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Prof. Valmir F.

Juliano

QUI624
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS
Classificação dos métodos analíticos
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS

Chamados de métodos Baseados em propriedades


de via úmida físicas (químicas em alguns casos )

Gravimetria Volumetria Eletroanalítico Cromatográfico

Espectrométrico

Propriedades Propriedades Propriedades


elétricas ópticas mistas*
*Separação: interações físico-químicas.
Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas.
Cromatografia
Histórico
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903),
botânico russo: Separação de misturas de pigmentos
vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e
éter de solventes variados.
petróleo
mistura de
pigmentos

CaCO3 pigmentos
separados

1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)


Cromatografia
Definição - Princípio Básico

Cromatografia é um método físico-químico de


separação de misturas, identificação e
quantificação de seus componentes.
• A separação depende da interação dos componentes da
mistura com a fase móvel e com a fase estacionária.
• A interação dos componentes da mistura com estas duas fases
é influenciada por diferentes forças intermoleculares,
incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de
afinidade e solubilidade.
• A identificação se dá mediante a comparação da
interação de padrões com as fases estacionárias.
• A quantificação é feita também pela comparação com
padrões de concentrações conhecidas, através de
curvas analíticas.
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas

• De acordo com o sistema cromatográfico

• Em Coluna
• Cromatografia Líquida
• Cromatografia Gasosa
• Cromatografia Supercrítica

• Planar
• Centrífuga (Chromatotron®)
• Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
• Cromatografia em Papel (CP)
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas

• De acordo com a fase móvel

• Utilização de Gás
• Cromatografia Gasosa (CG)
• Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)

• Utilização de Líquido
• Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

• Utilização de Gás Pressurizado


• Cromatografia Supercrítica (CSC)
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas

• De acordo com a Fase Estacionária

• Líquida
• Sólida
• Quimicamente Ligadas

• De acordo com o modo de separação

• Por Adsorção
• Por Partição
• Por Troca Iônica
• Por Afinidade
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas

Técnica Planar Coluna

FM Líquido Gás Líquido

FE Líq Sól Líq Sól Líq Sól Troca Afinidade Fase Exclusão
Iônica Ligada

Tipo de
cromato- CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE
grafia
Cromatografia
Analogia
O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo
de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região.
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as
moscas e abelhas.

Fase estacionária Analitos


Cromatografia
Analogia

Para uma mesma mistura, a simples troca da fase


estacionária pode ser suficiente para alterar completamente
a ordem de eluição de componentes da mistura.

Fase estacionária Analitos


Cromatografia
Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Fase estacionária líquida suportada na celulose.

Separação
Fase móvel

A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos


(líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom
exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível
verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.
Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!

Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem


simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na
separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser
largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está
fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases
estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Termos e parâmetros técnicos

ΔSmancha
Rf 
ΔSsolvente

a
Rfa 
s s
c
b
Rfb 
s
b
c
a Rfc 
s
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD

FASES ESTACIONÁRIAS

Sílica (SiO2)
Ativação de 30 a 60 min
de 105 a 110 oC
Alumina (Al2O3)

Celulose
Ativação de 10 min
a 105 oC
Poliamida
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD

ANÁLISE QUALITATIVA

- Comparação com valores de Rf tabelados

- Comparação com padrão eluído em conjunto

- Extração e aplicação de métodos instrumentais


Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Conclusões:

Amostra não contém a espécie B

Amostra pode conter a espécie A

Para se certificar da presença,


eluir em outros solventes

A B Após
Amostra Eluição
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Cromatografia
Bi-dimensional

Solvente 1 Solvente 2
Cromatografia
Cromatografia planar

Chromatotron é uma
cromatografia de camada
fina preparativa acelerada
centrifugamente. Pode
substituir pequenas colunas e
HPLC.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Cromatografia
Cromatografia em Coluna

PROCESSOS DE SEPARAÇÃO

Exclusão Partição

Adsorção Troca Iônica

Afinidade
Cromatografia
Cromatografia em Coluna

ADSORÇÃO

- Fase Móvel Líq. ou Gás

- Fase Estacionária Sólida

Processos de
Adsorção/Dessorção

Ligações de hidrogênio;
Forças de Van der Waals
Cromatografia
Cromatografia em Coluna

Diferença entre Absorção e Adsorção


Cromatografia
Cromatografia em Coluna

ADSORÇÃO

Fase Estacionária Sólida:


Polar

Aumento da Atividade

-CO2H > -OH > -NH2 >

-SH > -CHO > -C=O >

-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-


Cromatografia
Cromatografia em Coluna
A função das fases móveis na cromatografia por adsorção
tem sentido amplo:
a) Função solvente
• Solubilizar os componentes
• Ter baixo ponto de ebulição
b) Função eluente
• Conduzir os componentes da mistura pela coluna
• Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)

SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente


Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano <
Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <
Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico <
Acetato de Etila < Acetona < Etanol <
Metanol < Ácido Acético
Cromatografia
Cromatografia em Coluna

ADSORÇÃO
Usos:
a) Laboratórios de química orgânica  separar e purificar
reagentes e materiais obtidos em síntese.
b) Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa
e analítica.
c) Laboratórios de análises clínicas  separação de
esteróides de urina ou de sangue, etc.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Gasosa

Fase Estacionária Líquida

Processos de Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua volatilidade.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Líquida

Fase Estacionária Líquida

Processos de Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua solubilidade.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
TROCA IÔNICA
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica
orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de
extraordinário valor em processos analíticos.

Fase Móvel Líquida

Fase Estacionária Sólida

Processos de Troca Iônica


Adsorção reversível e
diferencial dos íons da fase
móvel pelo grupo trocador
da matriz
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
TROCA IÔNICA
Resinas Catiônicas
e Aniônicas
Fluxo da FM

FE altamente carregada

Maior Interação

• Íons de alta carga

• Íons de menor tamanho

A diferença de afinidade entre


os íons da FM pode ser
controlada por pH e força iônica
Cromatografia
Cromatografia em Coluna

O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas


Cromatografia
Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária em Gel

Enquanto as partículas menores penetram nas


cavidades, as maiores vão sendo eluídas
contornando as estruturas moleculares da FE.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO
A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão,
introduzida por volta de 1960, de outros tipos de
cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado
constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas,
com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis.
- Separação de tamanhos específicos
- Separação de polímeros e proteínas
- Determinação de Massa Molar
Cromatografia
Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO
Características
desejáveis para os Géis
-Inércia Química:
Não pode haver uma interação
química entre a matriz e o soluto.
-Estabilidade:
O gel deve suportar uso contínuo
quanto mantido em condições
brandas de temperatura e pH.

-Baixo teor de íons:


Grupos carregados interferem no
processo de separação.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO
Fluxo da FM

Tipos de Géis

Dextrano (Sephadex)

Poliacrilamida

Ágar e Agarose
Cromatografia
Cromatografia em Coluna

AFINIDADE

Fase Móvel Líquida

Fase Estacionária Sólida

Propriedades

Biológicas e

Funcionais
Cromatografia
Teoria Básica
Sem
importância
SOLUTO na CG, mas
com grande
importância
na CLAE

FASE
MÓVEL ⇌ FASE
ESTACIONÁRIA
Cromatografia
Teoria Básica
Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o
equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase
móvel:

Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito


sorvido na FE e dissolvido na FM.

KC 
AFE Afinidade pela FE [A]FE

AFM MENOR RETENÇÃO !!!


KC = Constante de Distribuição
Volatilidade [A]FM
[A]FE = concentração do analito na FE
[A]FM = concentração do analito na FM
Cromatografia
Quantificação da eficiência
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados
onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM:

Cada “estágio” de equilíbrio é


chamado de PRATO TEÓRICO
O número de pratos teóricos
de uma coluna (N) pode ser
calculado por:

tR Coluna mais
N eficiente
wb
Cromatografia
Quantificação da eficiência
ALTURA EQUIVALENTE A UM
PRATO TEÓRICO (H)
Valores típicos de H e N:
“Tamanho” de cada estágio de dC df H N
equilíbrio 0,10 0,25 0,081 370370
0,25 0,25 0,156 192308
(L = comprimento da coluna) 0,32 0,32 0,200 150000
0,32 0,50 0,228 131579
Capilares, L = 30 m 0,32 1,00 0,294 102041
0,32 5,00 0,435 68966
dc = diâmetro da coluna em mm
df = espessura da fase estacionária em mm 0,53 1,00 0,426 70423
0,53 5,00 0,683 43924
2,16 10% 0,549 3643
Empacotadas, L = 2 m
2,16 5% 0,500 4000

Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas


como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais
eficientes
Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa

Fase estacionária

Detecção
Fase móvel
Separação
Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa

Injetor: submetido
à temperatura
controlada
Detector:
submetido à
Fase móvel: temperatura
gás inerte controlada

Coluna: contendo a
fase estacionária
está submetida à
temperaturas
controladas
Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade

Quais misturas podem ser


separadas por CG ?
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de
um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.

Misturas cujos constituintes sejam


VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)

DE FORMA GERAL:
CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que
sejam termicamente estáveis.
Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM)

INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem


com a fase estacionária ou superfícies do
instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que
possam degradar a fase estacionária.

Impurezas típicas em
gases e seus efeitos:
oxida / hidrolisa algumas FE
H2O, O2
incompatíveis com DCE

hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC


Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM)

CUSTO: Gases de A = 99,995 % (4.5)

CUSTO
altíssima pureza C B = 99,999 % (5.0)
podem ser muito B
A C = 99,9999 % (6.0)
caros. PUREZA

COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda


um gás de arraste específico para melhor funcionamento.

DCT He , H2
Seleção de Gases de
Arraste em Função DIC N2 , H2
do Detector: N2 (SS), Ar + 5% CH4
DCE
Cromatografia Gasosa
Injetor

Os dispositivos para injeção (INJETORES ou


VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução
INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica

t = 0

Injeção instantânea:
t = x

t = 0

Injeção lenta:
t = x
Cromatografia Gasosa
Injetor “on column”
1

2
1 - Septo (silicone)

3 2 - Alimentação de gás de
arraste)
4
3 - Bloco metálico aquecido

4 - Ponta da coluna
cromatográfica
Cromatografia Gasosa
Injetor “on column”

1 - Ponta da agulha
1 2 3 da microsseringa é
introduzida no início
da coluna.
2 - Amostra injetada
e vaporizada
instantaneamente no
início da coluna.
3 - “Plug” de vapor
de amostra forçado
pelo gás de arraste a
fluir pela coluna.
Cromatografia Gasosa
Parâmetros de injeção
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposição.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do
componente menos volátil.
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado
físico da amostra.
Amostras Amostras
COLUNA Líquidas Gasosas
Sólidos:
convencionalmente empacotada
se dissolve em um  = 3,2 mm (1/4”) 0,2 mL ... 20 mL 0,1 mL ... 50 mL
solvente adequado e
injeta-se a solução capilar
 = 0,25 mm 0,01 mL ... 3 mL 1 mL ... 100 mL
Cromatografia Gasosa
Microsseringas para injeção
LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 mL, 5 mL e 10 mL

êmbolo agulha (inox 316)

Microsseringa de
10 m L:
corpo (pirex)

corpo agulha

Microsseringa de 1 m L
(seção ampliada):
guia
êmbolo (fio de aço
soldado ao guia)
Cromatografia Gasosa
Colunas
EMPACOTADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pulverizado
(FE sólida ou FE líquida
depositada sobre as partículas do
recheio)

CAPILAR
 = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com
um filme fino (fração de mm) de
FE líquida ou sólida
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora
para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE
VAPOR (p0).
Estrutura química do analito
p0 = f
Temperatura da coluna

Temperatura Pressão Velocidade


da de de
coluna vapor migração

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE


(MENOR RETENÇÃO)
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna

TEMPERATURA DA COLUNA
CONTROLE CONFIÁVEL

AUMENTO DA
DA TEMPERATURA DA
COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAÇÃO EM CG
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito
diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

TCOL TCOL ALTA:


BAIXA:

- Componentes mais voláteis são - Componentes mais voláteis não


separados são separados
- Componentes menos voláteis - Componentes menos voláteis
demoram a eluir, saindo como eluem mais rapidamente
picos mal definidos
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:

TFIM

TEMPERATURA
R
TINI

tINI tFIM
TEMPO

TINI - Temperatura Inicial


Consegue-se boa
separação dos TFIM - Temperatura Final

componentes da tINI - Tempo Isotérmico Inicial


amostra em menor tFIM - Tempo Final do Programa
tempo R - Velocidade de Aquecimento
Cromatografia Gasosa

Programação linear de
temperatura

a) Isotérmico a 45 ºC;
b) isotérmico a 145 °C;
c) programado de 30 ºC a 180 ºC
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Possíveis problemas associados à PLT:

VARIAÇÕES DE VAZÃO
DO GÁS DE ARRASTE: A
viscosidade de um gás
viscosidade vazão
aumenta com a temperatura.

DERIVA (“DRIFT”) NA
LINHA DE BASE: Devido ao
aumento de volatilização de
FE líquida
Cromatografia Gasosa
Fase Estacionária
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível
próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os
componentes da amostra.

FE Seletiva:
separação adequada dos constituintes
da amostra

FE pouco Seletiva:
má resolução mesmo com coluna de
boa eficiência
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária sólida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE sólida é a ADSORÇÃO

A adsorção ocorre na
interface entre o gás de
arraste e a FE sólida

• Sólidos com grandes áreas superficiais


(partículas finas, poros)

ADSORÇÃO • Solutos polares

• Sólidos com grande número de sítios


ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária líquida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE líquida é a ABSORÇÃO

A absorção ocorre no interior


do filme de FE líquida
(fenômeno INTRAfacial)

• Filmes espessos de FE líquida

• Grande superfície líquida exposta ao gás


ABSORÇÃO de arraste

• Interação forte entre a FE líquida e o


analito (grande solubilidade)
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária quirais
• As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são
MUITO SIMILARES  FE convencionais não interagem
diferencialmente com os isômeros óticos.

PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de


origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias
oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).

FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos


têm atividade farmacológica.
Cromatografia Gasosa
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal
quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste.

Características ideais:
1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2. Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias
ordens de grandeza.
4. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos
400 ºC.
5. Tempo de resposta curto e independente da vazão.
6. Alta confiabilidade e facilidade de uso.
7. Similaridade de resposta para todos os solutos.
8. Não destrutivo.
Cromatografia Gasosa
Detectores

REGISTRO
DE
SINAL

ANALÓGICO
Registradores XY
DIGITAL
Integradores
Computadores

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA


Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.
Cromatografia Gasosa
Detectores
DCT DCE DNP

UNIVERSAIS: SELETIVOS: ESPECÍFICOS:


Geram sinal para Detectam apenas Detectam
qualquer substâncias substâncias que
substância eluída. com determinada possuam
propriedade determinado
físico-química. elemento
ou grupo funcional
em suas
estruturas
Cromatografia Gasosa
Detectores - Funcionamento
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU
TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste.

DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):


Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de
H2 + ar.

DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):


Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por
eluatos altamente eletrofílicos.

DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação


do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por
uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de
moléculas com N e P.
Cromatografia Gasosa
Detectores – Limites de detecção
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU
TCD): Universal. Observa-se para qualquer substância eluída.
Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de mg (104).
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):
Quase-universal. Detecta qualquer substância que contenha
ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4
(X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3.
Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108).
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos
conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01
a 1 pg com linearidade até ng. (104)
DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico.
Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg
(P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105)
Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos
detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o
espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância
eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa.
É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de
determinada razão m/z.
Detecção

TIC
Universal
Similar a DCT

SIM
Seletivo
Maior Sensibilidade
Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.

Cromatograma de íons totais:


TIM ou TIC

CONTAGENS
Em cada posição do
cromatograma tem-se
um espectro de massa.
MASSA / CARGA
CONTAGENS

TEMPO
Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.

Cromatograma de íons
selecionados: SIM

CONTAGENS
Em cada posição do
cromatograma tem-se
o sinal somente da m/z
selecionada. MASSA / CARGA
Oferece a vantagem
CONTAGENS

de registrar
somente o sinal do
constituinte de
interesse, sendo
“cego” para os
demais. TEMPO
Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.

Câmara
de Ionização
CG EM Coluna
Capilar

Vácuo

Separador Molecular
O gás de arraste leve Interface Capilar Direta
(He) difunde mais Com colunas capilares a
rapidamente que o analito vazão baixa de gás de
e tende a ser drenado arraste pode ser drenada
para o vácuo. pelo sistema de vácuo.
Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:

tR = Tempo de Retenção (tempo


tR decorrido entre a injeção e o ápice
do pico cromatográfico)
tR’ = tR - tM
tM = Tempo de Retenção do
Composto Não-Retido (tempo
SINAL

mínimo para um composto que não


tM interaja com a FE atravesse a
coluna)

tR’ = Tempo de Retenção Ajustado


(tempo médio que as moléculas do
TEMPO
analito passam sorvidas na FE)
Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm
Detector FID: 250 ºC
Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC
Volume injetado: 1 mL
Como se explica esta
Mistura de benzeno, n-propanona,
n-propanol, n-butanol, isobutanol e
ordem de eluição?
n-pentanol.
1. A n-propanona elui primeiro
devido à sua maior volatilidade.
2. O benzeno em segundo devido
sua natureza apolar (menor e).
3. Para os demais compostos,
cujas diferenças de polaridade
não são elevadas, a volatilidade
se torna o principal parâmetro
que define a ordem de eluição.
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é:

• Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois


a banda necessita ser perfeitamente simétrica.
• Área da banda cromatográfica.
SINAL

Área Altura

TEMPO
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa

Área
amostra

Concentração

tempo
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa

A partir de certo
ponto o sinal não
ÁREA

aumenta mais
linearmente

MASSA
1,05 S

O fim da zona de linearidade pode ÁREA / MASSA


ser detectado quando a razão
(Área / Massa) diverge em mais de
5 % da inclinação da reta na 0,95 S
região linear:
MASSA
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa

concentração
na amostra

Área
amostra

Concentração Adicionada

tempo
Cromatografia Líquida
Cromatografia em fase líquida
Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidade

Quais misturas podem ser


separadas por CLAE ?
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido
ela deve dissolver-se nesse líquido.

Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar


de 32 até 4000000.
DE FORMA GERAL:
CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de
volatilidade ou de estabilidade térmica.
Cromatografia Líquida
Aumento de polaridade

Insolúvel em água Solúvel em água


Apolar Iônico
Polar não iônico
Tipos e Partição
102
Aplicações da Partição
Adsorção em fase
Partição Troca
Cromatografia 103 reversa
em fase
normal
iônica
Massa molecular

Líquida
104

Permeação Filtração
em gel Exclusão em gel
105

106
Cromatografia Líquida
Componentes típicos - CLAE
Cromatografia Líquida
Esquema de um equipamento para CLAE
Cromatografia Líquida
Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 – Geração de pressões até 6.000 psi
2 – Saída com ausência de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min
4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de
0,5% ou melhor
5 – Componentes resistentes à corrosão

Bomba recíproca (também são chamadas de


bombas de pistão ou de diafragma)
Cromatografia Líquida
Sistemas de injeção de amostras

Suportam pressões de até 7.000 psi


Volumes típicos: 5 a 500 mL
Microamostragem: 0,5 a 5 mL
Cromatografia Líquida
Fase móvel para CLAE
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a
polaridade requerida na separação.
• Eluição isocrática:
• Quando a separação é feita utilizando um único solvente de
composição constante.

• Eluição com gradiente:


• São utilizados dois ou três sistemas de solventes que
diferem bastante entre si em polaridade.
• Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é
variada de modo programado, de forma contínua ou em
passos.
A eluição com gradiente produz efeitos similares aos
produzidos pela programação de temperatura na CG.
Cromatografia Líquida
Eluição com gradiente Coluna C18, 5 mm, fase reversa
Detector fluorescência:
excit. 334 nm – emis. 425 nm
Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE
As colunas geralmente são
construídas de aço inox, embora
tubos de vidro com paredes
resistentes sejam encontrados
ocasionalmente. No entanto, estes
últimos são restritos a pressões
mais baixas do que 600 psi.

Existem comercialmente centenas de colunas


empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase
estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE
•Remoção de material particulado
•Contaminantes do solvente
Pré-coluna
•Contaminantes da amostra
•Saturar a FM com a FE

Aumenta a vida útil da coluna


COLUNAS TÍPICAS
•Material: aço inox
•Comprimento: 10 a 30 cm
•Diâmetro: 4 a 10 mm
•FE: Partículas de 5 a 10 mm
•Eficiência: 40 mil a 60 mil
pratos/metro
Cromatografia Líquida
Separação isocrática de alta velocidade
Coluna de alta - 4 cm de comprimento
velocidade e - 0,4 cm d.i.
100.000 pratos/metro
alta eficiência - FE: spherisorb 3 mm

FM: 4,1% EtAc em n-Hexano

1– p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato
Cromatografia Líquida
Fase estacionária para CLAE
Basicamente são dois tipos de FE:
• Pelicular:
• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso,
esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 mm,
recoberto com uma camada fina e porosa de:
• Sílica
• Alumina
• Resina de poliestireno-divinil-benzeno
• Resina trocadora de íons
• Partícula porosa:
• Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3
a 10 mm. As partículas são constituídas dos mesmos
materiais do recobrimento pelicular.
Cromatografia Líquida
Detectores
As características desejáveis para os detectores
para CLAE não são diferentes daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores:
• Propriedades universais (índice de refração, densidade ou
constante dielétrica).
• Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).

Características ideais:
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de
grandeza.
4.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
6.Similaridade de resposta para todos os solutos.
7.Não destrutivo.
8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
Cromatografia Líquida
Detectores
• Absorbância
• UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105
• IV

• Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/mL – FL: 103


• Índice de refração (universal) –
S: 10-7 g/mL – FL: 104
Cromatografia Líquida
Detectores
• Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente.
Embora não sejam tão explorados quanto os detectores
ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta
sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
• Amperométricos
• Coulométricos
• Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104
• Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106
Cromatografia Líquida
Detectores
• Espectrometria de massa - universal
• Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa
potencializa a técnica de separação e quantificação
• Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente
grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.

Interface CL-EM
Cromatografia Líquida
Detectores
• Espectrometria de massa
TIC
SIM
CONTAGENS

CONTAGENS
MASSA / CARGA
CONTAGENS

CONTAGENS MASSA / CARGA

TEMPO

TEMPO
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE

Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como


um gás ideal e não contribui para o processo de
separação, a FM líquida da CLAE interage tanto
quanto a FE com os componentes da amostra.

Isto torna o desenvolvimento dos métodos em


CLAE um tanto mais complexo que na CG.
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre
elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do
suporte do empacotamento  Adsorção e ligação química.
Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase
reversa.
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água)
FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro por ser o
mais solúvel na fase móvel.
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)
FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila)
O componente mais polar aparece primeiro e o aumento
da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase
reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses
recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
Campo Misturas típicas
Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides,
analgésicos
Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios

Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes,


aflatoxinas, aditivos
Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes,
propelentes, corantes industriais
Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas
policloradas)
Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue,
narcóticos
Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas,
extratos de urina, estrógenos
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma
clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu
adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de
HPLC.
• TROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com capacidade
de troca iônica.
• EXCLUSÃO: líquido-gel. FE gel. Um material polimérico,
hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas,
são capazes de promover a separação de acordo com os
tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o
material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a
cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS.
Cromatografia

Para refletir e responder:


Duas substâncias diferentes com a mesma concentração
apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas?
Para um mesmo analito, a área ou altura aumentam
com o aumento da concentração. A área sob a banda
cromatográfica de duas substâncias diferentes
dependerá da resposta do detector para aquele tipo
de substância, independentemente do tipo de
detector utilizado.
Cromatografia

Para refletir e responder:


A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de
analito?

A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os


casos em que isto ocorre?
FIM