Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.

81-87, 2010 81
ISSN 1517-8595

FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO DE DIFERENTES RESÍDUOS PARA

A OBTENÇÃO DE LIPASE MICROBIANA

Érica Mara Dantas 1 Luciana Cristina Lins de Aquino2

RESUMO

A fermentação em estado sólido destaca-se no aproveitamento de resíduos agroindustriais para a

síntese de diversos compostos de interesse industrial e de elevado valor agregado. O objetivo
deste trabalho foi avaliar o potencial de resíduos agroindustriais (torta de mamona, torta de
babaçu, sementes de abóbora, casca de abacate e borra de café) para a obtenção de lipase
microbiana utilizando o microrganismo Aspergillus niger. Nos experimentos fermentativos
estudou-se a influência do teor de agua do substrato (35 a 65%b.u.) e avaliou-se a cinética de
produção de lipase. O extrato enzimático obtido nos processos foi avaliado quanto ao efeito do
pH (entre 2,0 e 8,0) e da temperatura (entre 30 e 70 oC) na atividade lipolítica. Maior produção
de lipase (24,6 U g-1) foi obtida quando utilizado como fonte de carbono a torta de babaçu
contendo um teor de água de 45%b.u. durante 168 horas de fermentação. A lipase obtida a partir
deste resíduo obteve maior atividade enzimática (3278 U g-1) em pH 2,0 e temperatura de 30 °C.
Através deste trabalho verificou-se que os resíduos: sementes de abóbora, cascas de abacate,
torta de babaçu, torta de mamona e borra de café demonstraram potencial para a obtenção de
lipase microbiana acídica.

Palavras-chave: Lipase, Fermentação em estado sólido, Resíduo agroindustrial.

SOLID STATE FERMENTATION OF DIFFERENT RESIDUES TO OBTAIN

MICROBIAL LIPASE

ABSTRACT

The solid state fermentation have been used agroindustrial residues for the synthesis of various
high value compounds. The objective of this study was to evaluate the potential of
agroindustrial residues (castor oil cake, babassu oil cake, pumpkin seeds, avocado rind and
coffee grounds) to obtain microbial lipase using the microorganism Aspergillus niger. In the
fermentations was evaluated the effect of moisture content in the substrate (35 to 65% w.b.) and
the kinetics of lipase production. It was evaluated the effect of pH (between 2.0 and 8.0) and
temperature (between 30 and 70 °C) on the hydrolytic activity of enzymatic crude extract. The
higher production of lipase (24.6 U g-1) was obtained when used babassu cake, as a carbon
source, containing 45% w.b. of moisture content for 168 hours of fermentation. A lipase
presented higher enzymatic activity (3278 U g-1) at pH 2.0 and temperature of 30 °C. Through
this work it was found that the waste: pumpkin seeds, avocado rind, babassu oil cake, castor
bean cake and coffee grounds have shown potential for obtaining acidic microbial lipase.

Keywords : Lipase, Solid state fermentation, Agroindustrial residue.

Protocolo 103.039 de 12/09/2009

1
Graduado em Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon, s/n, Jardim Rosa Elze, CEP 49000-000,
São Cristóvão, Se. Email: em_cv@hotmail.com
2
Professora Doutora do Curso de Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon, s/n, Jardim Rosa Elze,
CEP 49000-000, São Cristóvão, Se. Email: aquinoluciana@hotmail.com
82 Fermentação em estado sólido de diferentes resíduos para a obtenção de lípase microbiana
INTRODUÇÃO
As atividades agropecuárias e de
processamento de produtos agropecuários têm
proporcionado sérios problemas de poluição no
solo, em águas superficiais e em águas
subterrâneas. Os resíduos sólidos de
agroindústrias (bagaços, tortas, restos de frutas
e hortaliças, etc.) são provenientes de usinas
sucro-alcooleiras, matadouros, indústrias do
processamento de carnes (vísceras e carcaça de
animais), frutas e hortaliças (bagaço, tortas,
refugo e restos), indústria da celulose e papel
(resíduos da madeira, lodo do processo de
produção e do tratamento de águas residuárias),
curtumes (aparas de couro e lodo do processo e
tratamento de águas residuárias) e outros.
Muitos frutos comestíveis são processados para
fabricação de sucos naturais, sucos
concentrados, doces em conserva, polpas e
extratos, os quais possuem sementes que são,
muitas vezes, descartadas e poderiam ser
utilizadas para minimizar o desperdício de
alimentos (Vargas, 2004).
O descarte de resíduos representa um
crescente problema devido ao aumento da
produção. Os maiores impactos ambientais
provocados por resíduos sólidos orgânicos são
decorrentes da fermentação do material,
podendo ocasionar a formação de ácidos
orgânicos (“chorume” – líquido de elevada
DBO formado com a degradação do material
orgânico e a lixiviação de substâncias tóxicas)
com geração de maus odores e diminuição do
oxigênio dissolvido em águas superficiais
(Graminha et al., 2008).
Devido a quantidade de nutrientes
disponíveis nos resíduos sólidos agroindustriais
estes podem ser convertidos em produtos
comerciais ou matérias-primas para processos
secundários. Neste contexto a fermentação em
estado sólido (FES) desempenha um papel de
destaque no aproveitamento de resíduos sólidos
visando a síntese de diversos compostos de alto
valor agregado e de grande interesse industrial.
A FES é aplicada para produção de alimentos,
biopesticidas, e substâncias químicas diversas.
O grande potencial é principalmente na
produção de enzimas através de fungos
filamentosos, os quais têm recebido a maioria
das atenções nas pesquisas, pois apresentam
capacidade de crescimento em baixos níveis de
água (Couto e Sanroman, 2006; Rodriguez et
al., 2006; Pinheiro, 2006; Graminha et al.,
2008; Sun e Xu, 2008 ). Recentemente alguns
pesquisadores utilizaram resíduos de alimentos
provenientes de restaurantes para a produção de
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.81-87, 2010
Dantas &Aquino
glicoamilases microbianas (Wang et al., 2008).
Resíduos provenientes da produção de
biodiesel, tais como torta de pinhão manso e de
mamona também tem sido aproveitada para a
obtenção de lipases e proteases microbianas
(Mahatan et al., 2008; Godoy et al., 2009).
As lipases (triglicerol acil-hidrolases,
E.C. 3.1.1.3), são enzimas de origem animal,
vegetal ou microbiana, definidas como
hidrolases de ésteres contendo ácidos graxos de
cadeia longa, saturados ou insaturados, com
doze ou mais átomos de carbono. Dependendo
da fonte, podem ter massa molecular variando
entre 20 a 75 kDa, atividade enzimática em pHs
entre 4,0 a 9,0 e em temperaturas variando
desde a ambiente até 70 °C (Coelho et al.,
2001). As lipases microbianas constituem um
importante grupo de enzimas biotecnológica-
mente valiosas, principalmente, pela
versatilidade de suas propriedades e fácil
produção de massa. Essas enzimas são
diversificadas na suas propriedades enzimáticas
e especificidade a substratos tornando-se muito
atrativas para aplicações industriais na obtenção
de vários produtos tais como: alimentos,
detergentes, produtos farmacêuticos,
cosméticos, produtos têxteis e fábricas de papel
(Sharma et al., 2001; Pelizer et al., 2007). Neste
contexto, o presente trabalho teve como
objetivo avaliar o potencial de vários resíduos
agroindustriais para a obtenção de lipase
microbiana através de fermentação em estado
sólido (FES) utilizando o microrganismo
Aspergillus niger
MATERIAIS E MÉTODOS
O microrganismo Aspergillus niger foi
adquirido da coleção de culturas do Instituto
Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro, Brasil), mantido
sob refrigeração (4 ºC) em tubos de ensaio
inclinados contendo meio BDA (ágar batata
dextrose). Os resíduos utilizados foram:
sementes de abóbora (35% de lipídeos), cascas
de abacate (11% de lipídeos), torta de babaçu
(2,6% de lipídeos), torta de mamona (0,6% de
lipídeos) e borra de café (15% de lipídeos).
Estes foram secados em estufa a 80 ºC por 24
horas, posteriormente triturados e armazenados
até sua utilização.
As fermentações foram realizadas em
placas de petri contendo os resíduos (100 g) e 1
mL de suspensão de esporos (7,2 x 106 células
mL-1), mantidos à temperatura em torno de
30°C. Inicialmente para avaliar a influência do
teor de água na produção da enzima lipase
realizou-se experimentos com cada resíduo
 Fermentação em estado sólido de diferentes resíduos para a obtenção de lípase microbiana
contendo teores de água de 35%, 45%, 55% e
65% b.u. durante 96 horas de fermentação. A
enzima produzida foi extraída com água
destilada, centrifugada durante 10 min e o
extrato bruto enzimático (EBE) foi utilizado
para a determinação da atividade enzimática.
A cinética de produção de lipase foi
realizada através de fermentações utilizando
cada resíduo no teor de água pré-determinado.
De tempos em tempos retirou-se uma amostra
do material com água destilada e determinou-se
a atividade enzimática. O extrato bruto
enzimático (EBE) obtido nestes processos foi
utilizado para os experimentos subseqüentes de
caracterização bioquímica.
A determinação da atividade enzimática
foi realizada através da mistura de 1 mL do
extrato bruto enzimático, 1 g de óleo de oliva e
4 mL tampão fosfato de sódio (pH 6,0, 50 mM),
mantendo-se sob agitação à 130 rpm,
temperatura de 30ºC durante 60 min. A reação
foi paralisada pela adição 15 mL de
acetona:etanol (1:1 em volume) e a atividade
foi medida pela titulação dos ácidos graxos
liberados com solução de KOH 50mM usando
fenolftaleína como indicador. Um branco
contendo o mesmo meio reacional sem o
extrato enzimático foi titulado para a
determinação da quantidade pré-existente de
ácidos graxos livres no substrato empregado. A
atividade enzimática foi calculada segundo a
Equação 1 (Pinheiro et. al., 2006).
U=
[(Va − Vb ) × M × 1000 × Vd ] ÷ Vc × t
m borra de café (13 U g-1) com teor de água de
(1)
Onde:
U - Atividade enzimática da lipase (Ua g-1);
Va- Volume final de KOH gasto para titular
apenas os ácidos graxos liberados do óleo
de oliva, após a reação de
transesterificação enzimática usando o
extrato bruto enzimático (mL);
Vb- Volume de KOH gasto para titular os
ácidos graxos pré existentes encontrados
no óleo de oliva (0,2 mL);
M - Concentração da solução de KOH utilizada
na titulação (M);
t - tempo de reação (min);
Vc - Volume de óleo de oliva utilizado (mL);
Vd- Volume de solução de extração (mL);
m - Massa do substrato (g).
Para avaliar a influência do pH na
atividade da enzima, preparou-se soluções
contendo o extrato bruto enzimático, óleo de
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.81-87, 2010
Dantas &Aquino 83
oliva comercial e tampões na concentração de
100 mM, em diferentes valores de pH (2,0; 3,0;
4,0; 5,0; 6,0; 7,0 e 8,0). As soluções foram
mantidas à temperatura de aproximadamente 30
°C, sob agitação (130 rpm), durante 60 min e a
atividade enzimática foi calculada. Para avaliar
o efeito da temperatura, a solução contendo
extrato bruto enzimático (EBE), óleo de oliva e
tampão (onde se obteve maior atividade
lipolítica) foi mantida sob agitação em
temperaturas de 30 °C; 40 °C; 50 °C; 60 °C e
70 °C durante 60 min. A atividade enzimática
foi determinada como descrito anteriormente.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inicialmente avaliou-se a influência do
teor de água dos substratos, entre 35% e 65%,
na produção de lipase através da FES. O teor de
água é um fator bastante significativo nas
propriedades físicas do substrato. Elevado teor
de água causa a diminuição da porosidade do
substrato, diminuindo assim a troca de gases.
Por outro lado baixo teor de água pode acarretar
na diminuição do crescimento microbiano e
conseqüente menor produção de enzima
(Mahanta et al., 2008). Os resultados obtidos
estão apresentados na Figura 1.
O teor de água dos substratos influenciou
de maneira significativa a atividade hidrolítica
do EBE ao longo da fermentação. Foi
verificado que houve maior produção de lipase
quando empregado cascas de abacate (10 U g-1)
e sementes de abóbora (24 U g-1 ) com teor de
água de 35% e torta de babaçu (25 U g-1) e
45%. Quando utilizado torta de mamona como
substrato obteve-se máxima atividade
enzimática (19 U g-1) nos resíduos contendo
teor de água de 35% e 45% b.u. .
A cinética de produção de enzima foi
verificada durante a fermentação dos resíduos
cascas de abacate, torta de babaçu e torta de
mamona contendo teor de água de 35% b.u.; e
sementes de abóbora e borra de café contendo
teor de água de 45% b.u.. Os resultados estão
encontram-se na Figura 2.
As fermentações dos resíduos foram
conduzidas até ser observado a queda ou
estabilidade da atividade hidrolítica no EBE.
No processo fermentativo utilizando torta de
mamona obteve-se máxima atividade
enzimática em 96 horas de fermentação (23 U
g-1). Nas fermentações com cascas de abacate e
sementes de abóbora obteve-se máxima
atividade enzimática de 15,5 U g-1 e 20 U g-1
respectivamente, em 144 horas de fermentação.
84 Fermentação em estado sólido de diferentes resíduos para a obtenção de lípase microbiana Dantas &Aquino

Quando utilizados como torta de babaçu e borra de 25 U g-1 e 20 U g-1, respectivamente, em 168
de café obteve-se máxima atividade hidrolítica horas de fermentação.

30

Atividade hidrolítica (U g-1) 25

20 Borra de café
Torta de babaçu
15
Torta de mamona
10 Semente de abóbora
Casca de abacate
5
30 40 50 60 70
Teor de agua (% base seca)

Figura 1. Influência do teor de água do substrato na produção da enzima lipase

25
Atividade hidrolítica (U g-1)

20

Borra de café
15 Torta de babaçu
Torta de mamona
10 Semente de abóbora
Casca de abacate
5
0 50 100 150 200 250
Tempo (horas)

Figura 2. Cinética de produção enzimática através de FES utilizando diferentes resíduos

agroindustriais

Através dos resultados constatou-se que o Em comparação com pesquisadores que

tempo de fermentação variou significativamente utilizaram resíduos para a produção de lipase
com o tipo de substrato utilizado. Apesar da verificou-se que Ul-Haq et al. (2002) obtiveram
torta de babaçu conter 2,6% de lipídeos, obteve- máxima atividade enzimática de 26,0 U g-1
se maior atividade hidrolítica (24,6 U g-1) utilizando farelo de trigo e o fungo Rhizopus
quando empregado este resíduo como substrato. oligosporous e Gombert et al. (1999) obtiveram
Uma hipótese para este resultado seria que a máxima atividade enzimática de
presença de outros nutrientes pode ter aproximadamente 6,0 U g-1 utilizando torta de
contribuído para o crescimento do babaçu e Penicillium restrictum. Os resíduos
microrganismo. Além disso, como o teor de testados neste trabalho demonstraram potencial
agua do substrato é um fator importante para o para a produção de lipase.
crescimento microbiano em fermentação em Experimentos foram realizados para
estado sólido, pode ter ocorrido maiores perdas determinar o pH ótimo de atividade enzimática
de água durante a fermentação dos demais do EBE obtido através da FES dos diferentes
resíduos testados neste trabalho. resíduos. As reações foram realizadas em

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 Fermentação em estado sólido de diferentes resíduos para a obtenção de lípase microbiana Dantas &Aquino 85

diferentes tampões com pHs variando entre 2,0 Apesar disto, alguns autores têm
e 8,0. Os resultados obtidos estão apresentados produzido lipase microbiana com caráter
na Figuras 3 e 4. acídico, tais como Mahadik et al., 2002 os quais
obtiveram lipase a partir de farelo trigo
utilizando Aspergillus niger, com máxima
atividade enzimática em pH 2,5, Mahadik et al.,
3500 2004 obtiveram lipase acídica por fermentação
Atividade hidrolítica (U g-1)

3000 Torta de submersa em pH 5,5 utilizando Aspergillus

2500 babaçu niger e Mehtra et al., 2009 obtiveram lipase por
Torta de fermentação submersa utilizando Aspergillus
2000 mamona niger com máxima atividade enzimática em pH
1500 Casca de 2,5 e temperatura de 50 °C.
1000 abacate Definido o pH onde obteve-se máxima
500 atividade lipásica, a etapa seguinte foi avaliar a
0 influência da temperatura. A mistura reacional
1 3 5 7 9 EBE, óleo de oliva e tampão acetato de sódio
pH 2,0 foi mantida sob agitação em diferentes
pH temperaturas variando entre 30 °C e 70 °C
durante 60 min e a atividade hidrolítica foi
Figura 3. Influência do pH na atividade
determinada com descrito anteriormente. Os
hidrolítica do EBE obtido a partir de torta de
resultados estão demonstrados nas Figuras 5 e
babaçu, torta de mamona e cascas de abacate.
6.
Os resultados demonstraram que a
atividade hidrolítica do extrato bruto enzimático 3500
Atividade hidrolítica (U g-1)

(EBE) produzido a partir dos resíduos

agroindustriais diminuiu com o aumento do pH, 3100
sendo o valor máximo obtido em pH 2,0, o que
demonstrou o caráter acídico da enzima. Os 2700
EBEs obtidos a partir de borra de café, torta de Borra de café
babaçu, torta de mamona, sementes de abóbora 2300 Torta de babaçu
e cascas de abacate demonstraram máxima Casca de abacate
atividade hidrolítica (em pH 2,0) de 2000 U g-1, 1900
3278 U g-1; 789 U g-1 e 2603 U g-1,
25 45 65
respectivamente. De maneira geral os Temperatura (°C)
pesquisadores têm obtido lipases microbianas Figura 5. Influência da temperatura na
com máxima atividade enzimática em pH atividade hidrolítica do EBE obtido a partir de
próximo a neutralidade (Kamini et al, 1998; borra de café, torta de babaçu e cascas de
Hiol et al., 2000; Abbas et al., 2002; Diaz et al., abacate.
2006).
3500
Atividade hidrolítica (U g-1)

3000
Atividade hidrolítica (U g-1)

2500 3000
Borra de café 2500
2000
Semente de 2000
1500 Torta de mamona
abóbora 1500
1000
1000 Semente de abóbora
500
500
0
25 45 65
1 6
Temperatura (°C)
pH
Figura 4. Influência do pH na atividade
hidrolítica do EBE obtido a partir de borra de Figura 6. Influência da temperatura na
café e sementes de abóbora. atividade hidrolítica do EBE obtido a partir de
torta de mamona e sementes de abóbora.
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.81-87, 2010
86 Fermentação em estado sólido de diferentes resíduos para a obtenção de lípase microbiana
O EBE obtida a partir da borra de café,
torta de mamona, cascas de abacate, sementes
de abóbora e torta de babaçu demonstrou
máxima atividade enzimática (em pH 2,0) nas
temperaturas de 40 °C; 50 °C; 40 °C; 70 °C e
30 °C, respectivamente. Os resultados estão em
acordo com outros pesquisadores, os quais
obtiveram lipases microbianas com máxima
atividade enzimática em temperaturas de 35 °C
(Hiol et al., 2000); 30 °C (Ul-Haq et al., 2002);
37 °C (Kamine et al., 1998); 45 °C (Mahadik et
al, 2002) e 50 ºC (Koblitz e Pastore, 2006).
CONCLUSÕES
Apesar de serem produzidas na maioria
das pesquisas lipases com caráter básico, nas
condições propostas neste trabalho, a enzima
produzida a partir dos resíduos sementes de
abóbora, cascas de abacate, torta de babaçu,
torta de mamona e borra de café, apresentou
maior atividade hidrolítica em pH 2,0, o que
caracterizou a provável produção de lipase
acídica. Maior produção enzimática (25 U g-1)
foi obtida na fermentação em estado sólido de
torta de babaçu contendo um teor de água de
45% durante 168 horas. Dentre os resíduos
testados, a lipase obtida a partir de torta de
babaçu foi a que apresentou maior atividade
hidrolítica (3278 U g-1) em pH 2,0 e
temperatura de 30 °C. Os resíduos
agroindustriais, sementes de abóbora, cascas de
abacate, torta de babaçu, torta de mamona e
borra de café, os quais tradicionalmente são
descartados em lixos ou solo apresentaram
potencial para a obtenção de lipase acídica.
Com exceção da torta de mamona e da torta de
babaçu (provenientes do processamento de
biodiesel e de indústrias de refino de óleos), não
há relatos na literatura consultada do emprego
dos demais resíduos testados neste trabalho
como substrato para a obtenção de lipase
microbiana.
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