Você está na página 1de 71

Compreendendo as

crueldades do Sistema Rh

ANA LÚCIA GIRELLO


CRÉDITOS A
REGINA CARDOSO
Supervisora do Lab. Imuno-hematologia do Instituto de
Hemoterapia Sirio Libanes (SP)
OBJETIVOS

•  Compreender as bases moleculares dos

antígenos Dvariantes

•  Considerações para a seleção de

reagentes anti-D

•  Discutindo procedimentos para

resolução de algumas discrepancias na

fenotipagem RhD
Importância da fenotipagem Rh(D)

•  Imunogenicidade do antígeno D

•  Correta identificação dos doadores e clientes RhD+

•  Prevenção da aloimunização de gestantes e receptores

RhD variantes

•  ...Evitar problemas!

4
SISTEMA RH
q  1939: Levine e Stetson
q Causa da “eritroblastose fetal”: Anticorpo no soro de uma
mulher que havia recebido transfusão prévia do seu
marido.

q  1940: Landsteiner e Wiener


q Produção de um anticorpo (anti-Rhesus) que reagia com
85% das hemácias humanas.

q  Os mais importantes D, C, E, c, e


q 99% dos problemas clínicos relacionados a Rh.

q  Está envolvido em DHPN e Reações transfusionais.


q É o segundo sistema mais importante (o 1° é o ABO).
SISTEMA RH - Nomenclaturas
Diferentes nomenclaturas foram propostas (Fisher-Race / Wiener)
até a atual (Tippet). Existe alguma correlação entre elas, no
entanto, mesmo não sendo a atual, os fabricantes ainda citam
Wiener nos diagramas das hemácias comerciais.

Antígenos DCE e Fatores Haplótipos DCE e os


Sanguíneos de Wiener Genes de Wiener
D Rho DCe R1
C rh´ DcE R2
E rh´´ Dce Ro
c hr´ DCE Rz
e hr´´ dce r
dCe r´
Fenótipo DCcee = R1r dcE r´´
Genótipo DCe/dce = R 1 r dCE ry
Fenótipo ddCcee = r´r
Genótipo dCe/dce = r´r
SISTEMA RH - Nomenclatura

•  1962: Introdução de uma terminologia numérica, sem


implicações genéticas.

•  Adotada e aceita pela Sociedade Internacional de


Transfusão Sanguínea (ISBT)

•  Ordem de acordo com a descoberta dos antígenos:


•  D: RH1; C: RH2; E: RH3; c: RH4; e: RH5.

•  P e l o m e n o s 5 4 a n t í g e n o s i n d e p e n d e n t e s .
Classificados pela nomenclatura ISBT até o número
61, no entanto, sete (Rh13, Rh14, Rh15, Rh16, Rh24,
Rh25, Rh38) tornaram-se obsoletos.
http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cell-immunogenetics-and-blood-group-terminology/blood-group-terminology/working-party-reports/
SISTEMA Rh (ISBT: 004 – RH)

001 002 003 004 005 006 007 008


D C E c e f Ce Cw
009 010 011 012 013 014 015 016
Cx V Ew G Obsoleto Obsoleto Obsoleto Obsoleto

017 018 019 020 021 022 023 024


Hro Hr hrS VS CG CE Dw Obsoleto

025 026 027 028 029 030 031 032


Obsoleto c-like cE hrH Rh29 Goa hrB Rh32
033 034 035 036 037 038 039 040
Rh33 HrB Rh35 Bea Evans Obsoleto Rh39 Tar
041 042 043 044 045 046 047 048
Rh41 Rh42 Crawford Nou Riv Sec Dav JAL
049 050 051 052 053 054 055 056
STEM FPTT MAR BARC JAHK DAK LOCR CENR
057 058 059 060 061
CEST CELO CEAG PARG CEVF
*International Society of Blood Transfusion Working Party on red cell immunogenetics and blood group
8 terminology: última publicação Cancun 2012.
SISTEMA RH - Nomenclatura

q  Em 1986, Tippett propôs uma outra teoria


alternativa:
q  dois genes codominantes, muito semelhantes (94%
homologia).

q  RHD proteína D Ags D e G


q  RHCE(alelos: RhCe, RhCE. RHcE, Rhce) proteína
CE
CE, Ce, cE, ce

q  Localização: cromossomo 1p34-p36


BASES MOLECULARES COMPLEXAS!
Genes, Proteínas, Antígenos
Modelo proposto por Flegel, 2000

GENE ANCESTRAL

Rh-positivo
P N U D D SMP1 ce, Ce, cE, CE

Rh-negativo
X Deletado X D SMP1 ce, Ce, cE, CE

RhD RhCE

COOH N COOH
N
H H
Dra Lilian 2 DiaMed , BH, 2007
2 Castilho – Sistema RH e suas complexidades – palestra Curso 10
Mais crueldades do Sistema Rh!

Não são antígenos simples

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2264/
11
Mais crueldades do Sistema Rh!

Não são antígenos simples

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2264/
12
Mais crueldades!

Não são antígenos “simples”:


•  Quem é O ANTÍGENO D?

13
PROTEÍNAS Rh
FENOTIPOS PROTEÍNAS PESO NÚMERO DE
Rh PRESENTES MOLECULAR AMINOÁCIDOS

Rh(D)+ Proteína D 32 kD 417


Normal ou variante

Proteína RHCE 34 kD 417


(normal ou variante)

(ausência da proteína - -
Rh(D)- RhD)
deleção do gene RHD ou
mutações

Proteína RHCE 34 kD 417


(normal ou variante)
Frequência D # etnia

FENOTIPOS Caucasianos Afro- Asiáticos Americanos


Rh americanos nativos

85% 92% 99% 99%


Rh(D)+

15% 8% <1% 1%
Rh(D)-

Petrides M, Stack G. Practical Guide to Transfusion Medicine. 2001:AABB.

15
q  Não!
q  Comparando a proteína RhCE com a proteína RhD,

encontramos de 34 a 37 pontos de polimorfismos,

dependendo do alelo RhCE que gerou a proteína.

q  Pelo menos 10 pontos de troca de aminoácidos estão

localizados em “loops” externos das duas proteínas,

tornando o antígeno RhD muito imunogênico.


Diferenças estruturais entre (C, c) e (E, e)

POSIÇÃO DO
AMINOÁCIDO C c E e

16 Cisteína Triptofano

60 Isoleucina Leucina

68 Serina Ac.
Aspártico

103 Serina Prolina

226 Prolina Alanina


pos 103 SER/PRO=C/c
Observe os pontos de polimorfismo na proteina RhD

pos 226 PRO/ALA =E/e 18


Fenotipagem para demais ags Rh
34-37 PONTOS DE POLIMORFISMOS
~10 NOS LOOPS EXTERNOS

RhD

pos 103 SER/PRO=C/c

ClinLab
pos 226 PRO/ALA =E/e 48(2002)53
20
RH: Proteína com papel importante na integridade da
membrana eritrocitária

- RhD x RhCE (amarelo) - D fraco (vermelho/laranja)


- C/c (verde) - D categoria(azul)
- E/e (preto)
Frequências dos antígenos C, c, E, e
(Reid, M.E. 2012)

Frequência
Antígenos

Caucasianos Negros

D 85,0% 92,0%
C 68,0% 27,0%
c 80,0% 98,0%
E 29,0% 22,0%
e 98,0% 98,0%
A expressão fenotípica do Antígeno D
Pode variar qualitativamente e quantitativamente

D parcial

D Normal D Fraco

23
Variantes de D

Vamos visualizar o que significa D normal, D fraco, D parcial


(Variante), D fraco parcial (Variante fraca).

Notem que este


esquema representa
o antígeno D com
todos os epítopos
Variantes de D:
Primeiramente vamos visualizar o que significa D normal

Este é o esquema do D normal, ou


seja, a membrana expressando
varios antígenos D (com todos os
epítopos)

Notem que este


esquema representa
o antígeno D com
todos os epítopos

Na prática Imuno-hematológica:
Reatividade 3+ a 4+ em fase Temperatura Ambiente (TA)
Variantes de D:
Agora, vamos visualizar o que significa D fraco (variante)

Este é o esquema do D fraco, ou


seja, a membrana expressando
somente alguns antígenos D
(porém, com todos os epítopos
originais)

Notem que este


esquema
representa o
antígeno D com
todos os epítopos

Na prática Imuno-hematológica:
Reatividade somente na fase de antiglobulina humana (AGH).
Variantes de D:
Agora, vamos visualizar o que significa D fraco

Será?
Leia as bulas dos regentes!
Podem reagir fracamente a
T.A. com soros monoclonais
IgM!

Na prática Imuno-hematológica:
Reatividade somente na fase de antiglobulina humana (AGH).
D Fraco
SNP’s

FENÓTIPOS D FRACOS (n~70)

28
Variantes de D: Este é o esquema do D parcial, ou
seja, a membrana expressando
varios antígenos D (com
D Parcial (Variante) AUSÊNCIA de alguns epítopos
originais)

Notem que este esquema representa o


antígeno D com todos os epítopos. A
ausência de um deles está representada em
preto (acima).

Na prática Imuno-hematológica:
Reatividade 3+ a 4+ em fase Temperatura Ambiente (TA), DEPENDENDO
DO SORO UTILIZADO.
Se o soro for dirigido ao epítopo ausente a reação será NEGATIVA.
D Parcial
rearranjos genicos ou SNP’s

FENÓTIPOS D PARCIAIS (n=80)

30
Variantes de D: Este é o esquema do D parcial,
ou seja, a membrana
E para finalizar, vamos visualizar o expressando varios antígenos
D (com AUSÊNCIA de alguns
que significa D fraco e parcial epítopos)
(Variante)

Na prática Imuno-hematológica: Reatividade somente na fase


AGH, DEPENDENDO DO SORO UTILIZADO. Se o soro for
dirigido ao epítopo ausente a reação será NEGATIVA.
Fatos!
•  Nem todo Dparcial é fraco
•  Alguns tipam como Dnormal!
•  (ex. DIII)

•  Nem todo Dfraco é parcial


•  Alguns deles só reconheceremos depois de
terem formado aloac anti-D

32
Variantes de D: É óbvio que......
Temos todos os mecanismos moleculares para explicar como
acontece tudo isso na proteína RH!!!!
D normal, D fraco, D parcial, D fraco parcial

- D fraco (vermelho/laranja)
- D categoria (azul claro/ escuro)
Variantes de D:
E qual o problema ocasionado pelo antígeno D parcial?

q A ausência de um ou mais epítopos originais nos antígenos dos


indivíduos D parciais, poderá incorrer na imunização após contato
com células D normais (contendo todos os epítopos originais).
q  Gestação
q  Transfusões de glóbulos vermelhos

q  Pode haver produção de anticorpos anti-D contra esse epítopo


alterado.

q Esse anticorpo reage contra todas as células Rh+ normais, com


exceção das raras categorias de D; também não irão reagir contra
células Rh-.
Resumindo: Variantes do antígeno D

§  D fraco (polimorfismo “quantitativo"):


§  Numerosos tipos de RhD fraco já foram determinados
molecularmente
§  Mutações no gene RhD promovem alterações nos
aminoácidos localizados nas regiões transmembranares e
intracelulares da proteina.(então, é qualitativo também!)
§  D parcial (polimorfismo qualitativo):
§  Somente alguns epítopos originais de D são expressos.
§  Alterações nos aminoácidos nas regiões extracelulares da
proteina.
§  Podem ser expressos fracamente (então também é quanti!)

Importância clínica destas variantes do antígeno D:


Desenvolvimento de aloanticorpos anti-D
É possível diferenciá-los na “vida real”?

Utilizar a nomenclatura D variante.


•  Alguns Dfracos apresentam backgrounds
genéticos similares a alguns D parciais!
•  Ex: parcial DAR e Df tipo 4.2!

36
Antígenos D variantes

Alterações em aminoácidos alteram a estrutura

conformacional da proteína e pode criar novos

epítopos, ou destruir os já existentes .


Geoff Daniels, palestra Sírio Libanês, 2011.

Estas alterações podem ser extra-celulares (nos loops


externos), intramembranares ou intra-celulares
(supostamente não detectáveis pelo sistema imune).
38
Como detectar Variantes do antígeno D?
Métodos Sorológicos:

q  Fases de Reatividade e associação com fenótipos.

q  Soros Policlonais e Monoclonais: Produção de numerosos


monoclonais (epítopos distintos).
q  Kit Comercial com 6 ou 12 soros (BioRad®)
Como detectar Variantes do antígeno D - Métodos Sorológicos
Painel de Soros Monoclonais
(kit comercial - BioRad® com 12 soros anti-D)
Variantes de D
MAYRA ALTOBELI DE BRITO. Escola de Imuno-hematologia Bio-Rad.
Aula: Variantes de RHD e RHCE. Julho, 2015

Outra forma de detecção das variantes de D são


métodos moleculares (Genotipagem).
•  Análise de 6 dos exons do gene RHD (3, 4, 5, 6, 7 e 9) - Multiplex:

Reação RHD - Multiplex


EXONS - RHD:
1 2 3 4
5 6

50pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Imagem: Banco de Sangue Hospital Sírio Libanês

Controle Interno
COMO ELA É REALIZADA?

q Realizada por técnicas Moleculares de Baixo


Rendimento

q Necessário um Laboratório de Referência eficiente


e reprodutivo

q  Detectar as principais variantes RHD

q Determinar zigozidade RHD

q  Detectar RHD pseudogene, alelo r sr

MAYRA ALTOBELI DE BRITO. Escola de Imuno-hematologia Bio-Rad.


Aula: Variantes de RHD e RHCE. Julho, 2015
FENÓTIPO D FRACO – CONDUTA
TRANSFUSIONAL:
FENÓTIPO Haplótipo Alo Auto Transf. HDN
RHD fraco associado anti-D anti-D Glób
Tipo 1 CDe Não Não D-pos. Não

Tipo 2 cDE Não Não D-pos. Não

Tipo 3 CDe Não Inf. Não Inf. D-pos. Não

Tipo 4.0 cDe Não Inf. Não Inf. D-pos. Não

Tipo 4.1 cDe Não Inf. Não Inf. D-pos. Não

Tipo 4.2 cDe Sim Sim D-neg. Sim

Tipo 5 cDE Não Sim D-neg. Sim

Tipo 11 Cde, cDe Sim Sim D-neg. Sim

Tipo 15 cDE Sim Sim D-neg. Sim

Tipo 19 CDe Não Inf. Não Inf. D-neg. Sim

Tipo 20 cDE Não Inf. Não Inf. D-neg. Sim

Flegel, 2006
SISTEMA RH - Anticorpos
q  Ocorrem por transfusões
q  Por gestações (imunes)
q  Raramente são descritos anticorpos naturais.

Antígeno D é altamente
imunogênico!!! (1 a 10 ml já são
suficientes para imunização)
Está implicado em reações
transfusionais e DHPN
ENTÃO:
Que soros anti-D usar
nas rotinas?
O QUE DEVEMOS CONSIDERAR?

•  QUEM será tipado?

•  QUE tipo de serviço é o meu?

•  QUE reagentes estão disponíveis ?

•  QUAL metodologia eu utilizo?

•  O QUE farei com este resultado?


O QUE DEVEMOS CONSIDERAR?

•  QUEM será tipado?

•  QUE tipo de serviço é o meu?

•  Pacientes

•  “clientes”laboratórios

•  Gestantes

•  Doadores de sangue
EU DESEJO DETECTAR DVARIANTES?

•  Doadores / laboratórios SIM

•  Testes Pré-transfusionais ??????

•  Gestantes (pré-natal) ??

•  RN de mães RhD- SIM


Tipos de reagentes Anti-D

q  Policlonal - humano (IgM e/ou IgG)


q  Produção escassa
q  Pouco potente
q  Reagem com DVI e alguns Dfracos em fase AGH
q  Não detectam muito fracos e/ou parciais (Del e Crawford)

49
Tipos de reagentes Anti-D
q  Monoclonal – contra alguns epítopos ou mistura
de monoclonais contra a maioria dos epítopos
q  Possibilidade de falsos negativos por não detectarem
alguns tipos de D parciais, ex DVI
q  IgG (DVI+) = leitura em AGH
q  IgM (DVI-)= leitura imediata

50
Tipos de reagentes Anti-D
q Blend (mistura Acs IgM+IgG, e/ou mono
+policlonais)
q Muito potentes
q Leitura até AGH

51 http://www.misodor.com/ANEMIAS%20HEMOLITICAS.php
SISTEMA RH – Prática Laboratorial
Critérios de Seleção de Anticorpos Anti-D

q  Reagentes policlonais anti-D potentes reagem com

DVI e com antígenos D fraco de alguns indivíduos.

q  Reagentes Monoclonais que reagem com hemácias

D fraco e podem não com reagir com alguns

antígenos parciais, como ex. DVI


SISTEMA RH – Prática Laboratorial
Critérios de Seleção de Anticorpos Anti-D

Anticorpos monoclonais de modo a detectar a grande


maioria das variantes do antígeno D, no entanto,
devido à grande miscigenação da população brasileira,
os reagentes disponíveis ainda não conseguem
detectar todas as variantes.
Recomenda-se utilizar uma combinação adequada dos
clones anti-D, oferecendo uma segurança na
identificação destas variantes.
SISTEMA RH – Prática Laboratorial
Critérios de Seleção de Anticorpos Anti-D

q  Uma recomendação importante:

utilização de reagente anti-D que pode ser um

policlonal potente ou mistura de monoclonais e/

ou policlonais (blend) que detectam os D fracos

e a maioria dos D parciais / Associado à

Antiglobulina Humana */ou enzima.


Obs: acreditamos que esta recomendação tenha em vista os
testes realizados em tubo)
SISTEMA RH – Prática Laboratorial
Critérios de Seleção de Anticorpos Anti-D

Não há consenso quanto ao melhor procedimento de


detecção do antígeno Rh(D), devendo ser avaliado o
tipo de público-alvo que utilizará esse serviço e qual a
finalidade da classificação do fenótipo Rh(D)

q  Doadores
q  Pacientes (rotina pré-transfusional)
q  Pré-natal
SISTEMA RH – Prática Laboratorial
Critérios de Seleção de Anticorpos Anti-D

Recomendações dos Workshops nacionais e


internacionais:
Utilização de dois reagentes anti-D para a
fenotipagem RhD

Mistura de monoclonais que detectam os antígenos


q 
D fracos e a maioria dos antígenos D parciais;

Monoclonal que não detecte a variante mais comum,


q 

que é a categoria DVI , entre outras.


SISTEMA RH – Prática Laboratorial
Critérios de Seleção de Anticorpos Anti-D

Caso não seja possível a utilização de dois


reagentes anti-D, é recomendado utilizar reagente
anti-D que detecte a maioria dos epítopos originais do
antígeno D normal para imuno-hematologia de
doadores.

Não podemos errar na fenotipagem Rh(D) de


doadores sob risco de aloimunização dos receptores
de hemácias, portanto devemos atentar para a correta
escolha dos reagentes e de técnicas de grande
sensibilidade!
Critérios de Seleção de Anticorpos
Anti-D para pacientes ou gestantes???

Há controvérsias!

•  Um anti-D monoclonal (que não detecte todas as


variantes) e se o indivíduo for D parcial será
fenotipado como Rh(D)-

ou

•  Dois anti-D diferentes. O importante é garantir a


correta identificação e assim, o correto procedimento
em caso de indivíduos receptores ou gestantes que
sejam D variantes!
Art. 119. O antígeno RhD será determinado colocando-se as
hemácias com antissoro anti- RhD (Anti-D).
§ 1o Paralelamente ao procedimento previsto no “caput” deve ser
sempre efetuado um controle da tipagem RhD, utilizando-se
soro-controle compatível com o antissoro utilizado e do mesmo
fabricante do anti-D.
§ 2o No caso de utilização de antissoros anti-D produzido em meio
salino, o uso do soro- controle na reação é dispensável.
§ 3o Se a reação for negativa para a presença do antígeno RhD,
será efetuada a pesquisa do antígeno D-fraco.
Art. 119. O antígeno RhD será determinado colocando-se as
hemácias com antissoro anti- RhD (Anti-D).
(...) § 4o Para a realização da pesquisa de antígeno D-fraco
recomenda-se a utilização de, no mínimo, dois antissoros anti-
RhD (anti-D), sendo que, pelo menos um desses antissoros
contenha anticorpos da classe IgG.
§ 5o Os antissoros de que trata o § 4o devem ser obtidos de
linhagens celulares distintas incluindo a fase da antiglobulina
humana.
§ 6o Quando a tipagem RhD ou a pesquisa do antígeno D-fraco
resultar positiva, o sangue deve ser rotulado como "RhD
positivo".
§ 7o Quando ambas as provas de que trata o § 4o resultarem
negativas, o sangue deve ser rotulado como "RhD negativo".
Art. 176. Nos exames de sangue do receptor, a tipagem ABO e
RhD e a pesquisa de anticorpos antieritrocitários irregulares
serão realizadas nas amostras de sangue do receptor de
componentes eritrocitários.
(...) § 11. Se a reação for negativa para a presença do antígeno
RhD, recomenda-se a realização da pesquisa do antígeno D-
fraco.
§ 12. Se a pesquisa de que trata o § 11 não for realizada, o
paciente será considerado RhD negativo para fins
transfusionais.
§ 13. Quando a tipagem RhD ou a pesquisa do antígeno D-fraco
resultar positiva, o paciente pode ser considerado "RhD-
positivo".
Art. 176. Nos exames de sangue do receptor, a tipagem ABO e
RhD e a pesquisa de anticorpos antieritrocitários irregulares serão
realizadas nas amostras de sangue do receptor de componentes
eritrocitários.
(...) § 15. Recomenda-se a utilização de um antissoro monoclonal
que detecta o antígeno D parcial categoria VI (DVI+ / positivo) e um
antissoro que não detecta o antígeno D parcial categoria VI (DVI – /
negativo).
§ 16. Na hipótese do § 15, quando houver discrepância nos resultados
entre os dois antissoros utilizados, deve-se investigar a presença
dos antígenos D-fraco e D parcial na amostra.
CLONES DOS ANTI-D IgG DISPONIVEIS NO MERCADO BRASILEIRO
Levantamento de Silvia Leão Bonifácio (FPS/ ICESP-SP)

MARCA REAGENTE MÉTODO


Fresenius Anti-D IgM Clone (MS201) – compõe o Smart TUBO
Kit;
Anti-D IgG Clone (MS26) – compõe o Smart Kit;
Anti-D Blend de Monoclonais IgG (MS26) e IgM
(MS201) ou (LDM1) ou (LDM3)
BioRad Anti-D Blend de Monoclonais IgG (MS26) e IgM TUBO
(TH-28)

Lorne Anti-D Clone 1 IgM (RUM-1); TUBO


Anti-D Clone 2 IgM (MS201);
Anti-D Blend de Monoclonais IgG (MS26) e IgM
(RUM-1).

Ebran Anti-D Blend de Monoclonais IgG (MS26) e IgM TUBO


(TH-28)

63
Discrepâncias na
fenotipagem Rh(D)
O que fazer em caso de discrepâncias?

•  Com a utilização desses diferentes clones de anti-


D, podemos encontrar discrepâncias nos
resultados, o que pode direcionar a um estudo e
realizar testes complementares para identificação
de variantes do antígeno D:
- Dfracos: utilizar metodologias/ testes mais
sensíveis
- Dparciais: painéis de soros monoclonais
- Genotipagem RhD: diferenciar D fraco/ D parciais.

65
1A OPÇÃO: METODOLOGIAS OU TESTES
DE MAIOR SENSIBILIDADE

Microplacas Tubos (AGH)

Tubos Gel-teste

Gel-teste perfis diversos

Anti-D s de clones diversos

Monoclonal + GEL AGH!

Soros monoclonais com enzima

Adsorção-eluição

Genotipagem 66
Conclusões

q  Testes sorológicos não distinguem Dfraco e


Dparcial com fraca expressão

q  Testes sorológicos não detectam alguns D fracos,


Del e D parcial (dependendo do anti-soro)

q  Atenção à origem etnica do indivíduo!


q  A prevalencia de Dvariantes não é a mesma nos
diferentes grupos étnicos.

67
Conclusões
q  Testes sorológicos requerem experiência
profissional, conhecimento técnico.

q  É necessário muito critério na escolha dos


reagentes para sorologia de grupos sanguíneos e
estar familiarizado com as características dos
reagentes/ métodos utilizados

q  Por enquanto, a genotipagem está restrita


apenas a alguns centros e a plataforma em larga
escala ainda não está disponível.
68
69
Então, mantenha-se atualizado e principalmente:
USE O BOM SENSO!

Ana Lúcia Girello


contato@byoline.com.br
www.byoline.com.br
70
PÁGINA FACEBOOK: EU AMO IMUNO-HEMATOLOGIA
71