Actualización en Inmunohematología

Fundación Hemocentro Buenos Aires

Noviembre 2011

01/11/2011
Dr. Silvio Rosell
 El estudio de los antígenos y anticuerpos
presentes en la sangre, tanto en
condiciones normales como patológicas
 Es el estudio de los marcadores antigénicos
propios de los glóbulos rojos, plaquetas y
leucocitos, como así también de las respuestas
inmunológicas que estos provocan
 Sólo los antígenos de los sistemas RH, KELL
MNS y LW, son específicos de la línea
eritroide

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
  La aglutinación es la agregación,
mediada por anticuerpos, de las
partículas que expresan antígenos
de superficie.
 Tiene dos etapas
1. Sensibilización
2. Formación de puentes entre las
células sensibilizadas.

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 La hemólisis es la destrucción de los glóbulos
rojos, con liberación de la hemoglobina
intracelular
 La hemólisis no ocurre si los antígenos interactúan
con los anticuerpos en sueros sin complemento o
plasma con anticoagulante
 La hemólisis constituye un resultado positivo

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Algunos antígenos de grupo sanguíneo están
presentes en formas solubles en saliva, orina y
plasma
 Estas sustancias pueden utilizarse para inhibir la
reactividad de los anticuerpos correspondientes
 La inhibición también permite neutralizar
anticuerpos que enmascaran la presencia de otros
no neutralizables

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  El grado de ionización de
las moléculas
 Depende
fundamentalmente del pH
del medio
 Constante de equilibrio
(afinidad de los
anticuerpos)
 Deriva de las tasas relativas
de asociación y disociación

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 La inhibición de la aglutinación por exceso de
anticuerpos es sumamente infrecuente

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 La centrifugación promueve el acercamiento
físico de las células
 La prueba antiglobulínica indirecta emplea
suero antiglobulínico
 Otros métodos actúan:
 reduciendo la carga negativa de las moléculas
superficiales
 disminuyendo la capa de hidratación que rodea a las
células
 introduciendo macro moléculas con carga positiva
que las agregan

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  Albúmina Humana
 LISS (Low ionic saline solution)
 PEG (Polietilenglicol)
 POLYBRENE (BHDM)
 Técnicas con enzimas proteolíticas

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 Disminuye el potencial Z, favoreciendo la 2º fase
de la aglutinación.
 En concentraciones de 30% o >favorece la
aparición de rouleaux
 En la PCI no aumenta la sensibilidad de la prueba
 Por falta de ventajas objetivas está en desuso

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  Ante estos polímeros los GR normales exhiben
agregación espontánea, que puede dispersarse con
sales neutras como el citrato de sodio

 El BHDM es un polícatión de amonio cuaternario

que neutraliza las cargas negativas de los GR.

 Favorecen la aglutinación por Ig G

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 El Polybrene se añade a los GR incubados con
anticuerpos a baja potencia iónica y bajo pH
 Si se adiciona citrato de sodio, se restablece la
carga del GR
 Si el aglutinado se disocia
 prueba negativa
 Si el aglutinado persiste
 prueba positiva (aglutinación irreversible a los GR
sensibilizados con Acs)
 Tiene sensibilidad disminuida en la detección de
anticuerpos del sistema Kell
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  El PEG es un polímero lineal hidrosoluble que se
usa como aditivo para incrementar la captación de
anticuerpos
 Su acción principal es eliminar el agua
intercelular favoreciendo el acercamiento de los
GR
 No debe centrifugarse el PEG con el suero y GR
 Se lavan las células con solución salina y luego se
efectúa la prueba antiglobulínica

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 El reactivo AGH de elección en las
pruebas con PEG suele ser el anti-IgG
 evita las reacciones falsas positivas con
algunos agentes poliespecdGicos
 Precipitados podrían interpretarse como
reacciones positivas
 Potencia mucho la captación eritrocitaria de
anticuerpos en la fase I de la aglutinación
 La cantidad de iones +/- del LISS (0,03 M) es menor al
de la SF (0.17M)
 En la actualidad la mayoría de los profesionales
usa diluyentes o aditivos LISS
 Contiene macromoléculas además de sales iónicas
y amortiguadores

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  Puede aumentar hasta 1000 veces la afinidad
entre Ags y Acs
 El aumento del volumen de suero acrecienta la
potencia iónica del sistema LISS – aditivo
 Se deben respetar estrictamente las
instrucciones del fabricante

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 Ventajas:
 Aumenta la sensibilidad
de la PCI para detectar
Acs clínicamente
significativos
 Detecta Acs en baja
concentración y los de
baja afinidad que
pueden perderse con los
lavados
 Reduce el tiempo de
incubación
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 Desventajas:
 Debe ser sometido a
estricto control de
osmolaridad para evitar la
fijación inespecífica de C
 Los GR suspendidos el
LISS deben ser procesados
dentro de las 24 hs
 Menor sensibilidad para
anti-K. (1º fase de
aglutinación)
 Bromelina, ficina, papaína y tripsina
 (Las más usadas)
 Desnaturalizan ciertos antígenos eritrocitarios, en
especial M, N, S, Fya y Fyb, XG
 Disminuyen la carga superficial de los GR por
clivaje de las moléculas de ácido siálico de las
cadenas polisacáridas
 El tratamiento enzimático lleva a la formación de
espículas en los GR y aumenta así el número
potencial de puntos de contacto

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 Adherencia eritrocitaria
en fase sólida
(Microplacas)
 Aglutinación en columna,
pruebas en gel y
separación por afinidad
 Qimioluminiscencia
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 Pruebas Inmunoabsorbentes
ligadas a las enzimas (ELISA)
 Inmunofluorescencia
 Inmovilización de Antígenos
Eritrocitarios con Anticuerpos
Monoclonales Específicos
(IAEAM)
 Radioinmunoensayo
Dr. Silvio Rosell
 Las reacciones se producen en
microcolumnas que contienen
mezclas de cuentas de vidrio
o gel, amortiguadores y a
veces reactivos
 Se establecen barreras de
densidad permiten separar el
suero problema de los
eritrocitos
 Una de sus ventajas es que se
evita el lavado con solución
salina
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 Existen métodos manuales, semiautomatizados y
automatizados
 Utilizan antígenos o anticuerpos inmovilizados
 En la prueba indirecta si las células indicadoras se
adhieren a las paredes de la cubeta, la reacción es
positiva
 Si sedimentan no se produjo reacción Ag-Ac

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 Determinación de la clase de inmunoglobulina de
los Acs
 Identificación de las especificidades en mezclas de
Acs, IgM e IgG (desenmascarar)
 Determinación del monto relativo de IgG e IgM en
una especificidad dada
 Disociación de aglutinatos eritrocitarios por IgM
(crioglobulinas)

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 Destrucción de antígenos eritrocitarios
seleccionados para investigación de Acs
 (Kell, Dombrock, Cartwright, Gerbich y LW)
 Combinación con enzimas proteolíticas, para
disociar los Acs IgG de GR (ZZAP)
 DTT + Papaína activada con cisteína
 La cisteína forma puentes disulfuro que contribuyen al
plegamiento de las proteínas

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Principios
 El tratamiento de los Acs IgM, anula las
actividades aglutinante y fijadora de
complemento
 La visualización de la actividad de los Acs antes y
después del tratamiento con sulfhidrilos es útil
para determinar la clase de inmunoglobulina
 El tratamiento con sulfhidrilos también se emplea
para abolir la actividad de los anticuerpos IgM y
permitir la detección de IgG coexistentes

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

Preparación
 Diluir 0,154 g de DTT en 100 ml de PBS a pH 7,3
Conservación
 2 a 6 ºC
 Los reactivos sulfhidrilos en baja concentración
debilitarían los Ag del sistema Kell
 Pudiera observarse gelificación de la muestra
Causas
 Preparación incorrecta del DTT o concentración superior a
0,01 M.
 Incubación de suero y DTT prolongada
 Las muestras gelificadas no pueden estudiarse

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 Para los procedimientos de adsorción no existe
un procedimiento único ideal
 Para incrementar la captación de anticuerpos
puede aumentarse la proporción de antígenos
utilizando un volumen celular mayor
 La temperatura de incubación debe ser la de
reactividad óptima de los anticuerpos

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  Las pruebas de adsorción requieren un
volumen importante de GR
 Los eritrocitos testigos de los paneles
comerciales resultan insuficientes
 las fuentes mas convenientes pueden ser unidades
donadas o muestras de sangre del personal de los
fenotipos deseados

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 Las técnicas de elución liberan las moléculas de
Acs de los GR sensibilizados
 Los Acs fijados pueden liberarse:
 por modificación de la termodinámica de las reacciones
Ag-Ac
 neutralización o reversión de las fuerzas de atracción
que mantienen unidos a los complejos
 alteración de la concordancia estructural entre los Ag y
los puntos de fijación en las moléculas de Acs

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

Las técnicas de elución pueden servir para:
 Investigar una PAD positiva
 Concentrar y purificar Acs, detectar Ag de expresión
débil e identificar especificidades múltiples (junto a
adsorción)
 Preparar GR sin Acs para fenotipificación o estudios de
adsorción autólogos.

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

  Si el eluato reacciona con todas las células
 Alta probabilidad de que se deba a autoanticuerpos
 Si el paciente no fue transfundido en fecha
reciente y no existen Acs séricos inesperados no
se requieren estudios serológicos adicionales

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  Calor (56ºC)
 Calor suave (45ºC)
 Congelación-descongelación
 Frío-ácido
 Digitonina-ácido
 Diclorometano (DCM)
 Glicina-HCl / EDTA
 CLOROFORMO
 XILENO
 ETER

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 Ventajas Desventajas

 Adecuado para EHRN  Recuperación escasa

por incompatibilidad de otros auto y
ABO aloanticuerpos de
 Rápido y fácil grupo sanguíneo

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Ventajas Desventajas
 Adecuado para EHRN  Recuperación escasa
por incompatibilidad de otros auto y
ABO aloanticuerpos de
 Rápido y fácil grupo sanguíneo
 Requiere un volumen
celular reducido

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Ventajas
 Rápido y fácil
 Sensibilidad
comparable a
digitonina-ácido
Desventajas
 Menos sensible para
auto y aloanticuerpos
reactivos en caliente

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Ventajas Desventajas
 Adecuado para anti-K  Tóxico
 No inflamable  Recuperación escasa
de anti-Fyb

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Ventajas Desventajas
 Método de acción  Sustancia reconocida
rápida como carcinogénica
 Líquido no inflamable  Altamente tóxico
 Recuperación de la  Efecto narcótico
mayoría de los inhalatorio
anticuerpos
significativos

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Ventajas
 Buena recuperación
de la mayoría de los
Acs significativos
Desventajas
 Carcinogénico
 Tóxico
 Narcótico
 Provoca hemólisis

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Ventajas
 Excelente
recuperación de la
mayoría de los Acs de
grupo sanguíneos
Desventajas
 Narcótico
 Tóxico
 Explosivo
 Muy inflamable
 Poca recuperación de
anti-S-s

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Ventajas Desventajas
 No peligroso  El lavado del estroma
 Recuperación es lento
adecuada de la  Baja sensibilidad
mayoría de los Acs sistema Kidd
significativos
 Kit comercial

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Ventajas Desventajas
 Apropiado para preparar  Desnaturaliza los
eluatos y obtener células Ag del sistema Kell
PAD negativas
 No destruye las células
tratadas
 Sensibilidad comparable a
digitonina-ácido

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

  Los GR con PAD positiva no pueden tipificarse
con reactivos que requieran una técnica de
AGH
 En condiciones controladas, el difosfato de
cloroquina disocia la IgG de la membrana de
los GR sin afectar su integridad.
 Esto permite la fenotipificación completa de los
GR recubiertos con autoanticuerpos reactivos
en caliente

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

  Solución de difosfato de cloroquina
 preparada disolviendo 20 g en 100 ml de SF
 Ajustar el pH a 5,1 con OH-Na 1 N

 Conservación
 2 a 6º C

 Se necesitan GR de control portadores de una

dosis simple de los antígenos a fenotipificar
 Se utiliza reactivo anti-IgG monoespecífico

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

  No disocia el complemento de la membrana
celular
 Incubación no > de 2 hs.
 causa hemólisis y/o pérdida de reactividad antigénica
 Los Ag del sistema Rh podrían experimentar
cierta desnaturalización.
 Pudieran no eliminarse por completo los Acs de
los GR sensibilizados
 sólo atenuar la intensidad de la PAD
 La cloroquina atenúa la expresión de Ag HLA
de Clase I eritrocitarios

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Principios
 Es un método semicuantitativo que se emplea
para determinar la concentración de Acs en
muestras de suero o comparar la intensidad de
la expresión antigénica en distintas muestras de
GR

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

Aplicaciones
 Estimar actividad de Acs en embarazadas
alosensibilizadas
 Definir la especificidad relativa de los
autoanticuerpos
 Caracterizar Acs de título alto baja avidez (TABA)
 Ejemplo
 Knops y Chido-Rodgers, Csa y JMH
 Observar el efecto de los reactivos sulfhidrilo sobre
el comportamiento de los Acs (IgG o IgM)
 Monitoreo de IgG en embarazadas

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

Interpretación
 Observar la mayor dilución que produce
aglutinación 1+
 El título es la inversa de la dilución

 Si se advierte aglutinación en el tubo que contiene

el suero mas diluido no se alcanzó el punto final
 En los estudios comparativos la diferencia
significativa en los títulos es de 3 diluciones
 Los títulos solos sin la evaluación adicional de la
intensidad de la aglutinación pueden ser
engañosos

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Por ser un método semicuantitavo la variabilidad
técnica puede desviar los resultados

Score de Mars
 Asignar un valor numérico a la intensidad de la
aglutinación
 4 + = 12
 3 + = 10
 2+= 8
 1+= 5
 La suma correspondiente a todos los tubos representa el
score
 El umbral significativo arbitrario para comparar los
puntajes es de 10 ó más

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Claves Técnicas
 Calidad de las pipetas y su utilización
 Respetar tiempo y temperatura de incubación
 Duración y potencia de centrifugación
 La antigüedad, el fenotipo y la concentración de las
células influyen en los resultados
 Es casi imposible lograr resultados reproducibles
en su totalidad
 Las comparaciones son válidas con análisis
simultáneos
 Se disminuye la variabilidad con la utilización de
mayores volúmenes
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 Nomenclatura

SISTEMA GENES ANTIGENOS FENOTIPOS

MNS MNSs MNSs M+ N+ S-s+

Duffy FYa FYb Fy a y Fy b Fy (a+b-)Fy (a+b+)Fy (a-b+)Fy (a-b-)

Kell K k Kpa Jsa K k Kpa Jsa K+k+ Kp(a+b-) Js (a+b-)

Kidd Jka Jkb Jka Jkb Jk (a+b+)

Referentes históricos:
Issit, Daniels, Garratty, Pineda

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

Hibridomas
 La fusión de células
plasmáticas normales,
productoras de anticuerpos,
con células plasmáticas
neoplásicas permite obtener
líneas celulares con capacidad
reproductiva infinita.

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

  Una célula B estimulada da origen a una
progenie clonal que produce Acs específicos
para un epítopo
 El sobrenadante del cultivo de un clon de células
B contiene Acs de especificidad única
 Los eventos posteriores a la activación pueden inducir
diferencias en el isotipo de las cadenas pesadas
 la especificidad idiotípica codificada en las regiones
variables de las cadenas pesadas y livianas no se
modifica

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Siempre comenzar por verificar la existencia de
antecedentes transfusionales recientes

Puede tratarse de:

 Autoanticuerpos reactivos en frío
 Autoanticuerpos reactivos en caliente

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

  Si no hay clínica ni
laboratorio de
 Macroscópica hemólisis no se
 BI justifican estudios
 Haptoglobina adicionales
 LDH
 Hemoglobina libre en
plasma y orina

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
 La reactividad de la mayoría de los
autoanticuerpos reactivos en caliente aumenta
con el uso de PEG y enzimas
 Es conveniente realizar la DAI sin los medios
potenciadores habituales
 Si los resultados son negativos puede emplearse
el mismo procedimiento para la prueba de
compatibilidad sin necesidad de adsorciones

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

 Si el autocontrol es positivo en la fase AGH, podría
haber células recubiertas con Acs que determinan
una PAD positiva con campo mixto
 La elución podría ser útil en especial cuando las pruebas
séricas no son concluyentes
 En el paciente con PAD positiva transfundido en
fecha reciente o no, podría ser difícil obtener el
fenotipo exacto de los GR
 Muchos reactivos monoclonales pueden proporcionar
resultados válidos a pesar de la PAD positiva

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

  En nuestro país, además de los
laboratorios de investigación y los que
realizan pruebas de compatibilidad para
transplantes de médula ósea y órganos
sólidos, los bancos de sangre están
realizando en forma rutinaria pruebas de
biología molecular con amplificación de
ácidos nucleicos

01/11/2011 Dr. Silvio R. Rosell

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
 Sistemas antigénicos eritrocitarios

A, B, AB, A1
4
6
5
72
13
46

2
1

7
6 12p12.3
3
7
9 6p21.3

9
1
59

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

01/11/2011 Dr. Silvio R. Rosell
En la PCR se separan las cadenas de la
doble hélice del ADN mediante
desnaturalización térmica

Thermophilus aquaticus, es una bacteria termófila

que vive en la proximidad de las fuentes de agua
Taq DNA Polimerasa caliente
Vive a temperaturas comprendidas entre 50 y 80 °C,
debido a que su cóctel enzimático resiste tales
condiciones
Normalmente, a esas temperaturas, las proteínas
constitutivas de la mayoría de los seres vivos se
desnaturalizan y no vuelven a ser funcionales
 Una enzima de restricción (o endonucleasas de
restricción) es aquella que puede reconocer
una secuencia característica de nucleótidos
dentro de una molécula de ADN y cortar el
ADN en ese punto
 El mecanismo de corte de DNA se realiza a través de
la ruptura de dos enlaces fosfodiéster en la doble
hebra
 Un fluorocromo, es un componente de una
molécula que hace que ésta sea fluorescente
 Un grupo funcional de la molécula absorberá energía
de una longitud de onda específica y la volverá a
emitir en otra determinada de mayor longitud de onda
 La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó
ARN) es un proceso por el cual se combinan
dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas
y con secuencia de bases complementarias
 Se requieren oligonucleótidos alelo esoecíficos
complementarios a la secuencia a analizar
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
 Gracias por vuestra amable atención

medicinatransfusional@hotmail.com

01/11/2011 Dr. Silvio Rosell