UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

Ensaio de Potência de Antibióticos

CURSO DE FARMÁCIA
Controle da Qualidade de Medicamentos – FID1012
FUNDAMENTO
Determina-se a potência (atividade) de um antibiótico (que é a
ENSAIO DE amostra em análise) comparando a concentração da amostra
que inibe o crescimento de microrganismo sensível com a
POTÊNCIA DE ANTIBIÓTICOS concentração do padrão do antibiótico que produz inibição
similar.
 Métodos: difusão em ágar e turbidimétrico
Prof. Andréa I. H. Adams
 Indicados para substâncias ou preparações cujo teor não
pode ser definido por métodos físico-químicos.
1

Exemplos de fármacos analisados pelo método

(USP 38, 2015)
•Anfotericina •Bacitracina
•Neomicina •Polimixina
•Vancomicina

MÉTODOS

Turbidimétrico Difusão em ágar

(mede-se a turvação) (medem-se os halos de inibição)

neomicina

1
 Exemplo: ensaio microbiológico para voriconazol
MÉTODO DE DIFUSÃO EM ÁGAR

• Fundamento: Microrganismo teste:

Baseia-se na difusão do antibiótico em um meio de Sacharomyces cerevisae
ATCC 2601, 1%
cultura sólido e inoculado com m.o. padrão,
resultando no aparecimento de um halo de Meio de cultura:
inibição de crescimento, que é medido. Sabouraud dextrose 2%

Diluente:
• Diâmetro do halo é função da concentração do antibiótico: tampão fosfato pH 6,0 ± 0,1

Há relação linear entre o diâmetro do halo (mm) e o logaritmo da Condições de incubação:

22 - 24 h / 30 ºC ± 1 ºC
concentração.

MÉTODO DE DIFUSÃO EM ÁGAR

• Tipos (formas de execução)

- Método de cilindros em placas
- Método dos orifícios ou pocinhos
- Método do disco ou papel

• Delineamento: 2x2, 3x3 , 5x1

Há relação linear entre o diâmetro do halo (mm) e o

logaritmo da concentração do antibiótico (dose)

Delineamento do ensaio Forma de execução: cilindros em placa

2x2 3x3  Placas de Petri (20 x 100 mm)
No delineamento
2x2 e 3x3 são feitas  Cilindros de aço inoxidável, vidro, porcelana, alumínio.
P3
A1 P1 6 placas (réplicas) A1 A2 diâmetro interno: 6,0 mm + 0,1 mm
com essa diâmetro externo: 8,0 mm + 0,1 mm
distribuição altura:10,0 mm + 0,1 mm
P2 P1
P2 A2
A3
 Tempo de incubação: 16 a 18 horas

5x1
Camada
P1 P2 A P4 P5 semeada
P3 P3 P3 P3 P3 P3 P3 P3 P3 P3

P1 P1 P2 P2 A A P4 P4 P5 P5
P3 P3 P3 P3 P3 Camada base

No delineamento 5x1 são feitas 2 placas com essa distribuição, totalizando 10 placas
para obter um teor. Para um n=3, é necessário fazer 3 vezes o procedimento inteiro vista lateral da placa Vista superior da placa

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Forma de execução: método dos orifícios ou pocinhos
Usam-se placas de 20 a 150 mm de diâmetro;
Pocinhos de 5 a 8 mm, no meio inoculado.
As soluções padrão e amostra são inseridas dentro do pocinho,
com pipeta automática, e difundem no ágar
Camada semeada
Camada base
visão lateral da placa Visão superior da placa
PADRÕES
Substâncias de referência (padrões farmacopeicos)
São produtos de uniformidade reconhecida, estabelecidos e distribuídos
pelas farmacopeias. São usados como referência analítica, sem requerer
comparação com outra substância química.
Padrão secundário
Matéria-prima de boa procedência, cuja potência tenha sido determinada
por número adequado de ensaios comparativos em relação a um padrão
farmacopeico, validados por análise estatística apropriada e que os dados e
resultados sejam arquivados à disposição da fiscalização competente.
Tabela de equivalência entre cepas (FB 5, 2010, p. 277)
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Forma de execução: método do disco de papel
 Usado no doseamento de amostras com alta concentração de
solvente orgânico
Usam-se placas de 20 a 150 mm de diâmetro;
Usam-se discos de papel tipo Whatman SS (13 mm de diâmetro).
As soluções padrão e amostra são colocados sobre o papel, com
pipeta automática; aguarda-se evaporação do solvente para depois
depositar os discos sobre o meio inoculado
MICRO-ORGANISMOS EMPREGADOS
São empregados micro-organismos padronizados, obtidos de
centros como:
ATCC: American Type Culture Collection (USA)
INCQS:Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
NCTC: National Collection of Type Culture (Inglaterra)
A FB 5 apresenta uma tabela de equivalência entre cepas oriundas dos
diferentes centros produtores:
Preparo do inóculo
- São várias as exigências físicas e químicas para o crescimento microbiano,
ex.: fontes de carbono, nitrogênio, pH e temperatura. Alguns m.o. exigem
meios simples (B. subtilis e S. aureus) enquanto outros requerem
suplementos.
- No capítulo “Ensaio Microbiológico de Antibióticos” (FB 5, 2010) são
recomendados 22 meios, 17 m.o. e 8 procedimentos diferentes para
preparação de inóculos, padronização da suspensão e composição da camada
base e semeada de acordo com o antibiótico a ser testado
3

Preparo do inóculo
• Os micro-organismos são fornecidos na forma
liofilizada, exigindo recuperação em meio líquido
rico e diversas sub-culturas para retornarem às
características fisiológicas normais
• São usadas suspensões das bactérias ou fungos
especificadas na monografia do medicamento ou
no procedimento geral, que devem ser
padronizadas, a fim de obter suspensões com
transmitância igual a
25 ± 2 %, em 580 nm
1. NO DIA ANTERIOR AO ENSAIO:
A partir da cepa mantida em geladeira
(geralmente em meio inclinado) fazer
repique, para meio indicado na Farmacopeia.
Incubar por 24 h na temperatura indicada.
2. NO DIA DO ENSAIO:
Lavar a superfície do meio inclinado com solução fisiológica estéril e
coletar a suspensão resultante em tubo de ensaio estéril.
Padronizar a suspensão, diluindo com solução fisiológica estéril até
transmitância de 25 ± 2 %, em 580 nm. Obtém-se o INÓCULO.
Transferir volume do inóculo para volume de meio de cultura (camada
semeada – as quantidades constam na monografia farmacopeica)
A suspensão padronizada pode ser mantida em geladeira por vários dias,
semanas ou até meses, depende do micro-organismo.

Preparo das placas

- Alíquota da suspensão microbiana (INÓCULO) é adicionada ao ágar fundido
(48 °C – camada semeada). Este é vertido e homogeneizado sobre a camada
base já solidificada. Os volumes e meios para cada camada são determinados
pelo método geral ou na monografia específica. Volumes usuais: 20-21 mL ou Condições para o desenvolvimento dos
4-5 mL (camada base e semeada, respectivamente).
-Adicionar as soluções da amostra e do padrão. Incubar por 18-24 horas.
ensaios são especificadas no capítulo geral
de Ensaio de Potência de Antibióticos

Exemplos - Ensaio microbiológico (FB 5, 2010)

Exemplos - Ensaio microbiológico Antibiótico
Condições do ensaio#
(FB 5, 2010 – capítulo 5.5.3.3) 1# 2 3 4 5 6 7
cefalotina 1 - 1 1 mg/mL 5 dias 1 0,5 a 2 mg
dactinomicina 1 10.000/mL 2 1 mg 90 dias 2 0,5 a 2 mg
Meios de cultura e
em MeOH
Antibiótico Micro-organismo volume a ser adicionado Volume do inóculo Temperatura
às placas (mL/100 mL) de incubação bacitracina 1 - HCl 0,01 M 100 U.I. Usar no 1 1 a 4 U.I.
mesmo dia
base superfície Condições do ensaio#
1: condição de dessecação do padrão (cada número corresponde a uma condição; exemplo –
cefalotina S. aureus Meio 2 Meio 1 0,1 mL 32 a 35
condição 1: dessecar a vácuo, 60ºC)
ATCC 6538p 21 mL 4 mL
dactinomicina Bacillus subtilis Meio 5 Meio 5 ? 36 a 38
2: solvente inicial: quando não especificado, é o mesmo das diluições
ATCC 6633 10 mL 4 mL 3: solução para diluição: (1) TF de potássio 1%, pH 6; (2) TF de potássio 0,1M, pH 8,0
bacitracina Micrococcus luteus Meio 2 Meio 1 0,3 32 a 35 4: concentração da solução de trabalho
ATCC 7468 21 mL 4 mL 5: prazo de validade da solução sob refrigeração
6: solução para diluição : segue a mesma descrição da “solução para diluição”
7: dose mediana (mg ou UI/mL)

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 Após incubação (18-24h) Resultado
Leitura dos halos 1. Cálculo matemático da potência (%) pela Equação de Hewitt
- cálculo matemático - Potência = antilog M x 100
M = F/b
F = (A1 + A2 + A3) – (P1 + P2 + P3) / 3
Placa P1 P2 P3 A1 A2 A3 b = E/I
1 E = (A3 – A1) + (P3 – P1) / 4
2 I = log R
3
Onde:
4
A = média dos halos da amostra
5
P = média dos halos do padrão
6 R = razão entre doses ou concentrações das soluções aplicadas nas placas
soma Ex: 4, 8 e 16 g/mL, razão = 2. No exemplo: I = log R, logo I = log 2
média

Resultado
Cálculo matemático 2. Avaliação estatística do ensaio (ANOVA)

Resultado esperado: a potência deve encontrar-se dentro

dos limites estipulados na monografia farmacopeica.

Ainda que esteja dentro dos limites, o resultado só será

válido se cumprir determinados critérios estatísticos.

Regressão = significativa
Desvio de linearidade = não significativo
Desvio de paralelismo = não significativo

Análise estatística ANOVA

(exemplo de ensaio 3x3, com 6 placas)

ANOVA
numerador
Fontes de Soma de Quadrado
variação gL quadrados médio Fcal Ftab.
Preparação 1 8,028 8,028 0,38 4,24
Regressão 1 12558,375 12558,375 596,22* 4,24
Desvio de paralelismo 1 35,042 35,042 1,66 4,24
Quadrático 1 3,125 3,125 0,15 4,24
Diferença de quadrático 1 95,681 95,681 4,54 4,24
Entre doses 5 12700,250 2540,050 120,59 2,60
Entre placas 5 1003,917 200,783 9,53 2,60

Dentro (erro) 25 21,063 ........ ........

526,583

Usados para montar a

Total 35 14.230,750 ........... ......... .........
ANOVA
denominador

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 Avaliação do ensaio – Análise estatística
Importante:
CAUSA DE VARIAÇÃO CONDIÇÃO A SER COMENTÁRIOS
CUMPRIDA
Só usar resultados de ensaios aprovados na estatística, pois
REGRESSÃO F calc > F tab Deve ser significativa. Indica que com o aumento da dose,
resultados de ensaios reprovados estatisticamente não são
há um aumento no halo de inibição do crescimento do confiáveis
microrganismo.
DESVIO DE PARALELISMO F calc < F tab Não deve ser significativo. Se não houver paralelismo
entre as curvas dose-resposta do padrão e da • Potência dentro dos limites farmacopeicos, ensaio aprovado na
amostra, as potências de ambos podem aparentar estatística: amostra aprovada (ou lote aprovado)
idênticas no ponto de intersecção. Esta situação
invalida o ensaio, visto que a potência estimada da • Potência fora dos limites, ensaio aprovado na estatística:
amostra é superior ao padrão acima da intersecção e
inferior ao padrão abaixo da intersecção, ou o
amostra reprovada (ou lote reprovado), caso o resultado seja
contrário. confirmado após repetição do experimento
QUADRÁTICO E DIFERENÇA F calc < F tab Não deve ser significativo. Indica que na faixa de • Potência dentro ou fora dos limites, ensaio reprovado na
DE QUADRÁTICO concentrações empregada a resposta (halo) foi
proporcional às doses (concentrações), ou seja, não houve estatística: repetir o ensaio, pois o resultado obtido não é
desvio de linearidade. confiável (o ensaio está reprovado, não a amostra!!)
Caso qualquer um destes parâmetros for descumpridos, o ensaio será INVÁLIDO.

Técnica
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO 1. Em tubos estéreis adicionar:
Fundamento • 9 mL de meio de cultura líquido previamente esterilizado, inoculado com m.o.
• 1 mL de soluções do padrão ou da amostra, em diferentes concentrações
Concentrações do antibiótico a ser dosado são adicionadas a uma série de
(triplicata para cada solução de antibiótico)
tubos ou frascos contendo m.c. líquido e m.o. , incubados em temperatura e
tempo determinados.
A turvação produzida pelo crescimento bacteriano é quantificada por
espectrofotometria de absorção.

P1 P2 P3 A1 A2 A3

2. Incubar na temperatura indicada durante 3 a 5 horas

3. Interromper o crescimento com formaldeído 12% (0,5 mL)
4. Ler a absorvância (530 nm)
Concentração do antibiótico 5. Efetuar cálculos para determinar a potência

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 Exemplos – Ensaio turbidimétrico (FB 5, 2010)

Usar banho-maria com circulação de água

Calibrar o espectrofotômetro com o branco:
Meio de cultura + formaldeído,
nas mesmas quantidades empregadas no ensaio
 Determinar a potência e os limites de confiança através do
método estatístico de retas paralelas, usando as absorvâncias

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Difusão em ágar Comparação entre diferentes métodos para doseamento de antibióticos

Vantagens Difusão em Turbidimétrico CLAE
ágar
não necessita de equipamentos específicos para sua realização
Desvantagens Equipamento Básico Básico Especializado
- maior tempo de incubação do que o turbidimétrico Treinamento Moderado Moderado Moderado
- cuidado extremo no manuseio das placas
Habilidades técnicas Alta Alta Moderada

Tempo para avaliação do 24 5 ≤1

Turbidimétrico resultado (horas)
Vantagens Custo do equipamento Baixo Baixo Alto
- fornece medida objetiva da resposta Precisão do método Moderada Variável Alta
- é mais rápido (3 a 5 horas)
Relação com uso clínico Moderada Alta Baixa
Desvantagens
Robustez Moderada Alta Baixa
amostras não devem apresentar contaminação grosseira ou cor que interfira
na leitura fotométrica

Referências bibliográficas:
FARMACOPÉIA Brasileira 5.ed. 2010.
PINTO, T. J. A.; KANEKO, T. M.; OHARA, M. T. Controle
Biológico de Qualidade de Produtos Farmacêuticos, Correlatos
e Cosméticos. São Paulo: Atheneu. p.242-271.
BAIRD,R.M.; HODGES, N.A.; DENYER, S.P. Handbook of
Microbiolofical Quality Control : CRC Press. p.190-204.