PURIFICACIÓN DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE.

Jesús Calderón Rosales; Julio Chamorro Vergara; Fabián Mercado Pérez; Dayana Simanca
Hernández 1. Catalina López González 2
.
1. Estudiantes universidad de sucre, programa de medicina cuarto semestre.
2. Docente asesor del departamento de Biomédicas universidad de sucre.
Resumen
En el siguiente informe de laboratorio se llevó a cabo la practica de extraccion de ADN
mediante el aislamiento de moléculas puras en busca de la observación y cuantificación,
mediado por el método de salting out. Con el uso de pruebas específicas con un tiempo de
3 horas (aproximadamente) se pasó a revisar la muestra de ADN en el cual por posibles y
muy variadas factores se contaminó; dando resultados distintos a los esperados.
Justificando las posibles causas del error se llega a la conclusión que pese a la
contaminación por proteínas y ARN; se evidenció la prevalencia de ADN en un valor de 1,28
con lo cual se comprueba parcialmente la realización del procedimiento con éxito.
Palabras claves: extracción, ADN, métodos, salting Out, proteínas, cuantificación.

Abstract
In the following laboratory report the practice of DNA extraction was carried out by isolating
pure molecules in search of observation and quantification, mediated by the salting out
method. With the use of specific tests with a time of 3 hours (approximately) the DNA
sample was reviewed in which, due to possible and varied factors, it became contaminated;
giving different results than expected. Justifying the possible causes of the error, it is
concluded that despite contamination by proteins and RNA; the prevalence of DNA was
evidenced at a value of 1,28 which partially confirms the success of the procedure.
Key words: extraction, DNA, methods, salting Out, proteins, quantification.
Introducción
La extracción de ADN se realiza con el objetivo de obtener moléculas aisladas con alto
grado de pureza y poderlas utilizar en investigación científica, en medicina o para la ciencia
forense.
La mayor parte de los métodos que existen para extraer el ADN consisten en lograr primero
la lisis o ruptura de la célula, para luego separar las moléculas de ADN del resto de los
constituyentes de la célula.(1)
Para realizar la extracción se utilizan diversos métodos.
● Extracción orgánica: En este método convencional, ampliamente utilizado, las
células son lisadas y los restos celulares se eliminan generalmente por
centrifugación. Las proteínas son desnaturalizadas/digeridas utilizando una proteasa
y precipitadas con disolventes orgánicos tales como fenol, o una mezcla 1:1 de fenol
y cloroformo, y el precipitado de proteínas es eliminado por centrifugación
● Tecnología basada en sílica: Este es un método ampliamente utilizado en los kits
actuales. El ADN se absorbe específicamente a membranas/esferas/partículas de
sílica en presencia de ciertas sales y a un pH particular. Los contaminantes celulares
son eliminados mediante diferentes pasos de lavado. El ADN es eluído en un buffer
de baja salinidad o buffer de elución. Se utilizan sales caotrópicas para promover la
desnaturalización de proteínas y la extracción del ADN
● Separación magnética: Este método está basado en la unión reversible del ADN a
una superficie/esferas/partículas sólidas magnéticas, las cuales han sido recubiertas
con un anticuerpo que une ADN o un grupo funcional que interactúa específicamente
 con el ADN. Tras la unión del ADN, las esferas son separadas de otros
componentes celulares contaminantes, lavadas y finalmente el ADN purificado es
eluído utilizando extracción con etanol.
● Tecnología de intercambio aniónico: Este método se basa en la interacción
específica entre los fosfatos cargados negativamente presentes en los ácidos
nucleicos y moléculas de superficie cargadas positivamente en el substrato (2)
Además con la diversidad de métodos conocidos actualmente se puede extraer ADN de
muchos sustratos como lo son la sangre, la saliva, la orina y otros fluidos corporales, tejidos
vivos, cultivos celulares, líquido amniótico, entre otros. En este trabajo se analizan las
diferencias, ventajas y desventajas de algunos de los métodos existentes para la extracción
del ADN. (1)

Los criterios básicos que debería cumplir un método para purificar ADN de cualquier origen
incluyen:
1. extracción eficiente
2. cantidad de ADN purificado suficiente para las subsiguientes aplicacione
3. eliminación de contaminantes
4. calidad y pureza del ADN.

Al momento de realizar la cuantificación, La absorción ultravioleta puede ser utilizada para

evaluar la pureza del ADN extraído. Para una muestra pura de ADN, la relación entre la
absorbancia a 260 y 280 nm (A260/A280) es 1.8. Una relación < 1.8 indica que la muestra
se encuentra contaminada con proteínas o solventes orgánicos como fenol. En la figura 1 se
listan los pasos básicos involucrados en el método de purificación de ADN. (2)

Metodología
Para la extracción de ADN en este caso se realizó con el método de salting out. Inicialmente
se utilizaron 300 uL de sangre se le adicionaron 300 uL de buffer lisis, y para hacer
homogeneización se sometió a boltter por 2 minutos, luego de esto se adicionó 3 uL de
proteinasa K, se dejó en un bloque seco por 45 minutos para que la proteinasa realizará su
acción, luego de este tiempo se realizó la inactivación de la proteinasa K. Posteriormente se
realizó una centrifugación de la muestra a 12000 RPM por 10 minutos a 4°C. Al finalizar la
centrifugación se tomó el sobrenadante, y se adiciono a un nuevo vial al cual se adiciona
también 40 uL de acetato de K+, se realizó un proceso de inversión en series de 15
segundos en enfriamiento y fuera del hielo secuencialmente durante 20 minutos.
Posteriormente se centrifugó nuevamente por 10 minutos a 12000 rpm. Se extrajo el
sobrenadante al cual se le adicionó 0,6 volúmenes ( 240 uL ) de isopropanol frío, al finalizar
esto se dejó en incubación a -20°C por 8 días. En la siguiente sesión se continuó con la
centrifugación de la muestra incubada a 12000 rpm por 10 minutos, luego de esto se
descartó el sobrenadante por inmersión, al pellet se le adicionó 1000 uL de etanol y se
resuspendió para homogeneizar, este procedimiento de centrifugación, eliminación de
sobrenadante y adición de etanol se realizó 3 veces; finalmente se dejó secar el pellet a
temperatura ambiente por 3 minutos, luego de esto se resuspendió en 50 uL de agua
ultrapura y se procedió a hacer la lectura de la muestra en el Nanodrop; para ello la muestra
se sometió al boltter por 10 segundos, se realizó un blanqueamiento del equipo con agua
ultrapura, posterior a esto se tomaron 2 uL de nuestra muestra y se realizó la cuantificación
en el equipo.
 Resultados
El protocolo de extracción salting out permitió obtener un ADN íntegro a partir de muestras
de sangre de un individuo x, sin signos de degradación o fragmentación y pero con
contaminantes existentes en la muestra (proteínas y ARN). Este resultado fue confirmado
en el control positivo, que mostró la presencia de trazos y fragmento, lo que fue indicativo
de presencia de contaminación (Imagen 1). Adicionalmente, los valores de absorbancia a
280/260 mm mostraron la existencia de proteínas (ADN/proteína =1,28).

Imagen 1

Discusión

Inicialmente se mencionó que la relación entre la absorbancia a 260 y 280 nm (A260/A280)

debe ser de 1.8., valores inferiores en dicha relación son indicativos de muestras
contaminadas con proteínas o solventes orgánicos como fenol, ahora bien enfocándonos en
el producto final de nuestro proceso encontramos que los valores de absorbancia a 280/260
arrojados fueron de 1,28.(ADN/Proteínas), teniendo en cuenta estos resultados, podemos
sugerir que la presencia de agentes contaminantes en la muestra se debe a errores
directamente relacionados con la fase procedimental, si bien, los métodos de purificación
fueron realizados con orden y cautela, lo más probable es que el error gire entorno a la
proteinasa k, pues sabemos que cumple una función importante en la inactivación de
nucleasas y en la digestión proteica debido a que actúa liberando al ADN nuclear, mientras
destruye a las proteínas(rompiendo enlaces peptídicos por hidrólisis) e inactiva a las RNasas
y las DNasas, es decir, elimina a las nucleasas en las preparaciones de ADN y ARN, sabiendo
esto, se podría justificar que la presencia contaminante de proteínas en la muestra es debida
a falencias en la adición de proteinasa k( concentraciones inferiores a las estándar) y en el
tiempo de exposición(inferior al requerido) de la muestra ante esta enzima, este hecho
representa una de las posibilidades, la eliminación inadecuada de sobrenadante pudo haber
sido también un factor importante, teniendo en cuenta que contiene proteínas, ARN y otros
elementos, por lo que aún las pequeñas cantidades de este asociadas al pellet representan
contaminación.

Conclusión

De la práctica que se realizó se aprendieron los procedimientos necesarios y

correctos para una mejor extracción de ADN por medio del método de extracción y
purificación salting out, de tal forma que, el ADN obtenido se encuentre en un estado
totalmente purificado para así poder realizar un mejor análisis del genoma. Para ello
los reactivos utilizados, tienen parte crucial en la realización por que de ello depende
que se pueda observar cualitativamente en ADN con el Nanodrop, y así se evidenció
en la gráfica la cual brindó un esquema de cómo a partir de una gota de muestra, se
puede determinar su grado de pureza y si el proceso de extracción fue eficiente con
valores cuantitativos.

Bibliografía
1. Komsky; L. 10 métodos de extracción de ADN. Revisado: 20/09/2019. Disponible en:
https://www.wakolatinamerica.com/blog-reactivos/post/10-metodos-de-extraccion-de-
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2. .Dhaliwal; A. Extracción y purificación de ADN. 24/05/2018. Revisado: 20/09/2019.
Disponible: http://www.labome.es/method/DNA-Extraction-and-Purification.html
3. Lopera; N . Et al. Comparación de protocolos de extracción de ADN con muestras de
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https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?pid=S0718-
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