BIOLOGÍA DE LAS TOXINAS

KILLER

Las toxinas Killer son péptidos de origen proteico producidos por hongos que son
antifúngicos.

Fenómeno Killer en levaduras

El primer fenómeno killer fue descrito por primera vez por Makower y Bevanen 1963.
Ciertas cepas de Saccharomyces cerevisiae eran capaces de inhibir el crecimiento de
otras, estableciéndose una analogía con el fenómeno de inhibición bacteriana
mediado por bacteriocinas, es decir, son hongos que generan antifúngicos.

Como resultado de estas investigaciones se definió un sistema con tres fenotipos

distintos en función de las características de las cepas encontradas:
• Killer: cepa de levadura capaz de inhibir el crecimiento de otra levadura.

▪ Killer positivo

▪ Killer negativo: no tiene esa capacidad de inhibir el crecimiento de otras.

• Neutro: cepa que no presenta fenotipo Killer pero es resistente (K-/ R+), ni las
producen ni son sensibles.

• Sensibilidad: cepa inhibida por acción de ciertas cepas killer.

▪ Resistencia positiva (R+)

▪ Resistencia negativa (R-)

Otros fenotipos como consecuencia de la investigación:

• Superkiller (K++): actividad killer aumentada. Se hacen artificialmente infectando
a las levaduras con varios virus simultáneamente.

• Suicida: produce toxina killer que es capaz de matar a la propia célula que lo
produce (solo bajo condiciones experimentales específicas).

Fenotipos de levaduras
Estudio de antibiosis en placa para observar la actividad Killer: sembrar un
microorganismo sobre una placa de agar, dejar que crezca y posteriormente sembrar
levaduras killer para ver si es positiva o negativa. Las que no son no producirán
inhibición de crecimiento mientras que las que lo son inhibirán el crecimiento de la
cepa que sembremos en el césped.
Investigaciones posteriores determinaron que la actividad killler no era exclusiva de
S. cerevisiae, sino que estaba presente en levaduras de otros muchos géneros,
prácticamente todos los géneros y especies de levadura son capaces de producir
estas toxinas. Las toxinas killer de ascomicetos solo matan a ascomicetos; y lo
mismo ocurre con basidomicetos.

Diversidad de toxinas killer

En general las toxinas killer tienen características comunes. Suelen ser pequeñas, de
baja masa molecular (20KDa), con pocas subunidades. La base genética es diversa
(cromosómica, ADN de doble cadena, RNA de doble cadena…). Respecto a la manera
en la que afectan a las sensibles, existe toda una serie de mecanismos de acción,
aunque existe una cierta homogeneidad. Por ejemplo, como receptor primario suele
ser habitual el (1!6)-β-D-glucanos. Dentro de una misma especie existe variedad
entre las toxinas killer.

Características del fenómeno killer

En un entorno natural, este fenómeno tiene un porcentaje más elevado que las que
producen las levaduras de una colección. Esto se debe a que en una colección, las
levaduras no tienen que competir, por lo que no es necesaria la producción de
toxinas. Cuando las levaduras dejan de tener que competir en el entorno natural
(pasar del medio natural a una colección), estas características se pierden.
Características comunes:
Característica extendida en levaduras, pero su incidencia varía significativamente:
Aislamientos naturales 17%, cepas de colección 7%. Tienen mayor frecuencia de
aislamiento en ambientes naturales: Posible ventaja selectiva; codificación extra
cromosómica (no siempre). Existen características comunes, pero presentan una
naturaleza muy variable a nivel estructural, funcional y biológica.
- Son metabolitos primarios, a diferencia de los antibióticos.

- Carácter proteico (por eso son primarios).

- Baja masa molecular (10-25 kDa)

- Punto isoeléctrico muy ácido (3,5-4)

- Actividad restringida a: pH ácidos <5,5 y temperatura baja <25ºC. Debido a

esto, estas toxinas no tienen base terapéutica.

Esquema general
Mecanismo global: una levadura killer secreta una toxina que se acumula en el medio
extracelular y, posteriormente, se une a receptores primarios (a nivel de la pared) de
la levadura sensible. Además existen receptores secundarios a nivel de membrana. Se
da una cascada de eventos celulares que provocan la muerte de la levadura.

S. cerevisiae un modelo para el estudio de las toxinas killer

Toxina K1 y toxina K28.
Se utiliza como modelo por varias razones:
1. El fenómeno killer fue descrito inicialmente en S. cerevisiae.

2. Simplicidad en los análisis genéticos y bioquímicos.

3. Genoma secuenciado desde 1996.

La toxina killer, sea cual sea, está codificada en virus, es decir, la capacidad killer se
da en cepas infectadas por virus. Estos se llaman micovirus, todos tienen ARNdc
lineal, pertenecen a la familia Totiviridae y no les genera ningún problema a las
levaduras (ScVLPs).

Estructura de los Micovirus de la familia Totiviridae

Es necesario que sean dos virus los que infecten a la levadura. Uno de ellos es el
denominado helper o partícula L-A. La otra partícula viral es la que codifica la
toxina (cualquier toxina), y se nombran M1 toxina K1, M2 toxina K2, M28 toxina
K28…. Encontraremos un único helper y una única partícula que codifica para una de
las toxinas.
La partícula helper presenta un ARNdc con dos marcos de lectura, es decir, codifica
para dos proteinas: por un lado codifica para proteínas de la cápside (Gag), y por
otro lado codifica para una proteína de fusión con actividad polimerasa (Gag-RNA-
pol).
La partícula ScV-M codifica para una única proteína que es la toxina.
- Ambos virus se encuentran en el citoplasma.

- La coinfección de los dos virus es necesaria para elfenotipo killer.

- Los procesos de encapsidación de ambos virus dependen de los virus Helper o

virus L-A.

Ciclo de replicación de los virus killer y helper en S. cerevisiae

Partimos desde proteínas Gag y Gag-pol sintetizadas. En primer lugar se produce la
encapsidación y ensamblaje hasta formar una partícula vírica completa. Ocurre de
igual forma para cada partícula vírica. Se sintetiza la hebra negativa, posteriormente
se transcribe la hebra positiva y finalmente se da la traducción de las proteínas.
El virus killer (M) y el virus helper (L-A) son virus dsRNA. Ambos compiten por las
proteínas Gag y Gag-Pol codificadas por el virus helper. Ambas proteínas son
esenciales para:
a) Encapsidación del ARNss (+)
b) Ensamblaje del virus
c) Síntesis de la hebra de ARN (-)
d) Transcripción de la hebra de ARN (+)
e) Traducción del ARNsspara producir las proteínas Gag y Gag-Pol (en el virus L-A) y
killer (en el virus M)
f) Unión de la proteína Gag-Pol al ARNss

Síntesis de toxina killer

La toxina presenta dos subunidades, α y β. La hebra positiva se traduce en el
citoplasma y se forma la pre-pro-toxina, que tiene diferentes regiones. Esta se
transforma en el RE, en primer lugar una peptidasa corta el fragmento pre y
posteriormente el fragmento gamma (γ) sufre varias glicosidaciones, se forman
puentes difulsuro (1-3) que dependen del tipo de toxina. Todo esto da lugar a la pro-
toxina, que finalmente es transportada a través de una vía secretora del RE al A.
Golgi, donde se da una escisión proteolítica por varios sitios, dejando solo las
subunidades α y β. Las proteasas se llaman Kex y cortan en distintos puntos con lo
que se consigue la toxina madura por dos subunidades unidas por puentes disulfuro.
Finalmente la toxina sale al exterior a través de una vesícula.
Inmunidad en cepas Killer
Se da a través de la vía retrógrada de
transporte.
La toxina sintetizada y excretada al exterior
celular regresa al interior celular (una parte de ella), haciendo la misma vía pero en
sentido contrario (A. Golgi ! RE !citoplasma). Por tanto, en la célula se dan
simultáneamente dos cosas, la toxina sintetizada y la pre-pro-toxina. La que entra
por sentido retrógrado interacciona con la pre-pro-toxina. Esta interacción es
detectada por la célula, poliubiquitinada (marcada) en la subunidad beta y
degradada por el proteosoma. En células sensibles, no se da interacción y la toxina
queda libre.
Mecanismos de acción
Estructura de la pared celular:
La pared celular presenta capas donde hay básicamente mucho glucano (1!3-β-
glucanos y 1!6-β-glucano). En algunos puntos de la pared encontramos quitina, en
concreto en las cicatrices de gemación. También hay manoproteínas, que son
proteínas que tienen unidas cadenas de manosa.

➢ Toxina K1
La toxina interacciona primero con la pared celular, en concreto con los 1!6-β-
glucanos, mediante una interacción físico-química (2). Mediante un mecanismo
desconocido, esta interacción transporta la subunidad alfa a la membrana celular,
donde interacciona con un receptor secundario, Kre1p (3). La acción tóxica se puede
deber a: la toxina interacciona con un transportador de membrana (4) que
desestabiliza la membrana debido al transporte de moléculas a favor de gradiente; o
bien, la propia toxina polimeriza en la membrana y genera un poro (5) por el que se
escapan metabolitos pequeños y entran protones, por lo que disminuye el pH. Al
final se despolariza la membrana (pierde el gradiente) y la célula acaba muriendo.

No se sabe lo que ocurre, pero se sabe que se produce un poro por el cual entran
protones y salen metabolitos de bajo peso molecular. Todo lo que haya fuera de la
célula con un gradiente, va a entrar. Esto provoca una despolarización de membrana
y la célula muere.
 ➢ Mecanismo K28
La interacción en este caso se da con las manoproteínas y de aquí pasan las dos
subunidades a la membrana plasmática mediante un mecanismo desconocido. Se
presupone que hay un receptor secundario, y una vez unida la toxina, se forma un
endosoma que la internaliza completa al interior celular (A). En el RE, la toxina
utiliza una serie receptores para pasar al citoplasma. En este caso no interacciona
con la pre-pro-toxina, ya que ha entrado en una célula sensible. La subunidad β es
marcada (ubiquitinada) y degradada por el proteosoma. La subunidad α se transporta
al núcleo y afecta al ciclo celular, impidiendo la síntesis de ADN (bloquea el ciclo
celular) y provocando la muerte (B).

Pichia
membranifaciens y sus toxinas killer
P. membranifaciens forma pseudomicelio abundante con esporas en forma de
sombrero. Fisiológicamente es muy heterogénea siendo muy compleja su identidad
taxonómica y la de su anamorfo Candida valida. Aislada frecuentemente de procesos
industriales vegetales que sufren fermentación láctica (encurtidos).
• Su carácter killer en estos ambientes fue descrito por primera vez por Marquina
1992.
• Se trata de una levadura dominante en estos hábitats.
• No afecta al proceso de fermentación (utiliza ácido láctico como fuente de
carbono).
• No altera el producto.
• Se desarrolla como contaminante natural del proceso que no se realiza en
esterilidad.
Proyecto europeo en los que se trataba de vislumbrar la flora de levadura que
contaminaban un montón de productos de interés alimentario. Se observó la
existencia de una gran población de levaduras en donde había muchas capaces de
producir toxinas killer. Pichia membranifaciens es una levadura dominante en la
fermentación de aceitunas verdes, que no afecta al proceso de fermentación y no
alteraba al producto.
La fermentación de las aceitunas por parte de las bacterias lácticas de la naturaleza
provocaban un pH bajo y una alta concentración de sales, lo que favorecía la
presencia de levaduras killer. Entre todas las especies de levaduras aisladas, se
encontró en gran concentración P. membranifaciens.
- Pichia membranifaciens se aisló por primera vez de un exudado de olmo en 1888.
- Se reclasificó en el género Pichia en 1904.
- Forma pseudomicelio abundante.
- Con esporas en forma de sombrero.
- Fisiológicamente es muy heterogénea siendo muy compleja su identidad
taxonómica y la de su anamorfo Candida valida.
- Aislada frecuentemente de procesos industriales vegetales que sufren
fermentación láctica (encurtidos).
En el estudio se observan dos grupos: unas con más actividad killer (1-6) y otras con
menos actividad (7-10). Esto muestra una diferencia entre las toxinas que se están
produciendo. Se cogieron las cepas de cada grupo con mayor actividad killer. Se han
podido caracterizar dos toxinas: PMKT y PMKT2.

PMKT: mecanismo de acción de tipo K1. El receptor de membrana es Cwp2p, que se

encuentra tanto en la membrana como en la pared. La toxina en un liposoma es
capaz de integrarse en la membrana plasmática y mediante técnicas pash clamp
genera una conductividad a ambos lados de la membrana (genera un poro). Actúa
como una porina, muchos de los iones fisiológicos efluyen a través de él (entra sodio
y protones por la fermentación láctica). El glicerol se pierde en base al gradiente (es
un osmolito compatible). La célula sensible es capaz de defenderse, para ello
sintetiza glicerol, que contrarresta el efecto de la alta concentración de sodio.
Dependiendo de la concentración de toxina, el mecanismo de acción es distinto, pero
ambos provocan la muerte de la célula:
- Alta concentración de PMKT: al interior de la célula pasan iones que acidifican.
Esto activa la ruta Hog, dentro de aquí la Hog1p se fosforila (se activa), esto
provoca una señal en cascada y activa la ruta de síntesis de glicerol. La síntesis
de glicerol consume energía, por lo que la célula está perdiéndola, pero además,
este glicerol se pierde por el poro.

-B a j a

concentración de PMKT: se deben a mecanismos apoptóticos. Se da expresión

de genes relacionados con la eliminación de ROS.

Conclusión: mecanismos de acción de la toxina killer de P. membranifaciens: PMKT

PMKT2: a altas concentraciones de toxina se da una coincidencia en el ciclo celular
de las levaduras, es decir, todas están a la vez en el mismo punto del ciclo, que
coincide con el punto donde
comienza a formarse la yema.

Baja concentración de PMKT2:

apoptosis.

Conclusión: mecanismos de acción de la toxina killer de P. membranifaciens: PMKT2

APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS TOXINAS
KILLER

Levadura killer: levadura que sintetiza y secreta al medio extracelular proteínas o

glicoproteínas (toxinas killer) capaces de inhibir el crecimiento de otras levaduras u
hongos filamentosos (cepas sensibles).

Aplicaciones potenciales de las toxinas killer

1. Biología molecular y celular
Las toxinas killer se pueden utilizar como un modelo por extrapolación con respecto
a otro tipo de toxinas de tipo A/B. Lo que propone es utilizar estas toxinas killer
como modelo para compararlas con otras toxinas.

Toxinas de tipo A/B

Tienen dos subunidades (A y B) y tienen exactamente la misma función que la toxina
K28. La subunidad B es la encargada de interaccionar con un receptor en la pared,
por lo que tiene la función de reconocimiento y la A tiene la función tóxica.
Al igual que las toxinas A/B, K28 es una toxina que depende de la endocitosis y del
transporte en vesículas para ejercer su toxicidad en levaduras: Secuenciación de
genomas y colecciones de mutantes de delección. La ventaja de trabajar con
levaduras es que el genoma esta secuenciado, hay
mutantes en colecciones. Su estudio permite
fácilmente conocer la implicación de: proteínas
específicas de reconocimiento y procesamiento; Lípidos
implicados; Mecanismos de procesamiento.

Utilización del carácter killer como marcador

fenotípico para la selección de cepas
Utilizar la resistencia o capacidad de producir toxina
killer para seleccionar cepas en lugar de utilizar
plásmidos. Es decir, utilizar la proteína killer para seleccionar posibles células con
características de interés.
Tenemos dos cepas con características de interés y queremos obtener una única cepa
con características de ambas. Para unirlas:
Una cepa es auxótrofa para His y productora de la toxina killer, y la otra es
prototrofa para His pero sensible a la toxina. Se generan protoplastos, se fusionan y
estos se hacen crecer en determinadas condiciones para poder seleccionar aquellos
que nos interesen. En este caso se hacen crecer en un medio mínimo donde solo
crecerán las prototrofas (las que tengan capacidad de crecer sin His) y también en
presencia de toxina killer, de forma que solo crecen aquellos híbridos K+/R+. Por
tanto, se usa la toxina como marcador fenotípico.

2. Taxonomía

Biotipado de levaduras
El biotipado se basa en diferenciar cepas por una condición específica. El modo más
habitual es el biotipado respecto a las respuestas a antibióticos (exponerlos frente a
una batería de antibióticos a diferentes condiciones). Las toxinas killer son otra
manera de hacer el biotipado de levaduras, gracias al azul de metileno. Para
diferenciar las cepas resistentes y sensibles se observa el color del halo, ya que las
células vivas internalizan el colorante y mientras estén vivas el
halo será blanco, mientras que al morir, las membranas se
desestabilizan y el colorante sale al exterior. De esta forma se
pueden diferenciar biotipos.

Se pueden utilizar para diferenciar el origen etiológico de

diferentes cepas, en combinación con otra técnica de tipado:
Correlación entre cepas entre S. cerevisiae de distintas regiones
vitinícolas y sensibilidad killer: para el biotipado se realiza una
técnica genética basada en el DNAmit, pero esto da como
resultado cepas mal localizadas. Se necesita combinar con otra
técnica de
biotipado, en
concreto se usa la
toxina killer.

• Biotipado de bacterias patógenas

Utilizar toxinas killer para diferenciar aislamientos de Nocardia asteroides bajo el
cual hay 3 especies que son muy parecidas y difíciles de diferenciar, pero son muy
diferentes respecto a su patogenicidad. Se pone en una palca un césped de cada
especie y se siembran dos killer. Cada especie tiene un perfil de resistencia
diferente, por lo que se pueden diferenciar.
Nocardiosis: es un trastorno raro que afecta los pulmones, la piel o el cerebro de
personas con sistemas inmunitarios debilitados
3. Microbiología clínica/ veterinaria
Casos en los cuales algunas toxinas son capaces de inhibir algunas bacterias.

Actividad killer contra levaduras patógenas de animales y humanos

Candidiasis: levadura habitual en las mucosas que comienza a ser invasiva cuando
existe inmunodepresión. Causada por C. albicans, en menor medida por C. tropicalis
y C. glabrata. Suelen responder a los antifúngicos del mercado. El tratamiento
convencional es el uso de nistatina, fluconazol, ketoconazol, clotrimazol y
anfotericina. Como alternativa potencial se pueden usar toxinas killer.
Criptococosis: es una infección fúngica sistémica de distribución mundial. En
términos globales la enfermedad es poco frecuente, afecta a animales y al hombre,
pero desde la aparición de las infecciones por VIH es un cuadro con un importante
aumento en su incidencia y que se manifiesta fundamentalmente en personas
inmunodeprimidas. Causada por Cryptococcus neoformans. Suele provocar
infecciones pulmonares pero también tienen manifestaciones cutáneas. C.
neoformans es capaz de formar una cápsula. Responde a los antifúngicos del
mercado, como a fluconazol, fluorocitosina o anfotericina. Como alternativa
potencial se pueden usar toxinas killer.
Malassezia pachydermatis: Es una levadura bastante frecuente en caninos y poco en
gatos. Responsable de muchas otitis externas. Puede ser transmitida a humanos.
Tratamiento convencional: Ketoconazol, fluconazol, fluorocitosina, anfotericina
Potencial alternativa: toxinas killer.

Eliminación de levaduras patógenas animales. Salud animal

Los cangrejos que se cultivan en piscifactoría tienen infección por Candida, pero la
toxina de una Picchia puede inhibir su crecimiento.
Problema de la aplicación terapéutica de las levaduras killer

1. Inestabilidad a los valores de pH y temperatura fisiológico: las toxinas en los

rangos de pH y Tª corporal no son capaces de actuar. Son inestables a pH
mayor de 5,5 y a más de 25Cº.

2. Antigenicidad: al ser de origen proteico, la entrada de estas toxinas son

reconocidas por el sistema inmune, se generan anticuerpos y acaban siendo
neutralizadas.

Posibles soluciones
a) Restringir el uso de las toxinas a esas zonas del cuerpo donde el pH y Tª sean
más adecuadas para la estabilidad de las toxinas (aplicación a través de
cremas).

b) Desarrollo de anticuerpos anti-idiotípicos.

c) Desarrollo de una estrategia de Evolución dirigida.

Anticuerpos anti-idiotípicos
Los anticuerpos presentan regiones constantes, variables e hipervariables. Se unen a
través de las regiones hipervariables. El anti-idiotípico es un anticuerpo frente a la
región hipervariable de otro anticuerpo.
Tenemos un Ac primario frente a la toxina killer, este Ac en relación con sus zonas
hipervariables se une a la toxina. Por lo tanto, un anticuerpo secundario va a tener
una estructura similar al epítopo antigénico original. Es decir, no solo la estructura
también simularía la función de la toxina killer.

Desarrollo de una estrategia de Evolución Dirigida para la mejora de los

parámetros de actividad/estabilidad de las toxinas killer
Partiendo de unos genes parentales, ser capaces de cambiarlos a nuestro interés para
que obtengan esas características nuevas.
Esquema general de clonación: ejemplo de la toxina K1. Se producen muchas
mutaciones, se expresan en un hospedador y se ve cómo han afectado esas
mutaciones a las características de interés. Se quiere conseguir un mutante
resistente a pH7.
Clonación
Primero se hace una amplificación por PCR con una mutazima, que es una polimerasa
que tiene alta tasa de error y produce mutaciones de transiciones (purina por purina
y pirimidina por pirimidina). Posteriormente se hace otra estrategia, que es cambiar
las condiciones de la PCR para que la polimerasa provoque mutaciones de
transversiones (purina por pirimidina). En tercer lugar se hace una recombinación
entre los resultados de las anteriores generaciones. Por último se realiza una
recombinación homóloga in vivo
4. Industria alimentaria/ y de la fermentación

Para producir vino de mejor calidad se realiza un proceso de envejecimiento. Hay

una levadura que produce dentro de la barrica de forma muy despacio un metabolito
(4-etilfenol), que daña el vino y hay que tirarlo. Se utiliza una levadura con actividad
killer para eliminar la que daña el vino.

Selección de cepas iniciadoras: buscar aquellas cepas con las características

adecuadas. Entre las propiedades se busca que tengan actividad killer.

Conservación de alimentos: para la producción de quesos hay un problema habitual,

el acastañamiento de quesos.
5. Control biológico
a) Actividad antifúngica contra hongos causantes de enfermedades en plantas
Generan problemas a nivel de agricultura.
Normalmente para controlar las distintas plagas de microorganismos se usan muchos
productos químicos. En general se supone que está bastante controlado. A veces
tiene toxicidad sobre otros microorganismos beneficiosos, animales o plantas. Lo que
se hace es sustituir el uso de estos productos químicos por productos biológicos como
por ejemplo las toxinas killer, por ejemplo el uso de PMKT para inhibir a un hongo
que provoca la podredumbre gris.

b) Control biológico de hongos toxigénicos

Los hongos filamentosos producen micotoxinas. Estas sustancias producen efectos
tóxicos, teratogénicos, mutagénicos, carcinógenos e incluso depresión del sistema
inmune. Es posible el uso de las levaduras killer para controlarlas.

c) Mantenimiento de la estabilidad aeróbica de ensilados

El ensilado es un proceso de conservación del forraje basado en una fermentación
láctica del pasto que produce ácido láctico y una bajada del pH por debajo de 5
(acidificación anaerobia).Permite retener las cualidades nutritivas del pasto original
mucho mejor que el henificado. Si durante el almacenamiento el silo se abre, se
contamina y comienzan a crecer microorganismos como levaduras. Para solucionarlo,
se utiliza Kluv lactis que consume ácido láctico. Se modifica la capacidad de
consumir acido actico pero sigue produciendo la toxina killer.