Ruptura Celular PIS

Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Rompimiento celular
Sergio Huerta Ochoa

UAM-Iztapalapa
Productos Extracelulares Productos

-Antibióticos Intracelulares
-Enzimas extracelulares -Mayoría de proteínas modificadas
-Muchos polisacáridos genéticamente
-Mayoría de aminoácidos -Lípidos
-Algunos antibióticos
Esteroides
(Se extraen sin romper) Biomasa
Productos que requieren de ruptura celular
Tipo de producto Ejemplos
Proteínas recombinantes Insulina, HC, Proteína A, Proteína G
Enzimas L-Asparaginasa, Invertasa, Glucosinasa
Plásmidos Terapia génica
Vacunas Tétanos, Meningitis
Otros Mitocondrias, Esporas, Toxinas
Tejeda y col. 2011 Bioseparaciones

Esquema de la pared celular de células procariotas
Procariotes Gram –
(E. coli produce la mayoría de las proteínas recombinantes)
Membrana externa
(Proteínas y lipopolisacáridos) Fuerza mecánica
8 nm
Polipéptidoglucanos
8 nm
Espacio Periplasmático
(Proteínas)
Membrana de plasma Permeabilidad
Procariotes Gram +
Polipéptidoglucanos
Espacio Periplasmático
(Proteínas)
Membrana de plasma
(Fosfolípidos, proteínas dispersas, iones metálicos)
Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)
Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
Tomado de
“Advances in product
release strategies and
impact on bioprocess
design” (2009)
Bangaru
Balasundaram, Sue
Harrison and Daniel
G. Bracewell
Tomado de
“Advances in product
release strategies and
impact on bioprocess
design” (2009)
Bangaru
Balasundaram, Sue
Harrison and Daniel
G. Bracewell
Fermentación
Centrifugación, filtración con vacío,

Cosecha de células filtración con membranas
Homogenización, molienda, lisis

Etapas
Rompimiento Celular (enzimática o química)
primarias de
recuperación
Centrifugación, filtración con vacío,
Remoción de restos celulares filtración con membranas
Concentración y/o Precipitación, extracción, filtración

fraccionamiento con membranas, evaporación
Operaciones de alta
Cromatografía, cristalización
resolución
Operaciones finales
Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989

Producto Studies on cell disruption and cell debris
removal in downstream processing
Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae
Antes de la ruptura Después de 2 pasos a 1000 bar dando

celular un rompimiento celular de 95%
Equipo de ruptura
Industria Alimentaria
(Homogenización de la leche)
Aplicación en … Industria Biotecnológica

Industria de la Pintura
(Reducción de Pigmentos)
Método Técnica Principio Estrés Costo Ejemplo
sobre el
producto
Químico Choque osmótico Ruptura osmótica de la Suave Barato Ruptura de células de sangre
membrana
Digestión Rompimiento por digestión de la Suave Caro Micrococcus lysodeikticus tratado con
enzimática pared celular lisozima de huevo
Solubilización Detergentes solubilizan la Suave Moderado Sales biliares actuando sobre E.coli
membrana celular - caro
Disolución de Solventes orgánicos se disuelven Moderado Barato Ruptura de levadura con tolueno
lípidos en la pared celular y la
desestabilizan
Tratamiento La saponificación de lípidos Fuerte Barato
alcalino solubiliza la membrana
Mecánico Homogenización Células cortadas en una Moderado Moderado Tejido animal y células
(tipo navaja) licuadora
Molido Ruptura celular por molido con Moderado Barato
abrasivos
Ultrasonicación Células rotas con cavitación Fuerte Caro Suspensión de células a pequeña escala
ultrasónica
Homogenización Se hace pasar células por un Fuerte Moderado Tratamiento a gran escala de suspensión de
(tipo orificio) pequeño orificio y se rompen células excepto bacterias
por estrés
Rompimiento en Se aplastan las células entre el Fuerte Barato Tratamiento a gran escala de suspensión de
molino de perlas vidrio y perlas de acero células y células de plantas
Dificultad de la ruptura
Esporas
Cocos
gram -
Levaduras
Células vegetales
Bacilos gram +
Bacilos gram - y cocos
Micelios
Células animales
Elección del método de ruptura
Naturaleza de la fuente de la enzima

Escala de la operación
Velocidad del método de extracción
Estabilidad del enzima
Pureza requerida
Costo del proceso
Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento

Factor inactivante Fuente de Frecuencia Modo de
enzima contrarrestarlo
Calor Cualquiera Universal Enfriamiento
Frío Cualquiera Raro Calentamiento
Proteasa Mayoría Común Inhibidores de proteasas o
frío
Productos oxidación de Plantas y hongos Bastante común Agentes reductores
fenoles
Oxidación Cualquiera Común Agentes reductores
Dilución proteína Cualquiera Bastante común Concentración rápida
Pérdida de estabilidad Cualquiera Bastante común Restauración de ese factor
Inhibidores específicos Plantas y Raro Separación del inhibidor
bacterias
Metales pesados Cualquiera Raro Agentes quelantes
Cambio de fase Cualquiera Común Mínima agitación
Choque osmótico
1. Suspensión de células en solución tamponada hipertónica (sacarosa 20%)
2. Equilibrio osmótico
3. Centrifugación: concentración de las células
4. Re suspensión en agua (4 ºC)
5. Ruptura celular por entrada de agua en el interior
celular
• Mayor sensibilidad en GRAM negativas

(GRAM positivas alta presión osmótica interna)
• Ventajas:
Extracción de enzimas del espacio periplasmático,
simplificación de los procesos de purificación
• NO a gran escala:
Grandes volúmenes de medio
(400 L/10 kg pasta celular)
Elevado número de pasos de centrifugación
Necesidad de refrigeración
Tratamiento con lisozima + EDTA

•Digestión de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4)
glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico (NAM) y la N-acetilglucosamina
(NAG) del mucopéptido
•Mayor susceptibilidad GRAM +

•Combinación con EDTA: quelante del Ca2+
•Otros policationes: GRAM +: quitosano, hidroglutamato, polilisina,
antiobióticos GRAM -: lipasas, fosfolipasas, policationes
Hongos/levaduras: quitinasa/glucanasas
•Necesidad de choque osmótico
•No empleo a gran escala:
Alto precio de la lisozima
Eliminación de lisozima tras extracción
Tratamiento con detergentes

Permeabilización de células por solubilización de
proteínas de membrana, debido a apertura de poros
Tipos:
1. Iónicos: provoca desnaturalización
proteica
Aniónicos: Lauril sulfato sódico,
colato sódico, SDS
Catiónicos: Bromuro de cetil-
trimetil-amonio
2. No iónicos: preservan estructura

nativa e interacciones de la
enzimaTween, Spam,
Triton
Inconvenientes:
Precipitación de proteínas y necesidad de eliminación (cromatografía, ultrafiltración)
Tratamiento con álcalis

Tratamiento de las células con
soluciones alcalinas
(KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min)
Hidrólisis de la pared celular
Ventajas:
Simpleza, barato
Fácil aplicación a gran escala
Desventajas:
Tratamiento fuerte, es un ejemplo
extremo de la solubilización
(Saponificación de lípidos que se
convierten a detergentes)
No selectivo
Aplicación SÓLO si las enzimas a aislar
son estables a pH alcalino
Disolventes orgánicos
Método tradicional de ataque

( tolueno).
No se usan a gran escala.
Inconvenientes:
Precio
Toxicidad
Desnaturalización de
proteínas
Inflamabilidad
Homogeneización con abrasivos

•Mortero + abrasivo (cristal, albúmina, kieselgurh)
•Dispositivos de funcionamiento continuo:
Agitador Mickle (agitador vibratorio)
Dyno-mill (agitador de discos giratorios)
•Efectividad depende de:

Tipo y concentración de abrasivo
Tipo, concentración y edad de las células: levaduras >bacterias
Velocidad de agitación
Cantidad y flujo a través de la cámara
Temperatura
Dispositivo de discos
Sonicación
•Aplicación de frecuencia superiores a 20 kHz
•Aparición de áreas de compresión/enrarecimiento/cavidades
→colapso de cavidades →ondas de choque →daño celular
•Aplicación continua o discontinua
•Eficacia dependiente de:
Tipo de microorganismo:
Gram ->Gram +
Bacilos > Cocos
pH
Temperatura
Fuerza iónica del medio
Tiempo de exposición
Densidad de la célula
•Uso a pequeña escala, NO a gran escala:
Elevados requerimientos de energía
Dificultad de transmisión de la energía
Problemas de disipación del calor producido
Congelación/Descongelación
•Formación y fusión de cristales de hielo liberación de proteínas
•Combinación con otros métodos: congelación de sedimentos

bacterianos
•Ventajas:
Simplicidad
Bajas temperaturas de trabajo
•NO a gran escala:

Elevado tiempo de tratamiento
Resistencia de algunos microorganismos
Sensibilidad de las enzimas a congelación/descongelación
Cizalla líquida
•Paso de la suspensión de células a elevada presión (>55MPa) a través de un
orificio estrecho
•Homogeneizador de Manton-Gaulin
•Mecanismo:
Ruptura celular por caída brusca de presión y choque
•Modos de uso:
Paso único, series de reciclaje, reciclaje continuo con eliminación de
sustancia
•Efectividad depende de:
Tipo de microorganismos: GRAM -> GRAM +
Historia de la materia de partida:
Condiciones de crecimiento (fase estacionaria > fase exponencial)
Congelación/descongelación
Cizalla sólida
•Paso de células congeladas (-20 ºC) a través de

orificio
•Mecanismo:
Agitación en presencia de abrasivo
(cristales de hielo) + ruptura por cizalla
líquida
Fuerzas de cizalla: paso a través de
orificio + desgarro por cristales de hielo
•No produce la desnaturalización de las enzimas
•NO a gran escala:

Manejo complicado y costoso
Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

(Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones)
Choque osmótico: El cálculo del gradiente de presión se basa en el equilibrio
químico (Ley de van’t Hoff)
Pe − Pi = −R ⋅T ⋅ ∑ ci
Ejemplo: Las cianobacterias son capaces de acumular sales de bajo peso molecular en
respuesta a un medio con alta presión osmótica. Pueden ser cultivadas en medios con 0.11
M NaCl o en medios con 0.49 M NaCl y 0.01 M CaCl2. Cuando las células son crecidas en el
medio más salino y transferidas a agua pura se permeabilizan liberando los carbohidratos y
aminoácidos intracelulares en 2 min. Estime la diferencia de presión osmótica para
permeabilizar las células a 25 ⁰C (donde: R = 82 cm3 atm mol-1 K-1).
cm 3atm
∆P = −82 ⋅(25 + 273 )o
K ⋅ ∑ [(0 . 11 + 0 . 11) ] mol 1L
= −5.38atm
mol⋅o K
NaCl
L 1000 cm 3
∆P = −82
cm 3atm
mol⋅o K
⋅(25 + 273 )o
K ⋅ ∑ (0[. 49 + 0 . 49 )NaCl + (0 . 01 + 0 . 02 ]
)CaCl 2
mol 1L
L 1000 cm 3
= −24 .68atm
Molino de perlas de alta velocidad
Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones

Parámetros operacionales
- Velocidad del agitador
- Velocidad de alimentación de la suspensión celular
- Diseño del agitador
- Tamaño de las perlas de vidrio
- Carga de las perlas de vidrio
- Concentración celular
- Temperatura
Velocidad del Agitador

La Velocidad Periférica Normalizada de los Anillos agrupa varios parámetros
relacionados con la velocidad del agitador
Dm πω
U= ω : velocidad angular del agitador (rpm)
Dm : diámetro
60x1000
En impulsores concéntricos,
Dm = diámetro del impulsor (mm)
En impulsores excéntricos,
Dm = diámetro promedio (mm)
d : diámetro de los anillos
d2 del agitador (mm)
Dm = 2 e +
2
e : diámetro de la flecha
4
Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones del agitador (mm)
Flujo de alimentación, F
• El flujo permisible en un molino de perlas depende:
Del volumen del molino
De la carga de perlas
Velocidad del agitador
Disminuye el grado de
desintegración
Al aumentar el
flujo de
alimentación
El proceso resulta NOTA: Conviene operar con
más económico altos flujos de alimentación y
usar varios pasos para obtener
el rendimiento requerido
Diseño del Agitador y Efectos del Mezclado
El comportamiento de un molino de perlas depende del patrón

de flujo y mezclado que produce la agitación. La cual es un
agitado intermedio a los dos modelos ideales: Flujo tapón (sin
mezclado axial) y tanque continuo agitado (100 % agitado)
El tipo de mezclado puede ser

determinado por técnicas con
trazadores
Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones


(Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones)
Molino de Perlas (operación intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas

a altas velocidades sigue una cinética de primer orden. El balance de masa de proteína
liberada puede ser expresado mediante la ecuación:
= k (Rm − R )VM
dR
VM
dt
Integrando y re-arreglando Rm
ln
Rm − R
Rm
ln = kt Ejemplo 5.2
Rm − R k
t
Grado de mezclado en un Molino de Perlas (operación continua):

El grado de desviación del flujo tapón ideal en los molinos de perlas comerciales, ha sido
simulado utilizando el modelo de “Tanques en serie perfectamente agitados”. Esto
permite realizar experimentos con pulsos de tinta para determinar el número de tanques
equivalentes al grado de mezclado que tiene el molino de perlas utilizado y calcular la
eficiencia esperada del rompimiento.
C0 C1 C2 C3 CN
F F
1 2 3 N
Al aplicar un pulso de tinta en la primera etapa de una serie de tanques perfectamente

agitados de igual volumen, el balance de la masa de tinta para cualquier etapa N es:
= F (C N −1 − C N )
V M dC N
N dt
tF t
Utilizando un tiempo adimensional definido por: θ= =
VM t R
El balance de masa de tinta puede expresarse como:
dC N
= N (C N −1 − C N )
dθ
Integrando para cada etapa, se obtiene que para la etapa N la expresión:
C N N Nθ N −1
E (θ ) = = exp(− Nθ )
C0 (N − 1)!
E(θ) es una medida de la distribución de tiempos de residencia del fluido dentro del
recipiente. Derivando con respecto θ e igualando el resultado a cero se tiene:
1
N=
1 − θ máx
Donde θmáx es el tiempo adimensional en el cual E es máxima:
Eficiencia de un Molino de Perlas (operación continua):

Para relacionar el número de etapas con la eficiencia de rompimiento es necesario
realizar un balance de proteína liberada (células rotas) considerando que el molino
consta de N etapas tipo tanque perfectamente agitado en serie y que el rompimiento
sigue una cinética de primer orden.
El balance de proteína liberada en la primera etapa está dada por
= − FR1 + k (Rm − R1 ) m
Vm dR1 V
N dt N
Expresando la ecuación en función de un tiempo adimensional e integrando obtenemos

 kVm 
R1  NF 
=  Eficiencia de la etapa !!!
Rm  1 + kVm 
 
 NF 
Re-arreglando y generalizando para N etapas, tenemos:
N
Rm  kV 
= 1 + m  Ejemplo 5.3
Rm − RN  NF 
Homogeneizador de alta presión: La desintegración celular

en un homogeneizador de alta presión a una presión fija puede
ser descrita mediante una cinética de primer orden respecto al
número de pasos, de tal manera que:
= k ' (Rm − R )
dR
dN
Integrando obtenemos la ecuación:
Rm
ln = k' N
Rm − R
Se ha determinado experimentalmente que la constante
k’ tiene una dependencia con la presión de la siguiente
forma:
k ' = k" P
a
Combinando las ecuaciones anteriores se tiene:

Rm
ln = k " NP a
Rm − R
Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cinética de rompimiento presenta una

cierta dependencia no lineal con el número de pasos expresada mediante la ecuación:
Rm
ln = k" N b P a Ejemplo 5.4
Rm − R
Donde b es un exponente que varía con el tipo de célula y toma valores entre 0.28 y 1
Chang and Su, 2006

Kinetic model for simultaneous cell
disruption and aqueous two-phase
extraction
A = Am[1 − exp(−kt)]
La Ruptura celular, cuando se están procesando cientos o miles de

litros de material, represanta un reto diferente a la ruptura celular a
nivel laboratorio
Factores claves son: Eficiencia y reproducibilidad
A nivel Industrial sólo se emplean los molinos de perlas agitados y

los homogeneizadores a alta presión. El diseño de los molinos
está basado en ecuaciones empíricas y en experimentos piloto.
GEA Liquid Processing cell rupture

skid for biologic cell lysing. The
homogenizer feature the high
efficiency sharp profile rupture valve
type R which enable cell disruption at
lower pressures

Ruptura Celular PIS

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Productos Extracelulares Productos

Productos que requieren de ruptura celular

Tipo de producto Ejemplos

Proteínas recombinantes Insulina, HC, Proteína A, Proteína G

Enzimas L-Asparaginasa, Invertasa, Glucosinasa

Plásmidos Terapia génica

Vacunas Tétanos, Meningitis

Otros Mitocondrias, Esporas, Toxinas

Tejeda y col. 2011 Bioseparaciones

Esquema de la pared celular de células procariotas

Membrana de plasma Permeabilidad

Centrifugación, filtración con vacío,

Homogenización, molienda, lisis

Concentración y/o Precipitación, extracción, filtración

Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989

Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae

Antes de la ruptura Después de 2 pasos a 1000 bar dando

Aplicación en … Industria Biotecnológica

Elección del método de ruptura

Naturaleza de la fuente de la enzima

Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento

• Mayor sensibilidad en GRAM negativas

Tratamiento con lisozima + EDTA

•Mayor susceptibilidad GRAM +

Tratamiento con detergentes

2. No iónicos: preservan estructura

Tratamiento con álcalis

Método tradicional de ataque

No se usan a gran escala.

Homogeneización con abrasivos

•Efectividad depende de:

•Formación y fusión de cristales de hielo liberación de proteínas

•Combinación con otros métodos: congelación de sedimentos

•NO a gran escala:

•Paso de células congeladas (-20 ºC) a través de

•No produce la desnaturalización de las enzimas

•NO a gran escala:

Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

Molino de perlas de alta velocidad

Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones

Velocidad del Agitador

Diseño del Agitador y Efectos del Mezclado

El comportamiento de un molino de perlas depende del patrón

El tipo de mezclado puede ser

Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones

Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

Molino de Perlas (operación intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas

Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

Grado de mezclado en un Molino de Perlas (operación continua):

Al aplicar un pulso de tinta en la primera etapa de una serie de tanques perfectamente

Eficiencia de un Molino de Perlas (operación continua):

El balance de proteína liberada en la primera etapa está dada por

Expresando la ecuación en función de un tiempo adimensional e integrando obtenemos

Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

Homogeneizador de alta presión: La desintegración celular

Combinando las ecuaciones anteriores se tiene:

Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cinética de rompimiento presenta una

Chang and Su, 2006

La Ruptura celular, cuando se están procesando cientos o miles de

A nivel Industrial sólo se emplean los molinos de perlas agitados y