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Preparação e propriedades de soluções tampão

Faculdade de Ciências – Universidade de Lisboa


Licenciatura em Bioquímica – Bioquímica I

Data: 01.03.2013 Alunos: Diogo Santos nº 44205


Turma: 5 Tiago Rebelo nº 43238
Grupo Nº: 3

1. Resumo

Com esta actividade experimental, pretendeu-se preparar várias soluções tampão de


fosfatos mediante diferentes métodos, e verificar a dependência da capacidade das soluções
tampão com o seu valor de pH, molaridade e temperatura.
Numa primeira fase, procedeu-se à preparação de soluções tampão de fosfatos com
diferentes valores de pH, e estudou-se o efeito do pH na capacidade das soluções tampão,
com a adição de 0,1mL de HCl 0,1M. Numa segunda abordagem prepararam-se soluções
tampão de fosfatos segundo dois métodos, um deles em que toda a molaridade provinha do
ácido, e noutro em que esta provinha da base. De seguida estudou-se o efeito da
molaridade, preparando para isso soluções tampão com o mesmo pH e diferentes
molaridades, adicionando 0,1mL de HCL 0,5M. Por fim, procedeu-se ao estudo do efeito da
temperatura sobre o pH de uma solução tampão, nomeadamente nos tampões de fosfatos
(pH 7,2) 0,1M e de Tris-HCl (pH 8,2) 0,1M.
Em todos as relações estudadas obtiveram-se resultados concordantes com os
esperados. Assim, comprovou-se que uma solução tampão é tanto mais eficiente quanto
mais perto estiver o seu valor de pH do valor de pKa respectivo e quanto maior for a sua
molaridade. Concluiu-se também que, o aumento da temperatura de uma solução tampão
faz com que o seu pH diminua.
2. Apresentação, Tratamento e Discussão de Resultados

2.1. Estudo da influência do pH na capacidade de uma solução tampão

- Exemplificação do cálculo das concentrações do ácido e da sua base conjugada

[𝐻𝑃𝑂4 2− ] [𝐻𝑃𝑂4 2− ]
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log [𝐻 − 5,9 = 6,89 + log [𝐻 −
{ 2 𝑃𝑂4 ]  { 2 𝑃𝑂4 ] 
[𝐻𝑃𝑂4 2− ] + [𝐻2 𝑃𝑂4 ] = 0,1 𝑀

[𝐻𝑃𝑂4 2− ] + [𝐻2 𝑃𝑂4 ] = 0,1 𝑀

0,1− [𝐻2 𝑃𝑂4 − ] 0,1− [𝐻2 𝑃𝑂4 − ]


−0,99 = log [𝐻2 𝑃𝑂4 − ]
0,1023 = [𝐻2 𝑃𝑂4 − ]
{  { 
[𝐻𝑃𝑂4 2− ] = 0,1 − [𝐻2 𝑃𝑂4 − ] [𝐻𝑃𝑂4 2− ] = 0,1 − [𝐻2 𝑃𝑂4 − ]

[𝐻2 𝑃𝑂4 − ] = 0,091 𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑚−3


{
[𝐻𝑃𝑂4 2− ] = 0,009 𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑚−3

- Exemplificação do cálculo das fracções molares

0,091
%(𝐻2 𝑃𝑂4 − ) = × 100 = 91 %
0,1

0,009
%(𝐻𝑃𝑂4 2− ) = 0,1
× 100 = 9 %

- Exemplificação do cálculo dos volumes

𝑛 𝑛
[𝐻2 𝑃𝑂4 − ] =  0,091 =  𝑛 = 9,1 × 10−4 𝑚𝑜𝑙
𝑉 0,01

9,1×10−4
𝑉= 0,1
= 9,1 × 10−3 𝑑𝑚3 ≈ 9,1 𝑚𝑙

𝑛 𝑛
[𝐻𝑃𝑂4 2− ] = 𝑉
 9 × 10−3 = 0,01  𝑛 = 9 × 10−5 𝑚𝑜𝑙

9×10−5
𝑉= = 9 × 10−4 𝑑𝑚3 ≈ 0,9 𝑚𝑙
0,1

- Exemplificação do cálculo do pHic

[𝐻𝑃𝑂4 2− ] 0,009
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log [𝐻 −  𝑝𝐻 = 6,89 + log  𝑝𝐻 = 6,89 − 1 
2 𝑃𝑂4 ] 0,09

𝑝𝐻 = 5,89
- Exemplificação do cálculo do pHfc (Após adição de HCl)

[HCl] = 0,5 M

V = 0,1 ml ≈ 1,0 x 10-4 dm3

Vtotal = 10 ml ≈ 0,01 dm3

𝑛 𝑛
[𝐻𝐶𝑙] =
𝑉
 0,5 = 1,0×10−4
 𝑛 = 5,0 × 10−5 𝑚𝑜𝑙

𝑛 5,0×10−5
[𝐻𝐶𝑙] =
𝑉
 [𝐻𝐶𝑙] = 0,01
 [𝐻𝐶𝑙] = 5,0 × 10−3 𝑀

H2PO4- ↽
⃑⃑⃑ HPO42- + H+

Inicio: 9,07x10-2 9,3x10-3

Final de Reacção: 9,07x10-2 + 5,0x10-3 9,3x10-3 – 5,0x10-3

[𝐻𝑃𝑂4 2− ] 9,3×10−3 −5,0×10−3


𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log  𝑝𝐻 = 6,89 + log 
[𝐻2 𝑃𝑂4 − ] 9,07×10−2 +5,0×10−3

𝑝𝐻 = 5,54

Para os restantes valores de pH dados, o raciocínio foi idêntico, apresentando-se todos


os valores calculados no Quadro 1. Além disso, no Quadro 1 estão presentes também os
valores obtidos experimentalmente.

Quadro 1. Estudo do efeito do pH na capacidade de uma solução tampão

Fracção Fracção Volume Volume


Molar Molar KH2PO4 K2HPO4
pH pHic pHiexp pHfc pHfexp ΔpHc ΔpHexp
H2PO4- HPO42- 0,1M 0,1M
(%) (%) (ml) (ml)
5,9 91 9 9,1 0,9 5,89 5,81 5,54 5,31 0,36 0,5
6,3 79,6 20,4 8,0 2,0 6,3 6,31 6,19 6,16 0,11 0,15
6,7 60,8 39,2 6,1 3,9 6,7 6,64 6,60 6,55 0,1 0,09
6,9 49,4 50,6 4,9 5,1 6,9 6,86 6,83 6,77 0,07 0,09
7,1 38,1 61,9 3,8 6,2 7,1 7,08 7,01 7,01 0,09 0,07
7,5 19,7 80,3 2,0 8,0 7,5 7,50 7,39 7,38 0,11 0,12
7,9 8,9 91,1 0,9 9,1 7,9 7,91 7,68 7,71 0,22 0,20
7.9
7.7
7.5
7.3
7.1
pH

6.9
pHic
6.7
pHiexp
6.5
6.3
6.1
5.9
0 20 40 60 80 100
Fracção molar de HPO42-

Figura 1. Representação de pHic versus Fracção de HPO42- e pHiexp versus Fracção de HPO42-

No gráfico não se observam desvios significativos, aspecto que demonstra que as


medições efectuadas foram rigorosas o suficiente para os valores de pH experimentais se
aproximarem bastante dos previstos. As pequenas diferenças deveram-se a erros mínimos
durante as medições, perda de pequenas quantidades de substâncias na realização das
soluções tampão de fosfatos e também devido a pequenas falhas de medição por parte dos
aparelhos.

Os valores de pH calculados e obtidos experimentalmente, após a adição de HCl


(exemplificação dos cálculos já demonstrada anteriormente), estão presentes no Quadro 2.

Quadro 2. Comparação dos valores de pHf

pHfc pHfexp ΔpHf

5,54 5,31 0,23


6,19 6,16 0,03
6,60 6,55 0,05
6,83 6,77 0,06
7,01 7,01 0,00
7,39 7,38 0,01
7,68 7,71 0,03
Ao observar-se o Quadro 2, verificou-se que a diferença entre o pH final calculado e o
pH final experimental foi mínima, havendo apenas discrepância num deles (0,23). Essas
diferenças, novamente, podem dever-se a erros experimentais nesta etapa ou ainda
aquando da preparação das soluções anteriores.

0.6

0.5

0.4
ΔpH

0.3
ΔpHexp
ΔpHc
0.2

0.1

0
5.9 6.1 6.3 6.5 6.7 6.9 7.1 7.3 7.5 7.7 7.9
pHic

Figura 2. Variação do pHexp e pHc em função do pHi

Quer na curva da variação do pH experimental, quer na curva da variação do pH


calculado, está patente que é com um tampão de fosfatos a pH 6,9 que a variação de pH é
menor. Uma solução tampão é caracterizada por ter um valor de pH que diste menos de
uma unidade do valor de pKa para a espécie considerada. Assim sendo, dentro desses
valores, quanto mais afastado estiver o pH da solução tampão, do valor de pKa, menor a
capacidade do tampão, e, consequentemente, maior será a variação de pH.
Convém registar que aquando da medição do pH das soluções tampão terão ocorrido
algumas perdas de solução, embora sendo em quantidades quase insignificantes, tal como
possíveis alterações do pH após a adição do ácido clorídrico.
2.2. Preparação de uma solução tampão de fosfatos por diferentes métodos

pH = 7,2

[HPO42-] = 0,3 M

[Tampão] = 0,15 M

[HCl] = 1 M

Vtotal = 100 ml ≈ 0,1 dm3

[𝐻𝑃𝑂4 2− ] 0,1−[𝐻2 𝑃𝑂4 − ]


7,2 = 6,89 + log 0,31 = log [𝐻2 𝑃𝑂4 − ]
{ [𝐻2 𝑃𝑂4 − ]  { 
[𝐻𝑃𝑂4 2− ] = 0,15 − [𝐻2 𝑃𝑂4 − ] [𝐻𝑃𝑂4 2− ] = 0,15 − [𝐻2 𝑃𝑂4 − ]

0,15
3,0417 =
[𝐻2 𝑃𝑂4 − ]
[𝐻2 𝑃𝑂4 − ] = 0,0493 𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑚−3
{  {
[𝐻𝑃𝑂4 2− ] = 0,15 − [𝐻2 𝑃𝑂4 − ] [𝐻𝑃𝑂4 2− ] = 0,101 𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑚−3

No método 1, toda a molaridade do tampão provém do ácido daí que se tenha de


adicionar a quantidade de base (NaOH) igual [HPO42-] pretendida, sabendo já as
concentrações calculadas anteriormente.

𝑛 𝑛
[𝐻2 𝑃𝑂4 − ] =  0,15 = 0,1  𝑛 = 0,015 𝑚𝑜𝑙
𝑉

𝑛 0,015
[𝐻2 𝑃𝑂4 − ] =  0,3 =  𝑉 = 0,05 𝑑𝑚3 ≈ 50 𝑚𝑙
𝑉 𝑉

𝑛 𝑛
[𝑁𝑎𝑂𝐻] =  0,101 =  𝑛 = 0,0101 𝑚𝑜𝑙
𝑉 0,1

𝑛 0,0101
[𝑁𝑎𝑂𝐻] = 1 =  𝑉 = 1,01 × 10−2 𝑑𝑚3 ≈ 10,1 𝑚𝑙
𝑉 𝑉

Juntou-se 50 ml [KH2PO4] 0,3 M com 10,1 ml de [NaOH] 1M, adicionou-se um pouco


água e mediu-se o pH. Após aferir o valor de pH, adicionou-se água até perfazer os 100 ml
num balão volumétrico.

No método 2, o que escolhemos para preparar a solução, toda a molaridade do tampão


provém do HPO42- daí que se tenha de adicionar a quantidade de ácido (HCl) igual [H2PO4-]
pretendida, sabendo já as concentrações calculadas anteriormente.

𝑛 𝑛
[𝐻𝑃𝑂4 2− ] = 𝑉  0,15 = 0,1  𝑛 = 0,015 𝑚𝑜𝑙
𝑛 0,015
[𝐻𝑃𝑂4 2− ] = 𝑉  0,3 = 𝑉
 𝑉 = 0,05 𝑑𝑚3 ≈ 50 𝑚𝑙

𝑛 𝑛
[𝐻𝐶𝑙] =
𝑉
 0,0493 = 0,1  𝑛 = 0,00493 𝑚𝑜𝑙

𝑛 0,00493
[𝐻𝐶𝑙] =
𝑉
1= 𝑉
 𝑉 = 4,93 × 10−3 𝑑𝑚3 ≈ 4,93 𝑚𝑙

Juntou-se 50 ml [K2HPO4] 0,3 M com 4,93 ml de [HCl] 1M, adicionou-se um pouco de


água, e por fim mediu-se o pH. Como o pH medido foi 7,22, bastante próximo do pretendido
(7,2), não foi necessário aferi-lo e juntou-se água até perfazer os 100 ml num balão
volumétrico.

2.3. Estudo da influência da molaridade na capacidade de uma solução tampão

Quadro 3. Estudo do efeito da molaridade na capacidade de uma solução tampão

Solução pHiexp pHfc pHfexp ΔpHc ΔpHexp

Água Destilada 6,92 2,30 2,37 4,7 4,55

Tampão de Fosfatos (pH 7,2) 0,05M 7,15 7,02 6,92 0,18 0,23

Tampão de Fosfatos (pH 7,2) 0,1M 7,22 7,10 7,11 0,1 0,11

Tampão de Fosfatos (pH 7,2) 0,15M 7,31 7,14 7,20 0,06 0,11

Tampão de Fosfatos (pH 7,2) 0,2M 7,26 7,15 7,17 0,05 0,09

O pH inicial da água destilada foi estabilizado em 6,92. Após a adição de 0,1 ml de ácido
clorídrico, a ΔpHexp da água foi cerca de 4,6. A explicação para esta variação baseia-se no
facto de na água não estar presente uma base que possa consumir todo o ácido adicionado,
não reagindo, tal como previsto, como uma solução tampão.

0.25

0.2

0.15
ΔpH

ΔpHexp
0.1
ΔpHc

0.05

0
0.05 0.1 0.15 0.2
Molaridade da Solução Tampão (M)
Figura 3. ΔpHexp e ΔpHc versus molaridade da solução tampão.
Pela análise das curvas, na Figura 3, observou-se que ao aumento da molaridade da
solução, está associado o aumento da capacidade da solução tampão. Este facto é explicado
pelo aumento da concentração da base com o aumento da molaridade, o que faz com que a
mesma quantidade de ácido adicionado sofra uma neutralização maior com molaridades
mais elevadas, como se pode verificar com as soluções tampão de molaridade 0,05M e
0,1M, em que a ΔpH foi de 0,23 e 0,11, respectivamente.
As diferenças de valores entre ΔpHexp e ΔpHc devem-se sobretudo aos diferentes valores
de pH iniciais respectivos, originados por erros de medição, quer na preparação das
soluções, quer na adição do ácido clorídrico.

2.4. Estudo da influência da temperatura no valor de pH de uma solução tampão

Quadro 4. Estudo do efeito da temperatura no valor de pH de uma solução tampão.

Solução Tampão Condições Usadas Temperatura pHexp ΔpH / ΔT


(oC)
((⁰C)-1)

Tampão de Fosfatos (pH 1 Gelo 4 7,23


7,2) 0,1 M
2 Temperatura Ambiente 17 7,20 -3,4E-3

3 Banho Termostatizado 36 7,12

Tampão de Tris-HCl (pH 1 Gelo 4 8,41


8,2) 0,1 M
2 Temperatura Ambiente 17 8,19 -1,6E-2

3 Banho Termostatizado 36 7,90

Comparando os valores dos coeficientes térmicos obtidos, conclui-se que o tampão


de fosfatos é menos sensível à variação da temperatura do que o de Tris-HCl.

A variação do pH ocorre de modo inverso à variação da temperatura, como se pode


constatar pelo Quadro 4. A variação de pH está relacionada com a variação da entalpia (ΔH)
da reacção de ionização das substâncias tampão, sendo estas favorecidas pelo aumento da
temperatura, deslocando a reacção no sentido directo (1), diminuindo o pH, e
desfavorecidas pela sua diminuição, deslocando a reacção no sentido inverso, aumentando
o pH.

(1) [H2PO4-] ↽
⃑⃑⃑ [HPO42-] + H+
De acordo com os coeficientes térmicos tabelados para o tampão de fosfatos (-
2,8E-3) e para o tampão Tris-HCl (-2,8E-2), pode afirmar-se que seria de esperar uma
menor variação de pH no caso do tampão de fosfatos e uma maior variação de pH no
caso do Tris-HCl.

3. Questões a desenvolver

3.1. Na escolha de uma solução tampão a ser usada em experiências bioquímicas deve-
se ter em conta alguns critérios, adaptando a mesma às condições e contexto da
experiência. Assim, o pKa e o pH não devem apresentar valores muito diferentes entre si, de
modo a que o pH seja abrangido pela zona tampão; a solução deve ser preparada à
temperatura a que a experiência vai decorrer porque o pKa, e consequentemente o pH, irão
alterar-se com a temperatura; deve ter-se em conta o intuito da experiência, de maneira a
escolher a capacidade da solução tampão (por exemplo, no estudo indirecto de reacções
químicas através da variação de pH); e, por fim, o sistema tampão não deve interferir nos
processos celulares, isto é, não deve absorver radiação visível e ultravioleta e não deve
formar complexos insolúveis com catiões.

3.2. Como foi comprovado nesta actividade laboratorial, o pH de uma solução tampão é
afectado pela temperatura a que esta se encontra. As proteínas têm um intervalo de pH e
temperatura óptimos, dentro do qual esta desempenha a sua função biológica. Uma vez que
uma proteína é particularmente sensível ao valor de pH e temperatura do meio, a
preparação da solução tampão a utilizar na purificação deve ser o mais rigorosa possível e a
temperaturas baixas para evitar desvios mais acentuados no pH, em relação ao pretendido,
e provocar a inactivação ou desnaturação da proteína, de modo a obter um processo de
purificação mais rentável.

4. Bibliografia

- Quintas, A.; Halpern, M. J. & Freire, A. P. (2008) Bioquímica – Organização molecular da


vida, Lidel

- http://www.teknova.com/v/vspfiles/files/Lit/buffer%20chart_5x7.pdf (07/03/13 18h34)