Raul Blas Marcadores Moleculares

Agrobiotecnología
2013 -
Tolerancia a estreses abióticos
Ruth Heinz
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Sumario Estreses abióticos
Problemas y pérdidas producidas por estreses abióticos
Respuestas a estreses abióticos
Solutos compatibles
Estrategias para aislar genes de tolerancia

a estreses abióticos en plantas
Uso de genómica funcional para la búsqueda

de genes de tolerancia a estreses abióticos
Búsqueda de genes regulados por factores de

transcripción inducibles por estreses abióticos
Ejemplos de tolerancia frente a diferentes

estreses abióticos:
Agrobiotecnología Solutos compatibles
Bomba de Na+/H+
Sobrexpresión de citoquininas
Tolerancia Factores de transcripción
a estreses abióticos Proteínas LEA
Citrato sintetasa
Referencias
Estreses
• Las plantas son frecuentemente sometidas
abióticos a estreses, condiciones externas que
adversamente afectan su crecimiento,
desarrollo o productividad.
• Los estreses pueden ser bióticos, provocados

por otros organismos, o abióticos, causados
por condiciones desfavorables en el ambiente
físico o químico.
• Los estreses disparan un amplio rango

de respuestas en la planta, desde alteraciones
en la expresión genética y el metabolismo
celular, a cambios en la tasa de crecimiento
Agrobiotecnología
y rendimientos de los cultivos.
Tolerancia • La tolerancia o sensibilidad a los estreses

a estreses abióticos
depende de las especies, del genotipo y
del estadío de desarrollo de la planta.
Diferentes factores ambientales
que resultan en estreses abióticos
Tomado de: Holmberg and Bülow, Trends in Plant Science, 1998.
La mayoría de estos factores ambientales induce estrés osmótico

Demandas
y restricciones • Se espera que la población mundial duplique
futuras de la su número para el año 2050.
agricultura • En ese momento, la población mundial
alcanzará los 11.000 millones de personas,
de las cuales el 90% residirá en países en
desarrollo.
• La producción de alimento deberá
duplicarse o triplicarse para entonces.
• En Latinoamérica sólo el 7% del total de
tierra es cultivable. Los esfuerzos por
satisfacer las demandas de una población en
aumento han conducido al cultivo de suelos
de pastoreo y, en algunos casos, de tierras
Agrobiotecnología forestales, así como también de tierras
marginales (suelos salinos, ácidos, etc.).
Tolerancia
Problemas y pérdidas producidas
por estreses abióticos
Agrobiotecnología
Tolerancia
Muchas tierras La producción
alimentaria en aumento
cultivables se es el principal factor de
presión ejercido sobre
pierden debido los recursos de la tierra.
Esto acentúa
al exceso de uso la degradación de los
suelos y conduce a
o al mal manejo fenómenos de
desertificación y pérdida
de los suelos de los mismos.
Más de 3.500 millones de

ha (25% de la superficie
total) están afectadas por
la desertificación a nivel
mundial. En Sudamérica,
la desertificación afecta
unos 250 millones de ha.
Las principales causas

de desertificación son la
salinidad y la sequía.
El acceso a la
Agrobiotecnología alimentación de más de
900 millones de personas
Tolerancia corre peligro debido a
a estreses abióticos que las tierras de las que
dependen están
amenazadas por este
problema.
Las aplicaciones
Para aumentar la
biotecnológicas producción agrícola
y preservar los suelos
contribuirán a se requiere
implementar políticas
la recuperación sociales y económicas
de largo plazo,
de suelos introducir nuevas
formas de manejo
inapropiados agronómico
e incrementar la
para el cultivo investigación científica
y tecnológica.
Las aplicaciones
biotecnológicas, en
particular el uso de
cultivos transgénicos,
prometen incrementar
la producción agrícola
disminuyendo los
costos de producción.
Agrobiotecnología El uso de plantas

tolerantes a estreses
abióticos podría
Tolerancia permitir el uso y la
a estreses abióticos recuperación de tierras
afectadas por salinidad,
acidez, sequía, etc.
Rendimientos y pérdidas promedio de los principales cultivos
Rendimiento Rendimiento Pérdidas promedio Pérdidas

máximo promedio (Kg/Ha) abióticas
Cultivo (Kg/Ha) (Kg/Ha) Bióticasa Abióticasb (% rend. max.)
Maíz 19.300 4.600 1.952 12.700 65,8
Trigo 14.500 1.880 726 11.900 82,1
Soja 7.390 1.610 666 5.120 69,3
Sorgo 20.100 2.830 1.051 16.200 80,6
Avena 10.600 1.720 924 7.960 75,1
Cebada 11.400 2.050 765 8.590 75,4
Papa 94.100 28.300 17.775 50.900 54,1
Remolacha 121.000 42.600 17.100 61.300 50,7

Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones. Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
a Los estreses bióticos incluyen enfermedades, insectos y malezas.
b Los factores abióticos ambientales incluyen, pero no se limitan a, sequía, salinidad, inundación, y
altas y bajas temperaturas.
La incidencia de los factores ambientales sobre
los rendimientos es mayor en las zonas tropicales
Tomado de: Chispeels y Sadava, Plants, Genes and Crop Biotechnology, 2003..
Rendimiento clima templado (Tm/ha) a Rendimiento clima tropical (Tm/ha)
Cultivo Promedio Récord Promedio Récord
Papa 18,1 126.0 (USA) 8,7 60,0 (América

Central) b
Batata 13,6 65,0 (USA) 6,9 ---
b
Arroz 4,1 10,5 (Japón) 2,0 7,4 (Asia)
Maíz 4,0 22,2 (USA) 1,4 12,9 (Zimbabwe)
Trigo 3,0 14,1 (USA) 1,4 10,3 (Asia,

Zimbabwe,
América Central)
Sorgo 2,3 20,1 (USA) 1,2 10,3 (Asia)
1,7 8,6 (USA 1,0 9,6 (Zimbabwe)
Soja 1,6 7,3 (Japón) 1,0 4,8 (Zimbabwe)
% rendimiento récord 20,8 100 15,7 100
a Las zonas subtropicales y templadas se consideran templadas. Las zonas entre 23,5º latitud Norte y 23,5º latitud Sur se consideran
tropicales. b Asia está representada por Filipinas, Thailandia e India. Centro América está representada por México y Colombia.
La creciente
demanda de
agua es uno de
los problemas
Uso de agua (Km cubicos)

más acuciantes
que enfrentará
la agricultura
intensiva
Agrobiotecnología Agricultura Industria Uso doméstico
Tolerancia
a estreses abióticos El uso de agua en la agricultura se ha incrementado
siguiendo una función lineal en los últimos 70 años
El desarrollo de
las tierras áridas
Aproximadamente
y semiáridas es 60 millones de
un problema hectáreas están
sometidos a
geo-económico procesos erosivos
importante de en la Argentina
la Argentina
Cada año se suman
unas 650.000
hectáreas a los
procesos de erosión
Unos 9,5 millones de

personas están
Agrobiotecnología
localizadas en tierras
áridas o semiáridas
Tolerancia
Respuestas a estreses abióticos
Agrobiotecnología
Tolerancia
Respuesta de las plantas a niveles letales
o sub-letales de estrés
• En un ambiente desfavorable,
una planta podría enfrentar
las siguientes situaciones:
- Estrés letal que puede conducir a
la muerte de la planta debido al
incremento de los procesos de
senescencia.
- Estrés sub-letal o estrés letal precedido

por un estrés sub-letal durante el
cual pueden producirse cambios
adaptativos que permiten la
supervivencia de la planta (tolerancia).
• Estas adaptaciones pueden

ocurrir a nivel molecular,
(expresión génica y síntesis
. proteica) o a nivel bioquímico
. (síntesis de nuevos metabolítos),
. lo que conduce a respuestas
. celulares y fisiológicas alteradas.
Tomado de: Grover et al., Current Science, 2001.
Respuesta de las plantas a niveles letales
o sub-letales de estrés
• A nivel de toda la planta:
- Reducciones en la germinación de las semillas
- Reducciones en el establecimiento de las plántulas
- Pobre vigor de los brotes
- Decrecimiento en la extensión de las raíces
- Enrollamiento y senescencia de las hojas
. - Disminución de la tasa fotosintética
. - Reducción en la viabilidad del polen
- Reducción y llenado incompleto de los granos
• A nivel celular o subcelular:
- Niveles incrementados de diferentes osmolitos (sequía y salinidad)
- Represión general de la biosíntesis de proteínas (sequía y salinidad)
- Cambios selectivos en los niveles de K+/Na+ (sequía y salinidad)
- Incremento en la insaturación de los lípidos de membrana
. (descenso de temperatura)
- Regulación positiva de la glucólisis y enzimas requeridas
para la fermentación alcohólica (anaerobiosis; innundaciones)
Respuestas a estreses ambientales
ácido jasmónico,
,
ácido abscísico,
etileno, Ca 2+
Las plantas responden al estrés tanto a nivel celular como del conjunto de los tejidos. Los estreses constituyen
señales ambientales que son percibidas y reconocidas por las plantas. Las señales son transducidas en las
células y transmitidas a través de la planta. Típicamente, la transducción de señales a nivel celular resulta en la
alteración de la expresión genética, lo que a su vez influye sobre el metabolismo y el desarrollo de la planta.
Demarcación funcional de las rutas de señalización de
estreses inducidos por salinidad y sequía
Adaptado de: Zhu, Annual Review in Plant Biology, 2002.
Las rutas de señalización del estrés hídrico y salino son inducidas por exceso de Na+ o
por cambios osmóticos. Las rutas de señalización iónica y osmótica derivan en la
restauración de la homeostasis a nivel celular y de la planta.
recepción
Sensores: Señal
recepción
Rutas de Sensores:
histidina kinasa,
canales
histidina ionicos,
kinasa,
Señal
de estrés
de estrés
Hsfs, ionicos,
canales GPCR, RLKs
transducción Hsfs, GPCR, RLKs membrana
membrana
plasmática
de señales plasmática
Ca2+ Ca2+
involucradas MAPKKK
MAPKKK Ca2+ Ca2+
transducción de señales
transducción de señales
en las
CaM, CaN,
respuestas a MAPKK
MAPKK CaM,
CDPK
CaM,CDPK
CaN,
CDPK
SOS3
SOS3
estreses
abióticos MAPKK
MAPKK
Fosforilación
de proteínas
Fosforilación
de proteínas
SOS2
SOS2
Factores de
transcripción
Factores de
transcripción
niveles
antioxidantes, proteínas Transportadores
niveles de acción
osmolitos
antioxidantes, de tipo LEA
proteínas iónicos
Efectores/
Transportadores
osmolitos de tipo LEA iónicos
Efectores/
Agrobiotecnología
de acción
Protección de
Protección celular, homeostasis
macromoléculas,
Protección de reparación
Protección de daños,
celular, ionica
Tolerancia reparación de daños,
macromoléculas, homeostasis
homeostasis
reparación osmótica
de daños,
homeostasis
reparación osmótica
de daños, ionica
a estreses abióticos homeostasis osmótica
homeostasis osmótica
MPK, MPKK, MPKKK, : MAP quinasa, MAPK quinasa y MAPKK quinasa, respectivamente; CaM: Calmodulina; CDPK: proteína
quinasa dependiente de calcio; SOS3, SOS2: proteína quinasas (Salt overly sensitive); LEA: proteínas abundantes en la
embriogénesis tardía; Hsfs: factores de choque térmico; GPCR: receptor acoplado a proteína G; RLKs: quinasas de tipo receptor
Control transcripcional de las respuestas a estrés
sequía y alta salinidad

estrés biótico
y heridas
calor frío
AJ ABA
AREB/ABF DREB1D/CBF4 DREB2 DREB1/CBF

MYB MYC NAC HDZF
(bZIP) (AP2/ERF) (AP2/ERF) (AP2/ERF)
MYBR MYCR ABRE NACR HDZR DRE/CRT
Expresión de genes inducibles por estrés
Tolerancia a estrés
Adaptado de: Nakashima y Yamaguchi-Shinozaki, Abiotic stress adaptation in plants, 2010.
Los factores de transcripción que controlan respuestas inducibles por estrés están representados por elipses. Los elementos que actúan en cis
controlando la trascripción inducida por el estrés están representados como cajas. Los círculos pequeños sobre los factores de transcripción
representan modificaciones (tales como fosforilaciones) inducidas por el estrés que resultan en su activación.
Análisis proteómico
órgano especifico para
respuesta a estreses
abióticos
Setsuko Komatsu and Zahed Hossain

Frontiers in Plant Science, 2013, 4, 71
Rol de moleculas pequeñas como thiols en la
toleranica a estrés abiótico
Figure 1. Overview of the roles of
thiols in plant tolerance to abiotic
stress. Potential roles
of and the significance for abiotic
stress tolerance are depicted by
green circles next to
SH-adducts. Potential deleterious
compounds are shown in red and
their adducts in green
font. The dotted circle represents
the half-cell reduction potential of
the glutathione disulphide
(GSSG)/2 glutathione (GSH) redox
couple. Met, methionine; Cys,
cysteine;
TRX, thioredoxin; GRX,
glutaredoxin; PC, phytochelatins;
PCS, phytochelatin synthetase;
GST, glutathione-S-transferase;
GPx, glutathione peroxidase; GR,
glutathione reductase;
DHAR, dehydroascorbate
reductase; ASC, ascorbate;
MDHAR, monodehydroascorbate
reductase; DHA,
dehydroascorbate; ASCPx,
ascorbate peroxidase.
Zagorchev et al 2013, Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 7405-7432;

Funciones
bioquímicas
asociadas con
la tolerancia al
estrés hídrico
Agrobiotecnología
Adaptada de: Bohnert and Jensen, Trends in Biotechnology, 1996.

Tolerancia
a estreses abióticos El esquema incluye tres espacios que están definidos por la membrana plasmática y
el tonoplasto. Se muestran los efectos de la acción de proteínas relacionadas con la
tolerancia al déficit de H2O. El esquema se focaliza en los eventos bioquímicos y no
incluye eventos de señalización o rutas que conducen a alterar la expresión génica.
Respuestas de tolerancia al estrés hídrico
Las respuestas de tolerancia a estrés hídrico se basan en:
 Aumentar la actividad de bombas Na2+/H+

. en las membranas plasmáticas de células de raíz
. y en los tonoplastos del mesófilo y de otros tejidos
. (exportación y compartimentación de sodio)
 Controlar la expresión, actividad y propiedades de .

. los sistemas de transporte de potasio y la actividad
. de las acuoporinas
 Controlar el flujo de agua y el nivel de turgencia . .

incrementando la producción de solutos compatibles .
. (ajuste osmótico)
 Proteger las enzimas, complejos proteicos y estructuras

. de membrana incrementando la capacidad de detoxificación
. de radicales hidroxilos y la producción de osmoprotectores.
Solutos compatibles
Agrobiotecnología
Tolerancia
Parámetros
que
turgencia tensión
determinan
el ajuste p = 0 MPa
p = + 0,5 Mpa s = – 1,2 MPa
osmótico s = – 2,0 MPa w = – 1,2 MPa
w = – 1,5 MPa
Déficit de H2O
Suelo
con ajuste sin ajuste
Agrobiotecnología osmótico w = – 1,2 MPa osmótico
Tolerancia
a estreses abióticos Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
W : potencial de H2O S : potencial de soluto

W = S + P P : potencial de presión
El movimiento de
w externo = 0 MPa
agua hacia dentro
Membrana
o fuera de la plasmática
célula depende Valores

intracelulares
Pared celular
Vacuola
del gradiente de p = + 0,5 MPa
Rodeada por la
s = – 1,6 MPa membrana
potencial de agua del tonoplasto
w = – 1,1 MPa
(w) a través de
la membrana H2O w externo > w interno
plasmática Célula plasmolizada: w externo = – 2,5 MPa

Membrana
plasmática
Valores
intracelulares
p = 0 MPa
Agrobiotecnología s = – 2,0 MPa
w = – 2,0 MPa
Tolerancia
H2O
w externo < w interno
Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
Ajuste osmótico
en una célula
del mesófilo
en una hoja
de espinaca
sometida
a exceso de sal
Agrobiotecnología
Tolerancia Los iones de sodio y cloruro, que pueden interrumpir el

a estreses abióticos metabolismo en el citoplasma, se concentran en la vacuola.
Por el contrario, la concentración de glicina-betaína es alta
en los cloroplastos y el citoplasma, pero baja en la vacuola.
Funciones sugeridas de compuestos que se producen en
las plantas como respuesta al estrés hídrico
Grupo de productosa Componente específico Funciones sugeridas
Iones Potasio Ajuste osmótico, requisitos de
macronutrientes,
exclusión / exportación de sodio
Proteínas LEA/dehidrinasb Osmoprotección
Osmotinab Proteínas relacionadas con patogénesis
SOD/catalasa Detoxificación de radicales
Aminoácidos Prolina Ajuste osmótico
Amidinas Ectoína Osmoprotector
Azúcares Sacarosa Ajuste osmótico
Fructanos Osmoprotector, reserva de carbono
Polioles Acíclicos (ej., manitol) Reserva de carbono, ajuste osmótico
Cíclicos (ej., pinitol) Osmoprotector, ajuste osmótico
Aminas cuaternarias Glicina betaína Osmoprotector
-alanina betaína Osmoprotector
Dimetilsulfonio propionato Osmoprotector
Pigmentos y Carotenoides, antocianinas, Protección contra la fotoinhibición
carotenoides betalaínas
Poliaminas Espermina, espermidina Balance iónico, protección de la cromatina
Adaptado de: Bohnert and Jensen, Trends in Biotechnology, 1996.
a No todos los compuestos que se acumulan se encuentran en todas las especies; las rutas bioquímicas son
específicas para órdenes y familias de plantas.
b Las LEAs (late-embryogenesis abundant proteins) y las dehidrinas, así como las proteínas relacionadas con la
patogénesis, son ejemplos del reclutamiento de proteínas con “otra función” en las respuestas de estrés abiótico.
Estructuras químicas de solutos celulares compatibles
+ +
- NH3(CH2)3NH (CH2)4NH (CH2)3NH3
Espermina
Compuestos con amonios cuaternarios
-
-
-
Colina-O-sulfato
Los solutos
compatibles
preservan La capa de hidratación
de las macromoléculas
la capa no es perturbada por los
de hidratación solutos compatibles.
de las
macromoléculas
Agrobiotecnología
Proteína desnaturalizada: Proteína intacta: moléculas de H2O
Tolerancia pocas moléculas de H2O unidas rodeando a la proteína en forma
a estreses abióticos a la proteína; alta entropía altamente ordenada; baja entropía
Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
Estrategias para aislar genes
de tolerancia a estreses abióticos
Agrobiotecnología
Tolerancia
Las estreses primarios estreses secundarios
Adaptado de: Vinocur and
Altman, Current Opinion in
Biotechnology, 2005.
respuestas sequía salinidad
polución
química
estrés osmótico
estrés oxidativo
frio calor
al estrés Disrrupción de la
homeostásis osmótica
abiótico e iónica; daños a

proteínas funcionales
y estructurales y a
involucran
membranas celulares
mecanismos Osmosensores (ej., AtHK1),

enzimas que clivan fosfolípidos (ej., PDL),
ABF: ABRE binding factor;
AtHK1: histidin quinasa 1
Sensado , percepción de Arabidopsis thaliana;
complejos y transducción
de señales
segundos mensajeros ( ej., Ca2+, PtdOH , ROS),
MAP quinasas , sensores de Ca 2+ (ej., SOS3),
quinasas dependientes de Ca 2+ (ej., CDPKs )
bZIP: basic leucine zipper
transcription factor;
CBF/DREB: C-repeat-
binding
factor/dehidratation-
responsive binding protein;
Factores de transcripción
CDPK: protein quinasa
Control transcripcional (ej., CBF/DREB, ABF, HSF, bZIP , MYC/MYB dependiente de Ca2+;
COR: cold-responsive
protein;
Detoxificación Chaperonas Hsp: Heat-shock protein;
(SOD, PX) (Hsp, SP1, LEA, COR) LEA: late embryogenesis
Mecanismos de abundant;
respuesta al estrés Activación génica
MAP: mitogen-activated
Osmoprotección Movimiento de agua e iones
protein;
(acuoporinas,
(prolina , glicina- betaína,
polioles azúcares)
transportadores de iones) MYC/MYB: familias de
Agrobiotecnología actores de transcripción
PLD: fosfolipasa;
Restablecimiento de la homeostásis celular, Ptd-OH: ácido fosfatídico;
protección funcional y estructural de proteínas PX: peroxidasa;
Tolerancia y membranas celulares
ROS: especies reactivas
a estreses abióticos de oxígeno;
SOS: salt overly sensitive
SOD:
Tolerancia al estrés superoxidodismutasa;
SP1: stable protein 1
Estrategias para desarrollar plantas tolerantes al estrés
mediante ingeniería genética
Adaptado de: Vinocur and Altman, Current Opinion in Biotechnology, 2005.
Genes y proteínas asociadas a estreses
Componentes Hsps,
de rutas de chaperonas Transporte Detoxificación
señalización, y proteínas de agua e y scaveging
factores de iones de ROS
transcripción
LEA
Mejoramiento
vegetal y
marcadores Tolerancia adquirida a estrés Transformación
moleculares genética
(ej., QTLs)
Otros
Osmolitos, mecanismos
Poliaminas Metabolismo
osmo- de respuesta
de carbono
protectores a estrés
(ej., apoptosis)
Hsp: heat shock protein

LEA: late embryogenesis
Metabolitos asociados a estreses abundant
ROS: reactive oxygen
species
La tolerancia adquirida al estrés puede ser incrementada modificando la expresión de genes y proteínas
o por la sobrexpresión de metabolitos asociados al estrés. La tolerancia es un carácter que depende de
la actividad concertada de muchos genes, proteínas y rutas metabólicas. La tolerancia a los estreses
abióticos puede desarrollarse por ingeniería genética o mejoramiento asistido con marcadores
moleculares y quantitative trait loci (QTLs).
Estrategias
para desarrollar Buscar organismos que vivan
bajo condiciones medioambientales
plantas extremas de estrés
tolerantes al
estrés mediante Estudiar los organismos bajo
condiciones estresantes
ingeniería y no estresantes
genética
Aislar y clonar aquellos genes
que confieren la tolerancia al estrés
Caracterizar el producto génico

en un sistema modelo procariota
Introducir el gen en un sistema

vegetal y estudiarlo bajo estrés
Agrobiotecnología
Tolerancia
Introducir el gen en un cultivo
y proceder con ensayos de campo
Adaptado de: Holmberg and Bülow, Trends in Plant Science, 1998.

Craterostigma plantagineum es una planta poiquilohídrica
modelo para el estudio de tolerancia a la deshidratación
Los dos azúcares más prominentes hallados

en C. plantagineum son 2-octulosa y
estaquiosa. 2-octulosa predomina en las
hojas y es convertido en sacarosa durante la
deshidratación. Estaquiosa predomina en las
raíces, tanto en condiciones normales como
bajo deshidratación
Arriba: C. plantagineum (“Planta de la Resurrección”).

Abajo: efecto de la deshidratación. Planta totalmente
túrgida (izquierda); planta deshidratada (centro);
planta hidratada por 12 h (derecha). Tomado de: Bartels and Salamini, Plant Physiology, 2001.
Bromus pictus es una gramínea patagónica
resistente a frio y sequia con alto contenido de
fructanos
1. Aislamiento y caracterización de ADNc y secuencias genómicas completas.
2. Expresión en sistemas heterólogos (Piccia pastoris)
3. Transformación y evaluación de modelos de plantas.
4-Transformación decultivos de importancia agronómica para incrementar la
resistencia al estrés provocado por el frío y la sequía.
Bp 6-SFT
Miniexón
5´ ? ATG ? TAA 3´
Exón 1 Intrón 1 Intrón 2 Exón 3 Intrón 3 Exón 4
300 140 9 454 850 700 655 227 (pb)
Northern Blot
FRUCTOSIDOS TOTALES
0-2 cm 2-4 cm 4-6 cm Lamina Tip Lamina

nmoles Fructósidos/ mg PF
70
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
60
50
40
30
20
2,4 Kb.-
10
0
0-2 cm 2-4 cm 4-6 cm Lamina Tip Lamina
RNA
Florencia Del Viso (tesis doctoral 2010)
0-2 2-4 4-6 Lamina tip Lamina

Thellungiella halophila es una planta halófila modelo
para el estudio de la tolerancia a salinidad
Tomado de: Vinocur and Altman, Current Opinion in Biotechnology, 2005.
Thellingiella halophila es una pequeña halófila altamente tolerante

al estrés salino. Tiene un ciclo de vida corto y comparte muchas
similitudes biológicas y moleculares con Arabidopsis thaliana.
La fotografía muestra plantas de T. halophila y A. thaliana cultivadas
durante 7 días en medio saturado con 0, 200 y 600 mM de NaCl.
Thellungiella halophila es una planta halófila modelo
para el estudio de la tolerancia a salinidad
Uso de genómica funcional para la búsqueda
de genes de tolerancia a estreses abióticos
rd29A nAChRE a-tubulin
Tomado de: Seki et al., The Plant Cell, 2001.
Análisis de la expresión genética frente a estrés inducido por frío utilizando

microarreglos de 1.300 genes de Arabidopsis. Los genes señalados en la imagen
corresponden a controles positivos (rd29A), negativos (nAChRE) y a controles internos
no inducibles (α-tubulina). Se utilizaron sondas realizadas con ADNc de plantas
estresadas y no estresadas con frío. La coloración roja indica inducción génica; la
coloración verde, inhibición. Lo puntos en amarillo indican que no hay cambios en la
expresión génica.
Identificación de genes inducibles por estrés abiótico
Tomado de: Seki et al., The Plant Journal, 2002.

Clasificación de genes inducibles o reprimibles por frío, sequía y salinidad mediante análisis con
microordenamientos. Los números entre paréntesis (panel izquierdo) indican genes cuya inducción
es mayor de cinco veces para el estrés en cuestión y menor de tres veces para los restantes.
Identificación de genes de Arabidopsis thaliana inducidos
por estreses de frío, sequía y salinidad
Tomado de: Seki et al., The Plant Journal, 2002.
Análisis por Northern blot para tres genes altamente inducibles por salinidad
(RAFL08-19-G15), sequía (RAFL08-08-O14) y frío (RAFL04-12-P22). Se muestra
la expresión de un gen constitutivo (RAFL05-14-L02) como control interno.
Identificación Estrategia para
identificar genes
de genes inducidos por
frío y sequía
regulados por que son blanco
factores de del factor de
transcripción
transcripción DREB1A
(Dehydration
inducibles Responsive
Element Binding
por estreses Protein)
abióticos
a
Agrobiotecnología
Tolerancia

Identificación de genes inducibles por estrés abiótico
Genes inducibles por

Sequía y frío: 16
Genes
específicos
Genes que son blanco de DREB1A: 12 Genes inducibles
inducidos por
rd29A, cor15a, kin1, kin2, rd17, erd10, FL3- por frío: 2
sequía: 5
5a3, FL5-77, FL5-2122, erd4, FL5-94, FL3-27
FL5-90, DREB1A
FL6-55, FL5-2D23,
FL2-56, FL5-3J4, Genes que no son blanco
rd20 de DREB1A: 4
FL5-3M24, FL5-3A15,
FL5-2O24, FL5-1A9
Los genes inducibles por frío y sequía fueron clasificados en dos grupos: los
que son blancos de la acción de DREB1A y los que no son inducibles por este gen.
Estudios de expresión de genes candidatos
frente a estreses abióticos
Tratamientos estrés abiótico evaluados en hoja

Plantas crecidas en invernáculo y en estadio de segunda hoja
Salinidad expandida fueron regadas con solución 150 mM de NaCl durante 3
días (adaptado de Liu y Bard, 2003)
Frío Plantas crecidas en invernáculo y en estadio de segunda hoja

expandida fueron tratadas en cámaras a 10 grados durante 24
horas (Huang y col. 2005).
Control Plantas crecidas en invernáculo y en estadio de segunda hoja

expandida continuaron su crecimiento en invernáculo mientras las
otras recibían los tratamientos correspondientes.
4 plantas/maceta
Fernández et al 2008, BMC 8:11
Fernandez et al
Estudios de expresión de genes candidatos
frente a estreses abióticos
Análisis de expresión a gran escala mediante el uso de micromatrices de ADNc
a partir del banco local de ESTs
OBTENCIÓN DE ADNc
GENERACIÓN DE SONDAS
Y AMPLIFICACIÓN
IMPRESIÓN
HIBRIDACIÓN
ESCANEO Y PROCESAMIENTO DE LAS IMÁGENES
OBTENCIÓN DE MATRIZ DE EXPRESIÓN GÉNICA
Gentron Suc. Argentina

Microarreglo para deteccion de genes
candidatos para respuesta a frío y salinidad
Bandas de predicción (95%)

de los tres grupos de genes
generados por el método no
Supervisado k-means

33.00
33,00
S3
S2
S1
16.50
16,50
(17.2%)
CP 2 (17,2%)
Ctrl2
0.00
0,00 Ctrl1
C1
F1
-16.50
-16,50
C2
F2
C3
F3
-33.00
-33,00
-33.00
-33,00 -16.50
-16,50 0.00
0,00 16.50
16,50 33.00
33,00
CP 1 (75,6%)
(75.6%)
Bi-plot mostrando los 287 genes estudiados Bi-plot de la matriz de expresión

mostrando solo los genes con
p-valores menores a 0.05% in the F-text

FUNCTION= Defense / Stress related proteins
8.64
EF264-Defense / Stress related proteins
EF502-Defense / Stress related proteins
F231-Defense / Stress related proteins
H136-Defense / Stress related proteins
4.06
T110-Defense / Stress related proteins
-0.53 T340-Defense / Stress related proteins

Expresión génica
-5.12
-9.70
Ctrl1 Ctrl2 Frio1 Frio2 Frio3 Sal1 Sal2 Sal3
Perfil transcripcional de genes relacionados con respuesta a estrés

Cluster jerárgico
F467
F319
F373

T155
80 genes diferenciales para

F295
T479
F176
H360
F426
F514
F379
H406
F557
F496
T411
F491
T129
F593
frío/sal

T283
48 up/down en ambos estreses

F340
F305
T243
F455
EF264
F554
F572

F482
17 inducidos estrés específicos

F561
T368
F494
T307
T124
F577
H368

T120
12down estrés especificso

F202
F489
EF127
H329
T464
T187
T322

F192
T111
T107
F171
F210
H411
F216
EF624
T253
3 patrones opuestos
H322
T340
EF502
F137
F230
H209
H304
H136
F209
H111
F175
H385
T234
F231
T221
H302
H387
F443
F549
H123
H125
H354
F543
H124
F550
EF432
T289
H110
F401
Sal2
Sal1
Sal3
Frio2
Frio3
Frio1
Ctrl2
Ctrl1

Secuenciación de alto rendimiento
Roche / 545 FLX (2004) o Titanium 2009

Desarrollo de
Illumina Solexa Genome analyzer (2006)
plataformas
automatizadas para Applied Biosystems SOLIDTM System (2007)
secuenciación
Pacific Biosciences SMRT (2010)
masiva
Ion Torrent (2010)
Secuenciación de alto rendimiento
Plataforma de ABI 3730xl Roche 454 Illumina ABI SOLID Pacific

secuenciación Genome Titanium Genome Biosciences
Analyzer Analyzer
Química de Secuenciación Piro- Secuenciación Secuenciación Secuenciación
secuenciación automática secuenciación por síntesis por ligación por síntesis
por el método sobre soporte con
de Sanger sólido terminadores
reversibles
Método de Amplificación PCR en ¨Bridge¨ PCR PCR en Ninguna
amplificación in vivo emulsión emulsión (molécula
del templado vía clonado única)
de ADN
Longitud de 700-900 pb 300-400 pb 100 pb 75 pb 1-10 kpb
lectura
Producción de 0,03-0,07 Mb/h 13 Mb/h 25 Mb/h 21-28 Mb/h ?

secuencia
• Pronunciado descenso en el costo de secuenciación por base secuenciada

• Datos cualitativos (secuencia) y cuantitativos (abundancia de la secuencia)
• Posibilidad de incluir muchas situaciones por corrida
Identificación Planta no estresada Planta estresada
(estado de referencia) (estado experimental)
de genes
inducibles
por estreses
abióticos
mediante ARNm ARNm
enfoques
ADNc ADNc
transcriptómicos
Secuenciación Secuenciación
masiva masiva
Análisis bioinformático.
Selección de genes candidado
Análisis de función génica
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos Clonado de genes candidatos
Ensayos en sistemas modelo
Análisis transcriptómico y metabolómico del proceso de
senescencia foliar en girasol: identificación de genes y
rutas metabólicas implicadas
Esquema del (Programa

Mapman) de genes (cuadrados)
y metabolitos (círculos)
Up regulados (rojo o
downregulados(azul) durante el
proceso de senescencia
Moschen 2013,, Tesis doctoral

Rutas metabolicas involucradas en la fijacion de carbono
afectadas durante le proceso de senescencia foliar
Moschen 2013,, Tesis doctoral

Identificación de genes candidatos y Funciones
Moleculares significativas por microarreglos de
ADN en girasol
Fernandez et al 2012, PlosOne, October 2012 | Volume 7 | Issue 10 | e45899 ,

Solutos compatibles
Agrobiotecnología
Tolerancia
Transformación - Se transformaron plantas de tabaco con una
de tabaco con construcción genética que contenía el gen mtlD
de E. coli bajo el promotor de 35S de CaMV.
el gen de
- Se realizaron experiencias de crecimiento
manitol-1P en medios de alta concentración salina.
deshidrogenasa - Se evaluó la altura de la parte aérea y el peso
de Escherichia coli fresco de las plantas.
- Las plantas transgénicas toleraron mayores
niveles de salinidad.
Glucosa 6-fosfato Fructosa 1,6-difosfato

Fructosa
Fructosa 6-fosfato
Manitol 1-fostato
mtlD
Agrobiotecnología deshidrogenasa
Manitol 1-fosfato
Tolerancia Fosfatasa no
a estreses abióticos Fosfatasa
específica
inespecífica
Manitol
Transformación de tabaco con el gen
de manitol-1P deshidrogenasa de Escherichia coli
NT T
NT T NT T
Tomado de: Tarczynski et al., Science, 1993.
Plantas de tabaco transgénicas que Raíces de plantas de tabaco que acumulan
acumulan manitol y plantas control a los 30 manitol y plantas control a los 30 días en medio
días de crecimiento en medio de cultivo de cultivo sin sales (izquierda) y conteniendo
conteniendo 250 mM de NaCl. 250 mM de NaCl (derecha).
NT: no transgénica; T: transgénica. NT: no transgénica; T: transgénica.
Transformación - Se caracterizó el perfil de expresion del gen en B.
de tabaco con íctus, se asiló y clonó el mismo
el gen fructan 6- - Se expreso en el sistema heterólodo Pichia pastoris
fructosyltransfera -Se transformaron plantas de tabaco con una
(6-SFT) de la construcción genética que contenía el gen 6-SFT
bajo el promotor de 35S de CaMV.
gramínea
-Se evaluó la actividad enzimática así como lel
patagónica
contendio de fructanos en hojas de tabaco.
Bromus pictus
-Se realizaron ensayos sometiendo a plantas
previamente aclimatados o sin aclimatación a
condiciones de estrés fo temrperaturas de
congelameitno
- Se evaluó la perdidas de electrolitos asi como la
Agrobiotecnología altura de la parte aérea y el peso fresco de las plantas
en relación a controles no transgénicos.
Tolerancia
Transformación de tabaco con el gen fructan 6-fructosyltransfera (6-SFT)
de la gramínea patagónica Bromus pictus
Las lineas trangénicas tanto aclimatadas como no aclimatadas presentaron menor daño de membrana plasmática comparada con
controles no trangénicos y mayores nivles de fructanos. Las lineas trangénicas reasumieron el desarrollo despues del tratamiento de
congelamiento. Del Viso et al, 2011, J Plant Phys. 168 : 493–499
Ruta de síntesis de D-ononitol y de D-pinitol
en la planta del hielo (Mesembryanthemun crystallinum)
estrés en Arabidopsis thaliana

Vía ubicua; no inducible por
Vía ubicua y su extensión, la cual es inducible por Pool de glucosa 6 -fostato
estrés en Mesembryanthemum crystallinum
Inositol 1 -fosfato
inps1 sintetasa
Fosfoinosítidos,
Pool de myo -inositol 1 -fosfato fosfolípidos, fitatos
imp1 Inositol
monofosfatasa
D-glucuronato -1-fosfato,
síntesis de pared celular,
myo -inositol galactinol para azúcares
de rafinosa
imt1 Inositol
O -metiltransferasa
D-Ononitol
oep1 Ononitol
epimerasa
D-Pinitol
Adaptada de: Bohnert and Jensen. Trends in Biotechnology,1996.
La ruta de síntesis de D-ononitol y D-pinitol a partir de glucosa 6-P es inducible por sequía y/o
salinidad en varias familias de plantas halófilas. En la planta del hielo (Mesembryanthemun
crystallinum) se ha demostrado la inducción coordinada de la transcripción de inps1 y imt1. En
cambio, inps1 no se induce bajo estrés y el gen imt1 no está presente en Arabidopsis thaliana.
Expresión
constitutiva del gen
de la mio-inositol mio-inositol D-ononitol
O-metiltransferasa de
Mesembryanthemum
crystallinum en
Nicotiana tabacum
Tomado de: Sheveleva et al., Plant Physiol.,1997.
Acumulación de mio-inositol y D-ononitol en plantas de tabaco

Agrobiotecnología no transformadas (SR1) y en una línea transgénica (I5A)
transformada con el gen de imt1 de M. crystallinum en condiciones
Tolerancia de carencia de riego. Las plantas fueron privadas de agua durante
a estreses abióticos 8 días. Las plantas I5A exhibieron mayor tasa fotosintética,
mayor nivel de fijación de CO2 y mayor recuperación de la
fotosíntesis que los controles en condiciones de estrés .
Rutas biosintéticas presentes en diferentes organismos
para la síntesis de glicina betaína
Rutas
Rutasdede
dehidrogenación/oxidación de la
deshidrogenación/oxidación decolina
la colina
a) Plantas CMO: colina monooxigenasa
COD: colina oxidasa
CDH: colina deshidrogenasa
BADH: betaína aldehído
colina betaína aldehído glicina betaína
deshidrogenasa
b) Escherichia coli GSMT: glicina sarcosina
metiltransferasa
SDMT: sarcosina dimetiltransferasa
Fd(red) / Fs(ox): ferredoxina en
colina betaína aldehído glicina betaína
forma reducida u oxidada
c) Arthrobacter globiformis SAH: S-adenosilhomocisteína
SAM: S-adenosilmetionina
colina glicina betaína
Ruta de metilación de la glicina *

* La ruta de metilación de la
glicina fue identificada en dos
microorganismos halófilos:
glicina sarcosina glicina betaína Actinopolyspora halophila y
(N-metilglicina) N,N-dimetilglicina
Ectothiorhodospira halochocloris
Adaptado de: Murata and Chen Curr. Opin. Plant Biol., 2002.
Transformación de Arabidopsis thaliana con el gen
de colina oxidasa de Arthrobacter globiformis
- Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con una construcción
que contiene el gen codA de la bacteria del suelo Arthrobacter globiformis
dirigido por el promotor 35S de CaMV. Se agregó una señal de transporte
a cloroplastos a la secuencia del transgén para permitir la acumulación
de la enzima en dicha organela.
p35S rbcS tr codA tnos
- El contenido de glicina-betaína en hojas de plantas transgénicas aumentó

respecto del control.
- Las plantas transgénicas exhiben tolerancia al estrés salino y a altas
y bajas temperaturas.
Contenido (mol g-1 peso fresco)

Control Línea 1 Línea 2 Línea 3
Colina 1,5 ± 0,3 1,4 ± 0,3 0,8 ± 0,2 1,0 ± 0,3
Glicina-
0,0 0,9 ± 0,2 1,2 ± 0,2 0,8 ± 0,3
betaína Tomado de: Hayashi et al., The Plant Journal, 1997.
Transformación de Arabidopsis thaliana con el gen
de colina oxidasa de Arthrobacter globiformis
Efecto del estrés salino

sobre la germinación y el crecimiento
de plantas transgénicas y control
Tamaño de la planta (cm)

NaCl
(mM) Control Línea 1 Línea 2 Línea 3
0 3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,2 3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,2

100 0,2 ± 0,0 2,5 ± 0,3 2,0 ± 0,1 2,2 ± 0,1
200 0,1 ± 0,0 0,8 ± 0,1 0,1 ± 0,0 0,7 ± 0,1
300 0,0 0,2 ± 0,0 0,1 ± 0,0 0,2 ± 0,0
Se hicieron germinar 5 semillas de plantas controles

y 5 semillas de cada una de las líneas transgénicas
en placas de Petri suplementadas con varias
concentraciones de NaCl. Después de incubar a 0oC
por 2 días, las placas se incubaron a 22oC para
permitir la germinación y el crecimiento de plántulas.
Se midió la altura total de las plantas desde el tope
de la parte aérea hasta la punta de la raíz a los 5 días
de transferir las semillas a 22oC.
Tomado de : Hayashi et al., The Plant Journal, 1997.
Transformación Efecto del estrés salino en plantas transgénicas
de Arabidopsis y controles desarrolladas
thaliana con el A B Se cultivaron plantas
controles sin transformar
gen de colina y transgénicas en medio
oxidasa hidropónico por 30 días.
Las plantas se
de Arthrobacter transfirieron luego
globiformis a medio suplementado
con 200 mM de NaCl
y se las incubó por 10
5 cm
días con luz.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos A: Planta control no transgénica
B: Planta transgénica

Transformación Inducción de daños visibles en hojas de plantas
de Arabidopsis controles y transgénicas por bajas temperaturas
thaliana con el
gen de colina A B
oxidasa
de Arthrobacter
globiformis
Se cultivaron plantas transgénicas y controles durante 30 días y se las

incubó a 5oC bajo luz continua por 7 días. A continuación, las plantas
Agrobiotecnología
fueron incubadas en condiciones normales por 2 días.
Tolerancia
A: Planta control no transgénica
B: Planta transgénica
Tolerancia a altas temperaturas en plantas de Arabidopsis thaliana
que expresan el gen de colina oxidasa de Arthrobacter globiformis
No transgénica Transgénica
22°C 50°C 22°C 50°C
40°C 55°C 40°C 55°C

Tomado de: Alia et al., The Plant Journal, 1998.
Efecto de altas temperaturas durante la imbibición y subsiguiente germinación de semillas

de plantas no transgénicas y transgénicas. La semillas fueron imbibidas a 22, 40, 50 y 55oC
por 1 hora y luego sembradas en placas. Luego de incubarlas a 4oC por 2 días, las semillas
fueron mantenidas a 22oC por 3 días.
Comportamiento frente a distintas formas de estrés de
plantas modificadas para sobrexpresar glicina betaína
Acumulación Tolerancia
Especies Gen
máxima aumentada
Arabidopsis thaliana codA 1,2 mol g –1 pf Frío
codA 1,2 mol g –1 pf Frío, salinidad
codA 1,2 mol g –1 pf Calor
codA 1,2 mol g –1 pf Luz intensa
codA 1,2 mol g –1 pf Salinidad
codA 1,2 mol g –1 pf Heladas
cox 19 mol g –1 ps Heladas, salinidad
Brassica napus cox 13 mol g –1 ps Sequía, salinidad
Brassica juncea codA 0,82 mol g –1 pf Salinidad
Diospyros kaki codA 0,3 mol g –1 pf Salinidad
Nicotiana tabacum cox 13 mol g –1 ps Salinidad
betA * Salinidad
betA / betB 0,035 mol g –1 pf Frío, salinidad
Oryza sativa codA 5,3 mol g –1 pf Frío, salinidad
betA 5,0 mol g –1 pf Sequía, salinidad
(modificado)
* No se dispone de datos Adaptado de: Chen and Murata, Curr. Opin. Plant Biol., 2002.
codA: gen de colina oxidas de E. coli; cox: gen de colina colina oxidasa de A. globiformis; BetA y BetB: genes de betaína deshidrogenasa
y de betaína aldehido deshidrogenasa de E. coli;
Tolerancia frente a distintas formas de estrés de plantas
modificadas para producir otros solutos compatibles
Solutos Planta Acumulación Tolerancia
Gen
compatibles hospedadora máxima aumentada
Fructano sacB Tabaco 0,35 mg g –1 pf Sequía
sacB Remolacha 0,5 % ps Sequía
azucarera
Manitol mt1D Arabidopsis 10 mol g –1 pf Salinidad
mt1D Tabaco 6 mol g –1 pf Salinidad
mt1D Tabaco 3,8 mg g –1 ps Salinidad
mt1D Tabaco 7 mol g –1 pf Estrés oxidativo
D-ononitol imt1 Tabaco 35 mol g –1 pf Sequía, salinidad
Prolina Anti-proDH Arabidopsis 600 g g –1 pf Heladas, salinidad
P5CF127A Tabaco 4 mg g –1 pf Salinidad
Sorbitol S6PDH Caqui 61,5 mol g –1 pf Salinidad
Trehalosa TPS1 Tabaco 3,2 mg g –1 ps Sequía
TPS1 Papa * Sequía
TPS1 Tabaco * Sequía
otsA, otsB Tabaco 90 g g –1 pf Sequía
* No se dispone de datos Adaptado de: Chen and Murata, Curr. Opin. Plant Biol., 2002..
Anti-proDH: ADNc antisentido del gen de prolina deshidrogenasa de A. thaliana; imt: gen de myo-inositol O-metil transferasa de M.
crystallinum; mt1D: gen de la manitol-1-fosfato deshidrogenasa de E. coli; otsA y otsB: genes de trehalosa-6-fosfato sintetasa y de
treahalosa-6-fosfato fosfatasa de E. coli; P5CS: gen de ´-pirrolina-5-carboxilato sintetasa de V. aconitifolia; P5CF127A: gen mutado de
´-pirrolina-5-carboxilato sintetasa de V. aconitifolia; SacB: gen de la levanosacarasa de B. subtilis; S6PDH: gen de la sorbitol-6-fosfato
deshidrogenasa de manzano; TPS1: gen de la trehalosa-6-fosfato sintetasa de levadura.
Bombas de Na+/H+
Agrobiotecnología
Tolerancia
Regulación de exportación
la homeostasis
de Na+ y K+
por la ruta SOS
H+
compartimentalización
exclusión
Agrobiotecnología
Adaptado de: Zhu. Annual Review in Plant Biology, 2002.

Tolerancia
a estreses abióticos El estrés por alta concentración de Na+ da lugar a una señal mediada por
Ca2+ que activa el complejo de kinasas SOS3-SOS2, el que a su vez
estimula la actividad de intercambio Na+/H+ de SOS1 y regula la expresión
de distintos genes a nivel transcripcional y post-transcripcional.
Tolerancia a estrés salino en plantas de tomate transformadas
con el gen nhx1 de la bomba vacuolar de Na+/H+ de Arabidopsis thaliana
A B D
Tomado de: Zhang and Blumwald.

Nature Biotechnology, 2001
Plantas controles (A) y transgénicas (B) Plantas controles (C) y transgénicas (D)
crecidas en 5 mM NaCl crecidas en 200 mM NaCl
A B
A: Frutos de plantas controles

B: Frutos de plantas transgénicas
Tolerancia a estrés salino en plantas de Brassica napus transformadas
con el gen nhx1 de la bomba vacuolar de Na+/H+ de Arabidopsis thaliana
Plantas transgénicas y control crecidas en 200 mM de NaCl

Tomado de: Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001.
X1OE1 X1OE2 X1OE3 Controles

Las diferentes líneas transgénicas presentan niveles de expresión
X1OE1: nivel alto; X1OE2: nivel medio; X1OE3: nivel bajo
Tolerancia a estrés salino en plantas de Paspalum dilatatum
transformadas con el gen nhx1 de Arabidopsis thaliana
Se transformaron plantas de P. dilatatum con una construcción que

permite expresar el gen nhx1 de A. thaliana en forma constitutiva
T WT T WT T T
Texto: Arial 24
Gentileza: Ing. Agr. G. Schrauf

Plantas transgénicas (T) y control (WT) regadas con 250 mM NaCl
Sobrexpresión de citoquininas
Agrobiotecnología
Tolerancia
Tolerancia
• La salinidad y la sequía aceleran el proceso de
a estrés hídrico . senescencia en las plantas.
en tabaco
• Bajo un estrés no letal, las plantas tienden a florecer
transformado . más rápidamente.
con el gen ipt
• El estrés modifica la relación fuente/sumidero
bajo un
promotor • Las citoquininas retrasan el proceso de senescencia
inducible El retraso de la senescencia originada por el estrés puede proveer
mecanismos de supervivencia mediante la activación de mecanismos
por senescencia de evasión (regulación del turn-over proteico, mayor eficiencia en el
uso de agua, consumo de nutrientes de almacenamiento, retraso de
la floración inducida por estrés)
Se expresó un gen de la enzima isopentenil transferasa (IPT) bajo un

promotor inducible por senescencia para mantener niveles óptimos
de citoquininas y retrasar el estrés inducido por este proceso. La IPT
es el factor limitante de la biosíntesis de citoquininas.
Agrobiotecnología
Tolerancia El promotor utilizado proviene del gen de

a estreses abióticos una quinasa tipo receptor asociada a
SARK IPT senescencia (SARK) de Phaseolus vulgaris.
El gen SARK es inducido por este proceso.
Tolerancia No transgénica Transgénica
a estrés hídrico
en tabaco
transformado
con el gen ipt
bajo un
promotor
inducible
por senescencia
Gentileza Dr. E. Blumwald

Agrobiotecnología
Tolerancia
Fila superior: sin riego segunda semana

Fila inferior: riego restaurado, tercera semana
Tolerancia
La tolerancia a estrés hídrico puede visualizarse como un
a estrés hídrico carácter de productividad en condiciones de escasez de agua
en tabaco
transformado
con el gen ipt
bajo un
promotor
inducible
por senescencia

Agrobiotecnología
Tolerancia
Plantas transgénicas y control cultivadas en condiciones de riego
diario normal (derecha) y bajo 30% del riego diario normal (izquierda)
Tolerancia Peso fresco de plantas Producción de semillas
a estrés hídrico
en tabaco
transformado
semillas /planta
Peso fresco (g/planta)
con el gen ipt
bajo un
promotor
inducible
por senescencia
Rendimiento de semillas
(g semilla/planta)
Peso seco

Agrobiotecnología
Tolerancia
1 L/día 0,3 L/día Sequía

Expresión de factores de transcripción
Agrobiotecnología
Tolerancia
Transformación
La
de plantas de disponibilidad
Arabidopsis de agua regula
la expresión
thaliana del gen hahb-4
en los
con el gen diferentes
del factor de órganos de la
planta
transcripción
Hahb-4
de girasol
Gentileza Dr. R. Chan

Agrobiotecnología
Hahb-4 es un factor de transcripción de girasol que
Tolerancia pertenece a la familia Hd-Zip. Los factores de este tipo
a estreses abióticos contienen un dominio de unión a ADN asociado con
un cierre de leucinas y estarían involucrados en procesos
del desarrollo vinculados a factores ambientales.
Transformación de plantas de Arabidopsis thaliana
con el gen del factor de transcripción Hahb-4 de girasol
Plantas
transformadas
con
el gen Hahb-4
(derecha ) y
no transgénicas
(izquierda)
sometidas a
sequía.
Transformación T WT T WT
de plantas de
Arabidopsis
thaliana
con el gen
del factor de Plantas de
Arabidopsis
transcripción thaliana de 28
Hahb-4 días post-
germinación
de girasol sometidas a
estrés hídrico
extremo

Agrobiotecnología Las mismas
plantas que en
el panel
Tolerancia
a estreses abióticos superior a las 24
h de resumido el
riego normal
WT T WT T
Ensayos de campo con plantas de trigo transformadas
con el gen Hahb-4 de girasol
4000
Villalonga b
ab ab ab
Yield (kg ha-1)

3000
a a
2000
39°54’51”S 1000
62°37’12”W
0
4
.3
.4
.6
pe
.1
00
.a
.a
.a
Ty
.a
3
.ii
.ii
.ii
.ii
.IV
.IV
.IV
BI
ild
.IV
Villalonga W
Ta
Ta
Ta
Ta
2000
Monte Buey
1500
Yield (kg ha-1)
1000
32°55’08”S
62°27’28”W
500
0
Wild type Ta.IV.ii.a.3 Ta.IV.ii.a.4 Ta.IV.ii.a.6 Ta.IV.ii.a.12
Monte Buey
Gentileza Ing. Agr. G. Watson
Etapas de experimentacion para la llegada de un cultivo
transgénico al mercado
ESQUE
Proteínas LEA
Agrobiotecnología
Tolerancia
Sobreexpresión Se transformaron plantas de arroz con el gen hva1
del gen hva1 de cebada que codifica una proteína LEA (Late
de cebada Embryogenesis Abundant). La secuencia se puso
bajo la dirección del promotor de actina de arroz.
(Hordeum vulgare
Las plantas transgénicas exhibieron mayor crecimiento
L.) en plantas de hojas y raíces en condiciones de estrés.
transgénicas
de arroz
Planta control
no transgénica (NT)
y dos líneas
transgénicas (36, 41)
que fueron
sometidas a tres
ciclos consecutivos
de estrés hídrico
Agrobiotecnología de 7 días cada uno,
consistentes en
Tolerancia 5 días sin riego
a estreses abióticos seguidos por 2 días
con riego.
Tomado de: Xu et al., Plant Physiol., 1996.
Citrato sintetasa
Agrobiotecnología
Tolerancia
Tolerancia a aluminio en plantas de tabaco transformadas
con el gen de citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa
- Los suelos ácidos y con alta concentración de aluminio resultan tóxicos para
las raíces, las cuales no son capaces de desarrollarse y absorber los nutrientes
disponibles.
- El exudado de ácidos orgánicos produce la quelación del aluminio produciendo
tolerancia al mismo.
- Se transformaron plantas de Nicotiana tabacum con una construcción que contiene
el gen de citrato sintetasa (csb) de la bacteria Pseudomonas aeruginosa dirigido
por el promotor 35S de CaMV.
- Se cuantificaron los niveles de citrato en la planta y del exudado por las raíces,
en raíces transgénicas con CSb y controles sin transformar.
Niveles de citrato (mmol Eflujo de citrato (nmol
Línea por gramo de peso fresco) por plántula por hora)
Control 0,43 ± 0,05 57 ± 7,2
CSb-4 1,41 ± 0,07 105 ± 12,2
CSb-11 1,62 ± 0,08 111 ± 12,6
CSb-15 2,31 ± 0,10 163 ± 14,3
CSb-18 4,47 ± 0,35 231 ± 15,3
Tomado de: de la Fuente et al., Science, 1997.
- Las plantas transformadas toleraron altas concentraciones de aluminio.

Tolerancia a aluminio en plantas de tabaco transformadas
con el gen de citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa
A: Plantas controles germinadas
A B en medio con (derecha) y sin
(izquierda) 300 M de aluminio,
2 semanas post-germinación.
C B y C: Plantas controles (B)

y CSb-18 (C) germinadas
en medio conteniendo 0, 75, 300
y 1000 M de aluminio, 10 días
D E F G post-germinación.
D y E: Plántulas CSb-4 y CSb-18
de una semana germinadas
en 200 M de aluminio.
H: Segregación del fenotipo
de tolerancia a aluminio
en la progenie de CSb-18 luego
de 4 semanas de crecimiento
en medio con 300 M de aluminio.
Las flechas indican
H I J las plántulas susceptibles.
F, G, I y J: Tinción con hema-
toxilina de los pelos y la punta
de las raíces de plántulas de 7 días
tratadas por 1 h con 100 M
de aluminio. (F) y (I) son controles
y (G) y (J) plántulas CSb-18.
Tolerancia
a aluminio en
plantas de papaya
transformadas
con el gen de
citrato sintetasa
de Pseudomonas
aeruginosa

Agrobiotecnología
Plantas de papaya (Carica papaya) control
y transformadas con el gen csb a los 30 días de
Tolerancia
a estreses abióticos cultivo en presencia de 300 M de aluminio.
Izquierda: planta de papaya transgénica;
derecha: planta transformada con el vector vacío.
Incremento de la captación de fósforo en plantas de tabaco que
expresan el gen de la citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa
• En suelos alcalinos (compuestos fosforados con calcio y magnesio) y ácidos

(compuestos fosforados con hierro y aluminio) la disponibilidad de fósforo
soluble es baja.
• El exudado de ácidos orgánicos por parte de las raíces aumenta su
disponibilidad.
• Se introdujo en plantas de tabaco el gen de citrato sintetasa de Pseudomonas
aeruginosa bajo el promotor 35S de CaMV.
• Las plantas que expresaron la citrato sintetasa fueron capaces de solubilizar
y absorber el fósforo inmovilizado en suelos alcalinos.
actividad CS eflujo de citrato

Línea (mg CoA min-1mg-1 (nmol por plántula por
proteína) hora)
1522 (control) 225 ±11 57 ± 7,2
CSb-4 430 ± 14 105 ± 12,2
Csb-18 595 ± 18 231 ± 15,3

Tomado de: López-Bucio et al., Nature Biotechnology, 2000.
Crecimiento y productividad de líneas de
A B C tabaco CSb sometidas a distintos
tratamientos con fósforo. Se cultivaron
plantas transgénicas (CSb-4 y CSb-18) y
control (1522) en suelo alcalino estéril de
bajo contenido de fósforo, con o sin
agregado de fósforo. Las plantas fueron
fotografiadas luego de 4 meses en el
1522 CS-4 CS-18 invernáculo.
A1522 CS-4 CS-18
B1522 CS-4 CS-18
C
D
A: Plantas cultivadas sin agregado de P.
e P.
B y C: Plantas cultivadas con el agregado

de 22 ó 108 mg de PO4H2Na por kg de
suelo, respectivamente
1522 CS-4 CS-18 D: Frutos de plantas cultivada con 22
D E
ppm de PO4H2Na
E: Vista superior de una maceta
conteniendo la planta CSb-18 en que se
observan precipitados de citrato de calcio
(flechas).
F-H: Tinción de raíces de la planta CSb-
18 con Tryptan blue. F: planta no
F G H inoculada. G y H: planta inoculada con la
micorriza Glomus fasciculatum
Efecto de citrato
en la acumulación
de biomasa de plantas
de tabaco cultivadas
en medio conteniendo una
fuente insoluble de fosfato
Se cultivaron plantas
transgénicas (CSb-4
y CSb-18) y control (1522)
en medio (pH 8,0)
suplementado o no con 1 mM
de ácido cítrico. Las fuentes
soluble e insoluble de fosfato
(PO4H2Na y Ca10(PO4)6(OH)2)
se ajustaron a 1 mM. Las
plántulas se cosecharon
Sin
a los 15 días y se determinó

el peso seco. Datos promedio
de tres experimentos
independientes.
Nuevas estrategias basadas en gene targeting
Ejemplos de otros genes utilizados para conferir
tolerancia a estreses abióticos
Umezawa et al., Current Opinion in Biotechnology, 2006.





1. Umezawa, T., Fujita, M., Fujita, Y., Yamaguchi-Shinozaki, K. And
Referencias Shinozaki, K. Engineering drought tolerance in plants: discovering and
tailoring genes to unlock the future. Current Opinion in Biotechnology,
17:113-122, 2006.
2. Vinocur, B. And Altman, A. Recent advances in engineering plant
tolerance to abiotic stress: achievements and limitations. Current Opinion
in Biotechnology, 16:123-132, 2005.
3. Zhu, J.-K. Salt and drought stress signal transduction in plants. Annual
Review in Plant Biology, 53:247-273, 2002.
4. Iba, K. Acclimative response to temperature stress in higher plants:
approaches of gene engineering for temperature tolerance. Annual
Review of Plant Biology, 53:225-245, 2002.
5. Seki, M., Narusaka, M., Ishida, J., Nanjo, T., Fujita, M., Oono, Y., Kamiya,
A., Nakajima, M., Enju, A., Sakurai, T., Satou, M., Akiyama, K., Taji, T.,
Yamaguchi-Shinozaki, K., Carninei, P., Kawai, J., Hayashizaki, Y. and
Shinozaki, K. Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis
genes under drought, cold and high-salinity stresses using a full-length
cDNA microarray. The Plant Journal, 31:279-292, 2002.
6. Chen, H.H. and Murata, N. Enhancement of tolerance of abiotic stress by
metabolic engineering of betaines and other compatible solutes. Current
Opinion in Plant Biology, 5:250-257, 2002.
Agrobiotecnología 7. Zhang, H.X. and Blumwald, E. Transgenic salt-tolerant tomato plants
accumulate salt in follage but not in fruit. Nature Biotechnology, 19:765-
768, 2001.
Tolerancia
8. Zhu, J.-K. Plant salt tolerance. Trends in Plant Sciences, 6:66-71, 2001.

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Agrobiotecnología

Tolerancia a estreses abióticos

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular

Problemas y pérdidas producidas por estreses abióticos

Respuestas a estreses abióticos

Estrategias para aislar genes de tolerancia

Uso de genómica funcional para la búsqueda

Búsqueda de genes regulados por factores de

Ejemplos de tolerancia frente a diferentes

• Los estreses pueden ser bióticos, provocados

• Los estreses disparan un amplio rango

Tolerancia • La tolerancia o sensibilidad a los estreses

Tomado de: Holmberg and Bülow, Trends in Plant Science, 1998.

La mayoría de estos factores ambientales induce estrés osmótico

Más de 3.500 millones de

Las principales causas

Agrobiotecnología El uso de plantas

Rendimiento Rendimiento Pérdidas promedio Pérdidas

Maíz 19.300 4.600 1.952 12.700 65,8

Trigo 14.500 1.880 726 11.900 82,1

Soja 7.390 1.610 666 5.120 69,3

Sorgo 20.100 2.830 1.051 16.200 80,6

Avena 10.600 1.720 924 7.960 75,1

Cebada 11.400 2.050 765 8.590 75,4

Papa 94.100 28.300 17.775 50.900 54,1

Remolacha 121.000 42.600 17.100 61.300 50,7

Rendimiento clima templado (Tm/ha) a Rendimiento clima tropical (Tm/ha)

Cultivo Promedio Récord Promedio Récord

Papa 18,1 126.0 (USA) 8,7 60,0 (América

Maíz 4,0 22,2 (USA) 1,4 12,9 (Zimbabwe)

Trigo 3,0 14,1 (USA) 1,4 10,3 (Asia,

1,7 8,6 (USA 1,0 9,6 (Zimbabwe)

Soja 1,6 7,3 (Japón) 1,0 4,8 (Zimbabwe)

% rendimiento récord 20,8 100 15,7 100

Uso de agua (Km cubicos)

Agrobiotecnología Agricultura Industria Uso doméstico

Unos 9,5 millones de

- Estrés sub-letal o estrés letal precedido

• Estas adaptaciones pueden

Adaptado de: Zhu, Annual Review in Plant Biology, 2002.

sequía y alta salinidad

AREB/ABF DREB1D/CBF4 DREB2 DREB1/CBF

MYBR MYCR ABRE NACR HDZR DRE/CRT

Expresión de genes inducibles por estrés

Adaptado de: Nakashima y Yamaguchi-Shinozaki, Abiotic stress adaptation in plants, 2010.

Setsuko Komatsu and Zahed Hossain

Zagorchev et al 2013, Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 7405-7432;

Adaptada de: Bohnert and Jensen, Trends in Biotechnology, 1996.

Las respuestas de tolerancia a estrés hídrico se basan en:

 Aumentar la actividad de bombas Na2+/H+

 Controlar la expresión, actividad y propiedades de .

 Controlar el flujo de agua y el nivel de turgencia . .

 Proteger las enzimas, complejos proteicos y estructuras

W : potencial de H2O S : potencial de soluto

célula depende Valores

plasmática Célula plasmolizada: w externo = – 2,5 MPa

Tolerancia Los iones de sodio y cloruro, que pueden interrumpir el

Compuestos con amonios cuaternarios

abiótico e iónica; daños a

mecanismos Osmosensores (ej., AtHK1),

Genes y proteínas asociadas a estreses

Hsp: heat shock protein

Caracterizar el producto génico

Introducir el gen en un sistema