INTERLEUQUINA-1 (IL-1)

Citoquina producida por múltiples tipos celulares, entre los que se encuentran los
monocitos y macrófagos y las células endoteliales. Se presenta en dos formas, denominadas
IL-1α e IL-1β.

Ambos polipéptidos ejercen las mismas funciones biológicas y se unen al mismo receptor
de membrana celular, pero mientras la IL-1β se secreta al medio extracelular la IL-1α
permanece unida a la membrana de la célula que la produce. La acción principal de la IL-
1 es proinflamatoria y muy similar a la del TNFα.

En el shock séptico se produce liberación masiva de ambas citoquinas a la circulación,

induciendo fiebre y síntesis de reactantes de fase aguda. Los corticoides y las
prostaglandinas inhiben la síntesis de IL-1.

IL-1α e IL-1β reclutan diferentes células mieloides y promueven diferentes etapas de

inflamación estéril.
IL-1-beta
Pertenece a un grupo de proteínas relacionadas que elaboran los leucocitos
(glóbulos blancos) y otras células del cuerpo. Principalmente los leucocitos, un tipo
de glóbulos blancos, elaboran la IL-1-beta, una forma de IL-1-beta, y esta ayuda a
los macrófagos, otro tipo de glóbulos blancos, a combatir infecciones. También
ayuda a que los leucocitos pasen a través de las paredes de los vasos sanguíneos y
lleguen hasta los sitios de infección; además, causa fiebre porque afecta zonas del
cerebro que controlan la temperatura del cuerpo. La otra forma de IL-1-beta, la IL-
1-alfa, actúa igual que la IL-1-beta. La IL-1-beta que se produce en el laboratorio
se usa en el tratamiento del cáncer como modificador de la respuesta biológica para
estimular el sistema inmunitario. La IL-1-beta es un tipo de citocina. También se
llama IL-1B e interleucina-1-beta. (Instituto nacional de cáncer de los institutos
de salud de EE. UU).

IL-1-alfa
Pertenece a un grupo de proteínas relacionadas que elaboran los leucocitos
(glóbulos blancos) y otras células del cuerpo. Principalmente los macrófagos, un
tipo de glóbulos blancos, elaboran la IL-1-alfa, una forma de IL-1 IL-1, IL-1-beta,
y esta ayuda a otro tipo de glóbulos blancos, los linfocitos, a combatir infecciones.
También ayuda a que los leucocitos pasen a través de las paredes de los vasos
sanguíneos y lleguen a los sitios de la infección; además, causa fiebre porque afecta
zonas del cerebro que controlan la temperatura del cuerpo. La otra forma de IL-1
IL-1, IL-1-beta, IL-1 IL-1, IL-1-beta-beta, actúa igual que la IL-1-alfa. La IL-1-alfa
que se produce en el laboratorio se usa en el tratamiento de cáncer como
modificador de la respuesta biológica para estimular el sistema inmunitario. La IL-
1-alfa es un tipo de citocina. También se llama interleucina-1-alfa. (Instituto
nacional de cáncer de los institutos de salud de EE. UU).

En el estudio actual, evaluamos de manera comparativa el papel de IL-1α e IL-1β en el

inicio y la propagación de la inflamación estéril inducida por productos de células
hipóxicas. Encontramos que después de la hipoxia, la forma precursora de IL-1α, y no de
IL-1β, se regula al alza y posteriormente se libera de las células moribundas. Usando un
sistema de monitoreo de inflamación que consiste en Matrigel mezclado con sobrenadantes
de células hipóxicas, notamos la acumulación de IL-1α en la fase inicial, que se
correlacionó con la infiltración de neutrófilos, y la expresión de IL-1β se correlacionó con
la migración posterior de macrófagos. Además, pudimos demostrar que las moléculas de
IL-1 de células transfectadas con IL-1α precursor o IL-1β maduro pueden reclutar
neutrófilos o macrófagos, respectivamente. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que
la IL-1α, liberada de las células moribundas, inicia una inflamación estéril al inducir el
reclutamiento de neutrófilos, mientras que la IL-1β promueve el reclutamiento y la
retención de los macrófagos. En general, nuestros datos proporcionan una nueva visión de
la biología de las moléculas de IL-1, así como de la regulación de la inflamación estéril.

Las moléculas de IL-1 comprenden una importante familia de citocinas proinflamatorias,

que actúan principalmente mediante la inducción de una red compleja de citocinas /
mediadores proinflamatorios y mediante la expresión de integrinas en leucocitos y células
endoteliales. De los 11 miembros de la familia de ligandos IL-1, IL-1α e IL-1β son las dos
moléculas agonistas principales, mientras que el antagonista de IL-1R (IL-1Ra) es un
inhibidor fisiológico de la IL-1 preformada. IL-1α, IL-1β e IL-1Ra se unen al receptor de
señalización de IL-1RI. Aunque tanto IL-1α como IL-1β desencadenan inflamación en una
vía iniciada a través de la activación de Myd88 y que culminó en la transcripción de genes
inflamatorios inducida por NF-κB, varios hallazgos sugieren que ambos agonistas de IL-1
pueden tener diferentes actividades. La IL-1β no se expresa en condiciones homeostáticas
normales por las células mieloides derivadas de la médula ósea y es activa solo tras la
escisión de su precursor por la caspasa-1 en el inflamasoma, lo que también conduce a su
secreción. Las observaciones clínicas y experimentales han correlacionado IL-1β con
patologías en las que se observan manifestaciones inflamatorias. La IL-1α, a diferencia de
la IL-1β, se puede encontrar constitutivamente dentro de las células bajo homeostasis
normal, y es activa en su forma precursora y procesada en calpaína madura. IL-1α tiene
una secuencia de localización nuclear funcional y es activa en el compartimento
intracelular, especialmente en el núcleo, como regulador de la transcripción, mientras que
afecta la inflamación y la inmunidad fuera de la célula. Por lo tanto, IL-1α pertenece a un
grupo de citocinas de doble función, junto con IL-33, HMGB1 e IL-37. Sin embargo, la
posibilidad de diferencias en la función de IL-1α e IL-1β durante la inflamación estéril
sigue siendo hipotética. Informes anteriores sugieren que IL-1α sirve como señal de alarma
para iniciar la inflamación en respuesta a la lesión del tejido. IL-1α está presente en la piel,
donde las lesiones conducen a un estado hipóxico, lo que resulta en una necrosis celular
masiva. De hecho, recientemente demostramos que IL-1α se libera de las células
necróticas, mientras que las células apoptóticas retienen IL-1α dentro del núcleo como un
mecanismo para preservar la tolerancia inmune y prevenir la inflamación.

USO TERAPEUTICO DE LA IL-1

La IL-1 que se produce en el laboratorio se usa en el tratamiento del cáncer como

modificador de la respuesta biológica para estimular el sistema inmunitario. La IL-1 es un
tipo de citocina. También se llama interleucina-1.

Se evalúa su empleo para el tratamiento de sepsis, artritis reumatoide, psoriasis, asma y

enfermedades inflamatorias del intestino.
PAPEL DE LA IL-1 EN EL RIESGO DE APARICIÓN DE METÁSTASIS A
DISTANCIA EN PACIENTES CON CARCINOMA ESCAMOSO DE CABEZA Y
CUELLO

PAPEL DE LA IL-1 EN LA CARCINOGÉNESIS Y METÁSTASIS

Los pacientes con CECC se caracterizan por presentar alteraciones en la respuesta

inmunológica, inflamatoria y en la angiogénesis, lo cual se traduce clínicamente en
fenotipos tumorales agresivos y de peor pronóstico16. Estos procesos están mediados
por citoquinas pro-inflamatorias producidas en el microambiente tumoral cuya
principal exponente es la Interleuquina 1.

Descripción de la IL-1

La interleuquina 1 (IL-1) es una molécula con un interés particular por su papel

orquestador de la respuesta inflamatoria. Se trata de una citoquina pleiotrópica
con funciones determinantes en la inflamación, inmunidad y hematopoyesis91-93.
Desempeña funciones fisiológicas diversas; desde la inducción de la
permeabilidad vascular durante la sepsis, hasta la producción de hormonas
hipofisarias o estimulación de procesos autoinmunes. Su producción debe estar
regulada para evitar efectos negativos sobre el sistema vascular, endocrino,
inmunológico, hematopoyético y sobre el tejido conectivo.

Los principales miembros de la familia de la IL-1 son dos proteínas agonistas:

IL-1α e IL- 1β y una antagonista: el receptor antagonista de IL-1 (IL-1Ra); un
inhibidor fisiológico que se une al receptor de la IL-1 sin transmitir la señal de
activación.
Las 11 moléculas que constituyen la familia de la IL-1 están codificadas por 11
genes diferentes que se localizan en el brazo largo del cromosoma 2, en la región
2q12-q2195. Los genes de la IL-1α e IL- 1β e IL-1Ra están separados 430 kb. La
IL-1α y IL- 1β son codificadas por dos genes de longitudes diferentes pero con
organización similar que comprenden 7 exones. A nivel de DNA ambos genes
muestran una homología de aproximadamente 45%96. Los loci polimórficos de
estos genes están implicados en una amplia gama de enfermedades.

Estructura y Secreción de la IL-1

Diversos tipos de células producen y secretan IL-1 ante inflamación, estrés u
otros estímulos ambientales. La principal fuente de IL-1 son las células del
sistema inmune innato (macrófagos y monocitos), sin embargo las células
epiteliales, endoteliales y fibroblastos también la pueden producir. La producción
de la IL-1 es inducida por productos bacterianos como los lipopolisacáridos y
otras citoquinas como el TNF, IL-2, IL- 3, IL-12, factor estimulante de colonias
de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de
macrófagos (M-CSF), factor de células madre y factor de crecimiento derivado
de las plaquetas (PDGF). Otros inductores de la secreción de IL-1 son el daño
tisular (hiperosmolaridad, isquemia), sustancias neuroactivas (sustancia P,
anfetaminas), moléculas inflamatorias (PCR, α -1-antitripsina, cristales de urato
y de pirofosfato de calcio), factores de la coagulación (plasminógeno, trombina),
lípidos (factor

activador de plaquetas, LDL oxidadas) y algunos medicamentos como

anfotericina-B, bleomicina y colchicina.

La IL-1α no está presente en condiciones homeostáticas. Es producida y

secretada sólo en contexto de inflamación. Los pacientes con procesos
infecciosos e inflamatorios presentan concentraciones plasmáticas elevadas de
IL-1α, sugiriendo un rol sistémico de esta molécula. Por el contrario la IL-1β,
presente dentro de la célula en condiciones fisiológicas, es indetectable en fluidos
del cuerpo.

Tanto la IL-1α como la IL-1β son sintetizadas como precursores de 31 KDa y

posteriormente procesadas por proteasas para adquirir su forma madura de 17
KDa98. La proIL-1α es procesada por la calpaina y la IL-1β por la caspasa-1 o
enzima convertidora de IL-1α.

El precursor de la IL-1 (proIL-1α) tiene 271 aminoácidos y es sintetizado en

los ribosomas asociados a microtúbulos. La proIL-1α es biológicamente activa y
permanece en el citosol y en la superficie celular. Cuando las células mueren se
libera pro-IL1α, que puede ser clivada por proteasas extracelulares 98
. La forma
 madura de 159 aminoácidos se produce por acción de proteasas de membrana
llamadas calpainas.

La IL-1β después de ser sintetizada, permanece inicialmente en el citosol hasta

ser clivada y transportada fuera de la célula. Para ser funcional debe ser procesada
por la enzima convertidora de IL1-β (ICE). Al parecer la pro-IL1-α es liberada y
procesada por proteasas extracelulares (gelatinasa-B, MMP-2, 3 y 9) dando lugar
a la forma madura biológicamente activa.

El IL-1Ra también es traducido como una proteína de 17 kDa. Después de su

procesamiento, es secretado al ambiente extracelular. La homología en la
secuencia proteica de las formas maduras de IL-1β y de IL-1Ra es del 26%,
similar a la existente entre IL-1α e IL-1 β (23%).

Como se ha mencionado, la IL-1α y β, difieren en su localización dentro del

compartimiento celular y ambiental: la IL-1α es activa únicamente en forma de
molécula secretada, actuando de manera paracrina o sistémica, mientras que la
IL-1β es activa

dentro del núcleo, en el citosol o asociada a la membrana celular, su secreción es

muy limitada, por lo tanto actúa principalmente por mecanismos autocrinos o
yuxtacrinos.

Receptores y vía de señalización de la IL-1

Los receptores de IL-1 pertenecen a la superfamilia de inmunoglobulinas, cuyos

miembros participan en la respuesta inmune innata y en la inflamación. La
superfamilia de receptores IL-1/Toll like (TLR) incluye también receptores para
la IL-18 y para productos bacterianos. Todos ellos comparten secuencias
similares en sus regiones citosólicas; a estas regiones se les conoce como
dominio TIR (receptor de interleuquina Toll).
Funciones biológicas de la IL-1

Una de las principales actividades biológicas de la IL-1 es la regulación de la

inflamación. Al igual que el TNFα, la IL-1 es considerada una citoquina “de
 alarma” pues da inicio a la respuesta inflamatoria mediante la inducción de una
cascada de genes pro-inflamatorios, dentro de los que destacan la COX-2
(ciclooxigenasa 2), la iNOS (oxido nítrico sintetasa inducible), la mPGES-1
(prostaglandina E sintetasa microsomal), metaloproteinasas, quimioquinas y
citoquinas. La reacción es amplificada gracias a la inducción de sus propios genes
(feedback positivo) y a la expresión de factores de adhesión como la ICAM-1
(molécula de adhesión intracelular-1) e integrinas endoteliales para permitir el
paso de leucocitos del torrente sanguíneo a los tejidos.

En células sometidas a hipoxia aumenta la expresión de pro-IL1 . Posterior a la

muerte celular por necrosis, la pro-IL1α liberada genera una respuesta
inflamatoria “estéril”. Por el contrario, en la muerte celular por apoptosis, la IL-
1 se concentra en focos nucleares

densos y no se libera al ambiente. Esto explica porque no se genera respuesta

inflamatoria ante la apoptosis.

En cuanto a la acción sobre el sistema inmunológico, se sabe que la IL-1 estimula

la proliferación y diferenciación de células tanto del sistema innato (fagocitos,
natural killers, granulocitos, etc) como del adquirido (linfocitos T y B). Sus
efectos son más pronunciados sobre los linfocitos T, reflejados en la expansión
de los CD4+ ante estímulos de antígenos y en una respuesta potenciada de los
mismos.
MÉTODOS

Todas las determinaciones se realizaron en el Laboratorio de Angiología, Biología

Vascular e Inflamación (LABVI) del Instituto de Investigación Biomédica del
Hospital Sant Pau, dirigido por el Dr. Luis Vila.

 Análisis de la expresión del mRNA

Inmediatamente tras la obtención de las biopsias, una parte del tejido se estabilizó
mediante inclusión en RNA-later (Quiagen GmbH, Hilden, Alemania) y se
 PACIENTES Y MÉTODOS

almacenó a - 80ºC hasta su procesamiento. Los tejidos fueron homogeneizados en

1 ml de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). La extracción del RNA se realizó
siguiendo las instrucciones del fabricante. Para las células en cultivo el RNA total
se extrajo usando Ultraspec (Biotecx Laboratories, Inc., Houston, TX) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó a partir de
1 µg de RNA con el kit “High-CapacitycDNA Archive Kit” con hexámeros
aleatorios (Applied Biosystems, Foster City, CA). La expresión de RNAm se
estudió mediante PCR a tiempo real en un ABI Prism 7900HT utilizando ensayos
prediseñados validados (TaqMan Gene Expression Assays, Applied Biosystems)
y parámetros de amplificación universales. La expresión relativa de cada transcrito
se expresó como el cociente de transcrito del gen/ transcrito β-actina.

 Determinación de IL-1α liberada por las muestras tumorales de CECC

(Obtención del Secretoma)

Para esta parte del estudio se utilizaron biopsias de tejido tumoral de 35 pacientes.
Fragmentos de tejido de 100-200 mg se incubaron en 0.5 mL de DMEM
(Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) sin suero durante 48 horas en
la estufa de CO2. El medio de cultivo se almacenó a -80°C hasta el análisis de la
IL-1α.

 Cultivo de células tumorales

Se obtuvieron líneas SCC-4 (CRL-1624, carcinoma de lengua) y SCC-9 (CRL-

1629™, carcinoma de lengua) de la Colección Americana de Cultivos (ATCC®:
American Type Culture Collection) y se cultivaron según indicaciones del
proveedor.

 Aislamiento y cultivo de células endoteliales microvasculares humanas

(MVEC)

Las células endoteliales microvasculares humanas (MVEC) se aislaron de

prepucio de humano adulto (descripción de la técnica en referencias). Todos los
estudios experimentales se realizaron con MVEC purificadas con Dynabeads®
CD-31 entre los pases 2 y 6.
 PACIENTES Y MÉTODOS

 Análisis de la expresión proteica de IL-1 e IL-1β

El análisis cuantitativo de IL-1α e IL-1β en el medio de cultivo se realizó mediante

ELISA específica de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La IL-1α se
obtuvo de R&D Systems (Minneapolis, MN) y la IL-1α de eBioscience (San
Diego, CA).

 Transfección de células tumorales: plásmido/siRNA

Para los experimentos de knockdown de genes se silenció la IL-1α, (siRNA

ID:s7266) y como control negativo se utilizó una secuencia aleatoria (Silencer™
control negativo#1 ID:4390843) de Ambion®. Para la transfección se empleó un
plásmido que codifica la secuencia completa de IL-1α, pCMV6-IL-1α (SC324639)
y como control negativo el vector vacío PrecisionShuttle mammalian vector
pCMV6-AC (PS100020) de Origene Technologies (Rockville, MD).
Se realizó transfección del siRNA y de los plásmidos mediante nucleofección
utilizando Nucleofector™ (Amaxa Inc) y el kit “Amaxa Cell Line Nucleofector
kit V” siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Se suspendieron 3-5 x 106 células en la fase exponencial de crecimiento en 100 µL

de “Nucleofector Solution V”, se mezclaron con 3 µg de siRNA o plásmido y se
realizó electroporación con el programa X-001. Posteriormente, las células fueron
suspendidas en 500 µ L de medio de cultivo atemperado y se cultivaron en medio
completo por 6 horas. Transcurridas las 6 horas se cambió por medio sin suero
conteniendo 0.5% BSA. La sobre-expresión y el bloqueo o knockdown de genes
se verificó midiendo los niveles de IL-1α en el medio de cultivo mediante ELISA.
 PACIENTES Y MÉTODOS

Izquierda: Técnica de Knockdown mediante silenciamiento de RNA (siRNA) . Derecha: transfección con
plásmido

Esquemas tomados de la página web de: Santa Cruz Biotechnology e Ibidi®

respectivamente
 Ensayos de adhesión de células tumorales y migración transendotelial

Las células tumorales se mantuvieron durante una noche en medio sin suero con
0.5% BSA, se tripsinizaron y se suspendieron en PBS a una densidad de 1×106
células/mL. Se adicionó 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametil-indocarbocianina
perclorato (Dil, Sigma) en etanol para conseguir una concentración final de 10
µg/mL y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Después de realizar un doble lavado
de las células con medio sin suero, estas se suspendieron en DMEM con 0.5% BSA
a una densidad celular adecuada.

Para el experimento de adhesión, las MVEC se cultivaron en placas de cultivo de

12 pocillos hasta la confluencia. Posteriormente se trataron o no con IL-1 por 24
horas en MCDB con 1% SBF. Para los ensayo de adhesión las células MVEC se
lavaron dos veces con PBS y se añadieron 0.5mL de DMEM con 1% FBS. Se
mantuvieron en estufa de cultivo a 37ºC durante 5 minutos y seguidamente se
adicionaron 1×106 células tumorales marcadas fluorescentes suspendidas en 0.5 mL
de medio y se incubaron a 37ºC por 30 minutos. Las células no adheridas se lavaron
 PACIENTES Y MÉTODOS

exhaustivamente con PBS tras lo cual se añadieron 150 µL de 1% Triton X-100 a

cada pocillo. La fluorescencia se midió en un Synergy™ HT Multi-Detection
Microplate Reader (Biotek) usando un set de filtro 530/590. El número de células
se determinó mediante una curva de número de células/fluorescencia, que se realizó
en cada ensayo.

Para los experimentos de transmigración endotelial, las MVEC se colocaron en

insertos de cultivo Millicell (Millipore, Billerica, MA) placa de 24 pocillos 8-µm
PET y se dejó que formaran una monocapa confluente. Una vez alcanzada la
confluencia, el medio de cultivo de los insertos se extrajo y los insertos se
transfirieron a nuevos pocillos con 600 µL de DMEM sin suero con 0.5% BSA. Se
añadieron 2.5×105 células tumorales marcadas fluorescente en 0.35 mL de medio a
la parte superior de los insertos y se dejó que transmigrasen a través del endotelio
por 24 horas. Transcurridas las 24 horas se eliminaron las células que no migraron
y los insertos se colocaron en nuevos pocillos que contenían 0.5% tripsina en PBS.
Las células desprendidas se centrifugaron y se lisaron. La fluorescencia se midió de
la misma forma que en los experimentos de adhesión.
RESULTADOS CLÍNICOS

Comparación de los niveles de expresión transcripcional de IL-1 entre el

tumor y las muestras de mucosa sana

Las siguientes figuras muestran la distribución de los valores de expresión

transcripcional de la IL-1 , IL-1β, IL-1Ra, IL-1R1, IL-1R2 y IL-1RacP en las
muestras de mucosa normal y de tumor.

66
La siguiente tabla muestra los valores de significación estadística en la
comparación de los niveles de expresión de los diferentes genes implicados en la
vía de la IL-1 entre la mucosa sana y el tumor (test de Wilcoxon para datos
apareados).
P
IL-1 0.6
IL-1β 0.0001
IL-1Ra 0.0001
IL-1R1 0.537
IL-1R2 0.049
IL-1RacP 0.264

67
 Las muestras de tumor contaron con unos niveles de expresión de IL-1β
significativamente superiores comparados con la mucosa sana, apareciendo la
situación contraría para el IL-1Ra. En el caso del IL-1R2, las muestras de tumor
presentaron una expresión inferior a la mucosa sana, con unas diferencias al
límite de la significación estadística. No aparecieron diferencias entre la mucosa
sana y el tumor en la expresión de los genes responsables de la codificación de
la IL-1α, IL-1R1 y IL-1RacP.

Correlación entre los niveles de expresión transcripcional de la vía IL-1 en

el tumor

Existió una correlación significativa entre los valores de expresión de los

diferentes componentes de la vía de la IL-1, siendo especialmente manifiesto el
elevado grado de correlación que apareció entre los valores de la IL-1α y la IL-
1β.

IL-1 IL-1 β IL-1ra IL-1R1 IL-1R2 IL-1RacP

IL-1 Pearson 1 ,901** ,434** ,752** ,430** ,920**
Correlation
Sig. (2-tailed) ,000 ,000 ,000 ,000 ,000
IL-1 β Pearson ,901** 1 ,422** ,738** ,427** ,865**
Correlation
Sig. (2-tailed) ,000 ,000 ,000 ,000 ,000
IL-1ra Pearson ,434** ,422** 1 ,527** ,758** ,467**
Correlation
Sig. (2-tailed) ,000 ,000 ,000 ,000 ,000
IL-1R1 Pearson ,752** ,738** ,527** 1 ,471** ,886**
Correlation
Sig. (2-tailed) ,000 ,000 ,000 ,000 ,000
IL-1R2 Pearson ,430** ,427** ,758** ,471** 1 ,435**
Correlation
Sig. (2-tailed) ,000 ,000 ,000 ,000 ,000
IL-1RacP Pearson ,920** ,865** ,467** ,886** ,435** 1
Correlation
Sig. (2-tailed) ,000 ,000 ,000 ,000 ,000

Relación entre la expresión transcripcional de IL-1 y el control de la

enfermedad
De los 154 pacientes incluidos en esta parte del estudio, un total de 46 pacientes
(29.9%) tuvieron una recidiva local del tumor, 23 (14.9%) una recidiva regional y
18 (11.7%) metástasis a distancia.

68
 Se procedió a comparar los valores de expresión transcripcional a nivel del tumor
de los componentes de la vía de la IL-1 en relación con la supervivencia ajustada
y el control local, regional y a distancia de la enfermedad. La siguiente tabla
muestra los valores de la significación estadística en función del control de la
enfermedad,

IL-1 IL-1 β IL-1ra IL-1R1 IL-1R2 IL-1racP

Supervivencia 0,328 0,989 0,851 0,778 0,944 0,178
Control local ,696 ,423 ,549 ,317 ,541 ,104
Control regional ,012 ,215 ,200 ,842 ,226 ,472
Control a ,016 ,879 ,193 ,422 ,327 ,233
distancia

Tan sólo aparecieron diferencias significativas para los niveles de expresión de la

IL-1 en el control regional y a distancia de la enfermedad.

La siguiente figura muestra la distribución de los valores de expresión de la IL-1

en función de la presencia de recidiva de la enfermedad a nivel regional o a
distancia.

No aparecieron diferencias significativas en los valores de expresión

transcripcional de la IL-1α en función de la localización primaria del tumor
(cavidad oral-orofaringe versus laringe-hipofaringe), la afectación regional en el
momento del diagnóstico (N0 versus N+) o el tipo de tratamiento empleado
(cirugía ± radioterapia versus radioterapia- quimioradioterapia). Los pacientes con
tumores iniciales (T1-T2) contaron con unos niveles de expresión de IL-1 más
reducidos que los pacientes con tumores localmente avanzados T3-T4 (student t-

69
test, P=0.043). La siguiente figura muestra la distribución de los valores de
transcripción de IL-1α en función de la categoría de extensión local del tumor en el
momento del diagnóstico.

A continuación se procedió a establecer la existencia de un punto de corte con

capacidad pronóstica para definir diferencias en el riesgo de aparición de recidiva
a nivel regional o a distancia mediante una técnica de partición recursiva. El
modelo CART no encontró un punto de corte en los valores de IL-1 con
capacidad para clasificar los pacientes en función de la aparición de una recidiva
a nivel regional. Por el contrario, se clasificó a los pacientes en función del riesgo
de aparición de metástasis a distancia, tal como aparece en la siguiente figura.

Se realizó un análisis multivariante, considerando la aparición de metástasis a

distancia como la variable dependiente.

70
 HR IC 95% P
HR
Localización Cavidad oral – 1 0.37
orofaringe
Laringe - Hipofaringe 1.56 0.58-4.19
Extensión local cT1-T2 1 0.44
cT3-T4 0.66 0.23-1.88
Extensión regional cN0 1 0.11
cN+ 2.33 0.82-6.60
Tratamiento Cirugía ± radioterapia 1 0.21
(Quimio)-radioterapia 0.53 0.20-1.44
IL-1α Baja 1 0.002
Alta 5.35 1.81-15.84
La única variable que se relacionó de forma significativa con la aparición de
metástasis a distancia fue la categoría de expresión de la IL-1 . Considerando a
los pacientes con unos niveles bajos de IL-1 como categoría de referencia, los
pacientes con unos niveles elevados contaron con un riesgo 5.3 veces superior de
sufrir la aparición de metástasis a distancia (IC 95%: 1.8-15.8).

La otra variable que contó con una tendencia a relacionarse con la aparición de
metástasis a distancia fue la categoría de afectación regional en el momento del
diagnóstico. Los pacientes N+ tuvieron una tendencia hacia un mayor riesgo de
aparición de metástasis a distancia (HR 2.33, IC 95%: 0.82 - 6.60, P=0.11). Se
analizó la supervivencia libre de metástasis a distancia en función de los niveles
de expresión de IL-1 considerando la categoría de afectación regional en el
momento del diagnóstico. Las siguientes figuras muestran las curvas de
supervivencia libres de metástasis a distancia para los pacientes cN0 (n=90) y cN+
(n=64).

71
La supervivencia libre de metástasis fue en ambos casos superior para el grupo de
pacientes con niveles bajos de IL-1 si bien en el caso de los pacientes cN0 las
diferencias no alcanzaron la significación estadística (P=0.268). Por el contrario,
para los pacientes cN+ el riesgo de aparición de metástasis a distancia fue
significativamente mayor en los casos con IL-1 elevada (P=0.003).
Igualmente se analizó el riesgo de aparición de metástasis a distancia en función
del control loco-regional de la enfermedad. Se analizaron de forma independiente
los 99 pacientes para los cuales el tratamiento inicial había conseguido el control
de la enfermedad a nivel loco-regional.

72
Considerando sólo los pacientes con control loco-regional, existieron diferencias
significativas en los valores de la supervivencia libre de metástasis a distancia en
función de la categoría de expresión de la IL-1α (P=0.010). La supervivencia libre
de metástasis a los 5 años para los pacientes con unos niveles bajos de IL-1 fue
del 94.3% (IC 95%:
88.9 - 99.7%) y para los pacientes con unos niveles elevados del 75.2% (IC 95%:
59.4 – 91.0%), P=0.01.

A partir de variables clínicas como la extensión loco-regional de la enfermedad y la

presencia de metástasis ganglionares con ruptura capsular, se definieron dos grupos
de pacientes en función del riesgo (alto o bajo) de aparición de metástasis a
distancia.
El grupo de alto riesgo quedó constituido por un total de 60 pacientes que
cumplieron alguno de los siguientes criterios: pacientes con tumor localmente
avanzado (T4) y/o con afectación ganglionar extensa (N2-3) y/o con metástasis
ganglionares con ruptura capsular. La supervivencia libre de metástasis a distancia
a los 5 años para los pacientes incluidos en el grupo de riesgo elevado fue de 71.9%
(IC 95%: 58.2-85.6%). Los pacientes que no cumplieron ninguno de los criterios de
alto riesgo (n=94) se clasificaron dentro del grupo de bajo riesgo y contaron con una
supervivencia libre de metástasis a los 5 años del 93.9% (IC 95%: 88.6-99.2).

73
Se procedió a clasificar a los pacientes incluidos en el grupo de alto riesgo (n=60)
en función de los niveles de expresión de IL-1α. La supervivencia libre de
metástasis a distancia para los pacientes con unos niveles de expresión bajos fue del
93.5% (IC 95%: 84.9-100%), muy similar a la que presentaron los pacientes
incluidos en el grupo de bajo riesgo definido por características clínicas. Para los
pacientes incluidos en el grupo de alto riesgo que presentaron unos niveles de
expresión de IL-1α elevados, el riesgo de aparición de metástasis a distancia se
incrementó de forma notable. La supervivencia libre de metástasis a los 5 años para
estos pacientes disminuyó al 49.1% (IC 95%: 26.6- 71.6%). Existieron diferencias
significativas en la supervivencia libre de metástasis para los pacientes con riesgo

clínico elevado en función del nivel de expresión de la IL-1α (P=0.002).

Se dispuso de información relativa al estatus del virus del papiloma humano (HPV)
para 40 de los 49 pacientes con carcinomas de la orofaringe incluidos en el estudio.
Un 20% de los pacientes (n=8) con carcinomas de orofaringe fueron HPV+ (7 casos
HPV-16 y 1 caso HPV-51). No existieron diferencias significativas en los valores
de expresión de la IL-1 en función del estatus HPV (P=0.377). Ninguno de los
pacientes HPV+ sufrió la aparición de metástasis a distancia, frente a un 12.5% de
los pacientes HPV-.

Uno de los objetivos terapéuticos del tratamiento con quimioterapia de inducción

en los pacientes con tumores avanzados es la reducción en la aparición de metástasis
a distancia. De nuestra muestra de pacientes, un total de 42 (27.3%) iniciaron el
tratamiento con quimioterapia de inducción. Se analizó la supervivencia libre de
metástasis a distancia en función de que los pacientes hubiesen recibido o no un
tratamiento inicial con quimioterapia de inducción de acuerdo con la categoría de

74
 expresión de la IL-1

Existieron diferencia significativas en la supervivencia libre de metástasis tanto para

el grupo de pacientes que no habían recibido quimioterapia de inducción (P=0.007)
como para el de pacientes que iniciaron el tratamiento con quimioterapia de
inducción (P=0.025).

INTERLEUQUINA 7 (IL-7)

Conocida como linfopoyetina-1, porque actúan en la producción y maduración de

linfocitos. Es producida por las células del estroma de la medula ósea. Induce la generación
de la línea linfoide. Es inhibida por TGF-β.

LA INTERLEUCINA 7 (IL-7) PROMUEVE SELECTIVAMENTE LAS CÉLULAS

γδ PRODUCTORAS DE IL-17 DE RATÓN Y HUMANO.
Los estudios de IL-17 se intensificaron con la identificación de un subconjunto específico de
células CD4 + Th17 que, tras la activación, produce principalmente IL-17 en lugar de IFN-γ
(células Th1), IL-4 (células Th2) o IL-10 / TGFβ (células Treg) ( 1 ⇓ - 3 ). La diferenciación
de Th17 está regulada por los factores de transcripción RORγt y STAT3, este último en parte
explica la promoción de la diferenciación de Th17 por IL-6 e IL-23. Paradójicamente, estudios
más detallados de la inmunidad Th17 han identificado las células T γδ y / o las células linfoides
innatas como productores iniciales críticos de IL-17. En el estado estacionario, las células γδ
son solo un subconjunto menor de linfocitos T, pero tras la infección
por Listeria, Micobacterias o Plasmodium , o tras la administración de LPS, se expanden y
hacen contribuciones críticas para la protección del huésped ( 5 ⇓ ⇓ ⇓ - 9 ). Asimismo,
apuntalan la inmunopatología en modelos ampliamente utilizados de enfermedad
inflamatoria. En humanos, la IL-17 protege contra la candidiasis mucocutánea y nuevamente
está implicada en la inflamación autoinmune, incluida la psoriasis, la esclerosis múltiple y la
artritis reumatoide. Por lo tanto, existe un interés considerable en identificar los factores que
regulan las células γδ productoras de IL-17 en ratones y humanos.
A este interés se agrega la aparición de células murinas γδ como ejemplos principales de
preprogramación tímica, mediante el cual se establecen distinciones funcionales entre los
productores de CD27 + IFN-γ (células γδ 27+ ) y CD27 - células productoras de IL-17 (γδ 27− ) por

75
señales de desarrollo que en gran medida no están auditadas. Por ejemplo, las células
γδ 27− parecen surgir en gran medida de los timocitos fetales, que no requieren la participación
del ligando afín, ni RORγt o STAT3 que son necesarios para el desarrollo de las
células TCRαβ + Th17. Sin embargo, a pesar de la dispensabilidad de RORγt y STAT3 en
desarrollo, la mayoría de las células γδ productoras de IL-17 periféricas expresan RORγt y
responden rápidamente a IL-23 que envía señales a través de STAT3. Tal respuesta rápida en
ausencia de estimulación con TCR ha llevado a muchos a clasificar las células γδ 27− como
células inmunes innatas: de hecho, generalmente responden mal a las concentraciones de
agonistas de TCR que promoverían la activación robusta de las células γδ 27+. Sin embargo,
asignar células γδ productoras de IL-17 a la inmunidad innata parece prematuro hasta que se
sepa más sobre qué regula las células y cómo eso podría influir en su respuesta a la estimulación
de TCR.

Aunque las células γδ productoras de IL-17 también se evocan comúnmente en las respuestas
inmunes e inmunopatologías humanas, se sabe muy poco acerca de estas células, porque han
resultado particularmente difíciles de aislar y caracterizar. Por lo tanto, parecía lógico que al
dilucidar los estímulos para las células murinas γδ 27− , uno podría identificar los medios para
expandir sus contrapartes humanas. Este estudio identifica a IL-7 como un activador profundo
y selectivo de las células γδ productoras de IL-17 en ratones y en neonatos humanos.

Resultados

Enriquece IL-7 para las células del nodo linfático γδ 27− .

Las células γδ 27+ del ganglio linfático (LN) aparecen como células T convencionales vírgenes,
siendo principalmente CD62L + CD25 - CD44 lo ICOS -, mientras que entre el 50% y el 75% de
las células γδ 27− se parecen a las células T activadas (CD62L - CD25 +/− CD44 hi ICOS + ),
aunque en gran medida son CD69. Como se informó, las células γδ 27− también expresan niveles
más altos de IL-7R que las células γδ 27+. Para determinar si este fenotipo tenía implicaciones
funcionales, se cultivaron células LN con IL-7 durante 4 días. En ocho experimentos
independientes, las células γδ 27− se enriquecieron notablemente entre cinco y siete veces en
relación con las células γδ 27+ y entre 6 y 10 veces con respecto a las células LN totales, mientras
que el número de células αβT disminuyó ( Fig. 1 B y Fig. S1 B y C ). Esencialmente, todas las
células γδ 27- eran TCR hi CD44 hi , y ahora ∼70% expresó CD69 ( Fig. 1 B y C ). IL-7 también
aumentó la proporción de células γδ 27+ que expresan CD44 y CD69 (Fig. 1 C ), aunque sus
números disminuyeron ∼70% en 4 d, mientras que los números absolutos de células
γδ 27− aumentaron entre tres y cuatro veces ( Fig. 1 D ). Sorprendentemente, este
enriquecimiento fue para células con capacidad de producción de IL-17, cuya representación
aumentó de ∼30% a ∼70% del subconjunto γδ 27− ( Fig. 1 E ). De acuerdo con este aumento,
IL-7 se enriqueció para las células que expresan la proteína RORγt pero no para las que
expresan T-bet, un regulador primario de IFN-γ ( Fig. S1 D ).

76
Figura 1.

La IL-7 enriquece las células T γδ competentes para IL-17. ( A ) células T γδ de ganglios linfáticos (LN) de ratones
adultos, teñidas para CD44, CD69, IL-7R y CD27. ( B ) Gráficos representativos (de n = 8 experimentos) de células LN
totales, ex vivo ( Izquierda ) y después de cultivo 4-in in vitro con IL-7 ( Derecha ). ( C ) Tinción de superficie de células
T γδ después de cultivo 4-in in vitro con IL-7. ( D ) Números absolutos de células CD44 lo y CD44 hi γδ 27+ y células
CD44 lo y CD44 hi γδ 27− de células LN cultivadas como en B. Las barras de error son SEM de n = 8 experimentos:
* P <0.05, *** P <0.0005. ( E ) Tinción intracelular para IL-17 en células T γδ de células LN cultivadas como en B y
luego activadas con PMA + ionomicina.

Para investigar la generalidad de estas observaciones, investigamos células de la cavidad

peritoneal, conocida por albergar células T γδ productoras de IL-17. Ex vivo casi todas las
células γδ eran CD44 hi ( Fig. S1 E ), y se enriquecieron después de 4 d en IL-7, en comparación
con las células totales ( Fig. S1 E y F ). Sin embargo, mientras que IL-7 mantuvo el número de
células γδ 27+ in vitro en relación con el cultivo solo en medio, los números absolutos de células
γδ 27- aumentaron nuevamente: ∼ nueve veces en relación con el medio solo, y our cuatro veces
en relación con los números cosechados ex vivo ( Fig. S1 G) Entre estas células, la proporción
de productores de IL-17 aumentó nuevamente ( Fig. S1 H ). Por lo tanto, IL-7 se enriquece
preferentemente para células T γδ competentes para IL-17 de dos fuentes anatómicas distintas.

Para examinar si se lograrían los mismos efectos in vivo, a los ratones se les administró IL-7
recombinante tres veces durante 5 días y luego se examinaron el día 7. Hubo un
enriquecimiento notable de células CD44 hi γδ 27− , con números absolutos de LN γδ células
competentes para producir IL-17 tras la activación aumentando> cinco veces, en comparación
con aumentos de dos a tres veces en células competentes IFN-γ ( Fig. 2 A - C ). Tenga en
cuenta que antes y después del tratamiento con IL-7, pocas células γδ coprodujeron IL-17 e
IFN-γ, de acuerdo con la preprogramación del desarrollo ( 8 ).

77
Figura 2.

IL-7 enriquece in vivo para células T γδ competentes para IL-17. ( A ) Gráficos representativos ( n = 3) de células T γδ
del total de LNs adultas de ratones tratados con PBS ( Izquierda ) e IL-7 ( Derecha ). Para todas las parcelas, los números
indican el porcentaje de celdas en el cuadrante relevante. ( B ) Tinción intracelular para IL-17 e IFN-γ en células T γδ
cerradas, de ratones tratados como en A , y luego activados in vitro con PMA + ionomicina. ( C ) Números absolutos
de células T IL-17 + e IFN-γ + γδ de ratones tratados como en B : las barras de error son SEM de n = 3
ratones; * P <0,05. ( D) Los ratones fueron tratados con vaselina (Ctrl; superior ) o imiquimod (IMQ; inferior ) y anti-
IL-7R Ab ( derecha ) o control de isotipo ( izquierda ). Tinción intracelular para IL-17 e IFN-γ en células T γδ de células
LN, activadas con PMA + ionomicina. ( E ) Números absolutos de células IL-17 + e IFN-γ + γδ obtenidas como se
describe en D (las barras de error son SEM de dos experimentos, n = 8 ratones en total, * P <0.05). ( F ) Puntuación para
el eritema de la piel de ratones tratados con IMQ como en D (de 4 experimentos, n = 16 ratones en total, P <0,005).

Para probar si se requiere IL-7 para la expansión de las células γδ productoras de IL17 in vivo,
examinamos ratones tratados epicutaneamente con imiquimod (IMQ) en el que el desarrollo
de lesiones agudas de psoriaforma es atribuible en gran medida a la expansión de γδ productor
de IL-17 células en la piel y LN que drenan la piel. De hecho, tales lesiones son comparables
en ratones deficientes en células T WT y αβ pero reducidas drásticamente en ratones TCRδ. La
administración del anticuerpo anti-IL-7R bloqueó casi por completo el enriquecimiento (∼10
veces) en las células IL-17 + γδ en los LN que drenan la piel de ratones a los que se administró
IMQ versus vaselina, pero no limitó significativamente la expansión de dos a tres veces IFN-
γCélulas + γδ ( Fig. 2 D y E ). Los puntajes de eritema de la piel, que componen un marcador
altamente reproducible de la patología inducida por IMQ, se redujeron significativamente en
los animales tratados con anti-IL-7R ( Fig. 2 F ), al igual que el engrosamiento epidérmico
asociado con γδ productor de IL-17 dérmica. expansión celular. Sin embargo, el enrojecimiento
se debe probablemente a los efectos no inmunológicos ampliamente reconocidos del IMQ.

Mecanismo de enriquecimiento.
Directamente ex vivo, pocas células γδ 27+ y γδ 27− se dividieron según lo juzgado por la tinción
Ki67, pero después de 4 d en IL-7,> 90% de las células γδ 27− se dividieron en comparación con
solo ∼30% para γδ 27+ células (líneas negras versus líneas grises; Fig. 3 A ). Además, cuando

78
las células se marcaron ex vivo con un tinte intercalante de membrana, éster succinimidil
diacetato de carboxifluoresceína (CFSE), las células γδ 27- mostraron una dilución de tinte
mucho mayor (por división celular) que las células γδ 27+ ( Fig. 3 B ), y fueron esas células en
división las que explicaron casi toda la producción de IL-17 tras la estimulación ( Fig. 3 C) Por
lo tanto, IL-7 impulsa la expansión preferencial de las células γδ 27− con, por el contrario, poca
evidencia de supervivencia selectiva: de hecho, el ARNm de Bcl-2 cuya regulación por
aumento se ha asociado con los efectos antiapoptóticos de IL-7 en las células T ( 21 ) se expresó
más fuertemente por las células γδ 27+ ( Fig. S2 A ).

Fig. 3.

IL-7 promueve la expansión de células T γδ competentes para IL-17 mediante la activación selectiva de STAT3. ( A )
Tinción para Ki67 (células en ciclo) en células LN γδ 27− ( izquierda ) y γδ 27+ ( derecha ) activadas ex vivo (línea gris) y
después del cultivo 4-d con IL-7 (línea negra). Los histogramas sombreados muestran la tinción del isotipo Ki67. ( B )
Offset histogramas de células LN γδ 27+ (rojo) y γδ 27− (azul) marcadas con CFSE y luego cultivadas durante 4 días con
IL-7. El área gris sombreada representa las células T γδ teñidas ex vivo. ( C ) Las células LN marcadas con CFSE se
cultivaron durante 4 días con IL-7, se activaron con ionomicina PMA + y se tiñeron para IL-17 intracelular y se cerraron
sobre células γδ. (D ) Detección citométrica de flujo de pSTAT5 y pSTAT3 intracelular en células γδ 27− y
γδ 27+ cerradas como se marcó. Las áreas abiertas y sombreadas indican tratamiento y controles de IL-7,
respectivamente. ( E ) Localización intracelular por citometría de flujo ImageStream de pSTAT3 entre dos células L44
CD44 hi γδ 27− ( superior ) y CD44 lo γδ 27+ ( inferior ) después de 30 minutos de cultivo con IL-7 (BF, campo
brillante). ( F ) Células LN preincubadas con un inhibidor STAT3 específico y posteriormente cultivadas con IL-7
durante 72 h. Gráficos representativos (de n = 3 experimentos). (G ) Tinción para Ki67 e IL-17 intracelular en células T
γδ cerradas cultivadas como en F ; las áreas abiertas y sombreadas indican preincubación y controles del inhibidor
STAT3, respectivamente. Para todas las parcelas, los números indican el porcentaje de celdas en la puerta o cuadrante
relevante.

Las señales de IL-7 son transducidas principalmente por STAT5 y PI3-quinasa

( 22 ⇓ - 24 ). Sin embargo, la fosforilación de STAT5 dependiente de IL-7 fue comparable

79
entre las células γδ 27+ y las células γδ 27- ( Fig. 3 D ), sin tener en cuenta los efectos diferenciales
de IL-7 en las células γδ 27− . De hecho, la activación de STAT5 antagoniza la diferenciación de
Th17 en lo que la promoción de células productoras de IL-17 por IL-7 parecía paradójica. Sin
embargo, IL-7 también puede activar STAT3, que media los efectos de las citocinas que se
sabe que promueven las células T γδ productoras de IL-17: de hecho, después de la
estimulación de IL-7 γδ 27−las células mostraron una expresión> fosfo-STAT3 tres veces mayor
que las células γδ 27+ ( Fig. 3 D ). Esta fosforilación se limitó en gran medida a
las células CD44 hi , en las que la mayoría de pSTAT3 era nuclear, como se ilustra mediante la
colocalización con yoduro de propidio ( Fig. 3 E y Fig. S2 C ). En los ratones "mapeo del
destino" Il17aCreR26ReYFP, las células que transcriben el locus Il17a inducen cre que
elimina un codón de parada, activando irreversiblemente un gen de proteína fluorescente
amarilla mejorada (eYFP) en el locus rosa26. Las células LN eYFP + γδ son CD44 hi y
RORγt+ ( Fig. S2 D ), y después de 30 minutos de estimulación con IL-7, pSTAT3 fue
expresado selectivamente por las células eYFP + γδ ( Fig. S2 E ).

Cuando las células LN se incubaron durante 3 días con IL-7 en presencia o ausencia de un
inhibidor que bloquea la fosforilación de STAT3 pero deja intacta la fosforilación de STAT5
( Fig. S2 F ), las células γδ 27+ se vieron poco afectadas, mientras que el enriquecimiento
preferencial de γδ Las células 27 se redujeron en> 50%, con una reducción correspondiente en
las células Ki67 + y una atenuación muy severa de las células con potencial de producción de
IL-17 ( Fig. 3 F y G y Fig. S2 G ). Este efecto no fue atribuible a ninguna toxicidad del
inhibidor; por ejemplo, los perfiles γδ 27 −nexina-V eran equivalentes con o sin él ( Fig.
S2H ) En correlación con la activación selectiva mediada por IL-7 de STAT3 en las células
γδ 27-, se encontraron niveles muy bajos del supresor STAT3, SOCS3, en relación con
lascélulasCD44 lo γδ 27+ ( Fig. S2 I ). Curiosamente, elsubconjuntomenor CD44 hi γδ 27+ también
expresó niveles bajos de SOCS3, tal vez explicando el mantenimiento de estas células en IL-7
en comparación con la pérdida de células γδ 27+ en masa( Fig. 1 D ).

Enriquece IL-7 para γδ 27− Thymocytes.

Según se informa, las células γδ 27− productoras de IL-17 surgen durante el desarrollo del timo
fetal, aunque pueden encontrarse fácilmente en el timo de ratones adultos, donde expresan
niveles notablemente altos de IL-7R ( Fig. 4 A y B ) Se detectaron consistentemente altos
niveles de ARNm de Il17 solo entre las células IL-7R hi γδ 27- ( Fig. 4 C ). La IL-7 es
absolutamente necesaria para el desarrollo de células γδ, y el cultivo con IL-7 alimentó la
supervivencia y la expansión de todos los timocitos γδ adultos, como lo muestra un curso de
tiempo ( Fig. S3 A ). No obstante, nuevamente hubo un fuerte enriquecimiento para CD44hi IL-
17-competente, TCR hi CD27 - células γδ, con dichas células en transición de la minoría a la
mayoría en comparación con las células IFN-γ-competentes ( Fig. 4 D y Fig. S3 A ).

80
Fig.4.

IL-7 enriquece para timocitos γδ competentes para IL-17. ( A y B ) Histogramas para la tinción con IL-7R
de: timocitos γδ 27− (línea negra) y γδ 27+ (línea gris) adultos ex vivo ( A ); γδ 27− células que expresan IL-17 (línea negra)
o que no expresan IL-17 + (línea gris) después de la activación de la ionomicina PMA + ( B ). El área sombreada en gris
es la tinción de control de isotipo. ( C ) Il17 niveles de ARNm en γδ 27+ clasificado , e IL-7R lo y IL-7R hi γδ 27− timocitos
determinados por RT-PCR en tiempo real. ( D) Timocitos totales de ratones adultos ex vivo o activados durante 4 días in
vitro con IL-7 ( izquierda ); Expresión de CD44 y CD27 entre células T γδ activadas ( centro izquierda ); Tinción
intracelular para IFN-γ e IL-17 en todas las células T γδ ( centro derecha ) y células γδ 27− ( derecha ) después de la
activación de la ionomicina PMA +. Para todas las parcelas, los números indican el porcentaje de celdas en la puerta o
cuadrante relevante. ( E ) Timocitos adultos preincubados con un inhibidor STAT3 específico ( Inferior ) o control del
vehículo ( Superior ) y posteriormente cultivados con IL-7 durante 72 h. Gráficos representativos (de n = 3 experimentos)
de células T γδ activadas. ( F) Porcentaje y números absolutos de timocitos eYFP + γδ 27− y
eYFP - γδ 27− de ratones adultos Il17a CreR26ReYFP ex vivo (barras negras) o después del cultivo con IL-7 durante 4 d
(barras abiertas). ( G ) Células γδ teñidas para IL-17 e IFN-γ después de 7-d FTOC del día embrionario 16.5 timo fetal
en presencia ( derecha ) o ausencia ( izquierda ) de IL-7 (de n = 3 experimentos con ≥3 tímico lóbulos por condición).

En cuanto a las células LN, etiquetado CFSE y tinción Ki67 de timocitos ex vivo mostró que
la IL-7 promueve principalmente la proliferación de CD44 hi CD27 - timocitos con IL-17 de
potencial ( Fig S3. B y C ): En efecto, después de 4 d,> 90 % de CD44 hi CD27 - los timocitos
estaban ciclando con> 98% de células competentes de IL-17 encontradas entre
estos. Nuevamente hubo poca evidencia de supervivencia selectiva mediada por IL-7 de células
γδ 27− con niveles de ARNm de Bcl-2 inferiores en las células γδ 27− que en las células
γδ 27+ ( Fig. S3 D ). La expansión preferencial de CD44 + γδ27- timocitos se redujo ≥80% por el
inhibidor STAT3 ( Fig. 4 E y Fig. S3 E ). Es evidente que las células tímicas γδ 27− no fueron
enriquecidas selectivamente por otras citocinas activadoras de STAT5- (IL-2, IL-15 e IL-21) y
STAT3- (IL-6), solas o agregadas a concentraciones subóptimas de IL- 7) La IL-2 activó todos
los timocitos γδ, pero aún se enriqueció (casi el doble) para las células γδ 27+ , mientras que la
IL-15 activó principalmente las células γδ 27+ ( Fig. S4 ). Por lo tanto, en cuanto a las células

81
LN, IL-7 promueve la expansión preferencial dependiente de STAT3 de timocitos γδ 27 -
competentes IL-17.

La evidencia adicional de que IL-7 expande preferentemente timocitos competentes para IL-
17 dentro del subconjunto γδ 27- se derivó de los ratones Il17aCreR26ReYFP. Ex vivo ∼1% de
los timocitos γδ son eYFP + CD27 - , mientras que ∼8% son eYFP - CD27 - ( Fig. 4 F ),
aproximadamente coherente con ∼11% de los timocitos γδ 27− que producen IL-17 tras la
activación a corto plazo ( Fig. 4 D, superior ). Por el contrario, 4 días en IL-7 aumentó
eYFP + CD27 - número de células> 30 veces, lo que los convierte en el subconjunto más grande
en comparación con eYFP - CD27 - células que habían aumentado mucho menos (Fig. 4 F ).

Para demostrar que las células γδ 27− en desarrollo son un objetivo preferencial de IL-7, se
examinaron los timocitos fetales porque el timo fetal no será un objetivo para la recirculación
periférica de células T. El IL-7 suplementario agregado al cultivo de órganos tímicos fetales
(FTOC) 7-d expandió los números absolutos de timocitos γδ totales en cinco veces, pero
nuevamente el impacto fue preferencial para los timocitos γδ competentes en IL-17 cuya
representación se incrementó dos veces sobre IFN-γ –Productores de timocitos γδ ( Fig.
4 G ). Para verificar que IL-7 activó preferentemente timocitos γδ 27− en lugar de promover la
conversión de timocitos γδ 27+ en células γδ 27− , se aplicó IL-7 a CD44 hi γδ 27− purificado,
CD44 hi γδ 27+ o CD44 lo γδ 27+ timocitos. Después de un cultivo 4-d,
las células CD44 γδ 27− aparecieron por microscopía altamente activadas, en contraste con
hi

los subconjuntos γδ 27+. Para normalizar el número de células en los cultivos, se mezclaron
subconjuntos purificados con timocitos de ratones TCRδ - / - de la misma
edad. Sorprendentemente, ninguno de los subgrupos γδ 27+ generó células competentes para IL-
17 durante 4 días, mientras que> 70% de las células que surgieron de solo 5,000
CD44 hi γδ 27− fueron competentes para IL-17 ( Fig. S5) Por lo tanto, IL-7 expande
principalmente las células con competencia IL-17 en lugar de diferenciar las células hacia IL-
17 de novo.

IL-7 promueve el potencial de adaptación para producir IL-17.

Las células γδ productoras de IL-17 son ampliamente vistas como innatas porque son activadas
rápidamente por IL-1 e IL-23 solas y son relativamente poco sensibles a los agonistas de TCR
que activan fuertemente las células γδ 27+ productoras de IFN-γ ( Fig. S6 A ). Sin embargo, en
presencia de IL-7, los agonistas de TCR promovieron un enriquecimiento> 20 veces mayor de
las células γδ 27− en relación con las células LN, mientras que las células γδ 27+ se enriquecieron
solo entre tres y cuatro veces: por 4 d, ∼100% de γδ 27− células fueron
CD69 + CD44 hi CD25 + ICOS + ( Fig. 5 A y B y Fig. S6B ) En comparación con IL-7 solo, las
concentraciones subóptimas de agonistas de TCR añadidas a IL-7 aumentaronel número de
células competentesγδ 27 -IL-17 en un 40-50% adicional ( Fig. 5 C y D ), mientras que hubo una
sinergia insignificante paraCélulasγδ 27+ , que en cambio respondieron muy fuertemente a la
combinación de agonistas de TCR de IL-15 + ( Fig. S6 C y D ).

82
Fig.5.

Los agonistas de TCR e IL-7 promueven cooperativamente las células γδ productoras de IL-17. ( A ) Total de células LN
teñidas para marcadores como se indica ex vivo ( Izquierda ) y después del cultivo 4-d con IL-7 + 1 μg / ml de anticuerpo
agonista de TCR [GL3] ( Derecha ) o control de isotipo ( Centro ). ( B ) Las células T LN γδ se tiñeron para marcadores
como se indica después del cultivo 4-d con IL-7 y con anticuerpo agonista de TCR ( inferior ) o control de isotipo
( superior ). Para todas las parcelas, los números indican el porcentaje de celdas en los cuadrantes relevantes. ( C )
Número absoluto de γδ 27− ( superior ) total o IL-17 que expresa γδ 27− ( inferior) Células LN después del cultivo en IL-7
con 1 mg / ml GL3 o control IgG, como en A . Las barras de error son SEM de n = 3 experimentos; * P <0,05. ( E )
Tinción para CD107 en células γδ 27− ( Izquierda ) y γδ 27+ ( Derecha ) activadas durante 6 h con agonistas de TCR de 10
μg / ml (línea) o control de isotipo (área sombreada), de LN ex vivo ( Izquierda ) y después del cultivo 4-d con IL-7
( Derecha ).

Como prefacio para matar células objetivo en respuesta a la activación mediada por TCR, las
células T exocitan el contenido de gránulos citolíticos en un proceso que implica el movimiento
a la superficie celular de la proteína CD107a. Por lo tanto, los niveles de expresión de CD107a
proporcionaron un ensayo adicional para el impacto de IL-7 en la respuesta de las células T γδ
a la estimulación de TCR. Sorprendentemente, los agonistas de TCR provocaron la regulación
superficial de CD107a por las células γδ 27− solo después del cultivo de las células en IL-7,
mientras que las células γδ 27+ regularon la expresión de CD107a directamente ex vivo, sin
necesidad de IL-7 ( Fig. .5 E) En resumen, IL-7 facilita selectivamente respuestas fuertes de
las células γδ productoras de IL-17 a la estimulación de TCR, ya sea que se mida por expansión,
marcadores de activación o función efectora.

IL-7 revela células γδ humanas competentes IL-17.

A diferencia de los ratones, un subconjunto sustantivo de células T γδ humanas productoras de
IL-17 ha sido difícil de identificar en donantes sanos. Como se informó, no hubo producción
precoz de IFN-gamma por sangre fresca del cordón umbilical humano (CB) γδ células y por

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adulto TCRγδ + células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimuladas por PMA +
ionomicina, pero no había obvio IL-17 –Conjunto de producción ( Fig. 6 A ). Cuando se
cultivaron PBMC durante 1 semana con anti-TCRγδ + IL-7 y luego se activaron durante 6 h,
los monoproductores de IFN-γ describieron aproximadamente el 80% de las células; un
pequeño porcentaje coexpresó IL-17 e IFN-γ, pero todavía no había un monoproductor IL-17
( Fig. 6 B) Sin embargo, cuando las células CB también se cultivaron, fracciones sustanciales
de células Vδ2 + y Vδ1 + produjeron IL-17, siendo la mayoría monoproductores de IL-17 ( Fig.
6 B y Fig. S7 A ). Como era de esperar, los porcentajes de células γδ que eran competentes en
IL-17 variaban con la fuente de CB de ∼15% a> 40%, con una mayor representación siempre
entre las células Vδ2 + : de hecho, las células Vδ2 + competentes en IL-17 a veces superaron en
número a las células competentes IFN-γ ( Fig. 6 B y Fig. S7 B ). Comparando los principales
subconjuntos de células γδ: cultivo de 1 semana con agonistas de IL7 + TCR sostenidos
números absolutos de Vδ1 +las células, pero los monoproductores IL-17 se expandieron ∼50
veces, en comparación con ningún aumento significativo en las células competentes IFN-γ,
mientras que el número de células Vδ2 + aumentó ∼10 veces, dentro del cual los
monoproductores IL-17 se expandieron> 20 veces, en comparación con solo un aumento de 10
veces en las células competentes IFN-γ. Por lo tanto, como en el ratón, los efectos de los
agonistas de TCR de IL-7 + están fuertemente sesgados hacia la competencia de IL-17. De
acuerdo con la activación de las células γδ, ∼100% perdió el marcador de células T vírgenes
CD45RA, ICOS con regulación positiva y expresó CD161, un marcador de células T
productoras de IL-17 humanas ( Fig. S7 B y C) Cuando los cultivos frescos o de 1 semana de
CB o PBMC se estimularon recientemente durante 30 minutos con IL-7, todos mostraron un
aumento de la fosforilación de STAT5, que por lo tanto no se correlacionó con la competencia
de IL-17. Por el contrario, la activación de STAT3 fue medible solo en células Vδ2 + derivadas
de CB cuando se cultivaron durante 1 semana y luego se estimularon con IL-7 ( Fig. 6 C y Fig.
S8 A ). Por lo tanto, como en el ratón, la activación de STAT3 dependiente de IL-7 es altamente
selectiva.

Fig.6.

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Evocación de células T γδ productoras de IL-17 de la sangre del cordón umbilical humano. Parcelas representativas
de n ≥ 4 donantes. ( A y B ) Tinción intracelular para IFN-γ e IL-17 en células Vδ1 + ( Superior ) y Vδ2 + ( Inferior ) de
CB y PBMC adultas recién aisladas ( A ), o cultivadas durante 1 semana ( B ) con IL- 7 y anticuerpo pan γδTCR: en cada
caso, las células se estimularon previamente con PMA + ionomicina durante 6 h. ( C ) niveles de pSTAT3 y pSTAT5
evaluados por citometría de flujo en células Vδ2 + cerradas de CBMC o PBMC adultas frescas ( izquierda ), o después
de 1 semana de cultivo con IL-2 anti-CD3 + (Derecha ), en cada caso seguido de estimulación con IL-7 de 30 minutos
(áreas abiertas) o control (Ctrl, áreas sombreadas).

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2012 109 (43) 17549-17554; Editado por Robert L. Coffman, Dynavax Technologies,
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5.

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