FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES

CARRERA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

“ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA
AMILASA SALIVAL”

Caja Sanchez, Jairo; Huarcaya Puma, Jose Luis; Ortiz Bravo, Virginia; Porta
Castillon, Joselyn; Velasquez Sanchez, Ana Karina & Yauri Ortiz, Melody

Docente: Vélez Azañero, Armando

Curso: Bioquímica Ambiental

2019
INTRODUCCIÓN

Las enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son

proteínas como catalizadores; los enzimas actúan en pequeñas cantidades y se
recuperan indefinidamente, no llevan a cabo reacciones que sean energéticamente
desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran
su consecución (Avilez,2009). La saliva humana contiene entre 0 y 3 mg/ml de una
enzima llamada amilasa, capaz de romper los enlaces que unen las moléculas de
glucosa en el almidón (Avalos,2007). La α-amilasa salival humana (AASH) es la
proteína de la saliva que se encuentra en mayor concentración y posee actividad
enzimática, ya que cataliza los enlaces α-1,4-glucosídicos de los almidones y los
carbohidrato (Lamby et al.,2013).

Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos,
ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no
biológicos […] (Arroyo, 1998). Por ello, es importante conocer los factores que
modifican la actividad enzimática. Según Izquierdo (2012), los factores que afectan
la actividad enzimática son la concentración de la enzima, la concentración del
sustrato, el pH y la temperatura. Por otra parte, se realizó estudios que relacionan el
síndrome de Burnout con respecto a la actividad enzimática de la amilasa salival,
dando como resultado que el 25% tiene prevalencia del síndrome encontrándose
entre los 35-37 y 57-60 años, sobretodo en casados, sin diferencia de sexo y
contrato laboral, además la actividad de la amilasa salival al inicio y término de la
jornada laboral se encontraron elevados (Cornejo & Medina,2017).

El objetivo de esta investigación se basó en determinar la actividad enzimática de la

amilasa salival por su importancia en la degradación del almidón ya que debido a
esta acción se obtienen como producto moléculas de glucosa, siendo asimiladas por
cualquier ser vivo como fuente de energía.
MATERIALES Y MÉTODOS

El 19 de septiembre del 2019, en el laboratorio de Ingeniería Ambiental de la

Universidad Científica del Sur (UCSUR), Lima, Perú (76° 58´ 41,26´´ O y 12° 13´
12,13´´ S, 5 msnm) con una temperatura ambiental que oscilaba entre los 15 °C a 21
°C dato proporcionado por la estación meteorológica del laboratorio, se procedió a la
realización de la práctica “Análisis cuantitativo de la actividad enzimática de la
amilasa salival” tomando la muestra de amilasa salival de la señorita Camila
Montoya.

Para la determinación de la actividad enzimática de la amilasa salival se realizó en

función al método de Caraway (1959) mediante el cual se prepararon dos matraces
(Tabla 1) donde uno se distribuiría para el blanco y el otro para la muestra.

Tabla 1: ​Preparación de la muestra en los matraces

Luego se incubó a 37 °C ambos matraces durante unos 5 minutos, al mismo tiempo

que se formaba 2 grupos de tubos de ensayo (blanco y muestra), seguidamente se
extrajo la muestras a tiempo cero, después de ello al matraz de muestra añadimos 1
mL de muestra de amilasa salival, que luego se extrajeron a tiempos siguientes: 1,
2, 4, 6, 8, 10 minutos de ambos matraces, añadiendoles 7 mL de agua destilada y
tres gotas de solución yodo a cada tubo de ensayo, se procedió a mezclar por
inmersión y luego se dejo a tiempo de 10 minutos para medir la absorbancia a
través de un Espectrofotómetro T80+ / UV-VIS Spectrometer a una longitud de onda
de 660nm.
Los datos fueron analizados usando la hoja de cálculo ​Microsoft Excel 2019 con las
fórmulas establecidas de la actividad enzimática y gráficos proporcionados por el
mismo.

RESULTADOS

La absorbancia leída para la muestra fue disminuyendo conforme el tiempo

avanzaba, el mismo comportamiento ocurre para los 4 diferentes grupos (MESA
1,2,3 y 4) (Tabla 2). Por otro lado, la lectura de la absorbancia para el blanco se
mantuvo constante, no experimenta incremento o disminución significativa conforme
el tiempo avanza.

Tabla 2

Lectura de absorbancias del blanco y la muestra en diferentes tiempos

Tiempo (min) MESA 1 MESA 2 MESA 3 MESA 4

Abs Abs Abs Abs Abs Abs Abs Abs

[B] [M] [B] [M] [B] [M] [B] [M]
T1=0

0.378 0.378 0.346 0.346 0.586 0.586 0.723 0.723

T2=1 0.366 0.22 0.301 0.097 0.586 0.229 0.723 0.156

T3=2 0.398 0.204 0.245 0.08 0.586 0.216 0.723 0.17

T4=4 0.379 0.188 0.238 0.078 0.586 0.199 0.723 0.125

T5=6 0.395 0.184 0.212 0.07 0.586 0.179 0.723 0.108

T6=8 0.396 0.155 0.241 0.069 0.586 0.072 0.723 0.94

 T8=10 0.369 0.132 0.236 0.067 0.586 0.034 0.723 0.85

Se utilizó el dato de la concentración inicial del sustrato, almidón (1%), y la relación

con su absorbancia, de manera que se pueda determinar la concentración de
almidón en cada matraz conforme el tiempo avanza (Figura 1). Esta concentración
presentó un decrecimiento en todas las muestras evaluadas por mesa.

Figura 1.​ Gráfica de concentración de almidón según los tratamientos de tiempo (T0=0, T1=1min,
T3=2min, T4=4min, T5=6min, T6=8min y T7=10min)

En cuanto a la cantidad de almidón digerido, se hizo una diferencia entre los valores
de la concentración del blanco y de la muestra en un mismo tiempo (Figura 2).
Teniendo como resultado un comportamiento creciente. Se evidencia una diferencia
significativa para la Mesa 3 a partir del minuto 8.
Figura 2.​ Gráfica de cantidad de almidón digerido según los tratamientos de tiempo (T0=0, T1=1min,
T3=2min, T4=4min, T5=6min, T6=8min y T7=10min)

La figura 3 indica que la actividad enzimática, calculada por la cantidad de almidón

digerido por minuto, no tuvo una variación significativa conforme el tiempo pasaba.
Sin embargo, la mesa 1 y mesa 3 presentaron un dato extremo para el minuto 1 y
minuto 6 respectivamente. En la mesa 4 y 2 se encontraron valores negativos,
ambos para el minuto 1 y hay un aumento de valores para las mesas 1, 2 y 3 a los 6
minutos.
Figura 3.​ Gráfica de actividad enzimática según los tratamientos de tiempo (T0=0, T1=1min,
T3=2min, T4=4min, T5=6min, T6=8min y T7=10min)

DISCUSIÓN

En la concentración del sustrato (almidón) versus el tiempo en minutos, se tiene una

tendencia negativa, esto se debe a que la amilasa ha degradado el almidón, y con
ello el complejo azul, dando lugar a la formación de azúcares más sencillos
(Heredia, 2008) tras haber pasado el tiempo. En primeros momentos hasta el tubo
de tiempo 1 y tiempo 2 hay una acelerada baja de concentración de sustrato debido
a que hay una cantidad suficiente almidón-yodo donde el yodo degrada con facilidad
al sustrato (Damazo, 2014). Asimismo, Vasques & Minchola, (2009) demostraron la
coloración en el tiempo, en el tubo de tiempo cero presentaron una coloración azul
intenso, mientras el grupo que contiene la enzima su coloración varía de azul a
amarillento mientras más sea el tiempo de exposición de la enzima amilasa salival.
Gutiérrez, (2007) explica que la tendencia a color amarillento se debe a la
degradación del almidón, sin dejar residuos que puedan reaccionar con el I, esto
demuestra las condiciones óptimas de la enzima. Además Bohinsky (1991)
mencionó que el color amarillento también se debe a que el I​2 en disolventes polares
como el agua. Para la coloración de azul intenso del tubo a tiempo cero, Garrido
(2015), manifiesta que se debe a la adsorción del I​2 por las cadenas helicoidales de
la amilosa, formando así un complejo yodo-amilosa de color azul oscuro.

La cantidad de almidón digerido por tiempo en cada grupo, va a estar estrechamente

relacionado con la actividad de la enzima amilasa salival. Heredia S. (2008)
menciona que la saliva del cuerpo humano cuenta con un rango de 0 y 3 mg/ml de
una enzima llamada amilasa, la cual se caracteriza por romper los enlaces que unen
las moléculas de almidón y de esta manera el cuerpo humano pueda aprovechar los
monómeros de glucosa por acción de la enzima al digerir este almidón. En la Figura
2 se puede observar la manera en cómo esta cantidad de almidón fue aumentando
de manera creciente conforme al tiempo y la temperatura dada al momento de la
incubación; sin embargo, estos no son los únicos factores que influyen en el
mecanismo de la enzima amilasa salival. Vargas, S. (2009) clasifica las enzimas
según el pH que actúan las enzimas alcalinas y ácidas [...] las amilasas ácidas
actúan en un rango de 3.5 a 5 cuya existencia indica una mejora potencial en el
proceso de degradación de amilasa. De esta manera, la actividad del almidón
digerido en el presente experimento va a estar relacionado con el rango de pH el
cual ha trabajado la enzima. Sin embargo, según la Figura 2, el almidón no presenta
una digestión al 100%, existe una cantidad de almidón resistente a la actividad
enzimática. Este almidón resistente es debido a una cantidad más alta de amilosa
en relación a la amilopectina, lo cual permite construir una estructura menos
susceptible a la hidrólisis enzimática. (Villarroel, P., Gómez, C., Vera C. y Torres J.,
2018).

Al incubar con las manos no se sabe la temperatura exacta a la que fue sometido la
solución. Sin embargo, Peña (2009) expresó que según estudios se sabe que a
mayor temperatura se perderá más rápido la actividad enzimática ya que tiene una
la habilidad inherente. En el experimento se cuantificó los resultados de las
muestras primero al minuto y luego cada 2 minutos, concordando con lo que dijo
Molina (2006) que a menor tiempo de de sacar muestras, se logra un ahorro
energético importante.

Según Velardez (2015) primero se visualiza una coloración violeta donde la hidrólisis
de almidón comienza verse afectado, luego se presenta un color azul que unos
minutos después desaparecen y posteriormente se observa una degradación de
colores, tal información concuerda con lo observado en el experimento mediante el
cambio de coloración, sin embargo en nuestra mesa los colores no se diferenciaban
entre el tubo 1 y tubo 2, debido a que la actividad es más rápido respecto al intervalo
de tiempo justo al minuto, esta reacción es afectada por la baja temperatura al
actuar muy rápido y la coloración presente depende de la concentración y la
temperatura respecto al tiempo , según Pérez (2018) el pH muy ácido o muy alcalino
también altera el proceso lo que ocasiona la inhibición enzimática.
CONCLUSIONES

En conclusión, la actividad enzimática de la amilasa salival es importante en la

degradación del almidón, ya que debido a este mecanismo se obtienen como
producto moléculas de glucosa, las cuales son asimiladas por cualquier ser vivo
como fuente de energía. La eficiencia de las enzimas va a depender de distintos
factores del medio como la temperatura, el pH y el tiempo para conocer la cantidad
de almidón digerido y a partir de este dato, conocer la actividad enzimática por
muestra. Así mismo, se considera al reactivo de lugol imprescindible para la
presente práctica debido a que permite reconocer polisacáridos al estar compuesto
de yodo y yoduro. En el caso del almidón, el lugol le da una coloración oscura entre
negra y azul, condiciones adecuadas para poder ser llevado al espectrofotómetro y
conocer sus valores de absorbancia para que mediante fórmulas matemáticas, se
halle la concentración de las diferentes muestras. La saliva contiene una enzima que
es capaz de romper las cadenas de almidón.

RECOMENDACIONES

Se recomienda usar los tiempos indicados en la guia ya que ​la​s concentraciones

del almidón disminuyen a medida que el tiempo aumenta ya que la degradación de
este polímero involucra la asociación de los gránulos con muchas enzimas, siendo
una de estas la alfa-amilasa ( Ruiz, 2012)

Se recomienda no mover la solución mientras se está incubando, ya que al hacerlo

se pierde calor y por ende las reacciones se hacen más lentas y luego los datos al
ver la reacción de hidrólisis en los tubos, tendrán datos que nos 100% reales.

Usar una pera de succión por cada pipeta ya que al usarla casi todas, puede
haber un error al usar una que se haya usado para succionar por ejemplo un
reactivo y esto puede afectar el resultado esperado.
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