GUÍA DE PRÁCTICAS

FACULTAD: CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS Y CARRERA: Biotecnología

BIOTECNOLOGÍA
NIVEL: CUARTO ASIGNATURA: BIOQUÍMICA I TIPO GUÍA DE PRÁCTICAS: LABORATORIO
DOCENTE: CECILIA CARPIO CICLO ACADÉMICO: Sep 2019 – Ene 2020
AYUDANTE: PAMELA SILVA
Práctica 1
I. TEMA:
Reacciones para caracterización de carbohidratos

II. OBJETIVO:

Caracterizar desde el punto de vista estructural y funcional a los carbohidratos y sus componentes así como
relacionar los métodos para la extracción, purificación y caracterización de los mismos .
III. INSTRUCCIONES:

Use mandil, guantes, gafas, mascarilla y la sorbona para manipular reactivos y preparar soluciones, las cuales
deben guardarse en botellas de plástico o de vidrio, debidamente etiquetadas; mantener las soluciones en
refrigeración a excepción de la de DNS. Las soluciones de enzima guardarlas en el congelador al igual que la
solución de almidón.

Lave con anticipación el material a utilizar con cepillo detergente y enjuague de forma que no queden residuos
de detergente.

NO CONTAMINE los reactivos. Lave y seque las espátulas antes de emplearlas con otros reactivos.

Lea con anticipación la Guía para la práctica.

IV. LISTADO DE EQUIPOS MATERIALES Y RECURSOS

MATERIALES REACTIVOS

Fehling

• Balanza analítica con precisión de 0,1 mg • A: Sulfato de cobre pentahidratado

• Desecador con agente secante activo • B: Tartrato de sodio y potasio
• Estufa con regulación de temperatura • B: Hidróxido de sodio
• Pinzas Benedict
• Guantes de plástico • Citrato de sodio
• Papel aluminio • Carbonato de sodio
• Vasos de precipitación de 50 mL • Sulfato de cobre
• Pipetas de 5 y 10 mL Barfoed
• Micropipeta de 100 a 1000 L • Acetato de cobre
• Espátula • Ácido acético glacial ó al 38 %
• Tubos de ensayo DNS
• Gradillas • Ácido 3,5 dinitrosalicílico
• Sistema de calentamiento • Hidróxido de sodio 2 M
• Microscopio • Tartrato de sodio y potasio
• Termómetro Molisch
• Medidor de pH • α-naftol
• Papel filtro • etanol al 96%
• Tubos de centrífuga de 15 Ml Seliwanoff
• Plancha de calentamiento con agitación • Resorcinol
Monosacáridos: glucosa, fructosa y arabinosa • Ácido clorhídrico 3 M
(soluciones acuosas al 1%). Disacáridos: lactosa, Wohlk
y sacarosa (soluciones acuosas al 1%) • Amoníaco concentrado
• KOH al 25 %
 V. ACTIVIDADES POR DESARROLLAR
Preparación de soluciones: Calcular las cantidades a emplear a partir de la información proporcionada para
cada solución.

Fehling
Fehling A (25 mL): pesar con la mayor exactitud 34,65 g de sulfato de cobre pentahidratado y diluir con
agua destilada hasta 500 mL.

Fehling B (25 mL): Disolver 173 g de tartrato de sodio y potasio y 50 g de hidróxido de sodio. Llevar a 500
mL con agua destilada.

Benedict (25 mL)

Disolver 17,3 g de citrato de sodio y 10,0 g de carbonato de sodio en 80,0 mL de agua caliente. Filtrar a
través de papel filtro en una probeta de 100 mL y completar con agua hasta 85 mL. Por otra parte, disolver 1,73
g de sulfato de cobre en 15 mL de agua destilada. Transferir la primera solución a un vaso de precipitación
de 250 mL y añadir lentamente la solución de sulfato de cobre, agitando constantemente.

Barfoed (10 mL)

Disolver 6,65 g de acetato de cobre en 100 mL de agua destilada. Filtrar si es necesario y agregar 1 mL de
ácido acético glacial.

DNS (10 mL)

Disolver 1 g de ácido 3, 5 dinitrosalicílico en 40 mL de agua destilada, añadir 20 mL de hidróxido de sodio 2 M y
finalmente agregar lentamente 30 g de tartrato de sodio y potasio. Calentar a 40 °C si no se ha solubilizado
completamente el tartrato. Enfriar y llevar a volumen con agua destilada.

Molisch (5 mL)
Determinar la cantidad de α-naftol que debe pesar para preparar 5 mL de solución al 5 % en etanol de 96 % V/V.

Seliwanoff (10 mL):

Disolver 0,5 g de resorcinol en 100 mL de HCl 3,0 M (HCl:Agua destilada 1:3).

Wollk
Solución de KOH al 25 % (5 mL): determinar la cantidad de KOH que necesita para preparar el volumen
establecido. Pesar el hidróxido en una luna de reloj y agregar lentamente al vaso que contiene 5 mL de agua
destilada, colocado en un baño de agua fría para disipar el calor generado en la disolución del KOH.

Lugol (10 mL):

Preparar una solución de yoduro de potasio (KI) al 1%. Para 100 mL de solución de lugol disolver 0,1 g de
cristales de yodo en 100 mL de la solución de KI, preparada previamente. Guardar en una botella obscura.

Solución de almidón al 1% (25 mL):

Calcular la cantidad de almidón que debe pesar y suspenderlo con agitación (de preferencia magnética o con
una varilla) en 25 mL de agua destilada, calentar hasta que hierva y mantener la ebullición por 2 minutos.
Enfriar y restituir el agua evaporada.

• Reacciones típicas de los azúcares

Reacciones de óxidorreducción
i. Reacción con el licor de Fehling: se basa en el poder reductor del grupo carbonilo de los aldehídos el cual
se oxida a ácido y reduce la sal de cobre II en medio alcalino, a óxido de cobre, formando un precipitado de
color rojo ladrillo.

Tomar 3 mL de la muestra que se va analizar y colocar en un tubo de vidrio resistente al calor. Añadir 1 mL
del reactivo de Fehling A y 1 mL de reactivo de Fehling B. La solución del tubo adquirirá un color azul
intenso. Calentar el tubo a baño maría o directamente en un mechero. La reacción será positiva si se vuelve
de color rojo-ladrillo y aparece un precipitado o será negativa si la muestra queda azul o cambia a un tono
azul-verdoso.

ii. Reacción de Benedict: es otra prueba de óxido-reducción que permite reconocer azúcares reductores
 (aquellos que tienen el grupo OH anomérico libre). Al igual que con el licor de Fehling, la solución de cobre II
en medio alcalino se reduce a óxido de cobre I (color rojo ladrillo)

Colocar en un tubo de ensayo 5 mL del reactivo de Benedict. Agregar 2 mL de la solución de azúcar.

Calentar el tubo por 5 min en un baño maría a ebullición. Si la reacción es positiva aparecerá una coloración
o precipitado rojizo. Si la cantidad de azúcar es pequeña puede dar color anaranjado o verdoso.

iii. Reacción de Barfoed: es un ensayo químico diseñado para detectar monosacáridos. Se basa en la reducción
del Cu2+ en forma de acetato a Cu+ como óxido. A diferencia de los métodos de Fehling y Benedict la reacción
se realiza en medio ácido (ácido acético al 1 %). Se emplea también para distinguir cualitativamente
monosacáridos de disacáridos en base a la velocidad de reacción que es más rápida para los monosacáridos
reductores que para los disacáridos, pero si se hierve por mucho tiempo se pueden hidrolizar los disacáridos
y dar resultados positivos falsos.

Colocar en un tubo de ensayo (resistente al calor) 2 mL de la solución de mono y disacáridos y 3 mL del reactivo
de Barfoed. Mantener los tubos en un baño maría a ebullición por 1 min. y enfriarlo rápidamente en agua fría. El
precipitado de óxido cuproso es menos denso que con el reactivo de Benedict por lo que se debe dejar
los tubos en reposo hasta que el precipitado sedimente.

iv. Reacción con ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS): se basa en la oxidación, en medio básico, de los azúcares
reductores al ácido aldónico correspondiente a expensas de la reducción del DNS a ácido 3-amino, 5-
nitrosalicílico el cual cambia de tonalidad amarilla a naranja cuya intensidad depende de la concentración del
azúcar presente.

Colocar en tubos de vidrio (resistentes al calor) 0,2 mL de las soluciones de azúcar y de la muestra problema.
Agregar igual volumen de la solución de DNS (0,2 mL). Mezclar bien y hervir por 5 min exactos. Enfriar y añadir
2 mL de agua destilada. Leer la absorbancia a 540 nm frente a un blanco preparado de idéntica manera con agua
destilada.

Reacciones con furfural o hidroximetilfurfural (HMF)

i. Reacción de Molisch: es una reacción cualitativa que tiñe cualquier carbohidrato presente en una
disolución. Se basa en que todos los carbohidratos con más de 4 átomos de C se deshidratan por acción del
ácido sulfúrico concentrado formando compuestos furfurálicos (las hexosas hidroximetilfurfural y furfural para
cetosas y aldosas de 5 Cs). Los compuestos furfurálicos reaccionan positivamente con el reactivo de Molisch
que contiene α-naftol al 5% en etanol de 96º; la reacción se realiza a temperatura ambiente mediante la adición
de ácido sulfúrico concentrado (por las paredes del tubo) a la mezcla de la solución de carbohidrato y reactivo
de Molisch. Inmediatamente aparece un anillo de color violeta en la interfase si la reacción es positiva y de
color verde cuando no hay glúcidos. Cuando la concentración de glúcidos es alta se forma un precipitado rojo.

Colocar en un tubo de ensayo 2 mL de la muestra a analizar. Agregar 2 gotas de la solución de α-naftol y

agitar. Añadir cuidadosamente por las paredes del tubo de ensayo H2SO4 concentrado hasta que se formen
dos capas. NO AGITAR. Observar cualquier cambio de color en la interfase de los dos líquidos que es
donde se realizará la deshidratación del carbohidrato y, su reacción con el α-naftol formará un anillo de color
violeta obscuro. Realizar también la reacción colocando en sendos tubos 2 mL de la muestra y 2 gotas de reactivo
de Molisch y verter lentamente esta mezcla en un tubo que contiene 2 mL de ácido sulfúrico concentrado, de
modo que se formen dos capas y se observe un anillo en la interfase.

ii. Reacción de Seliwanoff: es otra versión de reacción furfurálica. Se basa en la formación de compuestos
coloreados cuando el furfural o el hidroximetilfurfural (HMF) obtenidos por acción de los ácidos sobre las
pentosas y hexosas, respectivamente, reaccionan con resorcinol. En esta prueba la reacción de
deshidratación se realiza con HCl. Con el furfural, el compuesto formado es de color verde, mientras
que con el HMF el resorcinol produce un compuesto de color rojo. Este compuesto permite además
diferenciar aldosas de cetosas, siendo la reacción más rápida con las cetosas.

Colocar en un tubo de ensayo 2 mL del reactivo de Seliwanoff y 1 mL de la solución que se desea analizar.
Calentar por 1 min en un baño de agua hirviendo. La aparición de un color o precipitado rojo es indicativo
de la presencia de cetosas.

ii. Reacción de Wohlk: es una reacción específica para lactosa que se produce al mezclar este disacárido
con NH3 y KOH al 25 % a temperatura moderadamente alta. El producto de la reacción tiene coloración roja
 o salmón.

Colocar en tubos de ensayo 1 mL de glucosa o de galactosa al 1% y de lactosa al 1%. Agregar lentamente

a cada tubo 1 mL de hidróxido de amonio y 4 gotas de KOH al 25% de manera que las gotas caigan sobre
el contenido de los tubos. Agitar los tubos y colocar en un baño maría a temperatura inferior a la de ebullición.
En unos minutos (10 min) se observa coloración roja que indica la presencia de lactosa distinta a la coloración
parda del monosacárido.

Elaborar una Tabla con los resultados experimentales obtenidos en la que conste el nombre de la muestra, la
prueba realizada, la fotografía correspondiente y si la reacción fue positiva o negativa.

DISCUSIÓN: definir si los resultados obtenidos se ajustan a lo esperado. Establecer las posibles explicaciones
de los resultados obtenidos.

VI. RESULTADOS OBTENIDOS

Caracteriza a los carbohidratos y sus componentes desde el punto de vista estructural y funcional, así como
relaciona estas características con los métodos para la extracción purificación y caracterización de las proteínas y
sus componentes

VII. CONCLUSIONES
• Se notan claramente las diferencias entre pruebas positivas y negativas, las cuales dependerán de la
especificidad de la reacción ensayada.

Cuestionario
• Escriba las ecuaciones de óxido reducción cuando se emplean los reactivos de Fehling y de DNS.
• De las reacciones realizadas en la práctica, cuáles le permiten distinguir entre azúcares de 5 y 6 carbonos y
entre aldosas y cetosas.

VIII. RECOMENDACIONES. Elabore la Tabla de resultados en forma horizontal. Use una buena cámara para
que las fotografías sean claras