Centro de Investigación Científica de Yucatán, A. C.

Obtención de etanol a partir de residuos

agroindustriales de plátano

Tesis que presenta

M. en C. Xenia Mena Espino

En opción al grado de

DOCTOR EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA EN

PLANTAS

Mérida, Yucatán

Diciembre 2011
 Declaración de Propiedad

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Experimentales, los Resu ltados y Discusión de este documento provienen
de las actividades de experimentación real izadas durante el período que se
me asignó para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y
Laboratorios del Centro de Investigación Científica de Yucatán , A. C. y que
dicha información le pertenece en térm inos de la Ley de la Propiedad
Industrial, por lo que no me reservo ningún derecho sobre ello.

Mérida, Yucatán, México

Noviembre del 2011

M: :m Z : : :ena Espino
 RECONOCIMIENTOS

Este trabajo se rea lizó en las Un idades de Biotecnolog ía y Energías

Renovales del Centro de Investigación Científica de Yucatán , A C. bajo la
dirección de la Dra. Blondy B. Canto Canché y la Dra . Li liana M. Alzate
Gaviria.

El trabajo fue financiado por el Fondo Mixto de Tabasco (Proyecto TAB-

2006-02-43776) y por la beca de doctorado otorgada por el Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología (número de becario 211766) para Xenia
Mena Espino.

Dr. Os oreno Valenzuela

Director Académico
Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C .
 AGRADECIMIENTOS

A mis asesoras, la Dra. Blondy B. Canto Canché y la Dra. Liliana M. Alzate

Gaviria, a los miembros de mi comité tutoral y de revisión de tesis por su
dirección y consejos que permitieron enriquecer este trabajo.

A la Dra. Refugio Rodríguez por proporcionar las cepas fúngicas empleadas

como referencia durante los ensayos enzimáticos.

A los Biológos Aarón Sánchez y Eglé May por el establecimiento y

enseñanza de algunas de las metodologías empleadas en este trabajo.

A los M. en C. Miguel Tzéc Sima y Jorge Domínguez Maldonado por todo

su apoyo y orientación en el laboratorio.

A todos los miembros del laboratorio de Biología Molecular de Plátano y de

Energ ías Renovables que me acompañaron en los primeros años y a los
que conocí al final de este trabajo.

En especial mis hermanos académicos Nuvia, Maggie, Yeni , Rosalia,

Yamili, Miguel, Roberto, Jairo, Frank y a los pequeños del grupo lnes,
Yoreni y Efrén. Gracias por su amistad.

A todos mis compañeros del CICY por su compañía y apoyo.

Al Dr. Alfredo Martínez por la estancia durante mí doctorado y a los amigos

que conoci durante la estancia (Alejandra, Lucy, Marco, Larys, Susy).

A Katia Cob y familia por su apoyo y animes todo el tiempo.

A Eric Luis por su cariño y por estar tantos años de una u otra forma cerca
de mí.

A todas las personas y colaboradores que tanto directa como

indirectamente hicieron posible la realización de esta Tesis.

¡MUCHAS GRACIAS A TODOS!

DEDICATORIAS

A Dios por darme la oportunidad de term inar este proyecto, gracias por
darme la fuerza para hacer realidad mis sueños y estar conmigo en cada
momento.

A mis padres mis padres Manuel Mena y Maria Espino, por todo su amor,
por enseñarme a nunca dejar de luchar por mis sueños, guiarme y
apoyarme siempre en ellos. Gracias por estar siempre conm igo y su apoyo
incondicional.

A Mari Mena por ser la mejor hermana, amiga, aliada, compañera y

confidente. No tengo palabras para decirte lo mucho que significas en mi
vida.

A mis hermanos adoptivos Erik Navarro y José Huch fn, gracias por todo su
cariño y por estar en mi vida.

A las fam ilias Mena Madera y Espino Abarca por su apoyo siempre
constante.
 ÍNDICE

ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS vi
ÍNDICE DE CUADROS x
LISTA DE ABREVIATURAS xi
RESUMEN xiii
ABSTRACT xv
CAPÍTULO l. ANTECEDENTES 1
l. 1. Petróleo como fuente de energía 1

l. 1. 2. Biomasa 2

l. 1. 2. 1. Estructura química de la lignocelulosa 4

l. 1. 2. 2. Usos de la biomasa lignocelulósica 9

l. 1. 3. Fuentes alternas de materia prima para la obtención 9

del etanol

l. 1. 4. Etanol a partir de materiales celulósicos 12

l. 1. 5. Cultivos de importancia en México 13

l. 1. 6. Cultivo de plátano 13

l. 1. 7. Justificación 15

l. 1. 8. Hipótesis 16

l. 1. 9. Objetivos 16

l. 1. 9. 1. Objetivo General 16

l. 1. 9. 2 Objetivos Particulares 16

l. 1. 10. Estrategia experimental 17

l. 1. 11. Referencias 18

CAPÍTULO 11. PRETRATAMIENTOS 25

11. 1. Introducción 25
 11. 2. Pretratamientos de los materiales lignocelulósicos 26

11. 2. 1. Pretratamientos físicos 29

11. 2. 2. Pretratamientos físico-químicos 29

11. 2. 3. Pretratamientos químicos 31

11. 2. 4. Pretratamientos biológicos 34

11. 3. Subproductos de la hidrólisis de la 35

biomasa lignocelulósica

11. 4. Materiales y Métodos 38

11. 4. 1. Colecta de material vegetal para la 38

elaboración de harinas

11. 4. 2. Pretratamiento de los residuos de plátano 38

11. 4. 3. Hidrólisis de residuos de plátano 38

11. 5. Resultados y Discusión 39

11. 5. 1. Pretratamiento físico-químicos de los 39

residuos de plátano

11. 5. 2. Hidrólisis de residuos de plátano 40

11. 6. Conclusión 45

11. 7. Referencias 46

CAPÍTULO 111. SACARIFICACIÓN 55

111. 1 Antecedentes 55

111. 1. 1. Hongos ligninolíticos 56

111. 1. 1. 1. Enzimas Ligninolíticas 59

111. 1. 1. 2. Principales enzimas ligninolíticas 60
ii
 111. 1. 1. 3. Aplicación de enzimas ligninolíticas 61

111. 1. 1. 4 Enzimas Celulolíticas 62

111. 1. 1. 5. Propiedades y modo de 62

acción de las celulasas

111. 1. 1. 6. Inductores y sustratos de 63

las enzimas celulolíticas

111. 1. 1. 7. Aplicación de celulasas 64

111. 1. 1. 8. Organismos con actividad celulolítica 65

111. 2. Materiales y Métodos 67

111. 2. 1. Cuantificación de las actividades

de ligninasas y celulasas 67

111. 2. 2. Actividad enzimática de ligninasas 67

111. 2. 3. Actividad enzimática de celulasas 67

111. 2. 4. Preparación de extractos enzimáticos 67

111. 2. 5. Sacarificación de los residuos de plátano 68

111. 2. 6. Preparación de extractos enzimáticos 68

cel u lolíticos

111. 2. 7. Análisis estadístico 68

111. 3. Resultados y Discusión 69

111. 3. 1. Cuantificación de enzimas lignocelulolíticas 69

111. 3. 2. Sacarificación de los residuos de plátano 75

111. 3. 2. 1. Sacarificación del material pretratado 77

con ácido más calor

111. 3. 2. 2. Sacarificación del material pretratado 78

con álcali más calor
iii
 111. 3. 2. 3. Sacarificación del material pretratado 79
con ácido más álcali y calor

111. 3. 4. Cuantificación de celulasas de hongos 81

autóctonos obtenidas con el medio sales de
Mandels y CMC

111. 3. 4. 1. Sacarificación de harinas pretratadas 82

con ácido empleando celulasas de hongos
autóctonos

111. 4. Conclusiones 84

111.5. Referencias 85

CAPÍTULO IV. FERMENTACIÓN 93

IV. 1. Introducción 93

IV. 2. Factores externos e internos que afectan 93

la fermentación

IV. 3. Parámetros de la fermentación 94

IV. 4. Características deseables en los 94

microorganismos productores de etanol

IV. 5. Producción de etanol 95

IV. 6. Limitantes del proceso 97

IV. 7. Levadura Saccharomyces cerevisiae 98

IV. 8. Uso de levaduras termotolerantes en los 100

procesos de obtención de etanol

IV. 9. Fermentación de diferentes materias primas 101

IV. 9. 1. Fermentación para obtener etanol 101

a partir de caña de azúcar

IV. 9. 2. Fermentación para obtener etanol 101

a partir de almidón
iv
 IV. 9. 3. Fermentación de materiallignocelulósico 102

IV. 10. Destilación 103

IV.11. Materiales y métodos 105

IV. 11. 1. Hidrolizado 105

IV.11. 2. Curva de crecimiento de la levadura 105

Saccharomyces cerevisiae en hidrolizados de
plátano. Preparación del inóculo para la
fermentación

IV.11. 3. Fermentación 106

IV.11 . 4. Destilación de los fermentados 106

IV. 11. 5. Métodos analíticos 106

IV. 12. Resultados y Discusión 108

IV.12. 1. Fermentación de los hidrolizados 111

IV.13. Conclusión 116

IV. 14. Referencias 117

CAPÍTULO V. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES GENERALES 125

V. 2. Referencias 128

VI. PERSPECTIVAS 131

ANEXO A 133

V
 LISTA DE FIGURAS

Figura l. 1. Porcentaje de aportación de cada fuente de energía primaria 2

en el total del consumo mundial. (Modificado de Ladanai &
Vinterback, 2009).

Figura l. 2. Reducción de las emisiones de C0 2 por la obtención de etanol 3

a partir de biomasa (Modificado de: http://soilcarboncenter.
kstate.edu/originals/Renewable_Energy. htm ).

Figura l. 3. Componentes principales de la lignocelulosa y su proporción 5

aproximada en las maderas (http://www.nrel.gov/features/12
04_biomass_technologies.html) .

Figura l. 4. Molécula de Celulosa (Serrano et al., 2010). 5

Figura l. 5. Estructura de la lignina (Adler, 1977). 7

Figura l. 6. Monómeros primarios de la lignina (alcoholes 8

hidroxicinamilicos) y las correspondientes unidades
estructurales (Higuchi, 1990).

Figura l. 7. Procesos comunes para la obtención del etanol (Modificado 10

de Abengoa Bioenergy, 2007).

Figura l. 8. Estructura química de la amilosa y la amilopectina, los 11

polímeros que conforman el almidón (Timberlake, 2006).

Figura l. 9. Estrategia experimental 17

Figura 11. 1. Modelo de la biomasa lignocelulósica y su ruptura o 26

modificación por diferentes pretratamientos, para liberar la
celulosa de la lignina. (Modificado por Zheng et al., 2009).

Figura 11. 2. Reacciones ocurridas durante la hidrólisis de los materiales 36

lignocelulósicos. (Modificado de Larsson et al. , 1999).

Figura 11. 3. Plátano en rodajas , secado en estufa a 45°C para su 39

posterior molienda y preparación de la harina.

Figura 11. 4. Harinas obtenidas después de la molienda con diámetro 40

aproximado a 2 mm . 1.- Harina de fruto de plátano, 2.- Harina
de pseudotallo

vi
Figura 11. 5. Harinas de plátano sometidos a pretratamiento co n NaOH al 40
3% (izqu ierda) y HCI al 3% (derecha).

Figura 111. 1. Efecto de la degradación de una madera por un hongo de 57

podredumbre suave (http://forestpathology.cfans.umn.edu/
microbes.htm ).

Figura 111. 2. Madera degradada por un hongo de podredumbre café. Estos 58

hongos digieren la celu losa, pero no degradan la lignina,
quedando un co lor café por la lignina oxidada (http://www.fli ckr
com/photos/cornellfung i/149085486).

Figura 111. 3. Fragmento de madera invadido por el hongo Phanerochaete 59

chrysosporíum (hongo de podredumbre blanca) (Thom Volk,
2001 ).

Figura 111. 4. Mecanismo de la hidrólisis enzimática de las celulasas 63

( http:/ /xray.bmc.uu.se/-wimal/projects/research. html ).

Figura 111. 5. Hongo Tríchoderma reeseí visto al microscopio (Karagiosis S., 65

2009).
Figura 111. 6. Cultivo líquido de los hongos lignocelulolíticos en medio PDB 69
para la obtención de biomasa

Figura 111. 7. Producción de los extractos enzimáticos lignocelulolíticos 70

med iante el cu ltivo de los hongos en amortiguador de acetato
adicionado con harina de pseudotallo de plátano

Figura 111. 8. Monitoreo de la enzima Manganeso peroxidasa en extractos 71

enzimáticos

Figura 111. 9. Mon itoreo de la enzima Lignina perox idasa en extractos 72

enzimáticos preparados a partir de cuatro cultivos fúng icos.

Figura 111.10. Monitoreo de la enzima Lacasa en extractos enzimáticos de 73

cuatro cultivos fúng icos.

Figura 111. 11. Mon itoreo de actividad de ce lulasas durante 16 días en los 74
extractos de los diferentes hongos cu ltivados con harina de
pseudotallo como fuente de carbono.

Figura 111. 12. Extractos enzimáticos de ligninasas y celulasas recuperados 75

para la hidrólisis biológica de los desechos de plátano

vii
Figura 111. 13. Harinas de desechos de plátano sometidas a pretratam iento 76
químico y adicionadas con extracto enzimático para su
sacarificación

Figura 111. 14. Monitoreo de los azúcares reductores, liberados durante la 77

sacarificación con los extractos de enzimas ligninocelulolíticas
en la mezcla de harina de plátano y pseudotallo (1:1)
pretratada con 3% HCI y calor

Figura 111. 15. Monitoreo de los azúcares li berados por el pretratamiento 78

alcalino más calor combinado con los diferentes extractos de
enzimas lignocelulolíticas

Figura 111. 16. Mon itoreo de los azúcares liberados durante el pretratamiento 79
ácido-alcalino combinado con los diferentes extractos de
enzimas lignocelulol íticas

Figura 111. 17. Monitoreo de la actividad de celulasas de los hongos 82

autóctonos 13-1 y 13-4 y comparados con Trichoderma reesei

Figura 111. 18. Monitoreo de los azúcares liberados durante la sacarificación 83

de una mezcla de harinas ( 1:1 ), empleando el extracto
enzimático obten ido de cultivos fúngicos de la cepa del hongo
Trichoderma reesei y los hongos autóctonos 13-1 y 13-4 en
medio de Mandels con CMC

Figura IV. 1. Rutas del piruvato en relación a la presencia o ausencia de 96

oxígeno (Modificado de Biosca, 2002).

Figura IV. 2. Imagen al microscopio de la levadura Saccharomyces 99

cerevisiae , responsable de gran parte de las fermentaciones
alcohólicas (vvww.biologia. blogger. com.br/2008).

Figura IV. 3. Curva de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae , A) Fase 100

Lag , B) Fase Loga rítmica , C) Fase estacionaria, D) Fase de
declinación (Mod ificado de Mad igan et al., 2004 ).

Figura IV. 4. Cromatograma de los estándares de azúcares después de ser 108

separados por cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC).

Figura IV. 5. Cromatograma de los azúcares presentes en el hidrol izado de 109

las harinas de plátano después del pretratamiento químico.
viii
Figura IV. 6. Cromatograma de los azúcares liberados en la harina de 109
plátano después del pretratamiento químico y la sacarificación
enzim ática con enzimas de Trichoderma reesei.
Figura IV. 7. Curva de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en 110
hidrolizado de plátano, después del pretratamiento ácido y la
sacarificación.
Figura IV. 8. Fermentación de los hidrolizados de plátano (material 111
lig nocelulósico) usando como inóculo 10% de levadura
Saccharomyces cerevisiae.
Figura IV. 9. Monitoreo de la disminución de los azúcares reductores en los 112
hidrolizados de plátano durante la fermentación con la
levadura Saccharomyces cerevisiae.
Figura IV.10. Monitoreo de los grados Brix durante la fermentación de los 113
hidrolizados.
Figura IV. 11. Concentración de etanol presente en cada una de las 114
fracciones destiladas (Cabeza , cuerpo y cola).

ix
 LISTA DE CUADROS

Cuadro l. 1. Principales cultivos en México por nivel de producción anual 13

Cuadro 11. 1. Métodos de pretratamiento utilizados para aumentar la 28

degradación de los materiales lignocelulósicos en la
producción de etanol

Cuadro 11. 2. Composición química de las fibras de diferentes partes del 37

Plátano
Cuadro 11. 3. Cantidad de azúcares reductores liberados con los 41
pretratamientos físicos y qu ími cos aplicados a las harin as
de pseudotallo y fruto verde de plátano

Cuadro 11. 4. Cantidad de azúcares reductores liberados por los 42

diferentes pretratamientos físicos y qu ímicos sobre
harina de plátano compuesta por fruto y pseudotallo ( 1:1 ).

X
 LISTA DE ABREVIATURAS

~mol micromol
AR Azúcares reductores
ABTS Ácido 2, 2'-azin o-bis-(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico
AV Alcohol veratrílico
cm Centímetros
co2 Dióxido de carbono
Cu Cobre
DNS ácido dinitrosalicílico
etc. Etcétera
Fe Hierro
g Gramos
h Horas
H20 Agua
H20 2 Peróx ido de hidrógeno
k Da Kilodaltons
Km Kilómetro
L Litros
LiP Lignina peroxidasa
mg Miligramos
ml Mililitros
mm Mil ím etros
Mn Manganeso
MnP Peroxidasa dependiente de manganeso
N. D. No determ in ado
nm nanómetro
02 Oxígeno molecular
oc Grados Celsius
pH Potencial de hidrógeno
sp. Especie
Ton Toneladas
U/L Un idades por litro

xi
xii
RESUMEN

En este trabajo , se realizó una evaluación para determ inar la posibilidad de

utilizar los residuos agroindustriales del plátano como materia prima para la
obtención de etanol. Además se consideró para este fin establecer un
pretratam iento rápido , económico, amigable con el medio ambiente y sin
requerimiento de una infraestructura compleja , de manera que pueda ser
llevado a escala Industrial. Para este objetivo se dividió el proceso en tres
etapas: pretratamiento, sacarificación y fermentación . En la primera etapa
se utilizó una mezcla de harinas hecha con diferentes tejidos de la planta de
plátano (pseudotallo y fruto verde) y se le aplicaron diferentes
pretratamientos para determ inar la más alta liberación de azúcares
reductores (AR) . El pretratam iento químico de HC I al 3% y calor húmedo
aplicado durante 15 minutos fue el tratam iento que produjo los mejores
resu ltados dado que liberó 42.41 g/L de azúcares reductores.
En la segunda etapa se llevó a cabo la sacarificación de los hidrolizados de
residuos de plátano. Se realizaron comparaciones entre extractos
enzimáticos provenientes de diferentes hongos y bajo diferentes
condiciones de cultivo. La mejor sacarificación se obtuvo con el extracto
enzimático del hongo Trichoderma reesei cultivado en medio Mandels con
carbox imetilcelulosa como fuente de carbono. Con el extracto de este hongo
se incrementó a 69.4 g/L la cantidad de azúcares reductores .
Se determinó que los únicos carboh idratos liberados durante el
pretratamiento y los productos de la sacarificación de las diferentes harinas
de plátano correspondieron a la manosa y la glucosa.
En la última etapa se realizó la fermentación del hidrolizado de las harinas
de plátano, utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae. La
cuantificación de los azúcares reductores antes y después a la etapa de
fermentación evidenció una fermentación incompleta ya que sólo se
consumió el 27% de los azúcares reductores. La concentración de etanol
obtenida al final del proceso fue 0.822 g/L.

xiii
xiv
ABSTRACT
In this work, an evaluation was conducted to determine the possibility use of
the agro-industrial wastes of banana can be utilized as a raw material to
obtain ethanol. For this purpose, it was considered to establish a fast,
economic cost, environmental friendly pretreatment and without requirement
of a complex infrastructure, so it could be scaled up to industrial exploitation.
For could this objective the process was divided three stages: pretreatment,
saccharification and fermentation .
In the first stage a mixture of flour made with different fractions of the
banana waste (pseudostem and green fruit) was used and different
pretreatments were applied to determine which one released the largest
amount of reducing sugars. The chemical pretreatment with 3% HCI and
humid heat applied for 15 minutes released the largest amount of reducing
sugars ( 42.41 g/L).
In the second stage the saccharification of the banana hydrolysates was
carried out. Comparison of reducing sugars release between enzyme
extracts from different fungi and under different culture conditions were
made. The enzymatic extract of the fungus Trichoderma reesei grown in
Mandels medium with carboxymethylcellulose as carbon source produced
the best saccharification. With this extract, the amount of reducing sugars
increased to 69.4 g/L.
lt was determined that the carbohydrates released during the pretreatment
and the saccharification of the flours were mannose and glucose.
The fermentation of the hydrolizate was the last stage of this work, using the
yeast Saccharomyces cerevisiae. The quantification of the reducing sugars
before and after to the fermentation showed that it fermentation was
incomplete, because it is only consumed 27% of the reducing sugars were
consumed. The ethanol concentration obtained was 0.822 g/L.

XV
xvi
CAPÍTULO l. ANTECEDENTES

l. 1. Petróleo como fuente de energía

La demanda de energía a nivel mundial ha ido incrementando conforme

crece la población y aumenta el desarrollo económico. Actualmente la
fuente de energía más importante es la de los hidrocarburos (petróleo, gas,
carbón), que representan aproximadamente un 88% de toda la energía que
se consume a nivel mundial. Entre estos el petróleo es el más importante,
pues de él depende todo nuestro sistema de transporte y la producción de
derivados petroquímicos (Carroll & Somerville, 2009; Sagar & Kartha, 2007;
Sánchez & Cardona, 2005a).
En el año 2006, a nivel mundial se emplearon cada día 85 millones de
barriles de petróleo y se espera que en el 2015 esta cantidad se incremente
hasta 105 millones.
Para la economía mexicana la exportación de petróleo representa una de
las fuentes de mayor ingreso; aunado a las ventas nacionales que aporta
importantes ganancias al gobierno federa l. Sin embargo, ya que el petróleo
es un recurso natural no renovable su agotamiento ocasionará problemas
tanto económicos como energéticos (Gil & Chacón , 2008). Por ello, se
plantea la necesidad de desarrollar e implementar un plan estratégico en
México , para mantener las reservas de petróleo, al mismo tiempo que se
realice una transición desde la actual dependencia de los hidrocarburos,
hacia combinaciones energéticas diversificadas. La trans ición deberá
realizarse de forma gradual y ordenada, y requiere el aprovechamiento de
diferentes fuentes de energía. Entre las energías alternas podemos
encontrar la energía obtenida de la biomasa, la energía hidráulica, la eólica,
la nuclear y la energía solar (Sánchez & Cardona, 2005a) (Figura l. 1. ). Los
recursos renovables son una opción para producir combustibles alternos
capaces de aportar la energía necesaria, aunque por el momento solo
cubren una pequeña parte de nuestros requerimientos energéticos (CIE,
2007; Demain, 2009).

1
Figura l. 1. Porcentaje de aportación de cada fuente de energía en el total
del consumo mundial (Modificado de Ladanai & Vinterback, 2009).

l. 1. 2. Biomasa

Se considera que es una fuente renovable de energía porque su aporte

inicial proviene del Sol y la fijación del dióxido de carbono (C0 2 ). A través
del proceso de fotos íntesis, la clorofila de las plantas captura la energía
lumín ica proveniente del sol, y convierte el C0 2 del aire y el agua en
carboh idratos, para formar la materia orgánica . Cuando estos carbohidratos
se queman, regresan a dióxido de carbono y agua, liberando la energía que
contienen (Figura l. 2.). De esta forma , la biomasa funciona como una
especie de batería que almacena la energía solar en forma sostenida
indefinidamente.
La disponibilidad de la biomasa varía de región a región , de acuerdo con el
clima , el tipo de suelo, la geografía, la densidad de la población , las
actividades productivas , etc. La infraestructura, manejo y reco lección de
esta fuente energética deben adaptarse a las condiciones específicas de
cada localidad .

2
 El dloxido d~ C..tbono H
rf:ddado por las plantas "'' t.MS4W
durant~ su d~sarrollo. cri.lnt,n •• trdnsf rm• en
[t

U biomasa que c.ont~ne

c:.rbono e-s procesada •
biocombustible-

Ef dio•ido de Cetbono es liberedo

mn 1il quema d~l eombust.ible.

Figura l. 2. Reducción de las emisiones de C0 2 por la obtención de etanol

a partir de biomasa (Modificado de: http://soilcarboncenter. k-state.
eduloriginals!Renewable _Energy.htm).

Dependiendo de su origen , la biomasa lignocelulósica se puede clas ificar

en:

-Biomasa natural, producida en los ecosistemas naturales. Es una de las

principales fuentes energéticas en los países en vías de desarrollo, no es la
más adecuada para un aprovechamiento energético masivo, ya que puede
originar una rápida degradación de los ecosistemas.

-Biomasa cultivada, para la producción de energ ía alterna se ha empleado

biomasa cultivada con el propósito específico de producir energía: térmica ,
eléctrica o mediante su transformación en biocombustibles.
Existe una amplia variedad de cultivos alimenticios que se consideran
cultivos energéticos. Esto causa fuerte controvers ia ya que se plantea la
cuestión del impacto de la producción de biocombustibles en la
disponibilidad y el acceso a los alimentos. Aparte del aumento de precios
por el uso de estos productos para fines no alimentarios, la mayoría de ellos
requ ieren de una gran cantidad de energía para su plantación y cuidado
anual, ya que implican requerimientos de suelo, fertilizantes, agua para su
3
riego, además del costo de la materia prima (Goldemberg, 2007; Ranalli &
Di Candilo, 2007; Wyman, 1999).
La implementación de sistemas de fumigaciones intensivas y de abono de la
tierra , trae como efecto negativo la contam inación tanto para el suelo como
para las aguas subterráneas y superficiales (Bond & Ferrara, 2007; Galbe &
Zachi, 2002). Existen cultivos como el sorgo dulce y el Panicum virgatum
una variedad de pastos que se siembran sólo con el fin de emplearlos para
la producción de etanol, sin embargo mantienen la problemática del uso de
suelos y agua.

-Biomasa residual, a nive l mundial se producen anualmente unos 140

billones de toneladas de estos residuos que a menudo son desechados en
los procesos productivos de los sectores agrícola , forestal , industrial y
domésticos (residuos urbanos) (UNEP, 2009). Los residuos agríco las
proceden de los cu ltivos leñosos y herbáceos, destacándose los producidos
en los cereales (trigo, arroz, cebada , etc.). También se deben inclu ir dentro
de estos residuos los generados del acondicionamiento y selección de los
frutos cosechados. Por su parte, los de origen foresta l proceden de los
tratamientos silvícolas de mejora y manten imiento de las masas forestales,
y los generados en el procesamiento de la industria de la madera. Además
se puede considerar dentro de la biomasa residual la fracción orgánica de
los residuos domésticos e industriales, los cua les tienen va lor económico
en el contexto en que se generan, y suelen provocar problemas para su
gestión y eliminación final (Sagar & Kartha, 2007; Claassen et al., 1999;
Hahn-Hagerdal et al., 2006).

l. 1. 2. 1. Estructura química de la lignocelulosa

Las plantas han desarrol lado mecanismos de resistencia que les confiere
protección contra microorgan ismos, insectos y condiciones ambientales
donde se desarrollan . Estas ca racterísticas hacen reca lcitrante la biomasa
lignocelulósica dificultando la liberación de los azúcares que la conforman.
Está formada por tres pol ímeros principales, que son: la ce lulosa , la
hemicelulosa y la lignina además de otros componentes minoritarios. Siendo
la lignina la que protege a los ca rboh idratos fácilmente degradables
(celulosa amorfa y hem ice lulosa ) (Hüttermann et al., 2001 ; Solomón et al;
2007) (Figura l. 3. ).

4
Figura l. 3. Componentes principales de la lignocelulosa y su proporción
aproximada en las maderas (http:llwww.nrel.gov/features/12-
04_ biomass_ technologies.html) .

-Celulosa
Forma parte de las paredes de las célu las vegetales, está constituida por
cadenas lineales de O-glucosa unidas por enlaces glucosídicos ~-(1-4). El
número de monómeros de glucosa que forman una molécula de celulosa ,
puede oscilar entre 50 y 15,000 (Angenent, 2007) (Figura l. 4.).

Celulosa

Figura l. 4. Molécula de Celulosa (Serrano et al., 2010).

Las cadenas de celulosa se unen formando microfibrillas, en las que las

moléculas de celulosa se disponen en forma antiparalela. A su vez, varias
microfibrillas se agrupan en fibrillas, la c1:.1al da origen a las fibras de
celulosa. Esta estructura se mantiene unida por un elevado número de
puentes de hidrógeno y de interacciones de fuerzas de Van der Waals . Esta
conformación la hacen insoluble y resistente al ataque químico (Cunha &
Gandini, 201 0).

S
El modelo propuesto para explicar la estructura de la celulosa muestra
regiones cristalinas, con alto grado de ordenación, que se alternan con
regiones amorfas, menos ordenadas (Philippidis & Hatzis, 1997). Por lo
anterior las investigaciones están enfocadas en optimizar las técn icas de
degradación de la celulosa para emplearla en múltiples productos (Knauf &
Moniruzzaman , 2004).

-Hemicelulosa
La hemicelulosa es el segundo polisacárido más abundante en la
naturaleza. Tiene una estructura heterogénea constituida por azúcares,
siendo los principales hexosas (O-glucosa, L-galactosa, D-manosa),
pentosas (D-xilosa, L-arabinosa) y azúcares ácidos (a-D-glucorónico y a-D-
galacturónico); también existen otros azúcares como la a-L-ramnosa y a-L-
fucosa , que pueden encontrarse en pequeñas cantidades. Todos éstos
componentes se encuentran en proporción distinta en cada planta (Hendriks
& Zeeman, 2009).
La hemicelulosa está conformada de polímeros cortos y en general
ramificados, incapaces de agregarse, y por tanto, susceptibles de hincharse,
dispersarse fácilmente en agua por lo que resulta más fácil de hidrolizar que
la celulosa. Su función principal en la pared vegetal es la de unir la celulosa
y la lignina. Con base al grado de polimerización y el tipo de sustituyentes
que las conforman , se han identificado dos tipos de hem icelulosa: en las
maderas duras existe mayormente en forma de xilanos, mientras que las
maderas suaves contienen principalmente glucomanano. Las moléculas de
hemicelulosa se encuentran altamente entrecruzadas mediante puentes
diferúlicos, formando una red donde se encuentran embebidas las
microfibrillas de celulosa , al mismo tiempo que las proteínas de la pared
celular también forman puentes con el ácido ferúlico, dando resistencia e
insolubilidad a toda la estructura (Martínez et al., 2005; Saha, 2003). La
solubilidad en agua de los diferentes componentes de la hemicelulosa se
encuentran en el siguiente orden descendente: manosa, xilosa , glucosa,
arabinosa y galactosa; la solubilidad se incrementa conforme aumenta la
temperatura. La solubilización de los componentes de la hemicelulosa inicia
entre los 150 y 180°C bajo condiciones de pH neutro (Hendriks & Zeeman,
2009; Garrote et al. , 1999).

-Lignina
Es la forma más abundante de material aromático en la biósfera; su
descomposición es indispensable para el reciclamiento de carbono vegetal.
La palabra lignina proviene del latín "lignum" que significa madera (Áivarez
et al., 2007).

6
La lignina está formada por la deshidrogenación enzimática de alcoholes
derivados del fenilpropano, seguida por una polimerización no controlada, lo
que hace que la lignina no tenga una estructura definida, ni siquiera en una
misma especie vegetal (Figura l. 5.). La lignina de gimnospermas (maderas
blandas), está formada principalmente por unidades de tipo guayacilo,
mientras que la lignina de las angiospermas leñosas (maderas duras) está
formada por unidades guayacilo y siringilo. Esta alta proporción de unidades
derivadas del alcohol sinapílico en las maderas duras determina la
estructura y características de este tipo de lignina. El contenido de lignina es
más alto, en los árboles que en los pastizales (Ohkuma et al., 2001 ;
Houghton et al., 2008; Wyman, 2003).

Figura l. 5. Estructura de la lignina (Adler, 1977).

Los tres alcoholes precursores que conforman la lignina son el alcohol p-

hidroxicinamílico (cumarílico), el alcohol 4-hidroxi-3-metoxicinamílico
(coniferílico ) y el alcohol 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinamílico (Hüttermann et al.,
2001 ; Kirk & Farrell, 1987) (Figura l. 6.). Sus características estructurales
imponen restricciones para su biodegradación. Considerando que una
molécula de lignina tiene un peso molecular de 600-1000 kilodaltones (kDa),
es evidente que su tamaño impide poder ser degradada intracelularmente.
Además, por el tipo de enlaces covalentes que presenta (aril-éter, aril-aril y

7
carbono-carbono) y su heterogeneidad , no puede ser degradado por
mecanismos típicos de hidrólisis (Angenent, 2007; Kirk & Ferrell, 1987).
OH OH OH

OH OH OH

Alcohol p-cumarílico Alcohol coniferílico Alcohol sinapílico

Unidades estructurales correspondientes

Unidad p-hidroxifenilo Unidad guayacilo Unidad siringilo

Figura l. 6. Monómeros primarios de la lignina (alcoholes hidroxicinamilicos)

y /as correspondientes unidades estructurales (Higuchi, 1990).

La madera y otros tej idos vascu lares contienen alrededor del 20-30% de
lignina. Como se mencionó anteriormente, este compuesto provee de
rigidez a las plantas superiores, ya que actúa como pegamento entre las
fibras de celulosa, formando la lámina media, proporciona protección física
contra patógenos y permite el transporte de agua por el xilema. La estrecha
unión de la lign ina al armazón vegetal se considera como el principal
im pedimento para la hidrólisis de la celulosa , de la que sólo se le consigue
separar mediante pretratam ientos (Himmel et al., 2007).

-Extraíbles y cenizas
Los "extraíbles", son compuestos orgánicos que pueden ser extraídos con
agua , disolventes orgánicos neutros o vapor.
La composición y concentración de los extra íbles varía ampliamente de
acuerdo con la especie, la localización geográfica, la estación del año y aún

8
dentro de la misma planta. Están presentes en la corteza, hojas, agujas,
exudados, ramas, flores, frutos y semillas.
Entre los extraíbles hay una gran variedad de grasas, ceras , alcaloides,
proteínas, fenoles simples y complejos , azúcares simples, pectinas,
mucílagos, gomas, resinas , terpenos, etc, que aunque no forman parte de la
estructura de la pared vegetal representan entre el 4-1 0% del peso seco de
la madera. Actúan como intermediarios metabólicos, reserva de energía o
parte de los mecanismos de defensa contra los ataques microbianos.
Contribuyen al color, olor y resistencia de las plantas al marchitamiento.
Las cenizas son residuos inorgánicos que permanecen después de quemar
la biomasa a altas temperaturas ; suelen ser menos del 2% del peso seco de
la madera (Aguilar, 2004).

l. 1. 2. 2. Usos de la biomasa lignocelulósica

Por su potencial energético ha sido aprovechada desde tiempos remotos

por numerosos organismos, lo que ha llamado la atención de los
biotecnólogos que estudian procedimientos para utilizarla (Galbe & Zacchi,
2007).
A partir de la crisis del petróleo de los años 70 el estudio de la hidrólisis de
la celulosa pasó a ser una línea de investigación prioritaria en países como
los Estados Unidos, Canadá, Reino Unido (Bai et al., 2008; Slade et al.,
2009). El interés de los gobiernos en el financiamiento de esta línea de
investigación decreció en los años 80; sin embargo, el empeño de
microbiólogos, bioquímicos y genetistas por resolver las incógnitas
planteadas ha permitido continuar con el proyecto de aprovecharla de
diferentes formas.
Entre los principales productos que pueden obtenerse o recuperarse de la
biomasa lignocelulósica se encuentran los azúcares fermentables , enzimas,
furfurales, fenoles, metabolitos secundarios, fertilizantes y biocombustibles .

l. 1. 3. Fuentes alternas de materia prima para la obtención del etanol

El etanol combustible puede provenir de diferentes fuentes de materia

prima, (Figura l. 7.):

• Azúcares monoméricos o diméricos

• Almidones
• Celulosa y hemicelulosa

9
Figura l. 7. Procesos comunes para la obtención del etanol (Modificado de
Abengoa Bioenergy, 2007).

-Azúcares monoméricos o diméricos

La biomasa que contiene azúcares monoméricos o diméricos (disacáridos)
puede fermentarse directamente a etanol siendo su proceso el menos
complicado para la producción del etanol. En este proceso las materias
primas más comunes son la remolacha y la caña de azúcar. Para su
fermentación se emplean microorganismos que consumen los azúcares, y
en el proceso producen etanol y otros subproductos (Goldemberg, 2007 ).

El único país en que el etanol proven iente de la caña tiene precios

competitivos con los del petróleo es Brasil. Esto se log ró ya que el precio de
la materia prima es barato en comparación con otros países, debido a que
emplea distintas variedades de caña que se han desarrollado fácilmente por
las características de sus tierras cultivables y su clima (Lynd et al. , 2005).
Desde hace más de treinta años Brasil ha desarrollado una extensa
industria doméstica de etanol como combustible, produciendo
aproximadamente 15 millones de m3 de etanol por año. Con base a la EIA
(Energy lnformation Adm inistration) la producción de etanol en el Brasil para
el 2009, fue de 450,000 barriles por día y se irá incrementando con base en
las crecientes necesidades como combustible alterno. En el 201 O la
cosecha de caña de azúcar fue de 625 millones de toneladas, el 53% se
destinó a la producción de etanol, con un rendimiento de 27,7 millones de
litros del biocombustible.

-Almidón
Es un polímero cuya estructura consiste en moléculas de glucosa en forma
de dos compuestos, la amilosa y la amilopectina encadenadas por uniones
a-glucos ídicas. Estos acoplam ientos ocurren v ía enlaces a-1 ,4 con
ram ificaciones vía en laces a-1, 6. (Keel ing & Myers, 2010). El almidón es
10
una importante fuente de almacenamiento de energía en las plantas en
forma de gránulos semicristalinos por lo que se debe procesar para obtener
el azúcar simple. Entre los cultivos más empleados para la obtención de
almidón se encuentran el maíz, la papa, la yuca , entre otros (Sánchez &
Cardona, 2005b; Vázquez & Dacosta, 2007) (Figura l. 8.).
La mayor parte del etanol que es utilizado como combustible en los Estados
Unidos proviene del almidón de maíz. Su producción se triplicó en cinco
años, pasó de 2,8 billones de galones en el 2003 a 9 bi llones de galones en
el2008 (Chen et al., 2007; Tao & Anden , 2009).
Existen dos tipos generales de tratam iento para la obtención del etanol a
partir de maíz: por medio de una mol ienda húmeda o molienda en seco; La
diferencia entre los dos procesos se observa al inicio del procesamiento. De
acuerdo al reporte de los Laboratorios Nacionales de Energía Renovable
(NREL, siglas en ingles), el 80% del etanol producido en los Estados Un idos
se obtiene por el método de molienda seca (Arora et al., 2008).

Amllosa
(20%)

Un iones
glucosldlcas
Unión glucosldica P·1,6.
Unión glucosldlca a-1,4 a -1.4

OH OH OH OH
(•) Cadena de omllosa 11>) Cadena de am llopectlna
. . -
Figura l. 8. Estructura química de la ami/osa y la amilopectina, /os
polímeros que conforman el almidón (Timber/ake, 2006).

-Compuestos lignocelulósicos
Algunos ejemplos de materiales celu lósicos son: papel, cartón , maderas y
los residuos agrícolas como son bagazos de caña de azúcar, maíz, paja del
trigo y cascari lla de arroz (Sánchez & Cardona, 2005b).
Al considerar el etanollignocelulósico también debe considerarse que por la
estructura de la biomasa lignocelulósica se requiere un paso adicional para
liberar los azúcares que contiene. Este paso es el pretratamiento el cual

11
perm itirá abrir la estructura para la posterior hidrólisis. Los carbohidratos
provenientes de este material son una mezcla de azúcares de 5 y 6
carbonos por lo que también se requieren cambios en la fermentación.
El conocim iento de la estructura y compos ición de la biomasa
lignocelulósica y los subproductos generados por los pretratamientos
perm itirá optimizar el proceso de obtención del etanol. Además ayudará a la
generación de nuevos sistemas para aumentar rend imientos, disminuir
costos de producción y emplear métodos menos dañinos para el ambiente
(Farrell et al. , 2006; Masera et al. , 2005; Wyman , 2003). El aprovechamiento
de la biomasa lignocelulósica aún requiere de inversión para real izar
investigaciones que conduzcan hacia el establecim iento de procesos
eficientes de extracción.

l. 1. 4. Etanol a partir de materiales celulósico

Es obtenido a partir de la fermentación de los azúcares que se encuentran

en la biomasa celu losica . Estos se encuentran en formas simples o
formando polímeros más complejos como la celulosa y la hem icelulosa de
las plantas los cuales al ser fermentados generan el alcohol que luego es
recuperado por destilación, con un conten ido aproximado del 5% de agua.
Generalmente las mezclas de etanol (anhidro) con la gasolina se emplean
en concentraciones del 5 o 10%, identificadas como E5 y E1O
respectivamente. Una ventaja de estas mezclas es que pueden utilizarse sin
requerir modificaciones de los motores existentes (Hahn-Hagerdal et al.,
2006; Goldemberg, 2007; Guevara & Zambrano, 2006).
Se ha propuesto que el etanol celulósico puede llegar a reducir las
emisiones de gases hasta un 80% (comparado con la gasolina), mientras
que con el etanol proven iente del maíz la reducción es sólo de 20 a 30%
(Demirbas, 2005).

En estos momentos, al no tene r un proceso completamente eficiente, el

etanol celulósico se considera un combustible más costoso que la gasolina,
pero tiene la gran ventaja de ser un agente oxigenante lo que permite
elim inar al metil terbutil éter (MTBE) empleado actualmente (Solomón et al. ,
2007). El reporte del Instituto Mexicano del Petróleo señala que se
obtuvieron resultados satisfactorios y en consecuencia se ha cons iderado la
incorporación de etanol en las gasolinas de la zona metropol itana de
Guadalajara como oxigenante para el 201 1, por lo que se estima que serán
necesarios 176 millones de litros, para ser mezclados con las gasolinas
comercia lizadas. En otra etapa (2012) se introducirá el etanol como
oxigenante en las zonas metropolitanas de Monterrey y del Va lle de México
estimándose una demanda de 626 millones de litros de etanol (España-
Gamboa, 2010; SENER, 2006).

12
l. 1. 5. Cultivos de importancia en México

México tiene una variedad de cultivos importantes y en grandes volúmenes

(Cuadro l. 1.), que pueden ser empleados como fuentes de biomasa para la
producción de etanol.

Cuadro l. 1. Princi ales cultivos en México por nivel de producción anual.

Cultivo Producción Anual* (Ton)

Caña de Azúcar
Maíz (Mazorca)
'="-

~~
Naranja
Plátano 2,167,613

I=:;
A...,
v ...
e=na
= fo=r=ra=j =
e r=a.................========--..,12,"'"5 48 ,658 -==11--~
Trigo 3,918,395 ·.
Fuente: Guillen , 2005, SAGARPA, 2009 ~--=====-
Uno de los cu ltivos más empleados para producir etanol es el maíz, sin
embargo, los desechos de éste ya son empleados para alimento de ganado.
Por lo que para no afectar econom ías establecidas deben utilizarse
materiales a los que no se les ha dado ninguna utilidad y que son
desechados. En este contexto el presente trabajo está considerando
aprovechar los desechos agroindustriales de plátano, ya que mientras que
en México todavía no tienen una aplicación .

l. 1. 6. Cultivo de plátano

Uno de los cultivos más importantes en la agricultura mexicana es el

plátano. Además ocupa el cuarto lugar de importancia a nivel mundial
después del arroz, trigo y maíz y se considera que es el primer lugar de las
frutas tropica les, no sólo en México sino también a nivel mundial (Palencia
et al., 2006). Es considerado como una de las frutas básicas en la
alimentación humana, debido a su bajo precio, a la sensación de saciedad
que produce, así como por el elevado valor nutritivo, rico en potasio y
magnesio, pobre en sodio, tiene también hierro, betacaroteno y vitaminas
del grupo B. La disponibilidad del producto durante todo el año es otra
ventaja, ya que perm ite que esté presente en la mayoría de los mercados.
En México se cu ltiva en 18 entidades, destacándose dos de ellas como
principales abastecedoras del mercado nacional y de exportación , Ch iapas
y Tabasco. El mejoramiento en las técnicas de producción , así como el
manejo postcosecha en estas reg iones, han perm itido que el producto
13
mexicano incursione en el mercado internacional (Arias et al., 2004). La
mayoría de los residuos agroindustriales producidos por el cultivo del
plátano son acumulados en los plantíos, cerca de ríos o a orill as de los
caminos, lo cual llega a ocasiona r serios problemas al medio ambiente
como son los malos olores, fauna nociva y contam inación de mantos
acuíferos, por lo que en años recientes se ha tenido un interés importante
en darle un uso (Rosa les et al., 2002; Belewu & Belewu, 2005). Los
desechos de plátano se consideran como una buena fuente de materia
prima para la obtención de energía porque sus volúmenes de producción
son importantes (aproximadamente 2.2 millones de toneladas al año)
(SAGARPA, 2009).

Aunque no está clasificado como un cultivo energético, los residuos del

plátano pueden llamarse residuos energéticos, con base en su composición
química. Además, presenta la ventaja de ser un buen material para el
desarrollo de microorganismos lignocelulolíticos (Belewu & Belewu , 2005);
lo que sugiere que sea un material que se puede adaptar a la producción
biológica del alcohol (Joshi, 2001 ; Khal il et al. , 2006; Oliveira et al., 2007).

14
1.1. 7. JUSTIFICACIÓN

El petróleo es una fuente de energ ía no renovable cuyas reservas han

disminuido de forma importante en los últimos años. Por ello se buscan
fuentes de energías alternas para sustituirlo. El etanol ce lulósico se
considera como un combustible alterno que puede ayudar a disminuir el
consumo de la gasoli na. Su obtención a partir del maíz y la caña genera
conflictos por desviar estos del área alimentaria. Una opción prometedora
es la producción de combustible a partir de biomasa lignocelulósica res idual.
Los residuos agroindustriales del cultivo de plátano pueden ser
cons iderados como una buena fuente de materia prima para la obtención de
etano l, ya que su disponibilidad es alta al ser uno de los productos agríco las
más importantes del pa ís. De la planta de plátano sólo se aprovecha cerca
del 20% (fruto) y lo demás se desecha. Si se emplean los desechos
postcosecha para la producción de etanol, se eliminaría la necesidad de
inversión para obtener la materia prima, a la vez que se contribuiría a la
li mpieza de las plantaciones y se le daría un va lor agregado a estos
materiales. Como estrategia integral se propone el uso de hongos aislados
de las propias zonas productoras del cultivo , lo que favorecerá el
establecimiento de un proceso biológ ico ecoam igable para la producción de
etanol. Estos organ ismos permitirán emplear tratam ientos químicos y físicos
menos fuertes para la degradación de la lignina y la sacarificación.

15
l. 1. 8. HIPÓTESIS

Los hongos lignocelulolíticos pueden generar las enzimas necesarias para

sacarificar los residuos generados de la postcosecha del fruto del plátano
(pseudotallo, fruto verde ) permitiendo que sea utilizada como materia prima
para la obtención de etanol.

l. 1. 9. OBJETIVOS
l. 1. 9. 1. Objetivo General

Evaluar el potencial de los residuos de plátano para la obtención de etanol,

mediante un pretratamiento químico, sacarificando con enzimas
lignocelulolíticas tanto de hongos modelos como de hongos
lignocelulolíticos aislados de plantaciones del estado de Tabasco y
fermentando con Saccharomyces cerevisiae.

l. 1. 9. 2. Objetivos Particulares

-Establecer un pretratamiento físico o qu1m1co de los desechos

agroindustriales de plátano, que sea compatible con la sacarificación .

-Establecer la sacarificación biológica con hongos lignocelulolíticos modelo.

-Generar azúcares reductores de la degradación de desechos de plátano

empleando hongos aislado de una plantación de plátano y seleccionados
por su actividad lignocelulolítica.

-Fermentar los azúcares generados de la hidrólisis de desechos de plátano

y destilar el alcohol producido.

16
1.1. 10. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

nA ,~~:trAn de residuos de

plátano en plantaciones de
Teapa,

Pretratamientos físico-,
químicos de las harinas

ración de
extractos

Figura 1. 9. Etapas propuestas para la obtención de etanol a partir de los

residuos de plátano.

17
l. 1. 11. REFERENCIAS

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23
24
CAPÍTULO 11. PRETRATAMIENTOS

11. 1. Introducción

El etanol se considera como una de las fuentes de energías renovables más

importantes en términos de volumen y valor en el mercado. En el año 2008
aproximadamente el 90% de la producción mundial de etanol provino de dos
países, Brasil y los Estados Unidos de América , siendo este último el mayor
proveedor de este combustible. En Brasil, el etanol es producido a partir del
jugo de la caña de azúcar, mientras que en los Estados Unidos la principal
materia prima es el maíz (Goldemberg, 2007; Zheng et al. , 2007). El uso de
estas materias primas ha creado una gran controversia en el efecto que
puede causar emplearlas para la producción de etanol y no para el consumo
alimenticio. Por lo que se busca para este fin materias primas que no
afecten al sector alimentario.

El incremento de la producción de residuos se considera como una

consecuencia del crecimiento de la sociedad humana. Estos materiales
pueden provenir de diferentes fuentes como son el sector agrícola , el
industrial , el forestal y el urbano. Debido a la acumulación de estos residuos
se generan problemas ambientales y de salud pública. Por ello actualmente
se busca la manera para poder aprovecharlos de forma integral de modo
que no se acumulen, que tengan una aplicación y a la vez, puedan seNir
como fuente de ingresos (Sharma, 2007; Farrell, 2006). Una opción para
emplearlos es en la generación de etanol.

Para obtener los azúcares contenidos en los residuos vegetales se requiere

primero modificar la unión lignina-carbohidratos. Para ello, se han
establecido pretratamientos que eliminan o modifican la estructura química
de la lignina, de esta forma se liberan sus azúcares (Himmel et al., 2007;
Galbe & Zacchi, 2007).

El pretratamiento generalmente se refiere a la ruptura de la resistencia

natural que hay en la unión carboh idratos-lignina, la cual limita la
accesibilidad de las enzimas a la celulosa y a la hemicelulosa. No sólo es
costoso por sí mismo, sino también por su impacto en la etapa de
sacarificación, tratamiento de residuos y producción potencial de
subproductos (Yang & Wyman , 2008).

Se considera que el pretratam iento es aproximadamente el 18% de la

inversión total del proceso , por lo que al elegirse debe evaluarse el costo
que implica, los rendimientos obtenidos de azúcares, así como la cantidad
de inhibidores generados. Además debe considerarse que no todos los
pretratamientos son los indicados para los residuos lignocelulósicos, ya que
25
dependiendo de la composJcJon del material se requieren cond iciones
particulares (Yang & Wyman, 2008).

11. 2. Pretratamientos de los materiales lignocelulósicos

Se refiere a la solubilización de uno o más de los cuatro principales

componentes de la biomasa: hemicelulosa, celulosa, lignina y extraíbles, de
forma que sea más accesible para los posteriores tratamientos biológicos y
así poder liberar los azúcares fermentables (Ciaassen , 1999; Moredo et al.,
2003; Taniguchi et al., 2005).

Mediante los pretratamientos, la hidrólisis se lleva a cabo de manera

completa o parcial. Para lograr la mayor liberación de azúcares, los
materiales lignocelulósicos son pretratados con uno (Figura 11. 1.) o
combinación de varios métodos (Ciaassen, 1999; Yang & Wyman, 2008).
HEMICELULOSA
BIOMASA LIGNOCELULÓSJCA

LIGNINA
/ CELULOSA

OUIMICO FISICO BIOLÓGICO

Figura 11. 1. Modelo de la biomasa /ignocelulósica y su ruptura por

diferentes pretratamientos, para liberar la celulosa de la /ignina (Modificado
por Zheng et al., 2009).

Los pretratamientos tienen los siguientes objetivos:

• Reducir la cristalinidad de la celulosa.

• Disociar el complejo lignina-celulosa.
• Aumentar el área superficial de la fibra de celulosa.
26
 • Dism inuir en la medida de lo posible la presencia de inhibidores (por
ejemplo furanos, compuestos fenólicos, ácido glucorónico) que
dificultan el proceso.

Para que un pretratamiento se considere eficaz debe tener las siguientes

características: bajo consumo energético, bajo mantenimiento, utilización de
reactivos baratos y fácilmente recuperables, y la posibilidad de su aplicación
sobre diversos sustratos (Kumar et al., 2009; Yang & Wyman, 2008).
Se han descrito numerosos pretratamientos para los diferentes materiales
lignocelulósicos, siendo algunos de ell os muy eficaces con respecto al
incremento del rendimiento de hidrólisis enzimática. Sin embargo, no todos
son aplicables a escala industrial, debido a los altos costos o las dificultades
técnicas que conllevan (Taherzadeh & Karimi, 2008).
Por su naturaleza, los pretratamientos se clasifican en tres grupos
generales: físicos, quím icos y biológicos. La evaluación de la efectividad de
los mismos se hace con base en el rendimiento de la hidrólisis del material
pretratado (Stuhler & Wyman, 2003). En función del pretratamiento se
determinan experimentalmente las condiciones óptimas de operación para
cada caso. A continuación se describen brevemente algunos de los
pretratamientos más estudiados (Cuadro 11. 1. ).

27
Cuadro 11. 1. Métodos de pretratamiento utilizados para aumentar la
degradación de los materiales lignoce lulósicos en la producción de etanol.

Métodos Procedimientos Sustrato 1 Referencias

Pretratamlentos físicos
Pulverizado Reducción a astillas , Residuos de madera, paja , S un & Cheng ,
mecánico trituración , molienda. cáscaras de trigo , maiz, 2002
arroz, alfalfa, plátano.
Piró lisis Temperatura mayor a los Madera Yueta/.,
300 ' C. 1984
Pretratamlentos físiCO-Qulmlcos
Explosión con Vapor saturado a 160- Bagazo , madera , cáscara S un & Cheng,
vapor 280'C, aplicación durante de plátano. 2002,
segundos o minutos para S harma et al. ,
después realizar una 2007
rápida despresurización.
Explosión de 1-2 kg de amoniaco/kg de Cáscara de arroz, astillas de Lynd eta/.,
fibra con biomasa seca . A 90' C por álamo , bagazo . 2005
amoniaco 30 min.
Pretratamientos qu/mlcos
Hidrólisis ácida Los más empleados son Pastos, desechos de maiz, Telli & Eken,
H:¡S04, HCI, HN03, a residuos de plátano , 2006, Ferrer
diferentes semillas de girasol, bagazo . eta/., 2002
concentraciones y
temperaturas .
Hidrólisis alcalina Generalmente se emplean Bagazo , cáscara de maiz y Chen eta/.,
Na OH o Ca (OHh plátano. 2008
Pretratamlento biológico
Enzimas Enzimas de hongos de Paja de trigo, cáscara de Baig eta/.,
lignoceluloliticas pudrición blanca , café o arroz, de ma iz , residuos de 2004, Sharma
suave o bien enzimas de plátano. etal. , 2007,
algunas bacterias. Keller et al.,
2003

28
11. 2. 1. Pretratamientos físicos
Los pretratamientos físicos consisten en cortar, moler, prensar, radiar a
altos niveles de energía o someter a presión el material lignocelulósico. La
finalidad es reducir la biomasa a pequeñas partículas, para incrementar el
área de superficie para ,el ataque enzimático. Aun cuando implica un alto
costo económico y energético, se considera indispensable para un efecto
eficiente de la siguiente etapa del proceso (Gañan , 2004; Yang & Wyman,
2008).

• Trituración mecánica
La trituración de los materiales lignocelulósicos mediante una combinación
de astillado y molienda, reduce el estado cristalino de la celulosa, aumenta
la superficie específica y la densidad aparente, facilitando la hidrólisis
posterior. Existen diferentes tipos de moliendas donde emplean diferentes
instrumentos tales como molinos de bolas, martillos, cuchillas y rodillos . Los
molinos de bolas vibratorias han mostrado ser más efectivos que los
molinos de bolas ordinarios en la reducción de la cristalinidad y el aumento
de la cantidad de azúcares libres (lnoue et al., 2008; Mais et al., 2002).

• Radiación con alta energía

Mediante esta técnica se logran romper los enlaces ~-glucosídicos y los
enlaces entre la celulosa y la lignina. La celulosa del material lignocelulósico
puede ser degradada en frágiles fibras y oligosacáridos de bajo peso
molecular y en moléculas de celobiosa (Zhu et al. , 2006). Entre estos
métodos se encuentran la radiación con rayos y, ultrasonido, rad iación con
UV o calentamiento con microondas (Nitayavardhana et al., 2008; Saha et
al., 2008; Youssef & Aziz, 1999). Sin embargo, este tipo de pretratamiento
es de difícil aplicación técnica debido a la baja densidad de los materiales a
tratar, y las altas dosis requeridas, que obligan al diseño de instalaciones
muy complejas y de alto costo, lo que lo hace un proceso difícil para ser
llevado a nivel industrial (Betiku et al., 2010; Yang et al. , 2008).
Los pretratamientos físico-mecánicos incrementan la eficiencia de la
solubilidad y la fermentación de los res iduos lignocelulósicos, de manera
que permite su utilización y les da un mayor valor económico (Philippidis &
Hatzis, 1997).

l. 2. 2. Pretratamientos físico-químicos
Dependiendo del material lignocelulósico que se va procesar, en ocasiones
se requiere la combinación de sistemas de pretratamientos físicos y
químicos que permitan disolver la hemicelulosa y alterar la estructura de la
lignina, dejando accesible a la celulosa para la acción de las enzimas
hidrolíticas. Los principales pretratamientos físico-químicos incluyen la
explosión con vapor, con vapor de amoniaco (AFEX) y con C0 2 . En estos
procesos la biomasa molida es tratada con alta presión y luego se
29
despresuriza rápidamente , sufriendo el material lignocelulósico una
explosión por la descompresión (Hendriks & Zeeman , 2009).

• Explosión con vapor

En este pretratamiento el material lignocelulósico se somete a temperaturas
entre 190-230 °C, por medio de la inyección directa de vapor saturado,
durante un intervalo de tiempo entre 1 y 1O minutos, para después
someterse a una rápida pérdida de presión. El efecto del pretratamiento
sobre la biomasa es una combinación de alteraciones fís icas
(desagregación y ruptura de las fibras) , y quím icas (despoli merización y
ruptura de enlaces). El efecto mecánico es causado cuando la
despresurización provoca una evaporación del agua interna, creando
fuerzas que producen la separación de las fibras , principalmente de las
reg iones más débiles (celulosa amorfa ). Durante el tratamiento se destruyen
parcialmente los enlaces lignina-carboh idratos. Como resultado, se obtiene
un producto fibroso cuya celulosa es más accesible a la hidrólisis
enzimática. La hem icelulosa se despolimeriza en mayor o menor medida,
dependiendo de las condiciones del tratamiento , siendo fácilmente
recuperada por lavado. Este pretratamiento puede causar tanto
polimerización como despolimerización de la lignina, depend iendo del
tiempo de exposición (Li et al., 2007; Samuel et al., 2010). Considerando
que aun cuando presenta alteraciones en conformación, son pocas las
pérdidas en cantidad de lignina, por lo que puede ser extraída y uti lizada
con diferentes fines. Las variables más importantes en el pretratam iento de
explosión con vapor son la temperatura , el tiempo de residencia, el tama ño
de partícula , y la humedad. Este pretratamiento es reconocido como un
método muy efectivo para maderas duras y residuos agrícolas y se ha
aplicado a materiales como álamo, euca lipto, pino, paja de arroz y bagazo
(Ballesteros, 1998; Martín et al. , 2006).
Entre las ventajas del pretratam iento de explosión con vapor debe citarse
que el tamaño de partícu la del material requerido (15-30 mm) es
considerablemente superior a los utilizados en otros pretratam ientos,
reduciéndose costos por molienda (Ballesteros et al., 2002). Además, no
emplea catal izado res ácidos (en el caso de las maderas duras }, con lo que
se reducen los efectos ambientales.
Entre sus limitaciones se encuentran la destrucción de una parte de los
xilanos de la hemice lulosa, la incompleta ruptura de la matriz lignina-
carboh idratos, y la generación de compuestos (furfurales ) que pueden
resu ltar tóx icos para los microorganismos empleados en el proceso de
fermentación . Debido a la formación de estos compuestos , el material
pretratado debe ser lavado con agua para eliminar los productos inhibitorios
(Galbe & Zacch i, 2002).

30
• Proceso de explosión con vapor de amoniaco (AFEX)
Es un proceso similar a la explosión de vapor de agua pero el material es
previamente impregnado con amoniaco líquido (1 a 2 kg amoniaco/kg
biomasa seca) a una temperatura alrededor de 90°C por un tiempo
aproxim ado de 30 minutos. Transcurrido este tiempo el material se somete
a una rápida descompresión (Sun & Cheng , 2002). Este tipo de
pretratamiento ha sido empleado sobre diferentes tipos de sustratos como
alfalfa, paja de trigo, álamo, pasto y bagazo de caña. La diferencia con la
explosión con vapor y otros tipos de pretratamientos ácidos, es que este
proceso no solubiliza la hemicelulosa.
La composición del material sometido a un proceso AFEX es prácticamente
la misma que la del material original. Utilizando materiales con bajo
contenido en lignina (menos del 15%), se han obtenido rendimientos de
hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa del 90%, después del
pretratamiento. Sin embargo, este proceso no es tan efectivo con biomasas
con alto contenido en lignina. En estos casos, los rendimientos de hidrólisis
han sido inferiores al 50% (Balan et al., 2009).
Entre sus ventajas pueden citarse que no produce inhibidores que puedan
afectar las posteriores etapas del proceso de producción de etanol, y no
requiere de partículas pequeñas para aumentar la eficiencia.
Con objeto de reducir costos, y como medida protectora al medio ambiente,
una vez que el amoníaco pasa al tanque de expansión y al condensador, se
recupera para su reciclaje .

• Explosión con C0 2
Es un proceso similar a la explosión con vapor o al proceso AFEX. La
explosión con dióxido de carbono se basa en el hecho que el C0 2 forma
ácido carbónico, lo que aumenta la tasa de hidrólisis. Este proceso ha sido
empleado en el pretratamiento de alfalfa, obteniendo un rendimiento de
hidrólisis del 75% a las 24 horas (Pasquini et al. , 2005). Aunque los
rendimientos obten idos son relativamente bajos comparados con la
explosión con vapor o con el proceso AFEX, este proceso es más barato y
no origina los compuestos inhibitorios que se generan durante la explosión
con vapor (Zheng et al., 2007).

11. 2. 3. Pretratamientos químicos

Involucran la exposición del material lignocelulósico a compuestos químicos

durante diferentes períodos de tiempo y temperaturas, dando como
resultado la li beración de los azúcares monoméricos de la celulosa y la
hem icelulosa y la remoción de la lignina. Los químicos más usados son
ácidos diluidos, bases, disolventes orgánicos.
Cada tipo de residuo lignocelulósico requiere una combinación particular de
pretratamientos que permitan minim izar su degradación , favorecer el
31
rendimiento de azúcares y evitar la generación de compuestos tóxicos (Abril
& Abril , 2009; Tucker et al. , 2003). Los xilanos de la hemicelulosa pueden
ser extraídos en condiciones ácidas y alcalinas, mientras que los
glucomananos se extraen mejor en condiciones alcalinas.
De los tres polímeros principales de la biomasa lignocelulósica, la
hemicelulosa es la más sensible a un pretratamiento termoquímico (Sweet
& Winandy, 1999).

• Hidrólisis ácida
Está dividida principalmente en dos grupos, la hidrólisis con ácido diluido y
la hidrólisis con ácidos concentrados.
La hidrólisis con ácido diluido (concentración entre 0.1-5%) es un método
que ha sido empleado desde 1819 y fue muy utilizado durante la Segunda
Guerra Mund ial en Alemania para la obtención de celulosa. La hidrólisis
ácida transforma las cadenas de los polisacáridos que forman la biomasa
(hemicelulosa y celulosa) en sus monómeros elementales. En este tipo se
emplean ácidos como el ácido clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico y
fórmico (Galbe & Zacchi, 2002). Sin embargo, sólo los ácidos clorhídrico y
sulfúrico han sido empleados a escala industrial. La hidrólisis ácida es
probablemente el método más empleado, puede ser utilizado como un
pretratamiento que preceda a una hidrólisis enzimática o bien emplearse
como único tratamiento para la liberación de azúcares de la biomasa. Los
procesos que involucran ácidos diluidos son llevados a cabo a 140-180°C y
niveles de presión altos, y tiempo de reacción de aproximadamente 20
minutos, lo cual facilita que sea un proceso continuo; si este proceso se
prolonga, los azúcares liberados se transforman en furfurales, compuestos
con escaso valor para la producción de etanol. De los inconvenientes de
emplear ácidos diluidos está la formación de inhibidores para la
fermentación y la degradación de los azúcares, lo que ocasiona bajos
rendimientos de etanol (Varga et al., 2002). Esto puede deberse a las altas
temperaturas que se requieren para este proceso. En estos pretratamientos
generalmente los rendimientos de pentosas y hexosas recuperadas de la
hemicelulosa son altos (85-90% de los azúcares disponibles), mientras que
los rendimientos de glucosa proveniente de la celulosa son bajos (40-60%).
Sin embargo esto no se considera un problema grave, ya que la
combinación con otro pretratam iento permite mejorar los rendimientos de
los azúcares fermentables (Fonseca & Ovideo , 2006; Larsson et al., 2001 ).

En el proceso con ácidos concentrados no se requieren temperaturas altas

(aprox. 40°C); cuando se utiliza ácido sulfúrico concentrado (por ejemplo de
30-70%) se requiere luego de una dilución con agua para disolver e
hidrolizar, y convertir el sustrato a azúcares. Este proceso proporciona una
conversión completa y rápida , de la celulosa a glucosa, y de hemicelulosa a
azúcares de 5 carbonos . La principal ventaja de emplear el ácido
32
concentrado es el potencial para recuperar cerca del 90% de los azúcares
extraíbles, tanto a partir de la hemicelulosa como de la celulosa (Bond &
Ferrara, 2007). Entre los factores necesarios de controlar en este proceso
se encuentran optimizar la recuperación de azúcares y las técnicas para
reciclar el ácido empleado (Sun & Cheng, 2002).

Con objeto de dism inuir la degradación de los azúcares se puede utilizar un

proceso en dos etapas. En la pri mera etapa y bajo condiciones más suaves
(1 70-190 °C), se produce la ruptura de la hemicelulosa, que por su
estructura resulta más fácilmente hidrolizable, recuperándose sus azúcares.
Esto permite que, durante la segunda etapa, y bajo unas condiciones más
severas (200-230°C ), se produzca la ruptura de la celulosa, evitándose la
degradación de los azúcares hem icelulósicos producidos en la pri mera
etapa. Mediante los procesos en dos etapas es posible consegu ir hasta un
98% de recuperación de los azúcares liberados de la hemice lulosa de
maderas blandas. Sin embargo, los rendimientos en glucosa no superan el
50% (Nguyen et al., 1999; Wyman , 1999). En Estados Unidos a nivel
comercial se aplica la tecnología de hidrólis is en dos etapas.

A pesar de ser un proceso bien establecido todavía presenta varias

desventajas como son que requ iere recipientes resistentes a la corrosión, la
toxicidad de los residuos que se producen generan la necesidad de que
estos se diluyan con abundante agua o se requieran métodos de
recuperación. Cabe mencionar que se deben de realizar ajustes del pH
antes de continuar con la hidrólisis enzimática o el proceso de fermentación
(Sun & Cheng , 2002).

• Hidrólisis alcalina
En este proceso la finalidad no es la hidrólisis total de la materia
lignocelulósica sino la modificación de su estructura fís ica , haciéndola más
accesible (Zhao et al., 2008). Generalmente se emplean bases fuertes como
el hidróxido de sodio, de amonio o de calcio, en condiciones elevadas de
temperatura y presión (Abril & Abril, 2009).
Empleando estas condiciones se produce un esponjamiento y ruptura de la
celulosa debido a la pérdida parcial de su fracción cristalina. La celu losa
cristalina se transforma en celulosa amorfa, siendo más accesible a la
posterior sacarificación. As í mismo, se produce un efecto de sapon ificación
de los ésteres formados entre los grupos ácidos y otros componentes de las
hemicelulosas; los grupos acetilo de los mismos también se pierden. Al igua l
que la hidrólisis ácida, la alcalina también produce residuos tóxicos, por lo
que actualmente se está tratando de elim inar en los procesos industriales
(Angenent, 2007; Hah n-Hagerdal et al., 2006).

33
Los pretratam ientos alca linos pueden ser llevados a cabo a bajas
temperaturas pero requieren de alta concentración del reactivo y períodos
prolongados de tiempo. Este pretratamiento ha mostrado ser muy efectivo
para los residuos de tipo agríco la como por ejemplo la paja de trigo y la
cáscara de maíz y arroz (Hahn-Hagerdal et al., 2006). Comparando con los
pretratamientos que emplean ácidos o reactivos oxidantes, los tratam ientos
alca linos parecen ser más efectivos para romper las un iones éster entre la
lignina, hem icelulosa y celulosa, y a la vez evita la fragmentación de los
polímeros de la hemicelulosa (Taherzadeh & Kamiri , 2008). Uno de los
álca lis más recomendables por barato, seguro y de fácil recuperación es el
hidróxido de ca lcio. Aunque es una base débil y de baja solubi lidad, bajo
cond iciones adecuadas de pretratam iento incrementa de manera adecuada
la li beración de los azúcares en las biomasas con moderados conten idos de
lignina (Chang et al., 2001).

11. 2. 4. Pretratamientos biológicos

Los pretratam ientos biológicos emplean microorganismos ta les como los

hongos de podredumbre blanca, café y suave, así como algunas bacterias.
Estos microorgan ismos modifican la compos ición y estructura de la
biomasa lignocelu lósica haciéndola más accesible. Los hongos de la
podredumbre blanca son los más estudiados y los que se consideran más
efectivos para estos pretratamientos.

Tan iguch i et al. (2005) realiza ron una evaluación del pretratamiento de paja
de arroz empleando cuatro hongos de podredumbre blanca (Phanerochaete
chrysosporium, Trametes versicolor, Ceriporiopsis subvermispora, y
Pleurotus ostreatus ) con base en los cambios cuantitativos y estructurales
de los componentes de la paja. En este trabajo P. ostreatus demostró una
hidrólisis selectiva de la lign ina, aumentando la susceptibilidad de la paja de
arroz a la hidrólisis enzimática. Sin embargo los rendim ientos no fueron
mayores al 33% en un tiempo de pretratam iento de 60 días. En contraste,
Bak et al., (2009) pretrataron también paja de arroz durante 15 días
empleando sólo P. chrysosporium obteniendo una deg radación del 64.9%
del rendim iento teórico. Kurakake et al. , (2007) realizaron un pretratamiento
biológico sobre papel de oficina empleando dos cepas bacterianas,
Sphingomonas paucimabilis y Bacil/us circulans. Bajo ciertas cond iciones de
cultivo se logró la recuperación del 94% de los azúcares del papel de
oficina.
El pretratamiento biológico tiene ventajas muy evidentes, como por ejemplo,
la ausencia de productos químicos por lo que no genera compuestos tóxicos
por lo que son amigables con el medio ambiente, son procesos efectivos y
altamente específicos. Sin embargo, sus desventajas son tan evidentes
como sus ventajas. Como desventajas tiene que es un proceso lento y
34
requiere un control cuidadoso de las cond iciones de crecimiento. Además,
la mayoría de los microorganismos solubilizan no sólo la lignina sino
también la hemicelulosa y la celulosa. Por el momento, el pretratamiento
biológico enfrenta retos técnicos y económicos.

11. 3. Subproductos de la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica

Varios pretratamientos generan subproductos, y algunos de éstos son

tóxicos para los microorganismos que llevan a cabo la fermentación (Borole
et al., 2009). Estos inhibidores dism inuyen el rendimiento y la producción de
etanol. Investigaciones en el tema se han dedicado a resolver el problema
de los inhibidores, por ejemplo, convirtiendo los materiales tóxicos en
compuestos menos tóxicos para las levaduras o aumentando la tolerancia
de éstas hacia aquellos (Aimeida et al., 2007).
La celulosa, hemicelulosa y lignina pueden romper sus enlaces para formar
glucosa, xilosa , manosa, galactosa y compuestos fenólicos
respectivamente. De los monómeros producidos, algunos de ellos se
pueden descomponer durante el proceso y formar compuestos como 5-
hidroximetil furfural (HMF) desde las hexosas, y furfural desde las pentosas.
El HMF y el furfural pueden también descomponerse en ácido levulínico y
ácido fórm ico (Figura 11. 2.). Más aún, el ácido acético es liberado desde los
grupos acetilo conten idos en la hemicelulosa y también se pueden li berar
compuestos fenólicos desde la lign ina (Balant, 2011 ; Larsson et al., 1999;
Sánchez et al., 2010).

35
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Fu1 ural ~ 5-Hid ro imetilfurfural

Acido f órmico

Figura 11. 2. Reacciones ocurridas durante la hidrólisis de los materiales

lignocelulósicos. (Modificado de Larsson et al., 1999).

• Ácidos orgánicos
En el método de hidrólisis con ácido dilu ido se genera un gran número de
ácidos alifáticos que son orig inados desde los extraíbles de la madera, de la
degradación de la lignina y de la degradación de los azúcares de la
hem icelulosa. Entre estos, el ácido acético es el mayor constituyente y se
prod uce por la degradación del grupo acetilo en los po lisacáridos; en
cambio, el ácido levu línico y el ácido fórmico son productos de la
degradación de azúcares como manosa, galactosa y fructosa (Popoff &
Theander, 1976 ).
Se prod uce n también algunos ti pos de ácidos grasos como el ácido
hexadecanoico, ácido 9,12-octadecad ienoico , ácido oleico y ácido
octadecanoico , que en su mayoría provienen desde los extraíbles de la
madera . Se tienen también ácidos al ifáticos como ácido 2-m etil-2-
hidroxibutanoico , ácido metil propanodioico y ácido metil butanodioico. En
términos de concentración estos últimos ácidos son menos importantes, y
no afectan considerablemente al microo rgan ismo empleado para la
fermentación alcohó lica (Larsson et al., 1999).

36
• Compuestos fenólicos
Entre los compuestos fenólicos identificados se encuentran el 3-metoxi-4-
hidroxibenzaldehido, la 4-hidroxiacetofenona, la vainillina, la acetovainillina,
el ácido ferúlico, el ácido vainillínico y el ácido 4-hidroxibenzoico (Larsson et
al., 2001 ). Los aldehídos fenólicos se producen por la degradación de la
lignina y se reconocen como los principales inhibidores de la fermentación .

• Compuestos de tipo furano

El furfural y el 5-hidroximetil furfural (HMF) son productos de la
descomposición de pentosas y hexosas, respectivamente. Se ha reportado
que el furfural es un fuerte inhibidor de la levadura Saccharomyces
cerevisiae. Una concentración de furfural de 1 g/1 puede disminuir
significativamente la liberación de co2y el número de células totales en la
fase de fermentación.
Es importante mencionar que se puede reducir la composición y
concentración de estos inhibidores modificando el proceso de
pretratamiento (Foust et al., 2009).

Considerando la importancia económica que tiene el cultivo de plátano en

nuestro país y con base en la composición química de sus fibras (Cuadro 11.
2.), los residuos de plátano pueden considerarse como una materia prima
adecuada para la producción de energía, ya que contienen una proporción
importante de celulosa y su cantidad de lignina no es muy alta (Khalil, 2006;
Oliveria et al., 2007; Palencia et al. , 2006).

Cuadro 11. 2. Composición química de las fibras de diferentes partes del

plátano.
Componente 1
Hojas(%) 1
Pseudotallo (%) 2•3
Cáscara (%)

Hemicelulosa 14.80 17.44 20.2

Celulosa 13.20 24.25 63.2

Lignina 14.00 12.84 18.3

Fuentes: 1.- Monsalve et al., (2006) 2.-Khalil et al., (2006) 3.-0iiveira et al.,
(2007).

En este capítulo se presenta la evaluación de pretratamientos ácido y

alcalino sobre residuos lignocelulósicos de plátano .

37
11. 4. MATERIALES Y MÉTODOS
11. 4. 1. Colecta de material vegetal para la elaboración de harinas

La colecta se realizó en la plantación "BRONCO BANANA", en Teapa,

Tabasco, México (ubicado al sur del estado, entre los paralelos 1r 32' de
latitud norte y 92° 57' de longitud oeste). Se colectaron hojas, pseudotallos y
frutos verdes desechados en la empacadora; las muestras se envolvieron
en papel y se colocadaron en costales de plástico. Los pseudotallos se
prensaron para eliminar el exceso de agua y así evitar su rápida
descomposición y facilitar su traslado.

11. 4. 2. Pretratamiento de los residuos de plátano

Los pseudotallos colectados se cortaron mecánicamente a un tamaño

aproximado de 15 cm , mientras que los frutos verdes se cortaron en rodajas
de 2 cm , se dejaron secar al sol y posteriormente se terminó el secado en
una estufa Felisa® a una temperatura de 45 oc hasta llegar a peso
constante. Posteriormente los sustratos se redujeron de tamaño con un
molino PAGANI® con tamaño de malla de 10 mesh (aprox. 2 mm)
obteniéndose 2 harinas (pseudotallo y fruto verde) , que se almacenaron
hasta su uso (Baig et al., 2004; Chen et al., 2008).

11. 4. 3. Hidrólisis de residuos de plátano

Las harinas se sometieron a diferentes procesos de hidrólisis química para

determinar cual permitiría la liberación de la mayor cantidad de azúcares
reductores (AR).
Las dos harinas se colocaron en forma separada en tres lotes diferentes de
matraces, cada uno con 3 g de sustrato y diferente pretratamiento qu ímico.
Al primero se le añadió HCI al 3% por 15 minutos, al segundo se le agregó
NaOH al 3% por 90 minutos y al tercero se le agregó HCI al 3%, se
neutralizó y posteriormente se le agregó NaOH al 3%, manejando los
tiempos previamente mencionados. Posteriormente , a todos los
pretratamientos se les ajustó el pH a 4.8 y se les aplicó calor húmedo
mediante una esterilización a 121 oc a 15 lb durante 15 minutos (Chen et al. ,
2008; Mussatto et al. , 2006).
El ensayo también se realizó utilizando una mezcla de 6 g de las dos
harinas en una proporción 1:1, a la cual se le aplicaron los mismos
pretratamientos quím icos y condiciones de tiempo y temperatura. Se
midieron losAR durante los diferentes pretratam ientos (Miller, 1959).

38
11. 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Trabajos realizados con diferentes biomasas lignocelulósicas y cuyo fin es

la li beración de los azúcares de la celulosa y hemicelu losas, se han
encontrado con la necesidad de determinar el pretratamiento más adecuado
para este propósito , ya que cada sustrato presenta diferentes tipos y
conten idos de lignina, en particular de un mayor o menos número de grupos
(siri ngilo, guayasilo o fenólicos) la cual va a requerir de tratamientos menos
a más severos que permitan la liberación de los carbohidratos , por lo que
requiere de condiciones particulares de hidrólisis. Como se mencionó en
algunas ocasiones se requ iere de un pretratamiento suave mientras que en
otros se ha observado que se requiere la combinación de pretratamientos
más agresivos para conducir a incrementos sign ificativos en el rendim iento
de losAR (Zheng et al., 2008; Dien et al., 2006; Monsalve et al., 2006).

11 . 5. 1. Pretratamiento fí:.ico-qu fmicos de Jos residuos de plátano

El material vegetal seco y molido (Figura 11. 3.) correspond io al 30% de su
peso.

Figura 11. 3 . Plátano en rodajas, secado en estufa a 45 ·e para su posterior

molienda y preparación de harina.

La molienda del sustrato (Figura 11. 4.), se consideró como un pretratam iento
físico para aumentar la superficie de contacto con el pretratamiento qu ímico.

39
Figura 11. 4. Harinas obtenidas después de la molienda con diámetro
aproximado a 2 mm. 1.- Harina de fruto de plátano, 2.- Harina de
pseudotallo.

11. 5. 2. Hidrólisis de residuos de plátano

Con el tratamiento alcalino el material adqu irió rápidamente un color oscu ro

y consistencia pastosa, mientras que con el tratamiento ácido el material no
mostró cambio de color al menos visualmente (Figura 11. 5.).

Figura 11. 5. Harinas de plátano sometidos a pretratamiento con NaOH al

3% (izquierda) y HCI al 3% (derecha) .

40
La aplicación de calor húmedo permitió evitar la contaminación durante la
sacarificación, a la vez que se considera un pretratamiento físico importante.

Una vez concluidos los tiempos de pretratamiento se cuantificarán los AR.

El análisis independiente de los AR de las diferentes harinas, antes y

después de aplicar calor en el proceso de esterilización, se presenta en el
Cuadro 11. 3. Este ensayo permitió conocer la cantidad de azúcares
liberados de cada uno de los sustratos, siendo estos controles importantes
para conocer el sistema.

Cuadro 11. 3. Cantidad de AR liberados con los pretratamientos físicos y

químicos aplicados a las harinas de pseudotallo y fruto verde de plátano.

MEDICIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES (g/L)

PSEUOOTALLO (AR) FRUTO(AR)
PRETRATAMIENTO
Sin Calor 1 Con Calor- Sin calor 1 Con Calor"*
ÁCIDO 0.13.:!: 0.003 23.1 o.:!: 0.003 4.46.:!:0.004 62 .53.:!: 0.003

ALCALINO 0.16.:!: 0.002 0.49 .:!:0.002 0.19.:!: 0.001 0.81.:!: 0.001

ÁCIDO- ALCALINO 0.84.:!: 0.003 0.19.:!: 0.002 0.03.:!: 0.001 0.35.:!: 0.003
1
AGUA 0.13.:!: 0.001 0.03.:!: 0.001 2.10.:!: 0.001 ***
1
Se empleo un pretratam1ento de agua como control.
**Calor húmedo (121°C a 15 Lb, 15 min).
***Valor no determinado. Los experimentos se realizaron por triplicado.

El pretratamiento con la solución de HCI al 3% sobre cada una de las dos

harinas mostró ser el más eficiente después de haber sido esterilizado el
sustrato; con este pretratamiento se obtuvo 62.53 giL de ARde la harina del
fruto y 23.1 O giL del pseudotallo; esto se debe al alto contenido de almidón
en el fruto que en su estado verde alcanza hasta un 70% en base seca
(Bello et al., 1999; Gorosquer et al., 2004). Sin embargo con el material
lignocelulósico se alcanza la tercera parte, lo cual no se considera una
cantidad de AR despreciable. Fue necesaria la aplicación conjunta de ácido
y calor para lograr la liberación de AR , ya que los efectos de estos
pretratamientos por separado fueron despreciables con base en sus
rendimientos respectivos de AR.

La medición de los AR de la mezcla de las harinas antes y después de

aplicar calor, se presenta en el cuadro 11. 4.

41
Cuadro 11. 4. Cantidad de AR liberados por los diferentes pretratamientos
físicos y químicos sobre harina de plátano compuesta por fruto y
pseudotallo (1:1).
MEDICIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES (g/L)

PRETRATAMIENTO Sin Calor (AR) Con Calor (AR)*

ÁCIDO 0.87.:!: 0.002 42.41 .:!: 2

ALCALINO 0.81.:!: 0.003 1.37.:!: 0.002

ALCALINO+ÁCIDO 0.45.:!: 0.001 1.13.:!: 0.001

AGUA' 0.52.:!: 0.001 1.62.:!: 0.002

1
Se empleo un pretratamiento de agua como control.
*Calor húmedo (121°C a 15 Lb, 15 min). Los experimentos se realizaron
por triplicado .

La combinación del tratamiento ácido con calor fue el que liberó la mayor
cantidad de azúcares (42.41 g/L}, ya que ni el ácido solo ni el control sin
ácido (agua) generan esa cantidad de azúcares. Considerando los
resultados donde se midieron los AR de las harinas de manera individual, se
esperaba obtener 40 g/L de azúcar dado que fue la cantidad registrada para
le mezcla (1 :1) de harina de pseudotallo y fruto; 40 g/L es un dato promedio
de los obten idos en los análisis previos , lográndose en esta ocasión una
mayor cantidad de AR.

En el transcurso de este proyecto de investigación se ha requerido realizar

repeticiones de la etapa de pretratamiento durante la implementación de las .
etapas de sacarificación y fermentación , esto con el fin de obtener
reproducibilidad en la cantidad de AR liberados con el pretratamiento
ácido+calor; valores finales han permanecido de 42.41 .± 2 g/L.

En el trabajo de Hernández et al., (2009}, se observa el efecto del

pretratamiento, que depende del tipo de sustrato. En dicho trabajo se
hidrolizaron diferentes fracciones de bagazo de caña y dos variedades de
bagazo de agave; el pretratamiento inicial consistió en procesos físicos
como molienda y una explosión con vapor, seguidos de pretratamientos
químicos (ácido y alcalino) para determinar el que les proporcionara la
mayor cantidad de AR. Los mayores rendimientos de AR a partir de bagazo
de caña se obtuvieron con el pretratamiento ácido, mientras que para el

42
bagazo de agave se liberaron mejor con el pretratamiento alcalino, con lo
que demostraron la necesidad de implementar un pretratamiento específico
para cada sustrato. En el presente trabajo se realizaron diferentes
cond iciones de pretratamiento de los residuos de plátano (ácido, alcalino,
ácido más álcali, condiciones con y sin calor húmedo).

Yu et al. , (1984), se hidrolizaron fracciones de álamo con H2 S0 4 al 3%

durante 4 h a 100°C, liberando 44.2 g/L de AR ; aunque se considera que la
concentración de ácido no fue alta, si lo fue el tiempo y la temperatura de
exposición . Lo cual es una desventaja para el proceso, debido al alto
consumo energético. Además, se debe considerar que al exponer la
biomasa por un tiempo prolongado de pretratamiento, se tiene un mayor
riesgo de generar compuestos que podrían inh ibir a los microorganismos
empleados durante la fermentación. Como ejemplo de ello se encuentra el
trabajo de Telli & Eken, (2006), en el cual se obtuvieron 37 g/L de AR al
hidrolizar cáscaras de girasol con O. 7 M de H2 S0 4 durante 3 .5 horas; sin
embargo se requirió detoxificar el hidrolizado antes de fermentar con Pichia
stipitis NRRL Y-124. Considerando la importancia del tiempo de exposición
de la biomasa a los pretratam ientos químicos, en este trabajo se emplearon
tiempos cortos durante los ensayos de pretratamiento químico, 15 minutos
para el ácido y 90 minutos para el pretratamiento alcalino, estos tiempos
están entre los rangos presentados en otros trabajos (Chen et al. , 2008;
Mussatto et al. , 2006; Zhao et al., 2008 ).

Monsalve et al., (2006) reportaron que al hidrolizar cáscaras de plátano

obtuvieron un máximo de 20 g/L de AR , mediante una delignificación con
NaOH 0.1 N y una posterior hidrólisis con H2 S0 4 al 5% y calor. Esta misma
secuencia de pretratam ientos también la aplicaron sobre Yuca, pero
cambiando las concentraciones y tiempos de aplicación, obteniendo un
rend imiento de 170 g/L de AR; este alto rend imiento se debe al alto
contenido de almidón en este tubérculo. Sin embargo, con base al trabajo
de Mussatto et al. , (2006) donde el orden de aplicación de los
pretratamientos está invertido, primero ácido y luego álcali, rea lizamos un
ensayo de hidrólisis empleando esta secuencia de pretratamientos
químicos, obten iéndose cantidades bajas de AR (menos de 1.5 g/L).

Tomando en consideración que al momento de eliminar los residuos de las

empacadoras y las plantaciones, este proceso se hace de manera conj unta,
este trabajo propuso que los residuos de plátano (pseudotallo y plátano
verde) se hidroliza ran de manera simu ltánea , con el propósito de elim inar la
separación, hecho que redundaría en dism inuir el tiempo y los costos de
operación así como en un futuro escalamiento. Con la mezcla de harinas
nuevamente se observó que el pretratamiento ácido+calor (esterilización)
fue el que logró la mayor liberación de azúcares, alcanzando un rendim iento
43
de 42.41 g/L, donde la mayor cantidad del azúcar proviene del almidón del
fruto verde. Este resultado fue mayor que el promedio matemático esperado
de los AR de la mezcla de las dos harinas, superando la cantidad esperada,
aun cuando la harina conten ía 50% de pseudotallo. La propuesta de rea lizar
la mezcla de harinas puede considerarse por lo tanto factible para llevar
exitosamente el proceso a mayor escala, ya que sería más rápido y se
eli minaría el costo del proceso de separación.
Al igual que en este proyecto, con el propósito de aprovechar los residuos
agroindustriales desperdiciados en su país, Sharma et al., (2007) emplearon
en forma combinada dos residuos, los de un cítrico llamado kinnow y las
cáscaras de plátano. Después de moler los sustratos, estos fueron
mezclados en una relación 4:6 (residuos de kinnow:cáscara de plátano) y la
mezcla fue hidrolizada con la técnica de explosión de vapo r, donde
obtuvieron resultados de 63 g/L, cons iderando esta una buena cantidad de
AR para ser empleados en la producción de etano l. Sin embargo, como ya
se ha mencionado anteriormente la técnica de explosión con vapor requ iere
de un gasto energético alto , a la vez que tiene la desventaja de que
destruye parte de los xilanos de las hemicelulosas, generando compuestos
que pueden resultar tóx icos (furfurales , hidroximetilfurfural) . Otra gran
desventaja de emplear esta técn ica es que se requ iere de equ ipo
especializado, por lo que no es usada de manera rutinaria, especialmente
en pa íses en desarrollo. A diferencia de ese trabajo , el pretratamiento con
calor que realizamos consistió en emplear las mismas condiciones que se
usan para la esterilización en autoclave (121 °C a 15 lb), condiciones
comúnmente empleados en un laboratorio y en muchas industrias que
requ ieren esterilizar algún material, por lo que no se considera como un
proceso de alto costo y que no es muy agresivo para el material
lignocelulósico.

Parte de los resu ltados de este capítulo fueron publicados en el artículo

"Saccharification with Phanerochaete chrysosporium and P/eurotus
ostreatus enzymatic extracts of pretreated banana waste" de la revista
African Journal of Biotechnology Vol. 10 (19), pp. 3824-3834, 2011 .

44
11. 6. CONCLUSIÓN

El proceso de pretratamiento formado por secado y molienda, seguido de

hidrólisis ácida y calor húmedo fue el más adecuado para hidrolizar los
residuos de plátano evaluados. Al emplear cond iciones de baja
concentración de reactivo qu ímico (3%), corto tiempo (15 minutos),
moderada temperatura y presión (120°C a 15 lb), se tiene menor riesgo de
generar inh ibidores que afecten las posteriores etapas de sacarificación y
fermentación . En resumen , comparando la cantidad de AR generados con
otros materiales lignocelulósicos como por ejemplo de alfalfa, girasol , pasto
(Sreenath et al., 2001 ; Te lli & Eken, 2006; Zhu et al., 2006) los residuos de
plátano se pueden considerar como una fuente alterna de AR que pueden
ser empleados para usos biotecnológicos.

45
11. 7. REFERENCIAS
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53
54
CAPÍTULO 111. SACARIFICACIÓN

111. 1. Antecedentes

Los pretratamientos biológicos han retomado interés por las ventajas que
ofrecen , como la baja formación de inhibidores, bajo requerimiento
energético, por lo que son considerados procesos ecoamigables. Por las
ventajas antes mencionadas aún cuando se consideran procesos caros , no
se han dejado de realizar y se trabaja en su optimización y abaratamiento
(Shah et al. , 2005; Quintero et al. , 2006).
Las etapas de sacarificación y fermentación han ido modificándose para
lograr mayores rendimientos . Durante los primeros trabajos de hidrólisis
enzimática , las etapas de hidrólisis y de fermentación se realizaban de
manera separada (HFS) . En este proceso una parte de la biomasa
pretratada se utiliza como sustrato para la obtención de las enzimas. Una
vez producidas las enzimas del complejo celu lolítico se extraen del medio y
se añaden al resto del material pretratado en un reactor de hidrólisis. La
glucosa obtenida en este reactor pasa a otro tanque , donde se realiza la
fermentación mediante la acción de microorganismos. La ventaja de este
proceso es que al estar separadas la hidrólisis y la fermentación , ambas
pueden realizarse en sus condiciones óptimas. La etapa de hidrólisis se
realiza a la temperatura óptima de las enzimas celulolíticas (alrededor de
50°C), mientras que la fermentación se realiza a la temperatura óptima del
microorganismo fermentador de etanol. La principal desventaja del proceso
de HFS es que la glucosa y la celobiosa liberadas durante la etapa de
hidrólisis enzimática llegan a inh ibir las enzimas, obteniéndose bajos
rendimientos. Si en lugar de enzimas se emplea una hidrólisis ácida , se
requiere neutralizar el hidrolizado antes de la fermentación. Considerando
los efectos negativos de tener las etapas de sacarificación y fermentación
de forma separada, se han integrado los pasos, realizándose en un mismo
reactor. Su principal ventaja es que se reduce la inhibición de la
sacarificación por producto final , ya que la presencia de microorganismos
fermentadores reduce la acumulación de azúcares en el reactor. En el
proceso integrado se obtienen mayores tasas de hidrólisis que en el
proceso con etapas separadas. Otras ventajas son que requiere una menor
cantidad de enzimas, se reducen los costos de inversión al real izarse todo
el proceso en un mismo reactor y se obtiene un aumento en el rendimiento
de etanol (Ballesteros et a/., 2002). La principal desventaja es que la
sacarificación y la fermentación tienen diferentes condiciones óptimas de pH
y temperatura y en el proceso integrado es necesario ajustar el proceso a
condiciones compatibles a ambas etapas. Como se mencionó
anteriormente, puesto que la temperatura óptima de hidrólisis está próxima
a los 50°C y las levaduras productoras de etanol convencionales trabajan

55
alrededor de los 37°C, es aconsejable la utilización de microorganismos
termotolerantes (Castaño & Mejia, 2008).
Existe una gran cantidad de organismos (bacterias y hongos) con enzimas
hidrolíticas capaces de degradar y utilizar la celulosa y la hemice lulosa
como fuente de carbono y energía. Los microorganismos capaces de
degradar la celulosa producen una batería de enzimas con diferentes
especificidades. Estos microorganismos pueden interactuar sinérg icamente
con microorgan ismos no celulol íticos para degradar la celulosa , liberando el
C0 2 y agua en condiciones aerobias y dióxido de carbono , metano y agua
en condiciones anaerobias.
En lo referente al ataque y mineralización de la lignina, el número de
organismos es mucho más limitado. Siendo los principales , los hongos
filamentosos conocidos como hongos basidiomicetes (Papinutti et al. , 2003).

111. 1. 1. Hongos ligninocelulolíticos

La pared celu lar de los tej idos vegetales está proteg ida por la lign ina,
polímero difícil de degradar que res iste el ataque de la mayoría de los
microorganismos. A través del tiempo los hongos se han ido adaptando a
desarrollarse sobre los materiales vegeta les y a la descomposición de las
plantas en forma parasitaria o saprobiótica. Los hongos saprobióticos
crecen sobre material muerto y son particularmente importantes para la
ruptura de varios polímeros de la pared celular (Kamada et al., 2002).
La relevancia de los hongos y sus enzimas en el ciclo del carbono y en
aplicaciones biotecnológicas han reimpulsado el interés de los grupos de
investigación para conocer su papel en la degradación del material vegetal
(Martínez et al., 2009).
Se considera que la capacidad de degradar el material lignocelulósico está
asociada con el crecimiento del micelio, ya que el hongo transporta
nutrientes como el nitrógeno y el hierro conten ido en el material
lignocelulósico (Himmel, 2007).
Dependiendo de la forma en que los hongos ataquen la pared vegetal , se
clas ifican en hongos de pudrición blanda o suave (Hps), hongos de
pudrición parda o café (Hpc) y hongos de pudrición blanca (Hpb),
clas ificación que se ha hecho pri ncipalmente por los aspectos
macroscópicos del proceso de degradación.

La pudrición blanda o suave es causada por hongos clasificados en el

phylum Ascomycota y la degradación general se caracteriza por la
formación de series de cavidades que se forman dentro de las paredes
celulares de la madera. Son cavidades bicón icas y cilíndricas formadas a lo
largo de la estructura microfibrila r de la pared secundaria y que tienen una
orientación en espiral. Los Hps como son Chaetomium sp. y Coniothyrium
sp., pueden degradar la lign ina a C0 2 , pero de forma limitada, y son
56
capaces de utilizar la celulosa de la pared secundaria de las plantas (Kirk et
al., 1980). Se considera que los Hps pueden degradar madera muy
húmeda, mientras que los Hpb no pueden hacerlo. Una posible explicación
es que los Hps requieran menor cantidad de oxígeno. Otra posible
explicación es que los Hps pueden tener una mayor tolerancia al aumento
del dióxido de carbono, la aparición de materiales exudados -productos de
envejecimiento- o a cambios en el pH de los alrededores (Robert et al.,
2004). La Figura 111. 1. corresponde a una pudrición suave o blanda.

Figura 111. 1. Efecto de la degradación de una madera por un hongo de

podredumbre suave (http://forestpathology.cfans.umn.edulmicrobes. htm).

Los Hpc, tales como Schizophyllum commune y Fomes fomentarius, crecen

principalmente en la madera suave, representando aproximadamente el 7%
de los basidiomicetos degradadores de la madera. Este grupo puede
degradar polisacáridos de la madera, después de una degradación parcial
de la lignina, resultando en un material café compuesto de lignina oxidada ,
en especial de las quinonas producidas por el efecto del oxígeno (Figura 111.
2.).

57
Figura 111. 2. Madera degradada por un hongo de podredumbre café. Estos
hongos digieren la celulosa, pero no degradan la lignina, quedando un color
café por la lignina oxidada. (http://www.flickr. coml photosl cornellfungi/
149085486).

Al realizarse un estudio comparativo de los genomas de Postia placenta

(Hpc) y Phanerochaete chrysosporium (Hpb), se observó que mientras las
oxidasas y las lacasas se encontraban presentes en ambos hongos, las
peroxidasas de alto potencial redox (Lignina peroxidasa y Manganeso
peroxidasa) sólo se encontraban en el Hpb. Con base en las investigaciones
se ha observado que la dimetoxilación es la principal modificación a la
lignina realizada por los Hpc (Martínez et al., 2009).

Los Hpb son los más frecuentes degradadores de la madera, tienen la

capacidad de degradar lignina, hem icelulosa y celulosa (Quintero et al. ,
2006). Para degradar la lignina secretan enzimas que son esenciales para
la transformación inicial de la misma , y que en conjunto logran su
mineralización (Pointing , 2001 ). Estas enzimas llevan a cabo la degradación
por medio de procesos oxidativos y fenol oxidasas (Dhouib, 2005).
Además de ser importantes en la degradación de la biomasa
lignocelulósica, las enzimas ligninolíticas han sido ampliamente estudiadas
en la bioremediación de suelos contam inados con hidrocarburos aromáticos
pol icíclicos (Kirk & Farrell. , 1987; López et al. , 2006; Shah et al. , 2005).

Los Hpb presentan dos principales patrones de degradación :

58
 1) Delignificación simultánea (no selectiva) es cuando atacan
principalmente maderas duras, degradando simultáneamente
lignina, hemicelulosa y celulosa.
2) Delignificación selectiva o decaimiento secuencial, esta se lleva a
cabo en maderas duras y suaves. El ataque inicial es selectivo para
la lignina y la hemicelulosa y por último es atacada la celulosa.

Existen hongos con la capacidad de realizar los dos tipos de degradación,

sin embargo, la cantidad de madera degradada depende de la cepa del
hongo y del sustrato empleado (Martínez et al., 2005).
Los Hpb Phanerochaete chrysosporium (Figura 111. 3.) y Trametes versicolor
son empleados comúnmente como organismos modelos en estudios de
biodegradación de la lignina, debido a sus altas actividades ligninolíticas, y
su rápido y fácil crecimiento en medios de cultivo (Moredo et al., 2003).

Figura 111. 3. Fragmento de madera invadido por el hongo Phanerochaete

chrysosporium (hongo de podredumbre blanca) (Thom Volk, 2001).

111. 1. 1. 1. Enzimas Ligninolíticas

Existen enzimas extracelulares, oxidativas e inespecíficas que liberan

productos altamente inestables, los cuales catalizan el paso inicial de la
degradación de la lignina. La oxidación no especifica de la lignina recibe el
nombre de combustión enzimática (Pérez et al., 2002). La degradación de la
lignina por los hongos basidiomicetos es un paso clave en el decaimiento de
la biomasa lignocelulósica. En este proceso participan principalmente tres
clases de enzimas extracelulares llamadas frecuentemente "enzimas
modificadoras de lignina". Estas han sido llamadas Lignina peroxidasa (LiP),
59
Manganeso peroxidasa (MnP) y Lacasa (Lac). Son las responsables de
iniciar la despolimerización de la lignina (Kirk & Farell , 1987), y su patrón de
expresión es muy variable dependiendo de la especie de hongo; algunos
secretan LiP y MnP y no Lac mientras que otros pueden secretar MnP y Lac
y no secretan LiP (Ohkuma et al. , 2001). Algunos hongos pueden secretar
los tres tipos de enzimas o únicamente un tipo. Una vez que el complejo
enzimático permite a los hongos degradar la lignina, la celulosa queda
disponible.

111. 1. 1. 2. Principales enzimas ligninolíticas

Las lacasas son glucoproteínas y muchas de ellas son extracelulares, con

pesos moleculares entre 60 y 80 kDa ; del 15 al 20% de su peso molecular
está dado por carbohidratos (Shah et al. , 2005). Son enzimas conocidas
desde hace muchos años en plantas, hongos e insectos. Participan en la
síntesis de pigmentos, morfogénesis de los frutos y detoxificación en med ios
de cultivo líquido. Actualmente ha crecido el interés sobre estas enzimas
para su aplicación biotecnológica debido a su alta capacidad de degradar
compuestos xenobióticos (Dhouib, 2005, Rodríguez et al., 1999; Ohkuma,
2001 ). Catalizan la oxidación de un amplio espectro de compuestos
fenólicos y aminas aromáticas, utilizando el oxígeno molecu lar como
aceptor de electrones, reduciéndolo a agua (Shah et al., 2005). La lacasa
contiene átomos de cobre y la producción de esta enzima en medios de
cultivo sólido ha sido considerada como una característica única de los
basidiomicetos de podredumbre blanca. Sin embargo, existen algunos Hpc
que son capaces de producir lacasas (Gianfreda et al. , 1999). Esta enzima
oxida no solamente ácidos fenólicos y metoxifenólicos, sino que también los
descarboxila y ataca mediante desmetilación. Todas estas reacciones
pueden representar un paso importante en la transformación inicial de la
lignina (Leonowicz et al., 2001 ). También reacciona con polifenoles y otros
compuestos aromáticos derivados de la lignin a, los cuales pueden ser
polimerizados o despolimerizados, o incluso actuar como mediadores redox
de bajo peso molecular. La utilización de sistemas mediador-lacasa es una
alternativa promisoria para procesos biotecnológicos con aplicaciones
ambientales. Entre ellos, el blanqueo de la pulpa de papel , la decoloración
de colorantes textiles y la oxidación de hidrocarburos polinucleoaromáticos
(Leonowicz et al. , 2001 ; Rodríguez et al., 1999; Vaithanomsat et al., 201 0).
Las lacasas se pueden considerar enzimas relativamente estables bajo
condiciones fisiológicas de pH y temperatura, lo cual es ventajoso en
muchos procesos, así como también es importante considerar que debido a
su inespecificidad se considera una enzima con una gran aplicación
industrial (Gianfreda et al., 1999, Lo era et al. , 2006, Pérez et al. , 1996).

60
Las enzimas LiP y MnP fueron descubiertas a mediados de los años 80's en
el hongo Phanerochaete chrysosporium. La lignina Peroxidasa (LiP) puede
oxidar directamente sustratos aromáticos no fenólicos, siendo el más
estudiado el alcohol veratrílico.
Las ligninas peroxidasas son hemoproteínas monoméricas con una masa
molecular alrededor de 40 kDa, y se pueden presentar varias isoformas
(Wong , 2009). La diferencia funcional entre las ligninas peroxidasas y las
peroxidasas clásicas es que las primeras pueden oxidar anillos aromáticos
que están moderadamente activados mientras que las peroxidasas clásicas
solo pueden actuar sobre sustratos aromáticos fuertemente activados. Una
característica importante de la LiP es su habilidad para oxidar el alcohol
veratrílico como sustrato (Haapala & Linko., 1993).
La enzima manganeso peroxidasa, es una peroxidasa común en los Hpb,
que requiere como ce-sustrato peróxido de hidrogeno y Mn+ 2 que oxida a
Mn+ 3 ; este ion actúa como un oxidante sobre las unidades fenólicas y no
fenólicas de la lignina. En cultivos de hongos del género Pleurotus se
descubrió la presencia de otra enzima, la cual fue nombrada peroxidasa
versatil (VP). Esta enzima combina las propiedades de la LiP y la MnP
(Papinutti et al., 2003; Stajic et al., 2004).
Las lacasas y las peroxidasas ligninolíticas (LiP, MnP y VP) oxidan la
lignina, generando compuestos aromáticos. En la fase final de la
degradación de la lignina, los productos simples de su degradación son
absorbidos por las hitas del hongo para ser incorporados dentro sus rutas
metabólicas (Kalmis et al., 2008).

111. 1. 1. 3. Aplicación de enzimas ligninolíticas

En contraste a la lacasa y las peroxidasas de bajo potencial redox que se

emplean en diferentes sectores industriales, las lignina peroxidasas de alto
potencial redox prácticamente no se encuentran disponibles comercialmente
debido a que tienen bajo nivel de expresión. Se está implementando su
aplicación en procesos de detoxificación y degradación de residuos
agrícolas (Joshi, 2001 ; Patel et al., 2007), para emplear la lignina de estos
como fuente de productos tales como vainillina , dimetil sulfóxido y fenoles .
Las ligninasas ya están siendo aplicadas en la degradación de
contaminantes ambientales como; colorantes desechados por la industria
textil, plaguicidas, etc. (Shrivastava et al., 2005; Paszczynski & Crawford,
1991 ; Papinutti et al., 2006; Pérez et al., 2002).

Es importante considerar que la degradación de la lignina no sólo involucra

a las enzimas ligninolíticas descritas, sino que es un proceso que se apoya
también en enzimas accesorias que actúan de forma cooperativa (Wong,
2009).

61
Se espera que con la rápida adquisición de conocimiento de los últimos
años sobre la estructura y función de estas enzimas, se perfeccionen las
metodolog ías para modular sus propiedades catalíticas y regu latorias.

111. 1. 1. 4. Enzimas Celulolíticas

En los hongos estas enzimas también son parte importante del sistema de
degradación de la biomasa; son enzimas glucosil hidrolasas y su pape l es la
despolimerización de la celulosa a azúcares simples (Li et al. , 2009;
W ithers , 2001 ).

111. 1. 1. 5. Propiedades y modo de acción de las celulasas

Las enzimas fúngicas han evolucionado mecanismos sinérgicos que les

permiten vencer la recalcitrancia del material celulósico (Zhang et al., 2007).
La máxima actividad de degradación de la celulosa no se da por enzimas
individuales, sino por una mezcla de tres o más enzimas (Martínez et al.,
2008). Esta mezcla, denominada como "complejo enzimático", está formada
por tres tipos de enzimas, que se dividen, de acuerdo al sitio de ataque
sobre la fibrilla de celu losa, en :

Endoglucanasas: son las enzimas que inician el ataque aleatorio sobre

múltiples sitios en las regiones internas amorfas de las fibras de celu losa,
generando oligosacáridos de diferentes tamaños y, por lo tanto nuevas
cadenas term inales. Los sitios generados son posteriormente atacados por
las celobioh idrolasas (Bajaj et al., 2009)

Celobiohidrolasas: son también llamadas exoglucanasas. Son el principal

componente del complejo de celulasas, llegando a representar de l 40 al
70% de éste. Estas enzimas actúan progresivamente en los extremos
term inales del polímero li berando ya sea moléculas de glucosa o celobiosas
(Howard et al., 2003).

B-glucosidasas: son enzimas celulol íticas que rompen los enlaces ~- (1-4 )­
glucosídicos de la celobiosa a monómeros de glucosa (Lynd et al., 2005).
Esta enzima es requerida para realizar de forma completa la hidrólisis, pues
la acumulación de la celobiosa inhibe el proceso (Bezerra & Dias, 2005;
Zhao et al., 2004 ).
En resumen el mecanismo de hidrólisis de las celulasas se real iza de la
siguiente manera; la primera etapa de la hidrólisis enzimática consiste en la
degradación hidrolítica de las regiones amorfas , por medio de las
endoglucanasas, produciendo múltiples cadenas de polímeros de diversas
longitudes. En la siguiente etapa actúan las celobioh idrolasas sobre el
62
extremo no reductor de la cadena , presentando elevada actividad sobre la
celulosa amorfa, dando como producto moléculas de ce lobiosa y finalmente
actúan las ~-glucos i dasas que hidrolizan las moléculas de celobiosa para
liberar la glucosa (Figura 111. 4.) (Mansfield & Meder, 2003, Shao et al.,
2010).

CELULASAS
Elido Exo

Exog~~ ~ ...
Actua sobre extremos no reductores
1
.
~ Exoglucanasas
Acwa sobre cadenas reOJctoras
~. ,. ~.. .,. .. coi8A ~. fl. l'lt.ntrochlHHeCetTa
Endoglucannas
Actua sobfe ceklosa amorfl
E'.p.PJr~E2CeiiA u',.,....,._,"'".-' -

Po. C•I'7A ~ Pc._Cel70

Producto.Colobiosa Productos-Oilg~sacaridos de dlerentes Producto.Celobiosa ~

tamaños ucos
·-t--r-
~ Producto-Glucosa

Figura 111. 4. Mecanismo de la hidrólisis enzimática de /as ce/u/asas

(http://xray.bmc. uu. sel-wimal/projectslresearch. html).

Los productos de la hidrólisis de la celulosa son variables dependiendo de la

fuente y de los microorgan ismos celulolíticos. Se considera que la liberación
de estos azúcares es la base de las interacciones microbianas que se llevan
a cabo en el medio ambiente.

111. 1. 1. 6. Inductores y sustratos de las enzimas celulolíticas

Si bien el inductor real para la expresión del complejo celulol ítico no se ha

determ inado con exactitud, se sabe que la ce lulosa y la celobiosa actúan
como inductores naturales de este complejo . Debido a que la celulosa es
insoluble, cabría pensar que el verdadero inductor debería ser algún
compuesto solu ble, derivado de su metabolismo. La celobiosa junto con la
glucosa son los productos principales de la degradación de la celulosa , sin
embargo esta última y otras fuentes de carbono fácilmente metabolizables,
actúan como represores de la síntesis de endoglucanasas y
celobioh idrolasas. Se ha observado que Trichoderma reesei, aunque crece
muy bien en medios con glucosa , no sintetiza las enzim as ce lul olíticas,

63
hasta haber consumido totalmente la glucosa del medio donde esté siendo
cultivado (Kiyosov et al., 1986).

111. 1. 1. 7. Aplicación de celulasas

Tienen varias aplicaciones, se consideran como la más importante en la

descomposición de las paredes de las plantas, llevando a cabo la hidrólisis
de la celulosa. Existe un gran interés en aplicar estas enzimas en procesos
industriales, convencionales como es el tratam iento de basura, la
conversión de desechos vegeta les en fertilizantes o la industria textil donde
actúan como agentes decolorantes y detergentes quita pelusas (Ovando &
Waliszewsk., 2005). En la industria alimentaria se usan para favorecer la
extracción y filtración de jugos de frutas o verduras , filtración de mostos,
extracción de aceites comestibles, etc. As imismo, se usan en la hidrólisis
parcial de materiales lignocelulósicos para mejorar la digestión de rumiantes
(Ponce & Pérez, 2002).
En la industria energética las celu lasas han cobrado gran importancia para
la producción de biocombustibles a partir de celulosa. No obstante para
poder llevar a cabo estos procesos a gran escala, es cada vez más
importante la búsqueda de enzimas que tengan la capacidad de tolerar
diferentes temperaturas y puedan soportar cambios de pH (Sun & Cheng,
2002).
Además de las aplicaciones comunes las celulasas también son empleadas
en formulaciones para remover el limo industrial, en investigación para la
generación de protoplastos y de quitoo ligosacáridos, los cuales pueden ser
usados en la conservación de alimentos, inmunomodulación y como
potentes agentes antitumorales (Oberman et al. , 1990; Sukumaran et al. ,
2005; Xuanwe i et al., 2008).

Actua lmente las ce lulasas comerciales provienen principalmente de los

géneros Trichoderma y Aspergillus (Ovando & Waliszewsk., 2005; Zhang &
Lynd et al, 2005). Se ha encontrado que los cultivos mixtos conformados por
los hongos mencionados tienen una actividad ce lulolítica superior a la
esperada de la suma de las actividades de cada uno de ellos por separado,
posiblemente por una acción sinérgica (Guevara & Zambrano, 2006; UI-Haq
et al., 2005).

Para incrementar la producción de ce lulasas se están realizando estudios

que perm itan la reducción de la repres ión catabólica , disminuyan la
actividad de proteasas, incrementen el crecimiento de los hongos en medios
simples y con inductores de bajo precio. Además se rea lizan trabajos para
incrementa r la actividad especffica de estas enzimas y por ende dism inuir
tiempos y costos del proceso (Foust et al., 2009; Moreau et al. , 2004).
64
Existen mezclas comerciales de celulasas como la Accellerase™ (de
Genencor ®) que es producida por una cepa recombinante de T. reesei.
Muchos grupos de investigación se hallan en la busca de la generación de
organismos recombinantes capaces de generar grandes cantidades de
enzimas o mejorar su actividad catalítica o estabilidad .

111. 1. 1. 8 . Organismos con actividad celulolítica

Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos

aeróbicos o anaeróbicos, mesófilos o termófilos; sin embargo, solo algunos
de ellos producen las celulasas extracelulares capaces de hidrolizar la
celulosa. En el grupo de bacterias y hongos anaerobios se encuentran los
que habitan las aguas residuales, el rumen y el tracto intestinal de los
animales herbívoros, de algunos insectos como escarabajos y term itas
(Warnecke et al., 2007). En el grupo de especies aeróbicas se encuentran
las que habitan los suelos, especialmente los boscosos, tales como las
bacterias Cellulomonas y Streptomyces y Jos hongos aeróbicos, tales como:
Trichoderma viride, T. reesei, Penicillium pinophilum, Sporotrichum
pulverulentum, Fusarium solani, Talaromyces emersonii y Trichoderma
koningii (Ahmed et al., 2007).

Uno de los principales hongos celulolíticos es T. reesei. Las especies de

Trichoderma son hongos filamentosos que aparecen en cualquier tipo de
suelo, produciendo en cultivo colon ias, amarillas o más típicamente verdes
(Figura 111. 5. ).

Figura 111. 5. Hongo Trichoderma reesei visto al microscopio (Karagiosis S.,

2009).

T. reesei tiene la ventaja de secretar en grandes cantidades la mezcla de

enzimas con las tres actividades celulolíticas lo que perm ite la hidrólisis de

65
celulosas amorfas y cristalinas (Ovando & Waliszewski , 2005); además de
las celulasas produce hemicelulasas (xilanasas). Tiene aplicaciones en la
industria al imentaria (humana y animal), farmacéutica , textil del papel y la
pulpa, y energética (Druzhinina et al., 2005).

Las celulasas de T. reesei tienen la ventaja de ser resistentes a inhibidores

químicos y permanecer estables en reactores agitados bajo cond iciones de
pH 4.8 a 50°C hasta por 48 horas (Ovando & Waliszewski, 2005).

En una gran cantidad de trabajos descritos en la literatura se emplean

enzimas comerciales para la sacarificación (Canilha et al. , 2011 ; Lynd et al. ,
2005; Oraby et al., 2007), pero debido al alto precio de éstas se están
buscando alternativas más económ icas , como es la producción de enzimas
a través del cultivo de microorganismos lignocelulolíticos (Chen et al., 2008,
Sharma et al., 2007). La mayoría de los trabajos de sacarificación que
emplean extractos crudos fúngicos , únicamente toman en cuenta las
celulasas. Sin embargo, en este trabajo se cons ideró evaluar tanto
ligninasas como celulasas, considerando que al crecer los hongos sobre
material lignocelulósico requieren deg radar tanto la lignina como la celulosa ,
por lo que activan su sistema lignocelu lolítico completo, para primero abrir la
lignina y exponer la celulosa , que luego hidrolizan para liberar los azúcares
necesarios para su nutrición.

66
111. 2. MATERIALES Y MÉTODOS
111. 2. 1. Cuantificación de las actividades de ligninasas y celulasas

Se emplearon los hongos T. reesei CDBB-H-353, P. ostreatus ATCC 38540

y P. chrysosporium CDBB-H-686 (colección de cultivo microbianos,
CINVEST AV, México) para obtener las enzimas para la sacarificación . Se
evaluaron también tres hongos aislados a partir de colectas en una
plantación de plátano en Teapa, Tabasco , México. Uno de esos hongos fue
nombrado "Hongo Café" por la coloración que presenta en los diferentes
medios de cultivo. También se emplearon dos hongos con las claves
(arbitrarias) 13-1 y 13-4. Los micelios de los hongos fueron crecidos en
Caldo Papa Dextrosa (sus siglas en inglés son PDB) para generar un rápido
crecimiento.
Los hongos se filtraron en condiciones asépticas, se lavaron con agua
estéril y se transfirieron a un amortiguador de acetato 50 mM pH de 4.8 ,
adicionado con 4 g de harina de pseudotallo de plátano.

111. 2. 2. Actividad de ligninasas

Se prepararon alícuotas con los sobrenadantes de los cultivos y se

adicionaron a tubos de ensaye conteniendo un amortiguador según la
enzima a medir. La actividad de la lignina peroxidasa fue determinada
mediante la oxidación del alcohol veratrílico (Manji & lshihara, 2004), la
actividad de la lacasa fue determinada por la oxidación del ácido 2,2'-
azinobis-(3-ethilbenzotiazolin)-6-sulfónico (ABTS) (Crowe & Olson, 2001;
Mansur et al. , 1997) y la actividad de la manganeso peroxidasa se
monitoreó a través de la oxidación del colorante rojo de fenol (Shrivastava et
al., 2005).

111. 2. 3. Actividad de celulasas

Se realizó un monitoreo para registrar la actividad enzimática en los cultivos

fúngicos e identificar los puntos de actividad máxima.
Las ce lulasas se midieron in vitro usando celulosa como sustrato (Mandel et
al. , 1974) y cuantificando con el método del ácido dinitrosalicílico (DNS)
(Miller, 1959) la cantidad de azúcares reductores liberados.

111. 2. 4. Preparación de extractos enzimáticos

Cada uno de los hongos fue sembrado en un matraz que contenía 1O g de

harina de pseudotallo y se le adicionó 100 mi de amortiguador de acetato
0.05 M pH de 4.8, incubándose a temperatura ambiente, en agitación y en
condiciones de oscuridad .
67
Se inició un seguim iento para rastrear las actividades enzimáticas en los
cultivos fúngicos e identificar los puntos de producción óptimos.

111. 2. 5. Sacarificación de los residuos de plátano

Los extractos enzimáticos fueron añadidos independientemente a cada una

de las harinas pretratadas previamente de forma físico-química . Cada
muestra se dividió a la vez en cuatro subgrupos después del pretratamiento
para aplicar a cada uno los diferentes extractos enzimáticos procedentes de
los hongos lignocelulolíticos en estudio. Los matraces fueron incubados a
35°C durante 96 h y a 100 rpm , con el propósito de observar el potencial de
sacarificación de dichos extractos enzimáticos, muestreando a intervalos de
24 h (Baig et al., 2004; Patel et al., 2007).

111. 2. 6. Preparación de extractos enzimáticos celulolíticos

En este ensayo se trabajaron los hongos analizados anteriormente y se

añadieron a los ensayos dos hongos autóctonos. Para aumentar su
biomasa los hongos primero fueron sembrados en medio PDB. Se tomaron
2 gramos de cada uno de los hongos y sus micelios se filtraron en
condiciones asépticas, se lavaron con agua estéril y se inocularon en un
medio que conten ía carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato. Se
incubaron en condiciones de oscuridad a 45°C a 100 rpm (Mandels et al. ,
1974).
Actividad enzimática (U) fue definida como la cantidad de enzima que
transforma 1 ¡.Jmol de sustrato/minuto. El pH se midió con un potenciómetro
marca SympHony y los AR fueron cuantificados por el método del ácido
dinitrosalicíli co (DNS) (Miller, 1959).

111. 2. 7. Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por triplicado y a los resultados se les

realizaron una comparación de medias por medio de la prueba de LSD.
Para el análisis de los datos experimentales se uti lizó el programa
Statgraphics Centurion versión XV (Statistical Discovery Software).

68
111. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La obtención de biomasa de cada uno de los hongos modelo (T. reesei, P.
ostreatus y P. chrysosporium ) y los hongos autóctonos se obtuvo a partir de
la segunda semana después de la siembra (Figura 11 1. 6.).

Figura 111. 6. Cultivo líquido de /os hongos lignoce/u/o/íticos en medio PDB

para la obtención de biomasa.

111. 3. 1. Cuantificación de enzimas lignocelulolíticas

Las cuantificaciones de ligninasas y los primeros ensayos de celulasas

fueron con los tres hongos modelo T. reesei, P. ostreatus y P.
chrysosporium y el hongo café.
Los extractos enzimáticos fueron cuantificados cada segundo día para las
ligninasas (LiP, MnP y Lacasa) y diario para las celulasas durante 17 días,
para seleccionar el día donde hubiera una mayor actividad enzimática
(Figura 111. 7.). La actividad de ce lulasas y ligninasas se determinó por los
métodos estándares tradicionales (Kirk & Farrell, 1987; Mandels et al.,
1974)

69
Figura 111. 7. Producción de /os extractos enzimáticos lignocelulolíticos
mediante el cultivo de /os hongos en amortiguador de acetato adicionado
con harina de pseudotal/o de plátano.

En la cuantificación de la enzima MnP, el hongo que presentó la mayor

actividad enzimática fue el hongo café con dos picos de actividad, al día 7
(488.76 U/L) y el día 17 (567.88 U/L). Sin embargo como concluyó el tiempo
de monitoreo no se observó el momento en que declinó su actividad. El
segundo hongo con la mayor actividad fue P. ostreatus con 444.7 U/L. De
los hongos a los que se les cuantificó la actividad de la enzima MnP sólo T.
reesei no presentó una cons iderable actividad. Los otros hongos mostraron
una actividad enzimática que puede considerarse como opción para la
producción de esta enzima ligninol ítica (Dhouib et al., 2005; Kalm is et al.,
2008) (Figura 111. 8.).

70
 700
- r . reesei
- P.chrysosporium
..,._ P. ostreatus
600
........ Hongo café

:::J 500
2
0..
~ 400
QJ
"'C
"i
"'C
300
:~
tí
< 200

100

3 5 7 9 11 13 15 17
Tiempo de cultivo (d)

Figura 111. 8. Monitoreo de la enzima Manganeso peroxidasa en extractos

enzimáticos.

La actividad de LiP sólo pudo observarse en el extracto del hongo P.

chrysosporium (6 509.6 U/L). La actividad sólo se presentó entre los días
siete a nueve (Figura 111. 9.). Las condiciones de cultivo fueron favorables
para P. chrysosporium ya que presentó una mayor actividad de LiP que la
reportada en otros trabajos (Dhouib et al., 2005; Kalmis et al., 2008).

71
 ~ T. reesei
8000
- P. chrysosporium

7000 -+-P.ostreatus
~ Hongo café

6000

::J
2. 5000
D..
:J
~ 4000
"O
n:J
"O

~ 3000
:t
2000

1000

3 5 7 9 11 13 15 17
Tiempo de cultivo (d)

Figura 111. 9. Monitoreo de la enzima Ugnina peroxidasa en extractos

enzimático preparados a partir de cuatro cultivos fúngicos.

La actividad de Lacasa se detectó en todos los hongos con excepción del T.

reesei. Las mayores actividades las mostraron P. ostreatus y el hongo café,
con un valor de 730.16 U/L. La diferencia entre ambos hongos fue que P.
ostreatus presentó su máxima actividad el día 7 mientras el hongo café el
día 13 del cultivo (Figura 111. 10.). La actividad obtenida con estos hongos
fue muy parecida a la reportada por Vaithanomsat et al., 2010 (759.81 U/L)
en un ensayo con las condiciones óptimas para la expresión de la enzima
del hongo Datronia sp. KAPI0039.

72
 900 - r.reesei
- P.éhrysoSporium

-~ 800
700
-
P. ostreatus
HongocaM

.......
il

u 600
..J
,• 500
,-¡
'$
400
~ 300
e(

200
100
o
1' 3 5 7 9 11 13 15 17
Tiempo de cultivo (d)

Figura 111. 10. Monitoreo de la enzima Lacasa en extractos enzimáticos

de cuatro cultivos fúngicos .

En cuanto a la actividad de las celulasas se pudo observar que la cepa de

P. chrysosporium presentó dos picos; el primero fue el día dos, luego
disminuye de manera drástica y reiniciar una semana después y se
mantiene durante 4 días. El hongo café mostró un perfil similar en el pico de
actividad de celulasas comparables con el hongo T. reesei (32 222.2 U/L)
(Figura 111. 11.).

73
 40000.0 - r. reesei
-e- P. chrysosporium
35000.0 1 P. ostreatus
- Hangocafé
~30000.0 1
al
:25000.0 1

~ 20000.0 j
~ 15000.0
:! 1
~ 10000.0 1

5000.0

0.0 -->" ,

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Tiempo de cultivo (d)

Figura 111. 11. Monitoreo de actividad de ce/u/asas durante 16 días en /os

extractos de /os diferentes hongos cultivados con harina de pseudotallo
como fuente de carbono.

Con base en los resultados obtenidos en cuanto a la producción de las

enzimas ligninolíticas y celulolíticas , se estableció el día diez de cu ltivo
como el más adecuado para la obtención de las enzimas para la posterior
sacarificación , ya que los hongos muestran actividad en ese momento de
las ligninasas o de celulasas o de ambas. Una vez determinado el tiempo de
cosecha se realizó una nueva siembra de los hongos en un medio líquido a
base de amortiguador de acetato 0.05 M pH de 4.8 y harina de pseudotallo
como fuente de carbono, se incubó 1O días. Después se realizó la obtención
de los extractos por medio de centrifugación (Figura 111. 12.) para emplearlos
en la sacarificación del materiallignocelulósico previamente pretratados.

74
Figura 111. 12. Extractos enzimáticos de ligninasas y ce/u/asas recuperados
para la hidrólisis biológica de los desechos de plátano.

111. 3. 2. Sacarificación de los residuos de plátano.

En el cap ítulo JI se concluyó que el pretratatam iento que perm itió la mayor
liberación de azúcares reductores fue el pretratamiento con HCI al 3% más
calor húmedo. Sin embargo se consideró que este pretratamiento podía
generar compuestos inhibitori os que afectaran la sacarificación con los
extractos enzimáticos , por tal motivo se real izó la sacarificación de muestras
con los pretratamientos fís icos y químicos que se presentaron en el capítu lo
11.

Matraces con 6 g harina en proporción 1:1 (harina de pseudotall o y harina

de plátano verde ) se sometieron a diferentes pretratam ientos químicos: HCI
al 3%, NaOH al 3% y HCI al 3% seguido por NaOH al 3%. Posteri ormente,
todos los matraces fueron sometidos a calor húmedo por 15 minutos
(Capítulo 11). Antes de añad ir las enzimas se les ajustó el pH a 4.8. Se
añad ieron los extractos enzimáticos en los diferentes hidrolizados se
colocaron en ag itación a 37°C en condiciones de oscu ridad y esterilidad .
Todos los ensayos se real izaron por tripl icado (Figura 111. 13.).

75
Figura 111. 13. Harinas de desechos de plátano sometidas a pretratamiento
químico y adicionadas con extracto enzimático para su sacarificación.

Se cuantificaron los azúcares reductores monitoreando los hidrolizados por

96 h divididas en intervalos de 24 h.

76
111. 3. 2. 1. Sacarificación del material pretratado con ácido más calor.

Se observaron diferencias significativas con respecto a la cantidad de AR al

inicio y térm ino de la sacarificación . Con las cond iciones de pretratamiento
ácido y calor húmedo se observó que el hongo P. ostreatus y T. reesei
tuvieron la máxima liberación de azúcares reductores al día tres de
sacarificación. El hongo P. chrysosporium mostró al tercer dia de la
sacarificación un descenso drástico de los azúcares presentes en el
hidrolizado.
80 - T. reesei
- P.chrysosporium
~ P. ostreatus
70
.....,Hongo café
::J
:§¡ 60 - Control Químico
U)
~ 50
B
o
:::1
40
al...
U)
~
30
"'
(.)
•:::1 20
~
10

Tiempo de sacarificación (d)

Figura 111. 14. Monitoreo de /os azúcares reductores, liberados durante la

sacarificación con los extractos de enzimas ligninocelulolíticas en la mezcla
de harina de plátano y pseudotallo (1 :1) pretratada con 3% HCI y calor.

77
1,11. 3. 2. 2. Sacarificación del material pretratado con álcali más calor.

La cantidad de azúcares no mostró un incrementó significativo al comparar

la cantidad de AR iniciales con los AR liberados por la sacarificación
enzimática después del pretratameinto alcalino (Figura 111. 15. ). El
pretratamiento alcalino produjo 1.37 g/L de azúcares reductores y el mayor
aumento de azúcares liberados fue con P. ostreatus el cual produjo 2.08 g/L
en este caso .

- r. reesei
3 -e- P.chrysosporium
-r-P. ostreatus
2.5 - Hongo café
- - Control Qufmico

1.5

0.5

o
o 2 3 4
Tiempo de sacarificación (d)

Figura 111. 15. Monitoreo de /os azúcares liberados por el pretratamiento

alcalino más calor combinado con /os diferentes extractos de enzimas
lignocelulolíticas.

78
111. 3. 2. 3. Sacarificación del material pretratado con ácido más álcali y
calor.

Después de haber aplicado el pretratamiento quJmJco (ácido+álcali) en

conjunto con el calor húmedo, la cantidad de azúcares liberados fue muy
baja.
Sin embargo, durante este pretratamiento se observó un ligero aumento de
AR comparado con la cantidad liberada únicamente con el pretratamiento
alcalino, cabe destacar que la cantidad de AR obtenida en esta condición es
mucho menor que la obtenida con el pretratamiento ácido. Dado que la
cantidad de azúcares liberados en este proceso no es significativa, el
proceso no es atractivo para la obtención de etanol a partir de residuos de
plátano (Figura 111. 16.).

6 - - r.reesel
- - P.chrysosporium
T P. ostreatus
5
::::;- 1 - - Hongo café
$ - - Control Qulmico
1/1
4
f
o
t)
,~
1
3
f
1/1
._
Gl
2
"'
o
•:1
~

2 3 4

Tiempo de sacarificación (d)

Figura 111. 16. Monitoreo de los azúcares liberados durante el pretratamiento

ácido-alcalino combinado con los diferentes extractos de enzimas
lignocelulolíticas.

Comparando los tres pretratamientos (ácido, alcalino, ácido-alcalino) la

mejor sacarificación se logró cuando el material fue pretratado con el ácido.
Al emplear el extracto enzimático de P. ostreatus sobre la mezcla de las
harinas pretratadas con HCI al 3% se obtuvo un incremento de hasta 63.7
giL de los AR, mientras que con los extractos enzimáticos de los demás
79
hongos la cantidad de AR liberados fue significativamente diferente con
respecto al control químico. Se observa el nivel máximo de sacarificación
entre las 48 y 72 h, dependiendo del hongo empleado. Los AR declinaron
después de éste período de tiempo. Es importante considerar que para la
sacarificación se empleó el extracto crudo de cada hongo, donde las
enzimas presentes pueden no estar necesariamente actuando de forma
sinérgica, existiendo la posibilidad de que alguna pueda inhibir o retrasar la
actividad de otra.

En la evaluación de las actividades de ligninasas se encontró que P.

chrysosporíum presentó actividad de MnP y LiP, las cuales requieren la
presencia de peróxido de hidrógeno. Este H2 0 2 es producido por los hongos
ligninolíticos a través de la glucosa oxidasa y la glioxal oxidasa (Kersten,
1990). En estudios realizados en P. chrysosporíum se ha observado que la
glucosa oxidasa es el principal sistema para la producción de peróxido de
hidrógeno, para lo cual consume glucosa (Kersten & Kirk, 1987). Con base
en estos datos, la disminución drástica del conten ido de azúcares en el
ensayo de sacarificación de los residuos de plátano con las enzimas de P.
chrysosporíum puede deberse a que en el extracto crudo se encuentran
estas oxidasas. Durante este ensayo se empleó en conjunto tanto ligninasas
como celulasas esperando que las ligninasas degradaran la lignina y las
celulasas la celulosa que quedara expuesta, sin considerar la posibilidad de
que el producto liberado por las celulasas (la glucosa) podría ser empleada
para la producción del peróxido requerido para la activación de las
ligninasas (LiP y MnP).

Considerando los resultados de la sacarificación después de los diferentes

pretratamientos se decidió continuar solamente con el pretratamiento ácido
y calor húmedo, por ser con el que se liberó la mayor cantidad de AR . Sin
embargo, considerando la disminución drástica de los AR del hidrolizado
sacarificado con el extracto enzimático de P. chrysosporíum , se propuso
que esto se debiera a la presencia simultánea de ligninasas y celulasas , por
lo que se planteó incrementar las celulasas y reducir la producción de
ligninasas cultivando los hongos sobre celulosa en vez de lignocelu losa,
esperando que esto estimulara la actividad celulolítica (Rodríguez &
Piñeros, 2007). Para ello se evaluaron formulaciones preparadas con las
sales de Mandels (Mandels et al., 1974) y empleando Avicel, CMC y
lignocelulosa como fuentes de carbono .

Al cuantificar las actividades celulolíticas de los diferentes hongos se

observó un comportamiento distinto dependiendo del medio (Mandels y
Avicel , Mandels y CMC , Mande! y material Lignocelulós ico, Kirk y material
lignocelulósico). De las formulaciones probadas el medio de Mande! y CMC
permitió aumentar la cantidad de las celulasas en los hongos en estudio y al

80
ser empleadas estas celulasas en la sacarificación del hidrolizado de
plátano, el hongo que liberó la mayor cantidad de AR fue T. reeseí. Esto
coincide con lo reportado por Yoon & Kim (2005 ) donde indican que la
especificidad de las reacciones enzimáticas es sens ible a los cambios en
las propiedades estructurales de los sustratos celulósicos, lo que influye en
el proceso de degradación celulósica.

Una vez determ inadas las condiciones de cultivo para la producción de

celu lasas (Med io Mandels con CMC como fuente de carbono), se incluyo en
el estud io a dos hongos autóctonos identificados arbitrariamente como 13-1
y 13-4. Estos hongos fueron se leccionados entre una colección fúngica
aislada a partir de una plantación de plátano con base en que fueron los que
presentaro n los halos más grandes de actividad celu lolítica. Otra
característica por lo que fueron seleccionados estos hongos es por no
poseer actividad ligninol ítica (Castillo-Ávila, 201 O).

111. 3. 4. Cuantificación de celulasas de hongos autóctonos obtenidas

con el medio sales de Mandels y CMC

Se eva luó la producción de celulasas de dos hongos autóctonos (1 3-1 y 13-

4) provenientes de plantaciones de plátano de Teapa, Tabasco.
El hongo 13-4 alcanza su máxima actividad al día cuatro , mientras que T.
reesei y el hongo 13-1 lo hacen en el día seis para posteriormente dism inuir.
La actividad de T. reesei (54 571.01 U/L) fue mayor que la de los hongos
autóctonos (Figura 111. 18.). Al comparar la cantidad de celulasas de T.
reesei de la figura 111 . 11 . con la actividad presentada en la figura 111. 18. se
obseNa que T. reesei tiene casi el doble de actividad; además la actividad
máxima se obtiene en un menor tiempo . Al dia dos la actividad de los
hongos autóctonos era igual sin embargo T. reesei mostro diferencias
significativas con respecto a ellos. En las mediciones siguientes so lo se
obseNo una diferencia significativa en el dia seis, cuando T. reesei presenta
su máxima actividad . En los días ocho, diez y doce no hubo diferencia
significativa entre T. reesei y el hongo 13-4, y nuevamente se observa
diferencia entre ellos en el día catorce.

81
 .....,_ T. reesei
70000
- Hongo 13-1
- . - Hongo 13-
::::! 60000
2..
~ 50000
en
:a"'
~

~ 30000
40000
........,....
'ti
"'
:S! 20000
>
:¡::¡
~ 10000

o +----T----~---r----r----r--~
2 4 6 8 10 12 14

Tiempo de cultivo (d)

Figura 111. 17. Monitoreo de la actividad de ce/u/asas de los hongos

autóctonos 13-1 y 13-4 y comparados con Trichoderma reesei.

111. 3. 4. 1. Sacarificación de harinas pretratadas con ácido empleando

celulasas de hongos autóctonos

Para probar la capacidad de sacarificación de los hongos autóctonos estos

se cultivaron y se colectaron sus extractos en el día seis del cultivo, los
extractos enzimáticos fueron añadidos a una mezcla de harina de plátano
previamente pretratada en forma física y química (pretratamiento ácido y
calor húmedo).

Los análisis de varianza mostrarán que entre el hongo T. reesie y los

hongos autóctonos hubo diferencia significativa en los AR liberados durante
los primeros dos días. Sin embargo, la cantidad de AR fue estadísticamente
igual en los días tres y cuatro del ensayo. El valor máximo obtenido fue 69.4
g/L con la cepa T. reesei en el día dos de la sacarificación, mientras que con
las cepas autóctonas 13-1 y 13-4 se obtuvieron los valores máximos de 61.7
y 65.8 g/L respectivamente, en el día tres de la sacarificación (Figura 111.
18.).

82
 80.0 - r. reesei
_._ Hongo 13-1
70.0 --tr- Hongo 13-4
::i'
sUl
60.0
...o
Gl

-u
::;,
"C
50.0

40.0
1!!
Ul
30.0
1!!
1'11
u
·:::J 20.0
N
<C
10.0

0.0
o 2 3 4
Tiempo de sacarificación (d)

Figura 111. 18. Monitoreo de /os azúcares liberados durante la sacarificación

de una mezcla de harinas (1 : 1), empleando el extracto enzimático obtenido
de cultivos fúngicos de la cepa del hongo Trichoderma reesei y los hongos
autóctonos 13- 1 y 13-4 en medio de Mandels con CMC.

Parte de los resultados de este capítulo fueron publicados en el articulo

"Saccharification with Phanerochaete chrysosporium and Pleurotus
ostreatus enzymatic extracts of pretreated banana waste" de la revista
African Journal of Biotechnology Vol. 10(19}, pp. 3824-3834, 9 May, 2011 .

83
111. 4. CONCLUSIONES
Con base en los resultados, se concluye que los hongos autóctonos 13-1 y
13-4 proven ientes de las plantaciones de plátano tienen la capacidad de
producir celulasas y sacarificar-los residuos de plátano. Estos hongos logran
alcanzar la sacarificación del resid uo de manera significativamente similar a
la capacidad de T. reesíe, hongo reportado como buen productor de
celulasas. Por lo anterior se considera el potencial de la aplicación de los
hongos autóctonos de Tabasco para la sacarificación de residuos de
plátano.

84
111. 5. REFERENCIAS
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92
CAPÍTULO IV. FERMENTACIÓN
IV. 1. Introducción

La fermentación es una práctica muy antigua, realizada en muchas culturas

del mundo. Ha llegado a trascender sus fronteras de origen para convertirse
en un proceso cotidiano empleado en diferentes procesos: los ejemplos más
comunes son la elaboración de cerveza, vino, quesos y el pan , siendo la
fermentación alcohólica una de las más estudiadas (Saha, 2003).
Es un tipo de catabolismo parcial, que se caracteriza por ser un proceso de
oxidación incompleta, tfpico de los organismos anaeróbicos. Durante la
fermentación, la energía obtenida procede, al igual que en la respiración
aerobia, de las reacciones de oxido-reducción realizadas durante la
glucólisis, pero en la fermentación las coenzimas reducidas no ceden sus
electrones a una cadena cuyo aceptar final es el oxígeno, sino a un
compuesto orgánico que se reduce y es el producto característico de cada
fermentación (láctica, alcohólica, etc.) (Páres & Juárez, 1997; Stanbury et
al., 1995).
El proceso metabólico que se produce en la elaboración del pan es una
fermentación alcohólica. Se realiza por levaduras y ciertas bacterias que
poseen el enzima alcohol deshidrogenasa. Las moléculas de glucosa
(presentes en la masa) sufren glucólisis originando ácido pirúvico. Este
ácido pirúvico en condiciones anaeróbicas se descarboxila para
transformarse en acetaldehído, el cual se reduce a alcohol etílico por acción
del NADH2 conviertiéndose sí en el aceptar final de los electrones del
NADH obtenido en la glucólisis (Freeman, 2004).

Un gran número de materias primas que contienen azúcares pueden ser

transformadas a etanol. La variedad de materiales empleados se dividen en
tres tipos: azúcares, almidones y materiales celulósicos, la fermentación de
estos últimos es la más compleja (Abril & Abril, 2009).

IV. 2. Factores externos e internos que afectan la fermentación

Un proceso de fermentación típico se lleva a cabo en un fermentador o

bioreactor, donde los sustratos que componen el medio de cultivo son
transformados en metabolitos y biomasa por acción microbiana. El
microorganismo aumenta su población en el transcurso del proceso, al
mismo tiempo el medio se va modificando y formando nuevos productos,
como consecuencia de las actividades catabólicas y anabólicas. Algunos
reactores permiten manipular las variables físicas (la temperatura, la
agitación , aireación, etc.) y fijar o regular la alimentación de los
componentes de los medios (Yasuya et al. , 2004).

93
También influye en la fermentación la genética intrínseca del organismo
utilizado y sus mecanismos de regulación metabólica , los cuales pueden ser
modificados por alteraciones del medio ambiente mientras que la presencia
o ausencia de un gen depende de la especie de microorganismo
cons iderado (Bamforth , 2005; Degis et al., 1995).

IV. 3. Parámetros de la fermentación

Velocidad de fermentación: Se determina cuantificando la cantidad de

azúcar fermentada por unidad de tiempo y unidad de peso de levadura; la
velocidad de fermentación debe ser alta para disminuir riesgos de
contaminación (Páres & Juárez, 1997; Stanbury et al., 1995).

Rendimiento: Es" la relación entre el alcohol producido y el que

teóricamente se puede producir en función de la cantidad de azúcar
utilizada.

Medio de dilución: El medio de dilución es generalmente agua , aunque se

utilizan otros disolventes que no reaccionen quím icamente con el medio.

IV. 4. Características deseables en los microorganismos productores

de etanol

Las características deseadas en el proceso industrial de producción de

etanol (Lie et al., 2001) son las siguientes:

• Alta capacidad fermentativa

Alto rend imiento de producto por unidad de sustrato asimilado
Sustancial tolerancia al etanol
Habilidad para permanecer viable a elevadas temperaturas
Tolerancia a bajos pH.
Estabilidad a las cond iciones generales de la fermentación

Los microorganismos utilizados en la industria etanólica son seleccionados

para proporcionar la mejor combinación posible de características para el
proceso y equipo usado (H eldman & Newsome, 2003; Páres & Juárez,
1997).
Con un apropiado microorganismo productor de etanol , teóricamente de 100
g de glucosa puede producir 51.4 g de etanol y 48.8 g de dióxido de
carbono. Sin embargo, en la práctica los microorganismos emplean parte de
la glucosa para su crecim iento y la producción de otros metabolitos , por lo
que el rendim iento es menor al 100%; el rendimiento experimental puede
variar significativamente del teórico. Los rendimientos teóricos en la
94
industria se encuentran entre 87 y 93%. Con los materiales lignocelulósicos
se tiene como valor máximo el 85% del teórico (Vázquez & Dacosta, 2007).

El contenido alcohólico del líquido fermentado depende entre otras cosas de

la cantidad de azúcar de los zumos o macerados utilizados para iniciar la
fermentación. Debido a la influencia del alcohol producido sobre la fisiología
de la levadura, la fermentación se desarrolla en distintas fases y se va
haciendo más lenta a medida que aumenta el contenido alcohólico, hasta
alcanzar un máximo, que dependiendo de la tolerancia de la levadura
pudiera ser del orden de 7-18%, en donde la fermentación se detiene por
completo; solo cuando la levadura es modificada genéticamente se excede
este porcentaje. Si la materia prima contiene azúcares polivalentes
(disacáridos o polisacáridos) , antes de la fermentación las enzimas que
contienen las levaduras los descomponen en monosacáridos para después
fermentarlos (Haq, 2005).

Una levadura con alta resistencia al alcohol presenta grandes ventajas

técnicas. Su uso permite obtener mostos con gran riqueza alcohólica, lo que
mejora el proceso, ya que se consigue una destilación menos costosa ,
puesto que habrá menos consumo de combustible.

Además de la resistencia al alcohol la levadura debe poseer resistencia a la

acidez, ya que este parámetro se utiliza en ocasiones para combatir
contaminaciones; igualmente, debe resistir cambios de temperatura.

IV. 5. Producción de etanol

Entre las materias primas para la producción de etanol se encuentran frutas

y vegetales azucarados como la caña de azúcar y la remolacha ; materias
primas almidonosas como cereales (trigo, maíz, sorgo), tubérculos (papa,
yuca) y materiales lignocelulósicos como residuos agroindustriales (por
ejemplo bagazo de caña, rastrojo de maíz, cascarilla de arroz) (Sánchez &
Cardona, 2005; Zheng et al., 2007).
Es un proceso común llevado a cabo por muchos microorganismos que se
hallan en situación de anaerobiosis. La levadura Saccharomyces cerevisiae
se ha convertido en el microorganismo de referencia en cuanto a la
fermentación alcohólica en el área alimentaria. En las levaduras la
producción de etanol deriva únicamente de la vía glucolítica de Embden-
Meyerhof-Parnas, en donde la glucosa fosfato es transformada en dos
triosas fosfato: gliceraldehído-3-P y dihidroxiacetona fosfato . El
gliceraldehído-3-P es a continuación transformado en piruvato (Figura IV.
1.). Este se convierte en etanol y dióxido de carbono en un proceso en dos
pasos. En el primer paso, el piruvato se descarboxila en una reacción
irreversible catalizada por la piruvato descarboxilasa. En el segundo paso, el

95
acetaldeh ído producido se reduce a etanol por acción de la enzima alcohol
deshidrogenasa, usando el NAD H proveniente de la deshidrogenación del
gliceraldeh ído 3-fosfato.

Por otra parte, la dihidroxilacetona fosfato generada durante la glucólisis

pasa también a gliceraldeh ído 3-fosfato, por lo que por cada molécula de
glucosa se generan dos de etano l, dos moléculas de C0 2 , 2 de ATP , 2 de
H20 y se ox idan las dos molécu las de NADH obtenidos durante la glucólisis
(Freeman, 2004).

De acuerdo al cálculo realizado sobre la reacción qU1 m1ca, el etanol

resu ltante es casi un 51% del peso (Sánchez & Cardona, 2005).

C_,H 12 CJe----- ;----\.

.
1O Reacciones
HC
3
o
\\
.
//

P1ruvato
o

0
_
aeróbico
-+-~:.:..:..:..::.__ _. C02 +H20
Saccharomyces

--===-- -.. C~CH30H

Cf!fevi:;iaf;.

(etanol)

Figura IV. 1. Rutas del Piruvato en relación a la presencia o ausencia de

oxígeno (Modificado de Biosca, 2002).

Se debe considerar que el etanol va aumentando su concentración durante

el proceso de fermentación y debido a que es un compuesto tóxico , cuando
su concentración alcanza aproximadamente un 12% de volumen, las
levaduras tienden a morir (Epifa nio, 2005).

Desde hace muchos años se sabe que existe una inhibición del crecimiento
microbiano debido al etano l. La adición de etanol durante la fase logarítm ica
del cu ltivo microbiano ocasiona una rápida reducción del crecimiento
(posible efecto sobre la síntesis de proteínas), dism inución de la viabilidad
(desnaturalización irreversible de enzimas), así como también una
disminución en la propia producción de etanol (Ansanay et al., 2001 ; Brown
et al., 1981 ). La tolerancia al etanol que llegan a presentar ciertas levaduras
depende del conten ido de ácidos grasos que componen su membrana
plasmática , ya que esta composición favorece o inhibe la excreción del
etanol (Schmidt et al., 2006; Mishra & Ka ur, 1991).
Se ha demostrado que el etanol producido durante la fermentación (etanol
autógeno) afecta más fuertemente el proceso de crecimiento celular que el
96
etanol añadido (exógeno), probablemente porque el etanol exógeno alcanza
concentraciones intracelulares menores. La célula modifica la composición
de ácidos grasos de la membrana para minimizar los efectos de la
disminución de la fluidez que produce el etanol (Guerzoni et al. , 1999). Esta
modificación consiste básicamente en un enriquecimiento en esteroles y
ácidos grasos de cadena larga (M ishra & Kaur, 1991 ). La bacteria
Zymomonas mobí/is) tiene una tolerancia osmótica a concentraciones
superiores de azúcar con un máximo de 140 g/L. Esta resistencia es por la
presencia de ácidos grasos insaturados (Carey & lngram, 1983).

IV. 6. Limitantes del proceso

Son varios los factores que limitan la fermentación alcohólica y puede haber
interrelación entre ellos (Freeman, 2004). Los más importantes son:

Concentración de azúcares.- La concentración debe ser inferior al

22% para evitar frenar la actividad microbiana. Estudios reportan
que concentraciones de azúcares entre 120 y 180 g/L, disminuyen
el crecimiento y la viabilidad de las levaduras debido a que les
ocasiona estrés osmótico (Arrizon & Gschaedler, 2002). Las
concentraciones límite dependen del tipo de azúcar, así como del
microorganismo responsable de la fermentación .

• Concentración de etanol resultante.- El límite de etanol producido

depende también de la susceptibilidad de las levaduras al etanol
que se produce durante la fermentación (concentración de 7-18%)
(Folch et al., 2004; Sánchez & Cardona, 2005).

Acidez del sustrato.- Generalmente el funcionamiento de las

levaduras está en un intervalo de pH de 4.0 a 5.5. Durante la
fermentación industrial se procura mantener los niveles óptimos de
acidez mediante el empleo de soluciones amortiguadoras, ya que
las levaduras se ven claramente afectadas por el ambiente, bien
sea alcalino o ácido (Páres & Juárez, 1997).

• Temperatura.- Es un factor que depende en gran parte de la

temperatura óptima del microorganismo fermentador; sin embargo,
generalmente se mantiene el proceso en intervalos de temperatura
mesofílica (Fernández et al., 2008; Páres & Juárez, 1997).

Contacto con el aire.- La influencia del oxígeno en la fermentación

alcohólica mediada por levaduras aerobias facultativas puede
inhibir o estimular, según la dosis. Algunos estudios plantean que, si
97
 bien el oxígeno es necesario para que las levaduras desarrollen un
metabolismo respiratorio, no es condición suficiente para que el
metabolismo se dirija hacia esta vía . En el caso de Saccharomyces
cerevisiae incluso en presencia de oxígeno por encima de un
determinado umbral de glucosa, el metabolismo es fermentativo
(Freeman, 2004; Spencer & Ragout, 2001 ).

Nutrientes y Activadores .- Además de los azúcares que requieren

para su catabol ismo, los microorganismos fermentativos también
requieren de nitrógeno, fósforo , carbono, azufre, potasio, magnesio,
calcio y vitaminas , especialmente tiamina (vitamina 81 ). Es vital que
el medio disponga de una base nutricional adecuada para llevar a
cabo la fermentación alcohólica. El nitrógeno es el más importante,
siendo necesario que el mosto contenga inicialmente nitrógeno
amoniacal y en forma de aminoácidos. También esteroles y ácidos
grasos insaturados de cadena larga son necesarios para que las
membranas celulares del microorganismo puedan ser funcionales
(Luong , 2002; Stanbury et al., 1995).

IV. 7. Levadura Saccharomyces cerevisiae

Levadura es un nombre genérico que agrupa a una variedad de hongos no

filamentosos , incluyendo tanto especies patógenas para plantas y animales,
como especies inocuas de gran utilidad (Bennett, 1998).

Las levaduras son capaces de utilizar una diversidad de sustratos. Por

ejemplo Saccharomyces cerevisiae puede utilizar glucosa , maltosa,
maltotriosa, trealosa , galactosa, manosa, fructosa , sacarosa, rafinosa y
deoxiribosa (Wang et al., 2004). Aunque la producción de etanol es mayor a
elevadas temperaturas (40°C), la productividad general de la fermentación
decrece debido a la inhibición por producto (Kiran et al., 2000).

Dentro del género Saccharomyces la especie cerevisiae constituye la

levadura y el microorganismo eucarionte más estudiado (Figura IV. 2.). Este
organ ismo se conoce también como la levadura de panadería, ya que es
necesario agregarla a la masa para preparar el pan, para que este esponje
o levante; de hecho el término levadura proviene del latín levare, que
significa levantar (Folch et al., 2004; Lei, 2001 ).

98
Figura IV. 2. Imagen al microscopio de la levadura Saccharomyces
cerevisiae, responsable de gran parte de las fermentaciones alcohólica
(www.biologia. blogger.com. br/2008).

Entre los muchos microorganismos que han sido explotados para la

producción de etano l, S. cerevisiae sigue siendo uno de los principales (Bai
et al., 2008; Dengis, 1995). Este microorganismo muestra fases de
crecimiento bien defin idas (Figura IV. 3.): la fase lag , la fase logarítmica, la
fase estacionaria y la fase de declinación o muerte. La fase lag es un
periodo de adaptación en el cua l la cé lula se prepara para divid irse . Durante
la fase logarítmica las células alcanzan su máxima velocidad de duplicación
y llevan a cabo un metabolismo fermentativo en el que se produce el etanol.
La fase estacionaria se presenta cuando los nutrientes del medio se han
agotado y no hay división celular. La fase de declinación o muerte es
cuando el número de célu las que mueren es mayor que el número de
células que se dividen (Luong, 2002 ; Madigan et al. , 2004).

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Figura IV. 3. Curva de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae, A) Fase
Lag, B) Fase Logarítmica, C) Fase estacionaria, O) Fase de declinación
(Modificado de Madigan et al., 2004).

IV. 8. Uso de levaduras termotolerantes en los procesos de obtención

de etanol

En un proceso industrial de producción de etanol el empleo de levaduras

termotolerantes evita los problemas asociados por el sobrecalentamiento de
los fermentadores , obviando la necesidad de enfriam iento. Estos
microorgan imos perm iten por lo tanto la reducción de las interrupciones del
proceso debido al sobrecalentamiento que a menudo se producen en países
donde la temperatura ambiente es alta (arriba de los 3JOC) (Kiran et al.,
2000) y la reducción de los costos de producción (Fernández et al., 2008).
Otras ventajas de utiliza r altas temperaturas en el proceso son el aumento
de la productividad, la red ucción de los riesgos de contam inación, y una
mayor facilidad en la recuperación del producto.
Además de las ventajas mencionadas, la utilización de levaduras
termotolerantes permite ll evar a cabo un proceso de sacarificación y
fe rmentación simultanea (SFS), ya que se puede trabajar cerca de la
temperatura óptima de la enzima celulasa (aprox. 50°C). Entre las levaduras
más citadas por su capacidad de rea lizar la fermentación alcohó lica por
encima de los 40°C se encuentran especies pertenecientes a los géneros
Gandida (Bai et al. , 2008), Kluyveromyces (Ballesteros, 2002) y algunas
cepas de S. cerevisiae (Fern ández et al., 2008; Za ldívar et al., 2001 ).

100
IV. 9. Fermentación de diferentes materias primas

IV. 9. 1. Fermentación para obtener etanol a partir de caña de azúcar

La levadura Saccharomyces cerevisiae es capaz de hidrolizar la sacarosa

de la caña de azúcar liberando glucosa y fructosa , dos hexosas fácilmente
asimilables (Serrano & De la fuente , 1974). Además puede desarrollarse en
cond iciones anaeróbicas, pero necesita pequeñas cantidades de 0 2 para la
síntesis de sustancias como ácidos grasos y esteroles.
El proceso típico de producción de alcohol es en lotes a partir de melazas o
jugo de caña comprende la esterilización de la materi a prima, seguido del
ajuste del pH con H2 S0 4 y de los 0 Brix a valores de 14-22, y el mosto
obtenido se somete a fermentación (Echegaray et al. , 2000).
La fermentación semicontinua implica bajos niveles de concentración de
sustrato en el transcurso de la fermentación , mientras que el alcohol se va
acumulando en el medio. Este es el proceso empleado en Brasil para la
obtención de etanol (Fernández et al., 2008).
Los procesos continuos tienen mayores ventajas frente a los procesos por
lotes debido a que necesitan menores requerimientos de mantenimiento y
operación , tienen mejor control del proceso, a la vez que han mostrado una
mayor productividad (Monte et al., 2003). La clave de este proceso son las
mayores densidades celulares, las cuales se pueden alcanzar por
inmovilización de células, recuperación y reciclaje de biomasa o control del
crecim iento celula r. Sin embargo, las levaduras cultivadas por períodos
prolongados en condiciones anaeróbicas dism inuyen su capacidad de
producir alcohol (Ciaassen et al., 1999).

IV. 9. 2. Fermentación para obtener etanol a partir de almidón

Muchas clases de biomasa contienen almidón, el cual puede ser empleado

como sustrato en procesos microbianos. Estos sustratos incluyen el maíz, el
arroz, la papa y la yuca. La estructura qu ímica del almidón consiste en una
mezcla de dos polímeros, la amilosa y la amilopectina; ambos polímeros
están formados por unidades de glucosa. En el caso de la amilosa las
unidades están asociadas por enlaces a (1-4), lo que da lugar a una cadena
lineal, mientras que en el caso de la am ilopectina, aparecen ramificaciones
debidas a enlaces a (1-6) (Abouzied & Reddy, 1987; Young et al., 2007).

El alm idón debe primero ser descompuesto en azúcares simples

fermentables, tales como la maltosa y dextrosa, usando para ello enzimas
obtenidas usualmente de fuentes microbianas (Gorosquer, 2004). Los
granos (por ejemplo maíz) son agrupados y calentados (160-180°C} para
gelatinizar o solubilizar el almidón. Algunas preparaciones líquidas de las
101
enzimas pueden ser añad idas después de bajar la temperatura. El almidón
líqu ido es enfri ado a 65°C y tratado con amilasa de malta o de hongos, para
convertir el almidón en oligosacáridos (Joshi, 2001 ). Luego, la levadura es
añadida junto con amiloglucosidasa (o glucoamilasa), los cuales convierten
los oligosacáridos en glucosa. Los procesos de fermentación y refinación
posteriores son los mismos que se real izan cuando se usan azúcares
directos como materia prima.

Aún cuando la fermentación del almidón se considera un proceso

establecido y con el que se obtiene generalmente buenos rendim iento se
debe considerar que los costos de producción son elevados debido al alto
consumo energético en el proceso de cocción y por la adición de grandes
cantidades de enzimas amilolíticas (Matsumoto et al., 1985).

IV. 9. 3. Fermentación de material/ignoce/u/ósico.

La fermentación de los hidrolizados lignocelulósicos es más difícil de

realizar que los procesos establecidos para azúcares libres o para el
almidón (Qi et al., 2005; Sánchez & Cardona, 2008). Al hidrolizarse la
hem icelulosa libera no solo hexosas sino también pentosas, donde la xilosa
y la arabinosa son los azúcares predominantes. Ad icionalmente los
hidrolizados lignocelulósicos contienen un amplio número de inhibidores,
cuya compos ición y concentración depende del tipo de material, naturaleza
del pretratam iento y el proceso de hidrólisis (Lier et al., 1999; Nigam , 2001 ;
Vázquez & Dacosta , 2007). Por lo anterior los organismos fermentadores
empleados en los hidrolizados lignocelulósicos, deben tener cierta
resistencia a los inhibidores producidos durante los pretratamientos, y
capacidad para fermenta r pentosas, para dar altos rendimientos y
productividad (Jeffries, 2006).

Para poder aprovechar la xilosa se requ ieren microorganismos como

Pachysolen tannophilus y Candida shehatae. Actualmente se están
modificando microorganismos como S. cerevisiae, Zymomonas mobilis y
Escherichia coli para darles la capacidad de utilizar azúcares que no
fermentan de forma natural, además de otorgarles la capacidad de
tolerancia a inhibidores y aumentar sus rendimientos de producción de
etanol (Aimeida et al., 2007; Jeffries & Jin, 2004; Klinke et al., 2004).

102
IV. 10. Destilación

El pri ncipal problema de la producción del etanol es el alto costo energético

que conlleva su deshidratación , ya que el caldo de fermentación tiene bajas
concentraciones de alcohol (entre 5-12% en peso), por lo que para elim inar
el.exceso de agua se requ iere de una serie de destilaciones.
El principa l objetivo de la destilación es separar los distintos componentes
de una mezcla aprovechando para ello sus distintos grados de volatilidad .
Otra función de la destilación es separar los elementos vo látiles de los no
volátiles. La destilación etanólica separa el etanol del agua con base en la
diferencia de los puntos de ebullición. Para realizarla se emplea un
recipiente para calentar la mezcla, un condensador para enfriar los vapores
y los recipientes receptores para recoger los líqu idos condensados.
La destilación sigue dos métodos principales. En el primer método la mezcla
se cal ienta a una temperatura constante. Este método es simple, pero tiene
la desventaja que la obtención del alcohol es de una pu reza lim itada
(Ch ianese & Zinnamosca, 1990).
Un segundo método es la destilación fraccionada; es más efectiva para
separar líquidos con puntos de ebullición similares. Este método se basa en
el uso de un gradiente de temperaturas en la etapa del condensador del
equipo; a menudo en esta técnica se utiliza un condensador vertical o una
columna. Mediante la extracción de líquidos a diferentes alturas en la
columna, es posible extraer los que tienen diferentes temperaturas de
ebullición (y condensación ). En cond iciones ideales, la destilación puede ser
utilizada para efectuar una sepa ración cas i completa de un líquido respecto
a otro. Las fracciones se pueden pu rificar aún más mediante una segunda
desti lación.
Existe también la llamada destilación extractiva que se realiza con una
combinación de una sal y un disolvente como agente de separación ; esta
técnica permite la obtención de productos de alta pureza. Este proceso
integra la destilación extractiva tradiciona l con el principio del efecto salino,
en donde la disolución de la sal, la reuti lización y el transporte son
mejorados por el disolvente. Tiene la ventaja adicional de que se reduce la
cantidad de agente de separación , lo cual disminuye los requerimientos
energéticos de manera sustancial (Vásquez et al. , 2007).

La destilación no es eficaz para la recuperación de muchos productos de

fermentación por lo que se están desarrollando y utilizando técnicas de
menor costo y que requieran menor consumo energético total. En un
proceso de obtención de etanol a partir de maíz, la destilación llega a
consum ir cerca del 40% del gasto energético total. Entre las técnicas
alternas a la destilación podemos encontrar los procesos de deshidratación
por diferencia de tamaño molecular, la adsorción con tamices moleculares y
103
la pervaporación . También se realizan técn icas de precipitación y
separación por diferentes tipos de membranas (Uyazán et al., 2004). En
ocasiones para mejorar la eficiencia de separación al menor costo posible
se lleva a cabo la combinación de técnicas. Estas combinaciones se
consideran procesos híbridos y uno de Jos ejemplos más prometedores es
el sistema de destilación-pervaporación (Szitkai et al., 2002). Sin embargo,
estas técnicas están en desarrollo y aún no se aplican de manera general
en la investigación y en la industria.

En este capítulo se presenta la fermentación del hid rolizado que produjo la

mayor cantidad de azúcares reductores liberados. Con base a los
resultados presentados en los capítulos 11 y 111 , éste hidrolizado fue al que se
le aplicó el pretratamiento con ácido HCI al 3%, calor húmedo, y que
también fue sacarificado co n el extracto enzimático obtenido del hongo T.
reesei.

104
IV.11. MATERIALES Y MÉTODOS

Solo se llevó a etapa de fermentación el hidrolizado que obtuvo la cantidad

más alta de azúcares reductores después del pretratam iento y la
sacarificación .

IV. 11 . 1. Hidrolizado

Se fermentó el hidrolizado preparado a partir de 12 g de mezcla de harina

de pse udotallo y fruto, en relación 1: 1, pretratado con HCI al 3% y calo r
húmedo, y saca ri ficado con el extracto enzimático de T. reeseí. Se empleó
la combinación de estas cond iciones con base en que fueron las que
lograron la mayor liberación de azúcares reductores entre las cond iciones
evaluadas (ver capítu lo 11 1). La cantidad de azúcares reductores que ten ía el
hidrolizado al iniciar la fermentación fue de 67.2 g/L. Para la fermentación se
empleó la mezcla conten iendo tanto la fracción líquida y como la sólida del
hidrolizado.

IV. 11. 2. Curva de crecimiento de la levadura Saccharomyces

cerevisiae en hidrolizados de plátano. Preparación del inóculo para la
fermentación.

Se empleó como inóculo un cultivo de la levadura S. cerevísíae (Marca

comercial Safoeno Safmex S.A. de C.V., México). La levadura se sembró en
medio Gelpa (Peptona 1O g/L, Glucosa 20 g/L, Extracto de levadura 5 g/L, y
Agar 20 g/L). Se incubó por tres días a 3o•c y luego se evaluó la viabil idad
depositando una alícuota en una cámara de Neubauer. Como agente de
tinción vital se empleó el colorante azu l de metileno, el cual permite
diferenciar las cé lulas vivas de las muertas. Se cuantificó el número de
células vivas en el microscopio y se ajustó la cantidad de levadura a 3 x 107
cellmL. Conside rando que los hidrolizados contienen compuestos liberados
durante el pretratamiento que pueden afectar el crecim iento y función de la
levadura, se realizó la adaptación de las levaduras en los hidrolizados antes
de inicia r la fermentación . El hidrolizado empleado para la adaptación de la
levadura se obtuvo tras la fi ltración de la harina de plátano pretratada y
7
sacarificada . Se inocularon 3 x 10 cellmL en un matraz de 250 mL que
contenía 100 mL del hidrolizado de plátano. Se añadió sulfato de amonio
(1.5 g/L) y se incubó a 30°C, en agitación orbita l a 150 rpm . Se monitoreo el
crecimiento de la levadura tomando muestras cada 3 horas para evaluar la
concentración ce lular y la viabilidad del cu ltivo de la levadura.

105
IV. 11. 3. Fermentación

Una vez obtenido el inóculo éste se añad ió al hidrolizado en una proporción

10% (v/v), ajustando en la muestra la concentración inicial de la levadura a
7
3x1 0 cel/mL. Se homogenizó la mezcla y se dejó en incubación durante 3
días a 30°C. Se monitorearon los azúcares reductores y los grados Brix. La
toma de muestras para cuantificar los azúcares reductores fue cada 12
horas y para los grados Brix fue cada 24 horas. El volumen del hidrolizado
de plátano que se fermentó fue de 100 ml.

IV. 11. 4. Destilación de los fermentados

Posterior a la fermentación se rea lizó una destilación fraccionada utilizando
una columna Vigreux. Se obtuvieron tres fracciones: cabeza, cuerpo y cola.
La primera fracción corresponde a los componentes que se evaporaron a
una temperatura entre 45 y 7JOC y se le llama cabeza. La segunda fracción
es llamada cuerpo y es la que se evapora a una temperatura entre 78 y
85°C, y finalmente se colecta la cola del destilado, a temperatura entre 86 y
95 oc. Seguidamente se determinó la concentración de etanol en las tres
fracciones del destilado. El volumen del fermentado que se destiló fue de
100 mL.

IV. 11. 5. Métodos analíticos

La concentración de sólidos totales ( Brix) fue determinada co'n un

0

refractómetro portátil (Cole-Parmer). Los azúcares reductores fueron

cuantificados por medio del método del ácido 3,4-dinitrosalicilico (DNS)
(Miller, 1959). La absorbancia fue medida en un espectrofotómetro a 550
nm y la concentración fue calculada empleando una curva de calibración
preparada con concentraciones conocidas de glucosa.

Antes de la fermentación , los azúcares liberados durante el pretratamiento y

la sacarificación del material lignocelulósico fueron identificados por medio
de cromatografía líqu ida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en ingles)
se utilizó un equipo marca Agilent Series 1100 con un detector de Índ ice de
Refracción. La columna empleada fue una ZORBAX Carbohydrate de 4.6 x
150 mm (Ag ilent Technologies ). Para determinar los tiempos de retención
de los azúcares (xil osa , glucosa, manosa, arabinosa, sacarosa) se
prepararon disoluciones patrón con azucares estándar (marca Sigma-
Aidrich). Los azúcares estándares fueron elegidos con base en reportes de
la composición química de las diferentes partes del plátano (Chen et al.,
2011; Cordeiro et al., 2004; Mohapatra et al. , 2010; Oliveira et al., 2007).
Las cond iciones de operación fueron: la fase líquida móvil en proporción

106
75:25 de acetonitrilo-agua de grados reactivos para HPLC, 30 bar de
presión y flujo de 1.8 ml/m in durante 15 minutos.

El etanol fue cuantificado por dos técnicas, la técnica del dicromato de

potasio-H 2S04 y por cromatografía de gases.

En el primero la concentración de etano1lobtenido se cuantificó midiendo en

un espectrofotómetro a 585 nm (Bennett, 1971 ).
Para la cuantificación del etanol por medio de cromatografía de gases se
uso un equipo Perkin Elmer Clarus 500, equipado con un Detector de
Ionización de Flama (FID). La columna utilizada fue EC™-WAX (30 m de
longitud y 0.53 mm de diámetro); y se utilizó nitrógeno como gas
acarreador. El horno fue operado con una rampa de temperatura de 50, 100
y 200°C, la temperatura en el detector fue de 200°C y en el inyector 200°C.
En ambos casos las concentraciones de etanol fueron determinadas por
comparación con una curva de ca libración.

Todos los experi mentos se realizaron por triplicado.

107
IV. 12. RESUL TACOS Y DISCUSIÓN
Como se mencionó anteriormente se realizó una comparación de
pretratamientos y extractos enzimáticos para eleg ir el que liberara la mayor
cantidad de azúcares reductores y posteriormente llevarlo a la etapa de
fermentación . La combinación que perm itió la mayor liberación de azúcares
fue una hidrólisis con HCI al 3% más calor húmedo, seguido de una
sacarificación con el extracto enzim ático del hongo T. reesi (Capítu lo 11 y 111).

Una limitante para la obtención de etanol a partir de materiales

lignocelulósicos es la mezcla de azúcares liberados (5 y 6 carbonos ) que
dificultan la fermentación. Por tal motivo se identificaron los azúcares
liberados durante el pretratam iento y la sacarificación , para determinar la
abundancia de pentosas.
En la figura IV.4. se observa el cromatograma obtenido para la mezcla de
los estándares de los azúcares ana lizados.

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Figura IV. 4. Cromatograma de la mezcla de azúcares estándares
separados por HPLC. La señal observada con el tiempo de retención de
2. 181 minutos corresponde al sistema móvil.

En el aná lisis por HPLC de la mezcla de harina después del pretratamiento

con ácido y calor se observó la presencia de dos picos principales. Con
base en los tiempos de retención determinados en el cromatograma con los
estándares se concluyó que esos azúcares eran manosa y glucosa, siendo
estos los principales azúcares reportados en trabajos de caracterización
química de diferentes partes morfológicas del plátano (Chen et al., 2011 ;
Khalil et al., 2006; Ol iveira et al., 2007).

En el cromatograma obtenido del material con pretratamiento qu1m1co

también se observó la presencia de un pico pequeño (indicado con la flecha
en la figura IV. 5.), el cua l por su tiempo de retención sugiere que es un
disacárido. El único estándar con el que se contó fue la sacarosa y su
108
tiempo de retención no coincide con el observado en el hidrolizado (12.666);
es posible que éste azúcar no identificado sea el disacárido celobiosa
(Figura IV .5.).

.,,.... ....'"
o...,
e:
"' ..2
Cl

Figura IV. 5. Cromatograma de /os azúcares presentes en el hidro/izado

después del pretratamiento químico.

En el cromatograma del material pretratado y después sacarificado con el

extracto enzimático de T. reesei se aprecian también los dos picos
generados por la manosa y la glucosa. El pico de menor área observado en
el cromatograma del tratamiento ácido ya no se observó (Figura IV. 6.). Si
nuestra hipótesis de que corresponde a celobiosa es correcta, el complejo
de enzimas celulasas (exoendoglucanasa, endoglucanasas y ~-glucosidas)
de T. reesie fue probablemente responsable de su hidrólisis.

Figura IV. 6. Cromatograma de los azúcares liberados en la harina de

plátano después del pretratamiento químico y la sacarificación enzimática
con enzimas de Trichoderma reesei.

En el análisis de la muestra pretratada química y sacarificada

enzimáticamente se modificó el flujo de la fase móvil de 1.8 mUmin a 1
mUmin esperando obtener una mejor definición del pico de la glucosa. Sin

109
embargo fue todo lo contrario; la separación entre los dos picos se hizo más
amplia y se perd ió definición de ellos.

No se cons ideró que la presencia de manosa en el hidrolizado pud iera ser

limitante en el proceso de fermentación , ya que S. cerevisiae fermenta por
la vía Embden-Meyerhof a la glucosa, la manosa y la fructosa (Van Maris
et al. , 2006).

El hidrolizado inició la etapa de fermentación con una concentración de 67.2

g/L de azúcares reductores y 8 oBrix. El volumen del hidrolizado que se
fermentó fue de 100 mL.

La viabilidad que se obtuvo para el primer inóculo de la levadura S.

cerevisie en el med io Gelpa, fue de 52.5%. Dado que es importante tener un
buen inóculo al iniciar la fermentación , se cons ideró que la viabilidad era
baja, por lo que se realizaron subcultivos para mejorarla. Se utilizó un
inóculo que alcanzó 89.7% de viabilidad. Con dicha viabilidad se ajusto el
inóculo a una concentración de 3 x 107 cel/mL en la fase de adaptación en el
hidrolizado; se obtuvo la cuNa de crecim iento en estas condiciones .

La cuNa de crecimiento de S. cerevisiae mostró que que esta levadura es

capaz de crecer de manera eficiente en el hidrolizado de plátano (Figura IV.
7.), y que su máxima producción de biomasa se alcanzó a las 21 h; se
decid ió iniciar la fermentación con un inóculo de 16 h, para que la levadura
se encontrará en la etapa de crecimiento exponencial y no al final de ésta.

2.50E+08
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§
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u 5.00E+07
e
o
o
O.OOE+OO
o 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

110
Figura IV. 7. Curva de crecimiento de Saccharomyces cerev!s/ae en
hidro/izado de plátano, después del pretratamiento ácido y la sacarificación.

IV. 12. 1. Fermentación de los hidrolizados

Una vez añadido el inóculo al hidrolizado se dejó fermentar por 72 horas

(Figura IV. 8.). Se observó el inicio de un ligero burbujeo a las 10 hrs que
concluyó aproximadamente a las 48 hrs.

Figura IV. 8. Fermentación de /os hidro/izados de plátano (material

lignocelulósico) usando como inócu/o 10% de levadura Saccharomyces
cerevisiae.

El monitoreo del consumo de los azúcares reductores durante la

fermentación se presenta en la figura IV. 9.

111
 70.0

60.0
:::¡
s
0::
50.0
~
Cll 40.0
'ti
e
·O
'¡j 30.0
..
l'G
e
Cll 20.0
(.)
e
o
(.) 10.0

0.0
o 20 40 60 80

Tiempo de fermentación (h)

Figura IV. 9. Monitoreo de la disminución de /os azúcares reductores en /os

hidro/izados de plátano durante la fermentación con la levadura
Saccharomyces cerevisiae.

Du rante la fermentación la cantidad de azúcares reductores dism inuyó de

67.2 g/L a 49.1 g/L, lo que indica que hubo un consumo de solo 27% del
inicial. La disminución de los azúcares reductores se observó principalmente
durante las primeras 24 horas, posteriormente el consumo de los azúcares
fue un proceso lento.

El monitoreo de los grados Brix durante la fermentación permitió evaluar la

dism inución de los sólidos totales. Las cuantificaciones se rea lizaron cada
24 horas (Figura IV. 10.).

112
 9.0
8.0 l
X
•¡: 7.0
lXI

,"'o
ftl
6.0
!;¡, 5.0
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..
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4.0

. 3.0
CIJ
u
o
c..2.0
l. O

0.0
o 20 40 60 80
Tiempo de fermentación (h)

Figura IV. 10. Monitoreo de /os grados Brix durante la fermentación de /os
hidro/izados.

La medición de los grados Brix con el refractómetro mide las variaciones

que experimenta la refracción de un líquido al modificarse su contenido de
sustancias disueltas. Al igual que los azúcares reductores la disminución de
los grados Brix no fue elevada y se observó principalmente en las primeras
24 horas. Los grados disminuyeron durante la fermentación de 8 a 5.2 °8rix.

Ya que la levadura solo consumió aproximadamente un tercio del azúcar

que está presente en el medio se considera que probablemente existan en
el medio compuestos que hayan sido liberados durante el pretratamiento o
la sacarificación que disminuyen la capacidad fermentativa de S. cerevisiae.
Aunque fue posible monitorear la curva de crecimiento de S. cerevisiae
durante la fase de adaptación (Figura IV. 7.), su crecim iento es menor y más
lento de acuerdo a Franco-Brito y Barahona-Pérez (comunicación personal).
En el Gelpa obtuvieron 2.9 x 108 de células a las 12 horas, a diferencia de la
8
concentración obtenida en el hidrolizado de plátano que fue de 1.8 x 10 a
las 21 h. El menor crecim iento observado en el hidrolizado evidencia que la
levadura tuvo dificultad para crecer en este medio, lo cual puede ser una
causa probable de la baja producción de etanol (Larsson et al. , 2000; Smets
etal., 2010).

113
Al terminar las 72 horas de la fermentación los hidrolizados fueron
destilados. Se obtuvieron 3 destilados cada uno a diferente temperatura.
Los volúmenes obtenidos de las tres fracciones fueron los siguientes, la
cabeza fue de 2.3 ml, el cuerpo de 3 ml y el volúmen de la cola fue de 3.8
ml. Se pudo detectar un ligero aroma a alcohol y dulce en las fracciones
destiladas.
Al cuantificarse la cantidad de etanol mediante el cromatógrafo de gases los
porcentajes obtenidos del volumen de etanol en las tres fracciones fueron
los siguientes: Cabeza 10.7%, Cuerpo 15.3% y Cola 7% (Figura IV. 8.).

20.0
18.0
16.0
~
> 14.0
~
~
oe 12.0
S
w 10.0 • Cabeza
,
Cll
8.0 • Cuerpo
e
·O
'ü 6.0 • Cola
"'
b
e 4.0
Cll
u
e 2.0
o
u 0.0
Cabeza Cuerpo Cola
Fracciones destiladas

Figura IV. 11. Concentración de etanol presente en cada una de las

fracciones destiladas (Cabeza, cuerpo y cola).

Considerando que la temperatura de ebullición del etanol se encuentra entre

78 y 79°C, la mayor cantidad del etanol se concentró en la fracción llamada
cuerpo (temperatura de 78 a 85 °C).

Tomando en cuenta la consideración de 85% de eficiencia para la

fermentación de un material lignocelulósico (Vázquez & Dacosta, 2007) y
debido a que la cantidad de azúcares reductores con el que se inició el
ensayo de fermentación fue de 67.2 giL, se esperaba una producción de
etanol de 29.1 g/L.Sin embargo, la levadura únicamente logró consumir 18.1
g/L de azúcar y solo se obtuvo una concentración de etanol de 0.882 g/L.
114
Con estos datos se puede decir que el proceso de fermentación enfrentó
dos problemas: baja eficiencia en el consumo de azúcares y baja eficiencia
de la fermentación de los azúcares consumidos.

Los datos indican que muy poco del azúcar consumido en la fermentación
fue transformado en etanol. Por lo que probablemente los azúcares fueron
empleados para la producción de otros subproductos. Uno de estos
subproductos pudiera ser el glicerol (Scanes et al., 1998). Este subproducto
es de importancia para la levadura ya que la protege del estrés osmótico del
medio (Omori et al., 1995; Rem ize et al., 1999).

La poca producción de etanol también pudo deberse a diversos factores que

ya sean en forma individual o en conjunto dieron como consecuencia una
baja fermentación . Entre estos factores está el porcentaje de viabilidad del
inóculo que se empleó (89.7%), ya que es aconsejable iniciar con una
viabilidad por arriba del 98%. Otra posible causa del bajo consumo de
azúcares, es la pos ible presencia de inhibidores producidos con el
pretratamiento ácido (Garcés, 2004; Taniguchi et al. , 2005).

Es importante remarcar que en este trabajo, se consideró para integrar el

proceso de producción de etanol utilizar el material pretratado completo y no
sólo la parte líquida. Se empleó el material completo para evitar posibles
pérdidas de azúcares potencialmente fermentables, minimizar los
volúmenes de agua que son empleados en los lavados y reducir los costos
del proceso al evitar el paso de filtración (Palmqvist et al. , 1996). La
utilización del material pretratado completo (con la carga de sólidos) puede
hacer que el proceso de producción de etanol a partir de biomasa
lignocelulósica sea económicamente rentable (Galbe & Zacchi , 2002). Sin
embargo, hay que tener en cuenta que una mayor concentración inicial de
sólidos implica también el riesgo de una mayor concentración de tóxicos en
el medio de fermentación , lo que pudo llegar a ser en este caso una
limitación importante del proceso.

115
IV.13. CONCLUSIÓN
Los azúcares en el hidrolizado de desechos de plátano fueron manosa y
glucosa.

La cuantificación de los AR antes y después a la etapa de fermentación

evidenció que la fermentación fue incompleta , puesto que solo se consumió
el 27% de los AR (18.1 g/L). La concentración de etanol obtenido fue de
0.822 g/L

El consumo de los azúcares ocurrió únicamente en las primeras 24 horas

del proceso.

116
IV. 14. REFERENCIAS

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123
124
CAPÍTULO V. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES GENERALES

La necesidad de obtener combustibles alternos que ocasionen menor daño

que el petróleo, coloca al etanollignocelulósico en un punto importante en la
investigación.

Los casos limitantes del proceso de obtención de etanol que están en

investigación son : la etapa de los pretratamientos físico-químicos, los
tratamientos biológicos y la fermentación.

Este trabajo tuvo como objetivo explorar la factibilidad de obtener etanol a

partir de residuos de plátano y lograrlo por medio de pretratamientos poco
agresivos y costosos. Con base en trabajos reportados con otros residuos
lignocelulósicos (Saha et al. , 2008; Sánchez & Cardona, 2005; Shah et al. ,
2005) se implementó la combinación de pretratamientos para obtener la
mayor liberación de azúcares reductores que fuera posible. La primera
etapa del proceso consistió en un pretratamiento físico , donde el material
fue molido hasta partículas de 2 mm de diámetro, de tal forma que este
tuviera una mayor superficie de exposición para el pretratamiento químico.
El tamaño de la partícula fue mayor que la usada en otros trabajos y de esta
forma se invierte menos energía en el proceso (Balan et al., 2009; Shah et
al. , 2005).
La segunda etapa consistió en hidrolizar el material, para esto se evaluaron
diferentes pretratamientos químicos (HCI 3%, NaOH 3% y HCI-NaOH 3%)
en combinación con calor. La hidrólisis ácida (HCL 3%) con la aplicación de
calor húmedo fue la que permitió en este caso liberar la mayor cantidad de
azúcares reductores (41.42 g/L). En otros trabajos se ha visto la necesidad
de probar pretratamientos para cada material lignocelulósico (Chen et al. ,
2008, Telli & Eken, 2006). La variación que hay en la composición química
de cada material no ha permitido unificar un pretratamiento que sea
aplicado para todos los materiales (Hernández et al., 2009, Monsalve et al.,
2006). A diferencia de otros materiales lignocelulósicos, la naturaleza
estructural de los residuos de plátano permitió implementar un
pretratamiento con condiciones poco agresivas (Khalil et al., 2006). Las
condiciones de temperatura , tiempo y presión usadas son empleadas de
manera común en los laboratorios o en la industria.

Para realizar la etapa de sacarificación se cuantificaron extractos

enzimáticos de los diferentes hongos (de referencia y autóctonos), a los que
se les evaluaron las actividades de ligninasas (LiP, MnP y Lacasas) y
celulasas. Inicialmente se consideró que la presencia de ligninasas y
celulasas en un mismo extracto enzimático permitiría una mayor liberación
de los azúcares contenidos en los residuos de plátano. Uno de Jos hongos
ligninolíticos más importantes, P. chrysosporíum posee los dos tipos de
125
enzimas (Kirk et al., 1986; Venkatadri & lrvine, 1990; Wenj un &
Renganathan, 1992).
Con este hongo, sin embargo, se observó que al momento de llevar a cabo
la sacarificación la cant idad de azúcares disminuyó en lugar de aumentar.
La posible razón es la acción de enzimas degradativas de la glucosa como
lo es la glucosa oxidasa o glioxal oxidasa, parar generar H2 0 2 , que es un
cofactor de la LiP ( lzum i et al., 1990; Kersten & Kirk, 1987; Koker et al.,
2004), que es una de las principales enzimas producidas por el hongo.
Con base a esa hipótesis y a datos de sacarificación de otros materiales
lignocelulósicos, se cultivaron los hongos en condiciones que favorecieran
la producción de celulasas (Ximenes et al., 2007). Las mayores actividades
de celulasas se obtuvieron con el hongo modelo T. reesei y el hongo
autóctono denominado hongo café.
Aunque inicialmente se cons ideró que los hongos autóctonos iban a
sacarificar mejor a los res iduos de plátano por estar adaptados a este
material, fue el hongo modelo T. reesei con el que se obtuvierón los mejores
resu ltados en la sacarificación. El hongo T. reesei se caracteriza por
producir un complejo de enzimas celulósicas (endoglucanasa y
exoglucanasas ), por lo es ampliamente empleado en procesos de
sacarificación de diversas materias primas (Liming & Xueliang , 2004;
Rodríguez & Piñeros, 2007; Sukumaran et al., 2005). Debido a que en este
ensayo se combinaron el pretratamiento qu ímico y biológico, la cantidad de
azúcares reductores liberados fue mayor que el reportado en otro trabajo
donde solo se aplicó tratam iento biológico (Ba ig et al., 2004). A diferencia
de la mayoría de los reportes de sacarificación en el presente estudio se
emplearon extractos enzimáticos producidos en el propio laboratorio.
Generalmente se emplean celulasas comerciales las cuales son enzimas
purificadas. Sin embargo eso aumenta de forma importante el costo del
proceso.
La sacarificación aumentó los azúcares de 41.42 g/L del material pretratado
con ácido y ca lor a 67.2 g/L. Esta cantidad de azúcares es mayor que el
alcanzado con otros materiales lignocelulósicos (Bakker et al., 2004; Yu et
al. , 2010) y es mayor a otros reportes de hidrólis is lignocelulósica de plátano
(Baig et al., 2004; Monsalve et al., 2006; Shah et al., 2005; Tewari et al.,
1986 ).
Por lo tanto los resu ltados del pretratamiento y sacarificación obtenidas en
este trabajo son aceptables (Keller et al., 2003; Te lli & Eken , 2006).

Debido a la heterogeneidad de los azúcares y otros compuestos que se

liberan durante la hidrolisis de la biomasa lignocelulósica su fermentación es
más compleja. En la mayoría de las fermentaciones de hidrolizados
lignocelulósicos se emplea la combinación de microorgan ismos, donde uno
fermenta pentosas y otro las hexosas. En ocasiones también se llegan a
emplear microorgan ismos modificados genéticamente que son capaces de
126
fermentar los dos tipos de azúcares (Lebeau et al. , 1997; Sa ha et al. , 2008;
Sreenath et al., 2005). Sin embargo, en este estudio la fermentación se
real izó con S. cerevisiae debido a que solo se detectó la presencia de
glucosa y manosa en las muestras después de haber sido pretratadas y
sacarificadas, siendo estos azúcares capaces de ser fermentados por la
levadura empleada (Van Maris et al., 2006).
A pesar de que la fermentación inició con una cantidad suficiente de AR
(67.2 g/L), al final los rendimientos obten idos no correspondieron a los
esperados. No se realizó una caracterización completa del hidrolizado, por
lo que no se descarta la presencia de algún tipo de inhibidor que evitó una
correcta fermentación .

En resumen , los res iduos de plátano pueden cons iderarse una buena
opción para la obtención de azúcares fermentables. Debido a su
composición química no requieren pretratamientos agresivos para liberar los
azúcares que la conforman (HCI al3%, a 120°C, 15 Lb durante 15 minutos).

El extracto enzimático de T. reesei se cons ideró como una buena opción

para la sacarificación. Con el extracto enzimático se incrementó a 62% la
cantidad de AR respecto del contenido en el hidrolizado
termoquímicamente. El aumento de los AR de 25.78 g/L con el extracto
enzimático es alto comparándo con el logrado por otros reportes (Baig et al.,
2004; Singh et al. , 2008).

El tratam iento biológico permitió aumentar la concentración de los AR pero

es importante mencionar que el pretratamiento es necesario para facilitar la
hidrólisis enzimática.

Aún cuando ya se han rea lizado diversos trabajos para obtener etanol de
materiales lignocelulósico, no existe un protocolo que pueda ser aplicado
para todos los materiales. La complejidad de la biomasa lignocelulósica , así
como la variabilidad en su composición hace necesario el establecim iento
de protocolos particulares. Los residuos que quedan de la cosecha de
plátano no se aprovechan en nuestro país y en otros países; de lograrse
optimizar la fermentación se puede considerar una alternativa como materia
prima para la obtención de etanol , en base a que son una fuente de AR. El
uso de estos residuos para la producción de combustibles alternativos
proporcionaría beneficios, ya que es una fuente de materia prima de alta
distri bución , no compite con el sector de los alimentos y al ser material de
desecho es barato, además de que su utilización contribuiría a la limpieza
de las zonas donde se desechan y se lograría darle un va lor agregado a
este material.
Se recom ienda considerar enfocarse en la optimización de su fermentación
para lograr su aprovechamiento en la producción de etanol.
127
V. 2. REFERENCIAS

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130
VI. PERSPECTIVAS.

Este trabajo exploró la posibilidad de la obtención de combustibles alternos

en nuestro país a partir de los desechos de plátano. Sin embargo falta
entender algunos aspectos para mejorar los rendimientos en cada una de
las etapas del proceso, algunos de ellos comprenden,

• Establecer un pretratam iento que permita la completa liberación de

los azúcares fermentables de los residuos de plátano, sin ser un
pretratamiento agresivo ni costoso.

• Determinar las cond iciones específicas de cultivo para incrementar

la actividad celulolítica de los hongos que podrían emplearse
durante la etapa de la sacarificación .

• Deberá evaluarse analíticamente la posible presencia de inhibidores

de la fermentación.

• Mejorar el rendimiento del etanol modificando las condiciones de

fermentación, por ejemplo monitoreando la producción de etanol
durante el proceso, modificando la concentración del inóculo o bien
probar otra cepa de levadura que tenga mayor tolerancia a los
principales compuestos que pueden generarse durante los
pretratamientos (probablemente presencia de furfural,
hidroximetilfurtural, ácido glucorón ico, etc).

• Los cultivos lignocelulósicos de plátano permiten el cultivo de

hongos, por lo que pudieran usarse de sustrato para la producción
de ligninasas y celulasas fúngicas.

131
132
ANEXO A

Articul o publicado co n resultados presentados e n los capítul os JI y 111.

A~icanJo"'nal or BlottiCITJology Vol. 10( 19~ ·PP. 382•·3834. 9 May. 2011

Availablt onli,. atlmpttwww.aea<ttmk:joumaltor9'AJB
ISSN 1684-5315C 2011 AcadorrlcJoumals

Fui/ Length Research Paper

Saccharification with Phanerochaete chrysosporium

and P/eurotus ostreatus enzymatic extracts of
pretreated banana waste
Xenia Mena-Espino\ Felipe Barahona-Pérez 2, Llliana Alzate·Gaviria2, Refugio Rodríguez·
Vézquezs, Miguel Tzac· Si m ' , Jorge Domfnguaz-Maldonado 2 and Slondy B. Canto·Canché ' •
' Unidad d Biotocnologla. Centro d tnvesllgaclbn Clon1illcD d Yucatan, A.C.. Mórlda. Yucatan, Mó~lco .
'Unidad d Enorgln Ronovntie. Cerero d Investigación Clonllflel do Yucatin, A.C .. MórldD. Yucutén. Miixlco.
"Departamento do Blotocnologla y 6\olngonlcrla, CtNVESTAV·ZBCitonco, Móxlco.
Acc:tpted., FtbrU&I), 201 1

Llgnocelluloslc blomess hes 1 gr1111 polenllal es raw materlallor second and lhlrd generallon blo·luels
slnce lt ls the most ebundant cerbohychte on aarth and the maln component ol egrlculturel westa:
however, saccharmcallon ol llgnocelluloSic blomass ls crucial tor the establishment of a cerbohydrale-
based economy, The use of fungal enzymes ls the prelerred procedure lor llgnocelluloslc
saccharlflcallon. Fungl su eh n be sldlomycelts (e.g P!Janerochoele chrysosporlum) produce
celkllolyllc•hemlcelluiOiytlc and llgnlnolyllc ·enzymes, Whlch are responslb le for llgnocellulose
degradatlon. In thls study lhe saccharlflcellon of banana llour p111parad from pseudostem and green
non cornmerclal.grado lrull (1:1), two ollhe maln agro-waste ol banana lndustry was lnvestlgated. The
meterla! was plllt!llaled by physlcel tnd chemlcel prooesses lncludlng drylng and grlndlng, followed by
3~• HCI or 3'• NaOH hydrolysls, ora sequentlal pllltrBalment wllh 3% HCI llrsl and lhen 3 ~• NaOH and
heated al 121 "0, al 15 Lb'ln' for 15 mln. The hlghest concentratlon ol reduclng sugars (RS) was
obtalned wlh acid hydrolysls (42.41 gL·'¡, Cruda cellulolytlc·lignlnolytlc enzyrnatlc exlracls lrom
P1eurolus ostreatus and P. chrysosporium culturad on banana waste as the only carbon source were
prepared and used for the saccharJlcatlon. Surprisingly, P. chrysosporium crude extracl produced a
·decrea!l& in RS (2.27 gL·'¡. Although P. oneatus celkllose activlty (17,777.78 UL' 1) was almosl haJ
comparad to P. chrysosporium"s (31 ,296.30 UL' 1) , lile lormer produoed an lncrement In lhe release ol
AS (63,o65 gl' 1). In Mexlco, banana ls one of the maln crops and generales large agrlcullural waste alter
harvest. According to t he resulls oblained wllh acld·heal pretreatmenl followed by saccharil icaUon wllh
P. oslrealus enzymatic cruda extract, banana ago-wa,_e can be considerad as a polellllal feedslock lor
RS-!>ased bloproducls llke bloethanol.

Key words: Banana waste, lignocellulosic. pretreatmen1S. saccharification. reduclng sugars.

JNlAOOUCTJON

At p~esent oll ls the most wlclely used luel in a great
majorHy or activities : however. 1t ls a linlte and scaree
resource. with exceplionally high operalion costs In
&ddition to mejor environme n1al lmpacts. Lignocellulosic
biomass. lhe most abundan! carbohydrate source on
·correspondlng aulhcr. E·moll: contocanche@elc y.mx.
Tel: 52+ (999)9428330. FilO : 52+ (999) 981 39 OO.
earth. ls a potentlal candldale Jor oblainlng energy In lhe
lorm ol charcoal, hyctrogen, ethanol and blogas; the last
three requlrlng hydrol ysls or lho llgnocelluloslc material
(Posso. 2002: Zolclivor et al.. 2001 ). Production ol
bloluels and olher t:ioprcducts lrom llgnocellulose is
expected lo promete ruml economles, enhance energy
security and allovlote envlronmenl pollutlon.
The use of ngrlcultural wu te os rnw muturlal la parth
cularly convenlent becuuse 1t resulta In 1 algnlflcal1
roductlon In t~ ~ost ol production (Hohn ·Hlgardul et al ..

133

hlgh cost of enzymes (Hahn-Hagerdal el al., 2006).
Alternatwely.2006; Quintero et al. 2006). However, tor
the esta-blishment of lígnocellulose·based t:io!uel
economy, the saccharffícalíon of these malerials is
necessary (Sathttsuksanoh et al. . 2009). Agiculrural
waste includes a diverstty cé gasses. rice and wheal
husks. among others. Mexico is a majar r\Jt ¡:roducer
and the waste from this act!lity represents a viable option
fOf ot:Aaini ng renewai:je energy and Olher biopr~cts.
One of lhe main crops in Mexícan agricu"u.e is banana.
The Mexican banana industry cultivares approxirnately
77.301 hectares producing 2.2 milfion tons per year. Only
the fruit is commerciaJized. while the pseudoslem. leaves
and rachis are disca-ded (SAGARPA, 2007); lhese lingo-
ce!lulosic residues could re¡:resent an importan! source of
raw material for carbohydrate·based derilatives. The
prin cipal commercial banana is Musa acurrinara
Cavendish, AAA, cv. 'Grand Naine'. The composition of
banana 'Grand Naine · lignocellulosic ~esidues can be
coosldered as feedstock since they are re!alively low in
ligrin and rich in carbohyaates. The pseudostem
contains approximately 60 lo 550,, hollocelulose and 12
lo 18% lign in (Cordeiro et al.. 2004: Khalil el al, 2006)
and rachis is 36"/o hollocellulose and t0.5"1o ligrin
(Oiiveira el al. 2007). The pacl<ing companies also
discard a considerable amourt rJ fruit which d:les na
meet ccmmercialization standards (SAGAAPA . 2007);
fruit pee l has 28% hollocellulose and 14'!', tignin
(Monsalve el al.. 2005) and frutt p.¡lp cortains 72"/o starch
(Garcés·Mdina. 2004).
To efficientty process lignooellulosic wastes. the ~g~in
s~ucture must first be modffied. because this tridi·
mensional phenylprq)ane·based pdymer prevents the
access ro the cellulose and hemioelulose polfmers.
wnch are the source rJ hexoses and peooses. lhe
stbstrates for lhe femnentative ¡:roduction of etlanol Of
hydrogen. among others (Gafbe and Zacehl 2007 ;
Fonseca et al., 2008). Biomass processing and coover·
sien usually lnvolves two sequertial steps : pllysic·
chemical pretreatmen~fractionation of lignooelkllose and
enzymatic hydrolysls ol cellulose. The structural mocifi·
cations of lignocellulose are achieved by pllysicochemical
pretreatments; first a pu~erizalíon or grilding process is
ca-ried out to mechanically reduce lhe size ol lhe
biomass particles and increase the contact surface for
subsequent prooesses (Ferrer el al.. 2002: Moosalve et
al., 2006). When the biomass requires a more aggressive
treatmert. steam and pressure are a¡:plied (Sreenalh el
al. 2001: Shamna et al .. 2007). In lhe case ol chemical
pretreatments. stroog acids and bases suclh as H,so. Of
HCI (Chen et al.. 2007: Ferrer ei al .. 2002: Hernández·
Salas et al. 2009) and NaOH (Monsalle el al.. 2006:
Mussatto et al.. 2006) are used at dif erent
coocentratiors and temperatures. The use of
microorgaoisms or enzymes which lacil~ate lhe release
of sugars can also be empoyed. Currently. cellulosic·
based products like e1hanol are expensive because o the
Mena·Es¡:ino et al. 3825
enzymes obtained frcm llgnoceUulolytic micrOOI'ganlsms
are used for saccharification (Patel el al., 2007; Slt·arma
et al., 2007).
The white rot Basídlomycete Pllanerochaete
chrysosporium is able to complete~ degrade ceftulose.
hemicellulose and lignin (Kersten and Culeo, 2007). This
lungus has been used for sacchari!icatioo ol
lignocellulos ic agro·waste of paddy straw. wheat s~aw.
sugarcane bagasse (Havannavar and Geeta. 200n
cotton stalks (Kerem et al.. 1992) and collee pulp (Parani
and Eyini, 2010) amoog others: lherelore. ~ can be an
oplion for saccharification rJ other agriculural residues
as banana wasles . In addn.ion, the edible mushroom
Ple~rotus osveavus has been suocesslullf cukured on
banana agrowastes (leal, pseudostem) ro pr~e
ligninolytic and cellulolytic enzymes such as lacease
(Lac), lignin peroxidase (LiP) and oelulases (Reddy el
al., 2003). This fungus was preved to elficienlly cle~ade
banana pseudostem biomass (Ghosh el al- 2004). In
addttion, Re~rofus species have been shown to degrade
lignocellulosic agro-industrial wastes (Havannavar and
Geela, 2007: Parani and Eyini 2010) and they have also
been used to improve digestíbiry ol lgnocefulosic
biOfnass (Adamovi et al.. 1998: Altxlrés el al.. 2006;
Mukhe r¡ee and Nandl2004).
Lignocellulosic materials are largely heterogeneous,
making tt necessary ro determine for eadh case tle type
of pretreatment and biologícal saccharifocation lo achieve
the greatest release of RS (Angenenl, 2007; Hattn·
Hagerdal et al. 2006: Masera et al.. ~05). The objedive
of this work was to evaluate lhe rellase of RS from
banana waste by different sequences rJ physicodhemicaf•
pretreatments and subsequef1( sacclwificalion with
crude enzymatic extracts obt.ained from the lignooeUu·
lolytic fungi P. osveatusand P. chrysospaium.
MA TERIALS AN) METHODS
Blologlc:Jirnoterlal
Tll! lur>¡i P. osM•IlJS ATCC 311540 ard P. <irysospailm CIJBB·
H·SM (from the micn:tiat cálecfial d CHJESTAV. Mexico) wtYe
used to ottailthe enzymatic exuacts fcr fle sa:::chariicaliat.
SUbstrall and pratreolm<lnt
Green non conrnerciá-gra:lo llama lruil and pseud:lstems
(M;;sa aa;rrrn«a Cavendish. AAA. cv. ·Grand Nane') were
colbctsd i1 a olantation and oaa<ing cornoany localed i1 Teaoa
Taoasco Sta!e. Mexi::o Qocaled in ""' soul • al •• stal! belloeen
tt-o t)<:tralbls t7 0J2' ot~rth latilude and 92"57 ' west lon111ilJOO}. The
subsb'ates were mechaniealy tt.i toa sile ~ a¡:proxinaldy 2 crn.
dried in a Fetisa' sla.'O lo constan! weígtd iMuosallo etal.. 3)()6f
and subsequertly reduced in size .,.;,g a PAGAI>I' gin<i!r lo
particles d ab:Jul2 mr> i1 diamele< í8aig ei al. :!00': Oleo etal.
2001). San m a pseud:lstem and flt>llouu - · mxed (' :s~ Three
cl•mi:al preiJealnliiU were evaluased. each one cv ~ip li:ae .
Ratio of nor>w ood ignoc:e lulosic solid 10 iquid soiJ,oiiS was 69:
134
3826 Atr. J. BlotoellnOI.
~ ml In dlellsl poehe hlfll. 3ro i-ICI waa t.S«<ioo 1$ mln; n U•
SIJCOnd ¡lfetr lmtnl. 3'4 N•OH wa$ eppled lo• liD,.,;, (l.h sano
el aL 20Ce); lor U>e 1llild pe•eu•ne11. 3'!lo 1-iCl w81 actled lor 15
rrin lilen neu~aliled Md 3% NaOHw81 Bddod '''" 90 mil (CI'en er
al .. 2007. Zhal el al., ~· ~ .. eoch pre~elllnlOflt hoal was
"''Pied 111121'{: lll15Lhln hr 15 mOl and lile reóráng "'9"'
(AS)""'"' qmntifed b¡ fle DNS me lhod (MIIor. 195t).
Enzym ltlc •~tr-
ne lll)'W"aol P, ~rea!US and P. '/"ty50WJfJ!Jfflwtre lrsl ¡¡row n
in POB lor fasl {1100'1>. Al er 2 -..ee<s, ~la wtre llleroel In
asepoi<: conditions, wasl'ed wiltl srerle warer and 3 g el oach
my<:elhsn was trJWI&ned 1<> 100 mi olslerilo 0.1 N ae<>lalo bJHor
(pH ol 4.8) coolairing 6 g ot li¡no:ellulo•lc bamna I1CIUI as on~
catlon source. Fungi were cullured 111 room IM'f)eraiLft and
a~lalionwasdore a1100 rpm.
To eslablich ltle day lor 191»</orin¡ !he on<ymali: exlraoiG. lhe
cen.-aso ac r\ll!y was moasuJed overy day lor 17 days. Two
in<llopordonl o~porimoniS. wlh lh10o JODIC:ales eaoh wo10
cancllcled,
Eftf)fnlt aa..ya
Celul• oel~il)' was assayed In o.1 M Na elkale oH 4.8. U!ltla 1 '•
tN ) CMC as swan10 ard addltion ol lle ''"~al cullue
• ..,_,nalanL ~~~~Lfes v.e~e inclbahld lor 30 min M 50'C !Klm el
al .. 1996). The reloose of RS was moasl.fed os described Mrlier.
Ona activlly unl wes dolinod ss tho amounl o! enzyme lhl1
reiMsed 1 ~molo! RS eq>ressedas ¡jucoso) lna~emimto.
lac actiYiiy was dolturrineclll:t:Oilllrv lo Ll el al. (1iiil.lollov.lng
11'0 reWI ol oxklotion ol5 mM ABTS In O,1 M No acot1ll10 •• pH 5.0.
Odlationwat ,...asurtd a1420 M\ ¡,, 38,000 M' C'n'' ). LiPwll$
rneasuled In 100 mM Na su::cln•te. al pH 3.0, wllh4.0 o1M wuftll)'l
Ot\d 0.1 hlM H,O, loi1Cwir'(¡ .Omtraldohyóe llftldUCiiOI\ al 310M\
¡,,. • 9300 M"' cm"' ) (Ttetl•nd Kili<. 1!8&). M11P was fliNSLfed In
100 mM Nasucc'""le. alpH4.0. 25 mM ¡.a loclah>, 20mM~..OO, 7
mM flhenol red and 0.1 MM H,O, Phenol red oxidolion rolO wao
measured 111431 nm (r., 18.300 M' cm') {Artlibltd. 19192). Ono
aciM!y unil of laceaw (loe), 19li'l pelllxidase (UP) or mtr~gtr~eso
peroxiclaso IMnP) was do•nod as ll'e amounl ol enzymo lha1
reloasod 1 umol al I)IOQrtl per minute. TI18$0 et\lynes wo•o
m&asuJOd ov~ rwo doys lo• 17 days. Elllyme aciMlos wore
ropc710d as Ul' .
-tic
Enzymollc soochorl laiiOfl
Tl'e cel hee crudo eJ<IraciS bom 10 days lurgalc:ullrres
were recovered 1>y c:enrr;jug!lion al 3000 rpm cilrirlg 3) min. To
-nnine lho eniciency "" sacchalif~a1bll a banana
lig>ocelulosie Jtsi:lueol eacl1 lurvaJeullulo. ll'e w1>o1e enzym¡fic:
cr<do e>~acl(10011j ea:!>) was inclopeo(lenl~ added lopre~Oalod
llcurs f6g ea:h~ Tho lasl<s were inclbahld;, an or1:ilal shaker ti
100 ro m ard 35'{: lor 96 h. Ali¡uors wo111 samplod e-.err 24 h lo
eval.rale lile RS. oll was mon~o111d durirv lhis pro..,ss. Two
~penJent exoeril'R!:nts. wlh three reolicaJeS ea:h were
Cal~Ci ed.
Silllsllaolonalysls
AH oxgerimenls were earned oll In lriohcalo ald lhe resllll
oxprested os "'''"" : 11111dmi dovldion, To moJyze l it experi·
mvnltll <1111. Sl.l1í1 pli¡;¡ p~s v, .. 1 (Sitlt 1 1 G•aph;;. Corp,
WllutniOfl VA) $OIIwar&wJIS Jllod.
Sconnlng eletYon mlcrooc"''Y (Se"l)
For SEM -~•il. oamoleo 'MUe vacUUll irlilrllll!d w11h 2.5%
;luraraldoll)ldo írl 0.2 Msodum ohosohall!, al oH 7.3. ~ed lor 4S h
al room liiiiOtraiUJe ard rOised seve•al ~'!lOS in oute1 soh.lion. The
mnplos were dellydraiod usllg ora<Hill ~ions lrom 30 la 85%
Jvlv) elhanol. lollowed by ab5olule tl:<lhd and Clllbon doxldo,
~~ were mouniOd on stub1 lll'd c001ed wlh gold In o apo¡~er
coale• (SM"dr> 795, Tousill"is Ro~eruch C<J¡XIrtlbn. l'«'<viiiO.
Mlll)'lald. 'IJSAJ. The mages we1e~ued wifl aJEO. JSM·6360
LV •connllg H>ciJorlll'ieroseope.
RESULTS
Pretreatments
Three dfflel"1!fll JJelrealments were ovnlvaied on lhe llour
mli<Jure p¡epared 11om lhe banana p$eudoslem and
gro n non corYII'IIOrCial-¡,tld btlnofltl ruit So(!Jontl 1
addillon d 3% (vlv) HCI (lncublltod ror 15 min) lollowlld
bV 3% (Yi\1) NaOH 1
(lor 90 mln) ¡lr(ldutllld 0,45 gL" ol AS
whlch was sli¡;t111y Jowor lhan tho rosull oblaln d wlih lhl
ralorooc (0.52 gl"1). whor dolonlzod wa lcr WliS addod.
Alkall or acld llono prtlduced 0.81 and 0.87 gL"' ol RS.
respecltvety, belng Jhe hlghel v lues obt lnod wllh lhi!S
lrealmonls.
Tho mbciun~s ol llours w ro submillod lo lho ume
lrealmenls lcltowod by humid hoot Al 12 t'C re. 15 mln
wllh a double ~J.~rpose; as ph)l!lieal ligncc;alluloso pra·
Jrea1men1 and also to p111van1 mletobial conlamlnation
durlng SACC!latiliell1lon. RS woro 1'110l191J'Od a 1or each
Jraalmen1 Atl(J strow d lhRI Sllqlllln1lal HCI·NaOH· hCIII
stops producod 1.13 gL·' and i'laOfl-11011 pm lroatm ni
releasod 1.37 gt: '. RS m asurod in the rofarence (water)
was 1.62 gl''. The hlghest saccharUicalion was observod
wllh lhe fiCI·heal pr0ilea1menl, which yilllded 42,41 gL'
RS.
$canr~ing eleclron microscopy ($ EM) was conó.rcl ed to
ov.aluafe microslru efural changes in lho banana was1o
a~er pelteatmenls. NaOH·heal aro sequenlial HCI·
NaOH·heat produced a porous llal SLflace area,
apparently eiminaling lhe rough cxtemal surlacc. More
aflicienl tiomass slrucluro mod~ication was achieved by
HCI·i'eal prelreatmenl. exposlng imemal slruclures which
were seen as libers. Tha eee1ronlc scannlng lmages are
shown in Figure 1.
Enz ymatlc activities
Celll.lase, lacease, manganesa peroxidase and lig¡ln
peroxidaso w re moniJored in P. chrysosporium and P.
osb'ealus su bmo r~d agitat d cultures. cuNure Too
medlum was SIJpplemenled w~h binana lignocolluloslc
wliSfe as carbon source . Bec,IISe
135
 •as dO C!iO "' tn • tu~t eu Ioft trOtl' 51~ 10 dly
•ll!ltll'~ IT't. va ol ;30 t6 UL 011 t'lt "1 <1a1 ,,
-.e caso ol P. Cll"f~por.U/"1 crudo o. <!Xt rt s'lO.....O
t~.~o PI!"-' s oll e iiC!:~ tr31 ""oro k»or trar ~l rr. P
OS!f~LS. • lf!"JM lle OCIN 1 P. 1¡'$Xptlf:U:"!'Nati
<10\0CIDd 3 so 31 W•'O"'1 dly •ex nQ a v.:1-..o 34 ?J
L' 'lO WC01d m:u rrurr L.lc lCl · f auc wa:
.,,.,a
tSt ~ 03y, v31ue 1• 8l UL'

En~ymallc stechallficallon ot banana Wadt

fon

r 3SG~ \\0 N~SI.' d "'IISG efl4f

• r ~O'ld d3y Ir P ~) s.:>Sf,\.'1( ~m. In?
lctiv y~~~ d !ro t~ r."' Ol)' of a. :o·e FJQWo 31 w
·eJ.lCd lf~l t/le fhn dly, 'Ole I1Q B '!l l ~~ \\lU
of 258 ~8 UL' 11!' \l'Q i'll' &v T Ollla• fvn-~us '
orodl.cro !rP ¡,Ol') t'll! ttr dly. d sp l) no 1\\) Pt'll>s
1Yt "lU I~U"l~31.0SOI t8l!!ad,.4468 • o,dlys
3lld '31Fígur~ 3 l.tP act~ ty ~PQra~d on "le¡¡,~ t
i 3lld fQlC~eO " 11' 3J( ~"' ol 6 509 • 01 thO
13 P. ~t~S.."''t um s.g~~lcdnt P iiCtVÍl)' wlS
tr. asu•od P. os~llJt.s Cfudo O•l'ilC:S Ftg~.r 4 .
actNty wll!O ~.g~ · P osu;¡;,t.JS CJturo Ftg~.re. Sj lnd

136
3828 Alr. J. Biole<:hnol.

A • 0000

- anooo
§ 30000 ...
~ ,.f,QCI(I ' 1

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1 2 , ~ $ " .., ' ;¡. 10 u ·~ ,, •• 1$ u; 17

Figuro 2. Time eou1se for eeUulase ae tiv~y ol P. oslrea·rus an<l

P. chrysosporillln In li:¡uiQ mcdlum. Pano ! A nnc;l B co rrespontl
ro independenl elCP8rin>enrs. Oara f epresenr rhe mean s ot
lripllca'te and &flOr bnrs indca.1e SO.

~00
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- - l:l'o.st rw•tus.
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15
'•
Time { Days)
H H
"
F igt,ue 3.. M nP ac·l iiity p rodu c tl~n in erudll> e Jllymatic o trae' S o1 P. Qli!r$1f'
and P. Clltysosporrum cuft ues. Acri,;l,V was delet'mined followw1g oxidarion ol
phonol rod. Da1a reproscnt 1ho m ns or IIiplicaiiQ and ou or bars fndca tc S O.

137
 Mena·Es¡:ino et al. 3829

7000
-o- P. ostfeatu.s
:::1 (;00(1
3 - • - p ehry30p0f.un
~ ._
~ '000

~ 000

~ 2000

1000

1 l 5 9 11 ll 15 17
Time(days)

Rgurt 4. LIP aclviy oet<omiled q. fle VA usay il P. O<ffeatvs an:l P.

dttySCGporium cull11t1. Data lflll'OIGill lhe me''" d lrjpicáe l!lld e<ror bars
irdicae so.

300

lOJ
- .-Po.r:mrus
~ óOO
3
""' SilO
. ~
> Ji)O

ñ
" lOO
u
~ 100

11 11

Tlme(days)

Fl¡¡ure 5. Lac actiwly ¡~rofilos ol P. oct•atvs aM P. clty<copaJUm cullures. ACillilf

was measured l'llhe A&TS assay. Dala lfll;f8SO<lllhe mealli oltril:lica.IO ano enor
bus indcate SO.

(data 1101 shown). These resuls were negligil*l.
Wkh HCI·heii pretrealed banana lignocellulosic llour.
P. chrysospaium enzymatic exlract proWced no evident
reilase orAS. on the conlray. alter 24 h afler addilion of
lllls enzymalic prepamtion, the RS decreased from 42.4 f
to 31.56 gL·'. ~ the second day, lhe alliClOO of AS was
37.26 gl' 1• However, on lile lhird day. a dnmalic
decrease in AS lo 227 gl'' was meastnd (Figure 6A).
This behavior was reprodu<:IJie; lile same profie illhe
measured AS was obsetved in a second ildependent
experimenl (Figure 6B).
The best resun of RS was ~ailed when P. osveatus
enzymallc extlllel was added 10 lile HCI·heal pretrealed
biomass. In lis case. reducir-o sugar was 63.65 rj.:' ¡¡
the third day of sacdlarifJCaliln. Al lile fe~~rth day. lhere
was a lillil deaease lo S! .46 gL·' (Figuee 6A). Figure 6B
shows similarrest.*s in an ildepef1dent expe~imert
Tal:le 1 cortespends ro lhe ce!Uase and lignina!es
aciN~ics measured in P. MteatJJsand P. clry~
enzymaüc crude extracts halvested on lhe 10111 day. P.
chtysosporium exftacl conlained aho5l doutlle aciMy of
lhe oelllase and moelllan file lines lhe activily of MIP.

138
3830 Alr. J. Blotachnol.

A.,.
lf
__,_
¡·
5t
....,._..__
••
ae.
u
o

•
..
l'l

•
Flgu,. l. Enzymalic saocharili>allon ol HC~heal prelleeled banano
li¡nocelh.ioslo l:iomaas wlrh P. Cit/11!11/US and P. o/ry<tJ<fXJrillll cell he
crudo Ol<lfac•. Panel A ard a co'"'aPQld to lrdepel'!denr experlmer'll.
D•arepreaentlhe mean• ollrl>llollelllderrorba'tlrdlo•• so.

whlln comparad w~h P. ostreatus wract. On lhe
contrary, Lac actllllly was twlca In lha P. ostrestus
axtract. The mom remarkabla dll!orenca In thesa acllll·
lilas was In LIP. P. chrysospori<Jm had 38 timas tha
acllvlly mustrad In P. ostrealJs axlracl.
DISCUSSION
Llgnocellulosas ara oftan a ma)or wasta lrom lorasl/y,
agricuhure and municipalllies. Howevar, the sullabllity ol
llgnocallulosas to be usad as feadstock In many
Industries depand on the success in saccharlfication.
Enzymatic hydrolysís of unpretmated lignocalluloses ís
usually nol effectlve because of high stabil~y d the
materlals. Baig et al. (200o4) saccharWiad unpratraated
banana pseudostem-lea! mbced llour, they usad the
nzymatlc extract ol Trichod~rm11 Ygnorum cuhumd on
upretreatad llgnocellulosic matarla! and ot:talned a
maxlmum of 1.34 gl'' reduclng sugar. Slmllarly, Pata! at
al. (2007) saccharlllad lndapandonUy begana and rice
husks, uslng Individual and mlxed fungl and 11 was
observad tha~ tha comblnatlon of Pl~t~~o/us Sli}ON:IIju
and A!lp4r{Ji/lus 12wt1morl raloasad 0.34gL·' oiRS wlth
rica husk and Wlth begasse and Pll8nerochaete
ct.ysosporium re la asad 0.90 gL·' RS. Thas data show
tha lncapaclly of tha enzymas lo penetrate and raach thll
callulose whan lhe Hgnln has not been opened or
alimlnatad.
Beuer results wore oljalnad when raw materlals were
pretreated, maklng tham accassible to microblal and
anzymatlc attack. Zhu at al. (2006) hydrolyzad rice husk
rasldue, lncluding a microwavas/acldlalkall pretraatmont
and subsequently saceharillad n wlth eommarclal eellu ·

139

111111! t. C.llul- arnl t¡nir;¡.., atWkiK mns.-.d m P. <>StNtl.ll nd P. <lwyS<~~PQrum CNdn~~«Ymatic: t!l<l!acts 1\irv..-d on
t~ t01h d¡¡y af cu 1U!o. FU1191W'4>!1> gr010n mlq id ""'dGin cont&lning banaM hgnoool se bloman as carbot> ....roe. C.J trM
onzymollec.udt •• raCI...,. uwd 011ho ..c:c~wtioab<>n ollho prnoatl!d bo,..n.
Fungl
P. us1reart1s
P. c:lir't'S~/?I?!'l.lm
lasos: 1 m asod RS yielt:l wa:; 35 6 g L 1 Sim lar
rosu~s wert> !'II'PQI'Ied by S100nat et al. (200t) wttt
mitfO'Naves etreatmt>nt on ¡¡~da fiOOrs bt>fort> adtúlg
IXI!T11M e·;¡¡ w l la~s (final RS yielcl ol 40 gl ) . Che et
1
al (2007) mportt>d hlgh saccharilicat.on of aizo stalkli
w'th a comQnatio 1 col 13ws from Tfichoderrro rwsei
ZU -02 and A~r¡¡lfus ni¡¡fK ZL/..07 aftor pretmalmont to
tho Wasll.> w'th H,SO, (1 :6) lo1 3 h: s.:iccllari( af
rolroS('-!189 5 g ' RS.
1"1 1 .s 'Norlt !No fullQ l enzy atic l.>l(!racts '1\!Q e em-
ploy<>d to sacchafl1y b3naM 3Ql0Wastes ( ·~u l' of
ps¡;udost~m and noo.(;ommercl g aoo b3na!13 1 l ).
TI» at 1w:~s dril>!! omd ground untl fino flou: &izo of
partlcles. soM ns-'conce ltatlon an!l tl111t' us«l ro
prolt'!Nltm rots. as w P as cond tio s usoo r sacch11.11f~
~on (pH. ~mtl.ll\>. .1011 timt>l '1\!Q choson
lrom p;owdl:.!·o.s cll>wlbl>d tho 1tl'r3 (Salg 1 .
200$; SllalTna et 31.. 2.00 : :~herzaooh an'il K im¡
20061. lo'loW!ng critcria of oonvo nce an'il lli:Onomy.
f-or oJ;ampl9. part' !l>S of 2 m W(l>IO not big but W3S
n ahl!r 1h sm al st siz usod tn tho lllG Ottur . whlch
ll'(lo3.ns moro & ~n~lvo prOCl'~s oosl ,: sa~g Gt al . 200-4:
~s lv ot aL 2006 . T silo W3S usoo n som
roports (CI-tt!~ 1 <11 .. 2007). as mi 1no provos surt oo
R'3 a1d th roto· . acoossi Utit's of t ll.n'il
enzymes to tf'lG. ottlluloso. pH 4,8 was usod MtO ding¡ to
la cton i3 ot al . (2006) and Vath3nomsat ol <~~- {2009).
Saig ot al. ¡20041 studit>d 1 i once ol dWkl"Gnl ladors
in saocharl.;;¡tiol\ o1 b3nMJ vos and p$0Udo510ms
and lou1111 s mi..1r I'IIS~its all&m~111lu,os bl!lwoo 30 an'il
<lS~ ; JS'C. t111 intermod m l:c¡mpo ;¡turo •.v3li u:;od this
$(~ .
Atwr dryi"lQ aJid gtinding tf'lG. m;¡j¡¡)rial. lll oe chom~
protro~monts woro a,ppliOd. NaOH.ftOoat and s.oqu ñti
HCI-N30H 3.t podUcod no sl~lieatll rolt!35o of AS.
A.11<3Ji l)cotroalmonts romovod lignin an!l 3 ¡O;Ilt ot th
tl4miconu:.o<..os. bw1 usua roquiro 10ng timo a.nd 11
conco •3li0d'l ot l!l b.l$0 3.hor%3dc>h 3tld Kaliml
20081 Llg"llQQI uiosos aro iargoly 11010 ogoneous and
pr · trG-almonts whidl 3'0 ~ 10 ~ maU~rl31s aro not
QOOd 101 ot.hOtS (HO~nck!%·S3l3.s 01 Al , 20091 Tl'\0
$UCQOS$ of a P3rticl:.t ar pmc:o~~nt dopon'ils on whlelt
i¡)OOfié iOIIOOOIIUIO$'( biomA$$ U$11d . HOWOVC)r. cid$
mo• usod ror chomical protroatmol'll attOtZ~
a.r.d Kanm l. 2001: Tal0ón i3 . 200&). Acid$ ar ~
tfoet in dl$$0: ng iO n. bc.t1 lhOy e3l'l CIMtg¡ · and
Mena-Es 'no et al. 3831
MnP Kdvhy (Uitl LiP aalvily (Uil) La<: ICIIYily (U<t)
t:;3.39
~7 . 59 95.58 ± 62.57 193.12±3a.!i5
322 95 : -17 .52 :u 1.5-1 t!1?3.3t U62t47 .34
• rease oo IUI0611 suscoptibilty to enzymatic; llydrolysis.
Acids can be usad o~her as a pretmalmoot of raw
biowastes lx!fom onzymatlic tt~sis 01 as the ethod
of hyd!olyz ng thom to fem19 sugars (Tahlltzacll>h
and: Karim~ 2008). 1 this study. ltlo oost r1!5U wu
obtrunl!d w~h a~id-heat pretmatmont. Hoat • prOVI!s
d:.sruption of tho lignooo losic stiUd:uJo boc3US9 it
• crusos ioobc Gnorgy an!l f:JCOiitates m:JSs lrall$1 r
siOO the lignocolll.llow; In add ~ion, presslim also
p.!IJIII!S ~notration of so'utions il11o th bioma.ss. Tllis
t!~pl3l ns lhe fad that. prnt•c31mQ 1 wit HC he31
G~as«l 42.41 gl s w'h il9 HCI wilh no ooat proOOa!cl
1
0.87 gl • Ro r.e of su93.rs ls a combilatlon of aCid and
at..prnssu¡e otfoct on th bio ass s tilo ma*'ri31
subjQttoo t-o 121'(; and 1S lb/in' In W3t r (lllfof nce
condition) c!Qased on . 0.52 L 1 RS jnol shown),
Sl'qwn<: HCl-N:lOH Pfotreatmont with 01 Jhoull»3.1,
PfoQ¡(¡{!d also a peor Al el AS. j~ss th3"1 2. gl ').
bl>causo acid was neutraázoo by U19 b3so ootoro hoatll19.
Sfr. rcsuns confirmod that tlt acid-tloa.t prl!l atm t
was. th most onoctlvo in opon n.o 11p tho biOITlass
structuro (F ur 1}. whic: was: c;ongru nt w;th t bcltt!.!r
OCO\IOry of R.S.
Protm m nt of banana ;¡growasles h3\l bocín pro-
vious!y porll!d. Monsa!Yo ol 31 {2006) wo kod on
b3nana poo ls d ob\a.iood a RS yio Id el 20 gl ' a. r
SllqiJonti Na.OI-I-H~O... pro«roatmom and pmdlttocllllat
1
y Id of AS ·¡vi 1 incroaw lo 32 gL wh fJuit
ondosporrn was incluood. In thís study. a ighOr mkiaso
of RS was :~tflieved avon though SO% of p$QUdOS!Qm
w3s i.rtcludl'd· in tl'\0 flour. PsoodoSll!m tll1d TIOI'Ii-()O¡'¡'.
reJa! g!3d9 b3n3.n3 fMt 31'0 3ni!Q.Ilg thii111C)$1 abu!ldant
w3Slos tlíO Mo~ica.n b3r1an3 itídu$1Ty: a r03S0!'1 w'tty it
would be moro OCOiionuc to wor1< wi1t1 tl'lo míxturv
cil$trial StaJO, S3YII'IIl on wa.stO soparatw eost. F01
CJOmpar on. 11'10 rOio3SOd RS botll ratr m
w ro n"'llasu!Oó índopond0n11y. Tno Olo3$0d RS trom
t u~ ano HCI- a1 was 62.S3 gL mo3r'1WI"!iJo. tor
1
psoudOSt.Om 23.10 Qt.·l woro ob\3.inod jd3t3 nc1 Sl'ICWII).
S1'>3rm3 ot al (2.007¡ anal~ th4 S3C:dlafifall01'1 oc a
mrowo of tw agromdustr' roslduo$ ffom lndi lci\Mw
w:~St~ att<l btll13n3 poo Altor gOOt:S.ng. tho substl1llos.
., ro 1'1\Í>I0\1 111 a pr@'tioSn oi4:G ikinr<~w W3$to: banana
pool$ a1'ld 1h tO was l"tydfro!ytod by S10am
o~piOUin. y..ol!lil'lg 63 gt. 1 RS. liOWOVOfl. litis IGCitnlquO
oqu iros a t>onorgy i11put. Othor l..m.ltatiOII$ i11ekl<llllil:l
140
3832 Afr. J. Biotechnol.
dcSiruclion o! a part of xylanes. the incompleto ólsruption
ol tho lignin ·carbohydrate matri>l and tte gcncration ol
toxk: compounós (furturals. hycroxymethyl turturals)
wtich can inhibil the actlvily ot fermentative micro·
organisms. In aóóitlon. it reql.iros special tacUities not
canmonly available. particularly in dcveloping countries.
In this work. hcat br sterili~ation conóilions In a\Aoclave
(121 'C al 15 Lb'in ) was use d. which was commonly
employed in any laboratory anó in many industries.
Severa! works have reported the use ol commercial
enzymes for saccharification (lynó et al., 2005 ; Sreenath
el al .. 20()1 : Zhu el al., 2006); howevor, because d tigh
enzyme ces~ more economic a~emativos are being
investigated. such as thO dOmestie production el
enzymes using lignocellulolytic mleroorganisms (Chen él
al., 2007: Loathors, 2004; Sharma et al., 2007 ). for
saccharificalion. the dOmestlc p-epararion d dlrectlf or lrl d lroct~ . In P. cl~ysasporlum cu"uros. tho
lignocollulolytic enzymos wilh two fungal cuhuros was
prockJcod. P. osrroatus anó P. chrysosporium wcrc
culured In liquld artificial modlum (acolalo buHer supptc·
monlod with banana lignocolluloslc flour). In both casos .
lhe crudo enzymatlc extracts were harvesled atthe 1Olh
d2t1 ot culture. since cellulase act¡.,ily was maximum w~h
bolh ll.lngl. The cellulase actlvlty was not adjusted bullhe
whole volume ol lhe extracts was added . This means
rhal cellulase ac1¡.,1~ was 17.777 .78 UL' for P. os/Teatus
and 31 .296.30 UL for P. chrysosporium. Even when
cettulase aclivity in P. chrysospcrium"s extrae! was twice
!han that ol P. oslrealuss (FiQure 2A). the \atar p<oduoed
beUer saccharification (63.65 gL"' AS atthiró day) wtíle
P. chryscsporium produced a dramatic depletion of RS
(2.27 gL· ' ~ This was a surpoising resoft sinoe P.
ctTysospotium is one of the bes! known fUlQUS lhal
produces largo amounts ol lignocellulolyticenzymes.
Thís lu~us is able to oompletely degrade celuoee,
hemicclluloso and lignín (KerSlen anó C~len. 2007) and
has been extons.,ely usod lor the sacchar~icalíon ot
fignocellulosic agrowastes (Havannavar and Geeta,
2007; t<llrcm el al.. 1992; Paran! anó Eyini. 2010).
Alhough. contradictory lo what wasoxpoctod ínijialfy. lhis
resu• is largely rep¡oduciblo (Figure 6B) and ~ was not
duo lo mícrobial cortamlnation during saccflamica~on as
!he complete process was conducled under aseptic
condilions. In aóóition. when AS deple11on was obsetved
an aliquOI was pated (4th day): neither bacteria! nor
lungal colonies were lound on LB or PDA media al1er
lwo weeks (dala not shown). Data lor celtuase
aclivay in P. ostleatus ard P. chrysosporium crude
enzymatic extracls were also reproducible, being haK in
P. ostreatus (FigLJe 2B).
This unusual result has biOiechnological importance
and íl is worth to be d lscussed since the stralegy lo
induce lignOCollulolytic enzymcs us ing 1\gnocellulosés is
Cl.rrenlly p¡oposed te avold tho use of expensive
subslrates. The sudden dOcreaso ol RS Slrongly sug·
geSicd an enzymatíc-mooared trar1Siormation. Aftcr
anatys\s d rhe other cnzymatle activl11os. a probal:lo
explanalion to thls result can be proposcd. P.
cl~ysospcrium extrae! ilad hlgher act¡.,itfes ol por·
oxidases !han P. ostreatus (Figures 3 anó 4), MnP
1
aclivily was more Jhan fi ve times (322.95 UL ) anó LiP
act¡.,Uy was 38 limes more (3.611 .54 UL '1 in P.
dlryscspotium than that of P. ostreatv5o Tnese enzymes
require the ~osence ol H, O,. whlch in ligninolytic lungi.
ís produoed by various pathwayswith pyranose oxidases
(lrorn O-glucosa. D· xylose). glyoxal oxidase (from
glyoxal methylijlyoxal). aryl alcohol dehydrogenase
(lrorn benzaldehyce and bcnzoic acid) anó FAD·
dependen! ayl alcotiOI oxidase (from benzyl alcohol. 4·
mo111oxybenzyl alcohol. voratryl. cinnamyl and conifcryl
aleohols) (lzuml at al., 1990; Kerston and Kirl<, 19fl7:
Kmslen and CuiiM. 2007; Shah and Norud, 2002: KOkor
et al.. 2004); somo ol these onzy rnos consume sugars
gtucoso oxidase is the main systom lor H,O, pr<XiJction.
IOf 11 consumes glucoso (Kc!loy and Roddy, 1986). P.
clrysosporium so ero tos Qlueose oxldaoo In 1\quid eu"u•o
(Daniel 01 al.. 1992) whon thc lungus ls grown usl~
hgnocelluloses ns carbon source (Danlol et al .. 1994).
Therolore, based on thls intormai\on, reductlon In the RS
by the additlon ol P. chrysosporium enzymatlc extrae!
(figures 6A and 8) m111 be explalned In part by the
p<esenco of pyranose oxidases. whlch are sorne d tho
principal sources ol ~, o, in mulliple lungi including P.
cllrysosporium (Daniel ot al. 1994). Howover. it is also
inlriguishing lhal !he AS depletion occurred al !he thiró
day. Why was il delayed? Which mochanism expains
lhal lhe decmase did not occur from the beginning? The
delay coud bo explaincd by !he ¡7esence ol an ínactivc
enzyme al lhe beginning of the cu"ure, which was lur1her
ad.,ated in vílro by the production ot an activator (lhe
sySiem, even when it was not irr vivo but irr vitro, was
very cornpox , contalning many compounds lront the
prelmated biomass and many d ~ lerent enzymes. not only
discussod hcre. bu! produced the f u~i). Probably more
plausible, \s ro cxpoct the presencc ol a metabolrtc
(rcilasod lrom lignoce\lu loses or produoed during thc
pretroarmenl) whlch at the by boginnlng d
saccharilicallon inhibíted thc pyranose oxidases prescnr
in lhe lungat enlymatlc extrae!. Removal ot this inhob~or
(by P. dlrysospotium peroxidases. whlch are largely abte
lo degrade xenobiOiics) trigger.ed the acilvily ot pyranose
oxidases. resulting In the dramatlc decrease of RS io lhe
third day. Glucosa oxidase is not the only expianatioo.
CurrenUy, il is bclieved that aryl·alcohol oxidase ard
gttoxal ox idase are !he rna in enzymes responsible lor !he
prockJc~on ol exlracellular H, O, (Shah anó Nerud, 2002).
Glyoxal and rnelhyf.glyoxal can be produced by oxióation
ol ethytene glycol aceteldehyde and also trom glucose .
Chomical or biologlcal conversion of AS In oxoaloohydcs
(or olher melabolitos) can actívate in vítro the targct
enzyrncs triggering tho cetalyllc (onlymatic·modiatcd)
dcgradatlon of RS into oxoal0011ydes (for H.;Q,
prockJc6on by glyoxal oxidase). explalnlng tho deptotion
141

ot AS on lhe third day. AlthOugll. bolh proposals aro
targely spcculativc, a high demand of H20 2 ls cxpectod
for suSlalnlng the P. chrysospotium LIP and MnP
activfties for ilgrinclysis. slnce this wl'lte-rot basidio·
mycete is precisely one ot the most powerful ligninolytlc
fungus known so lar. "The cortinuous production cJ H,O,
requires a larga drain of the reducing equivalents, which
is nota problem for thc white-rot fungi. sin ce there is
oxcessive carbon in natura" (Shah and Nerud. 2002).
P. chrysosporium has becn uscd In salid stato
sacchari!ication and termentation: meanwhile in thrs
study the saccharification was conducled in 'liQJid state".
using the enzymalic extrae! Jl"oduccd in u., submcrgcd
cuhure. In solid state saccharification, 111ese enzymes act
seqoontially (time rogulatcd). First, pcroxidases and
pyranoso oxidases act coordnately to opon part of the
lignin and oxposo thc coUulosc and hemlcelluloso . When
lhese polymers are accessible. cellulases and
hemicelufases actto hydrolyze them into simple sugars,
which aro, al leas( in part. absorbed by the fungus as
nutrienl. This protebly explains why the resulls in lhis
siUdy ("no saccharification of tho prctrcatod material but
dopfotion of AS") are dffforont trom thosc ol othcr roports.
Saccharlflcatlon ol HCH1cat p-ctrcatcd material with P.
ostremus produced an •>cremen! cJ 50% (63.65 gL' 1)
1 Rt:FERENCES
above lile AS achleved alter Pllllreatmenl {42.41 gL ).
Aeddy ce al. (2003) reportad the use of banana leal and
pseuclc-stem agrowaste lo produce lignocellulolytic
onzymes from P. ostca/us and P. ~or-c¡fu In so~d
culturo. Enz)'lle activities could nd bo comparod
bccauso ll>oy oxpressed unlt values in Olher terms. bul
the proliJos wero similar. They measurcd cc llufasc and
high activíty ol Lac in P. ostreatus and UP was no1
delected. On the cor~rary. P. ssjor·caju was able to
produce UP on the9e malerials.
The banana rcsidues are suitable for lho cultivation of
highly outrlclous edibfo must-.oom as the oystor P.
ostreatus (Ghosh ct al .. 2004; Aeddy el al. 2003) and
Volvariella volvarea (Belewu and Belewu. 2005). These
fungl are easlly digestible and they havo no cholesicrd.
fn add~ion. they are rich In stati•s (which control
ct'Dfosterof in blood) and gftJamic acid (which hclps lho
immunc and norvous systoms). Theretore, t11ey can be
abfo 10 improve hun>an publ/c hcalth being an alternativo
application tor tho ligrocoluloscs.
Dried-grindod·HCI-hoat pretreatmont rofeased 42.41
gL ' AS. So. lhese materiafs are attractve te cause acid
can be used e~her as a pretreatmenl for enzymatic
hydrofysis or as a cheap method of hydrolysis to ralease
the fennon tablo sugars. HD'Nilver, the 50o/, incramenl in
AS with P. ostreatus cxtract was not ncgligiblc spéCially
wi'ICtl scal/rg up of the proccss. Both procoduros are
appropriato. dopcndng on the goal. Sincc an acceptat:te
saccharilication of the banana residual tiomass was
achieved. this ls suitablo lo be used in Mexico as
biocomposL biofa~ilizer. lor cattle leeding and biofuel
Mena-Espno ct al. 3833
production (bioethanol. bíohydrogen and methane).
ACKNOWLEDGEM ENTS
Our thanks to CONACYT for linancing the Pro¡ect FOMIX
TABASC0-43776 and schdarsllip No. 211766 lor Mena
Espino. Our thanks atso go 10 biologist Felipe A. Barredo
Pool for tho proccsslng of images at lho Electronic
Scanner Miaoscope and to "Bronco Banana· packing
company (1~ Guido Artavia) for allowlng the cottec~on
of banar>a blomass material in lhe plantatlon.
Abbrevlalfons
AS , Rcducing sugars; DNS, 3.5-<!in itrosalicyfic acid;
POS. p<;~ato dextrosa btoth: HC I, hydrochloric acid;
NaOH , sodium hydroxlde; CMC. carboxymethylcellulose:
H, o,, hydrogen peroxide : H, so,, sulfurlc acid: Lac.
lacease : ABTS. 2.2'-azinoiJjs-(3-ethyf benzothiazofine)-6-
sulfonate; LfP, lignin pcroxidase ; MnP, rnanganoso
pcroxidase : r , molar cxtindion coolliciont.
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lr.JP»f'8 v•'S'fXJ(J(. a1d Oudei'W:'S~.f.r rrvad:l~ A.~ . bv\fo1.
"' ro:l. . 60: 2'52oi ·25J2. .
F••• J. Pilo< G Ar..,.s dt ........, L Chll'd"" C. MY,.o IZ.
•- l (:!002¡. C•n(l!C. <'> 13 h<tóloSrS 6r:4a ~ llOgOC ~ I:> dt
en/la m"'"'"· Rov. For:. Agr<n. 19. :!3·33.
Fonsoe.a E. CMdoo A, Vargas 1 (200&¡.. Ht<iOICS Kd.l dll SUStrato$
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Ciemcat comPI"~IOn ot dtleent rrtuphcHugicDI oart1 hom ·t>.var1
Callef1dsh' banana ¡jant atd lhelr potontial •• a ron'Wood
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