
limpieza y desinfección, así como, adecuados y suficientes agentes detergentes y
desinfectantes, que permitan mantener a la fábrica libre de focos de contaminación, y
prevenir riesgos que puedan afectar la salud del consumidor.
La limpieza se debe aplicar a todas las áreas de la planta, detectando puntos de control
critico, con énfasis en especial en las superficies de contacto con alimentos.
Desinfección de superficies:
El aire:
La contaminación del ambiente procede de restos de alimentos, en el suelo o sobre las
superficies, favoreciendo el desarrollo de microorganismos, de la manipulación de
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El personal:
Utilización de hisopos: La toma de muestras con hisopos se emplea mucho, sobre todo
para el control de material en las salas de despiece, quesería, moldes, bandejas, válvulas,
palas de agitadores y en general de superficies que entren en contacto con el alimento o
donde se sospeche sea una fuente de microorganismos y donde el método sea factible de
aplicación.
Métodos por impresión: Se adaptan bien a las superficies planas, los microorganismos
son extraídos por contacto directo con el medio de cultivo. De esta forma se puede
establecer la localización de los microorganismos en las superficies desinfectadas
(método de placa RODACb).
Control de aire con placas de medio de cultivo: El control se lleva a cabo exponiendo la
superficie del medio de cultivo a la atmósfera seleccionada por un tiempo determinado
(sedimentación).
Sistemas colectores de aire: Estos equipos toman un volumen de aire determinado en una
unidad de tiempo determinada, proyectando el aire captado sobre la superficie de una
placa de petri con un medio definido. Es una técnica significativa de la contaminación
ambiental.
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PROCEDIMIENTO
Para la misma determinación, realice los métodos de enjuague con caldo nutritivo y
técnica RODAC con los medios adecuados. Incube todos los análisis por el tiempo y
temperatura adecuados.
Toma de muestras de aire. Seleccione del lugar de trabajo, un área, en la cual debe
exponer la superficie de una caja de agar plate Count para conteo total de bacterias y
NOTA: siempre tenga la precaución de marcar previamente los tubos, cajas y demás
pruebas con la fecha, lugar, análisis, hora, temperaturas de incubación y demás
información necesaria para el correcto desarrollo de las pruebas.
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BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS