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BIOQUIMICA DA FERMENTACGAO lo Pave kgm Ww Lt MARLENE APARECIDA DEMENIS BAPTISTELLA BELARMINO BAPTISTELLA FILHO Fermentagio alcodica 13 Fermentagao aleodlica CH,OH: CH,OH .CH,OH HOH FH,PO, Glicogénio wan H, | fosfortase NAD+ AMP(4) sesirogenase | ‘i NADH+H* cm CH,OH —_CH,OH CH,OH eee cs}. } % CH: a - \ = 3 a Ae 2 VEO: ARP -descarboxiiase Q ei fea] iruviea, Mg" | fea cooH ? ae on 0 cH, [P] “ ou : q 7 age © we _ ATP io" <= = Eee i rdvica hexoquinase, =) trealase a ‘ADP & uot @l fosfoisomerase . oo th ee foes one Fl Bl ppp. arp SHON on i | we OHS Wy CH,OH Sacalose | enolase {|Z “hexoquinase, Mgt 6 invertase Mom © : ‘COC ea a fosfofrutoquinase, ages eae Pe alot | ay. Mor a maliase AMP (+) ATP(-} Citrato(-) co Mee one i: CH,OH | fobs Yo a fostogiiceromutase, wa |® Lawoase®) ee H20H ac te NADt « NADH+Ht oc ADP. ATP COOH er a. EAR i 5 0-0 CHOH + Fi CHOH HOH 1 isomefase | desitrogenase | tostoption, CHP. CH,-[P) CHe| 5 f quinase” H.-P] | — NADH+Ht Ae Bs x [Conan [asiioaenas\ we CH.OH GHOH M tow Tee S CHOH + Pi One {P] on OH Glicerol Baptistella, M.A.p, JUSTIFICATIVAS 1-0 Homem, ao utilizar a levedura para a produgao industrial de etanol, elegeu o alcool como principal produto, cuja eficiéncia de produgao é comprometida pela formagao dos demais produtos da fermentacao. 2 — O objetivo primordial da levedura 6 crescer e multiplicar, sendo © etanol um produto rejeitado. 3 - Percebe-se, entdo que, os objetivos metabdlicos da levedura, a primeira vista, nao coincidem com aqueles tragados pelo Homem. 4 - A transformagao do agticar, na forma de glicose em etanol e CO; envolve 12 reagdes em seqiléncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especifica. 5 - Essas enzimas, referidas como "glicoliticas", sofrem agdes de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas, inibidores, substancias do préprio metabolismo, pH, temperatura e outros), alguns que estimulam e outros que reprimem a agao enzimatica, afetando o desempenho do processo fermentativo, conduzido pela levedura. Baptistella, M.A.D. OBJETIVO Ao estudar os passos reacionais, catalisados por enzimas, durante 0 processo da fermentagao alcodlica, verifica-se que as condigdes fisico-quimicas (temperatura, pressao osmética, pH, oxigenag&o, nutrientes minerais e organicos, inibidores) do meio podem ser alteradas, em beneficio do Homem, para assim, favorecer a converséo do aclicar em etanol, sem negligenciar as necessidades metabdlicas minimas da levedura. CRONOGRAMA 1 — Introdugao e Justificativas 2~Células e Estrutura Organelas e fungoes Procariotos e Eucariotos Organismos Aerdbicos e Anaerdbicos 3—Proteinas e Enzimas « Fungdes Aminoacidos Catalise Inibidores enzimaticos Regulacao enzimatica 4 -Carboidratos ¢ Estrutura + Endégenos: trealose glicogénio + Exégenos: Glicose, frutose, sacarose 5 Membranas e Lipideos e Estrutura © Fungées 6 - Energia livre Termodinanima e entropia © ATP, ADP e AMP 2 Grupo fosforil © NADH e NAD* Baptistella, M.A.p. 7 — Passos reacionais da via glicolitica. 8 — Vias afluentes da glicélise © -Glicogénio Trealose © Sacarose ¢ Frutose 14 — Regulagéo enzimatica da via glicolitica © Fosfofrutoquinase-1 © Hexoquinase 15 — Fatores que afetam a fermentagéio © Nutrico organica Temperatura pH Inibidores Concentragéo de agticares Concentragao de leveduras © Contaminagéio bacteriana © Formacéo de produtos secundarios Antissépticos Antibiéticos mineral e 18 — Viabilidade X Vitalidade Baptistella, M.A.D. 1 -INTRODUGAO HISTORICO O homem vem utilizando a fermentagao alcodlica desde a mais remota antiguidade; ha mais de 4.000 anos os egipcios fabricavam o pao e produziam bebidas alcoélicas a partir de cereais e frutas, Entretanto, apenas recentemente é que se pdde relacionar a fermentagéo com a levedura, fungo amplamente distribuido na natureza e com capacidade de sobrevivéncia tanto em condigdes aerébias (presenga de O,) como anaerdbias (auséncia de 02), Assim, a humanidade, por longo periodo, se beneficiou desse organismo, mesmo sem saber de sua existéncia, notada pela primeira vez por Antonie van Leewenhoek (1623-1723), ao observar amostra de cerveja em fermentagéo, com seu microscépio rudimentar. ~~ Depois da formulagdo da estequiometria da. fermentagao por Gay-Lussae, ém 41816, Pasteur, em 1863, demonstrou a natureza microbiolégica “da fermentagdo alcoélica como um processo anaerébio, ou seja, a vida se manifestando na auséncia de oxigénio. A partir dai, e, principalmente, durante as primeiras décadas de 1900, as pesquisas culminaram com a elucidagao das reagdes enzimaticas responsaveis pela transformacdo quimica do agucar em etanol e gas carbénico no interior da levedura. Devido a importancia econémica dos processos_ biotecnolégicos, envolvendo a levedura Saccharomyces, quer na panificagéo, na produgao de cerveja, vinho e outras bebidas alcodlicas, como no caso do Brasil, quer na produgéo de um combustivel alternativo e renovavel, tal organismo pode ser yaa Ape We a jjuleoonsiderado 0 Baptistella, M.A.D. fucaridtico) (célula com nucleo organizado e ul _” Processos metabalicos compartimentalizados) mais estudado e cujo metabolismo é o mais conhecido. Mesmo assim, 0 homem ainda se maravilha com as recentes descobertas sobre os mecanismos de regulagdo metabdlica, em leveduras. ~~~ O METABOLISMO NO INTERIOR DA CELULA A transformagao do agticar, na forma de glicose em etanol e CO, envolve 12 reagdes em seqliéncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especifica. Tal aparato enziméatico esta confinado no citoplasma celular, sendo, portanto, nessa regiaio da célula que a fermentagao alcodlica se processa. Essas enzimas, referidas como "glicoliticas", sofrem agées de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas, inibidores, substancias do proprio metabolismo, pH, temperatura e outros), alguns que estimulam e outros que reprimem a ac&o enzimatica, afetando o desempenho do processo fermentative conduzido pela levedura. Convém ressaltar que, a levedura Saccharomyces é um aerébio facultative, ou seja, tem a habilidade de se ajustar metabolicamente, tanto em condigdes de aerobiose como de anaerobiose. Os produtos finais do metabolismo do agticar iro depender das condigées ambientais em que a levedura se encontra. Assim, enquanto uma porgdo do aguicar é transformada em biomassa, CO, e H,0, em aerobiose, a maior parte é convertida,em etanol e@ COz, em anaerobiose, processo denominado de fermentagdo alcodlica. Os carboidratos considerados substratos para a fermentagao, tanto podem ser endégenos (constituintes da_— Baptistella, M.A.D. levedura, como glicogénio e trealose) como _exégenos (Sacarose, _ glicose, frutose e outros), estes ultimos fornecidos a levedura. « O objetivo primordial da levedura, ao metabolizar anaerobicamente 0 agticar, é gerar uma forma de energia (ATP, adenosina trifosfato) que seré empregada na realizagao dos diversos trabalhos fisiol6gicos (absorgdo, excregao e outros) e biossinteses, necessdrios 4 manutengao da vida, crescimento e multiplicagaéo, para perpetuar a espécie. O etanol e o CO, resultantes constituem-se, tao somente, de produtos de excrecdo, sem utilidade metabdlica para a célula em anaerobiose. Entretanto, 0 etanol, bem como outros produtos de excregao (como 0 glicerol e acidos organicos) podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas apenas em condigées de aerobiose. Na glicélise, uma molécula de glicose é degrada, em uma série de reagdes catalisadas por enzimas, para liberar duas moléculas de piruvato, contendo cada uma delas trés atomos de carbono. Durante as reagdes seqienciais da glicélise, parte da energia livpe liberada da glicose é conservada na forma de ATP e NADH. ° A glicélise foi a primeira via metabélica a ser elucidada e é provavel que, atualmente, seja a mais bem entendida. Desde a descoberta de Eduard Buchner (em 1897) da fermentagao que ocorre em extratos de células rompidas de levedura até o reconhecimento claro de Fritz Lipmann e Herman Kalckar (em 1941) do papel metabélico dos compostos de alta energia como o ATP, as reagées da glicélise em extratos de levedura e de mtisculo foram o centro da pesquisa bioquimica. Fermentagdo 6 um termo geral que significa a degradacdo anaerébica da glicose ou de outros nutrientes organicos em varios Baptistella, M.A.D. produtos (caracteristicos para os diferentes organismos) para obter energia conservada em forma de ATP. A quebra anaerébica da glicose é, provavelmente, o mais antigo mecanismo biolégico para obtengao de energia a partir de moléculas organicas combustiveis, ja que os organismos vivos apareceram primeiro em uma atmosfera sem oxigénio. UMA VISAO GERAL: A GLICOLISE POSSUI DUAS FASES A glicose tem seis atomos de carbono e sua divisao em duas moléculas de piruvato, cada molécula com trés atomos de carbono, ocorre em uma segiiéncia de dez passos, os cincos primeiros constituem a fase preparatoria. Nestas reagdes, a glicose é inicialmente fosforilada no grupo hidroxila em C-6 (passo 1). A glicose-6-fosfato, assim formada, é convertida em frutose-6-fosfato (passo 2), a qual é novamente fosforilada, dessa vez em C-1, para liberar frutose-1,6-bifosfato (passo 3). O ATP & doador de fosfato nas duas fosforilagées. A seguir, a frutose-1 ,6-bifosfato é quebrada para liberar duas moléculas com trés carbonos, a diidroxiacetona fosfasto e o gliceraldeido-3-fosfato (passo 4), esse € 0 passo em que ocorre a lise que da 0 nome ao processo. A diidroxiacetona é isomerizada em uma segunda molécula de gliceraldeido-3-fosfato (passo 5), e com isso termina a primeira fase da glicdlise. Note que duas moléculas de ATP precisam ser investidas para ativar, ou iniciar, a molécula de glicose para a sua quebra em duas partes com trés carbonos; haverd, depois, um retorno positivo para este investimento. Baptistella, M.A.D. O ganho energético provém da fase de pagamento da glicdlise. Cada molécula de gliceraldefdo-3-fosfato 6 oxidada e fosforilada por fosfato inorganico (ndo pelo ATP) para formar 1,3- bifosfoglicerato (passo 6). A liberagéo de energia ocorre quando as duas moléculas de 1,3-bifosfoglicerato so convertidas em duas moléculas de piruvato (passos 7 a 10). A maior parte dessa energia € conservada pela fosforilagéo acoplada de quatro moléculas de ADP para ATP. O produto liquido so duas moléculas de ATP por molécula de glicose empregada, uma vez que duas moléculas de ATP foram investidas na fase preparatdria da glicélise. A energia também é conservada na fase de pagamento na formacao de duas moléculas de NADH por molécula de glicose. Nas reagdes seqlienciais da glicdlise, trés tipos de transformagdes quimicas sdo particularmente notaveis: (1) rompimento do esqueleto carbénico da glicose para produzir piruvato; (2) fosforilagaéo do ADP para ATP pelos compostos de fosfato de alta energia formados durante a glicdlise, e (3) a transferéncia de um fon hidreto com seus elétrons para o NAD", formando NADH. O destino do produto, o piruvato, depende do tipo de céiula e das circunstancias metabdlicas. DESTINOS DO PIRUVATO © piruvato formado pela glicdlise pode tomar trés rotas catabdlicas alternativas. Nos organismos aerébicos, ou tecidos sob condicdes aerdbicas, a glicdlise constitui apenas o primeiro estagio da Baptistella, M.A.D. degradag&o completa da glicose. O piruvato é oxidado, com perda do seu grupo carboxila como COz, para liberar o grupo acetila da acetil-coenzima A, a qual € entao totalmente oxidada a CO, pelo ciclo do acido citrico. Os elétrons originados dessas oxidagdes sao passados para o O2 por meio de uma cadeia de transportadores na mitoc6ndria, formando H,0. A energia liberada nas reacgdes de transferéncia de elétrons permite a sintese de ATP nas mitocéndrias. A segunda rota para o metabolismo do piruvato é a sua redug&o a lactato através da chamada via de fermentacao do acido lactico. Quando o tecido muscular esquelético em contracéo vigorosa funciona em condigées de hipoxia — baixa pressdo parcial de oxigénio -, o NADH nao pode ser reoxidado a NAD’, e este é& necessario como receptor de elétrons para que o piruvato continue a ser oxidado. A terceira grande rota do metabolismo do piruvato leva ao etanol. Em alguns tecidos vegetais e em certos invertebrados, e microorganismos como-a levedura da fabricagéo da cerveja, o piruvato @ convertido anaerobicamente em etanol e CO, um processo chamado de fermentacao alcoblica, fermentagao do etanol ou, simplesmente, fermentagao do alcool. Dessa forma, juntamente com o etanol e 0 CO, o metabolismo anaerdébio permite a formagao e excregdo de glicerol, acidos organicos (succinico, acético, pirlvico e outros), alcoois superiores, acetaldeido, acetoina, butilenoglico!, além de outros compostos de menor significado quantitativo. Simultaneamente, ocorre 0 crescimento das leveduras (formagao de biomassa). Estima-se que, 5% do agticar metabolizado pela levedura seja desviado para gerar tais produtos secundarios da fermentagao, Baptistella, M.A.D. resultando num rendimento de 95% em etanol, conforme ja observado por Pasteur em condicées adequadas de fermentagdo. Entretanto, em condig6es industriais, nas quais fatores quimicos, fisicos e microbiolégicos afetam a levedura, rendimentos de 90%, normalmente, s&o obtidos, o que implica em desvios de 10% do aguicar processado para a forma¢ao de outros produtos que nao o etanol, Levando-se em consideragdo as reagdes responsaveis e a estequiometria das mesmas, pode-se calcular 0 equivalente em agar consumido para a formagao de cada um dos produtos da fermentacao, incluindo a biomassa ~ Produtosda==—=~=~*™Y:~*~ @ SS (prueznanssoroy) eapoEqOURED, ate {$ ——— tre —_—— "a'wN ‘eTTeastadeg 81 “ela] BU EpIA Bp OBSNIOAS eU BIOUgIAJal EP SOJUOY — § BANBIy KO6e 8 BEE sspeaout — SPAD} aid fo4q 59'y} aofow quasad way 069 seek 10 suoyic) cs | poausey @ ay OSE u Sulli 450719 ag St ov sr spourmy sobp sezedanyne | dpSyoUqsoYyDAy UESDoK DEROS souSn4 sosodsnqne PHS? | omeSucny.ey EDIDIDIPS —— -s[Buig orusyz20qg «= smeysdseag = s}iesay Botwsod “any Guronpas {OlSRpIDg O14s,90q9 sueweL) eDpquing spoyding 459PI0 Baptistella, M.A.D. © nucledide bacteriano nao é separado do citoplasma por uma membrana, mas nos organismos superiores o material nuclear 6 envolto por uma membrana dupla, 0 envelope nuclear. As células, com envelope nuclear, séo chamadas de eucarlotos; aquelas sem envelope nuclear — células bacterianas — sao os procariotos. —~ O reticulo é uma rede tridimensional de espagos envoltos por membrana altamente enrolada que organiza a sintese de proteinas e lipidios. ae © complexo de Golgi € um sistema de cavidades membranosas que ajuda a distribuir as proteinas. Qs lisossomos sao encontrados somente em células animais; eles contém enzimas capazes de digerir proteinas, polissacarideos, acidos nuciéicos e lipidios aos seus componentes mais simples, aminoacidos, monossacarideos, cidos graxos, etc. O compartimento lisossomal é mais acido (pH < 5). do que o citoplasma (pH aproximadamente 7), e as enzimas lisossomais séo praticamente inativas no pH elevado do citosol. ~ As células das plantas nao possuem lisossomos, embora seus vactiolos desempenhem reagées degradativas semelhantes, bem como outras fungées nao encontradas nas células animais. O pH dentro do vactiolo é geralmente inferior ao pH do vizinho citoso!, O vactiolo também fornece suporte fisico para a célula da planta. Devido a concentragéo de solutos (sais, ons, produtos degradados) ser maior no vactiolo do que no citosol, a agua passa osmoticamente para o interior do vactiolo, no equilibrio, uma press&o de turgor sobre o citoplasma e a parede celular estabiliza o tecido da planta. As leveduras regulam a osmolaridade através de uma variedade de mecanismos, em resposta as mudangas no ambiente Baptistella, M.A.D. em que se encontram. Quando ha um choque hiper-osmético, as leveduras produzem e acumulam osmoprotetores (GLICEROL) para aumentar sua osmolaridade interna, evitando o seu ‘enrugamento, € que a tevaria a morte. Quando ha queda de osmolaridade (meio hipo-osmético), as leveduras necessitam, rapidamente, exportar os osmoprotetores, para evitar a pressdo de turgor excessiva e explosao da célula. Os microrganismos mantém a pressdo osmética interna ligeiramente maior do que o meio em que vivem. A diferenga de pressdo é contrabalangada pela resisténcia da parede celular. a ot il | Furmtalaass = Louis Yasbeure 1853 Low Soluses estiril Profegtods. 12) ® Solucne* S| Pokus * aliese enjequoseidas equeld ep ejnjgo eunn (q) 3 ennewuaseides Jeuuue einjgo euun (2) :seoggueona seinjgo ep sody siop sop eoyeusenbse opdeqsni| — 9 BANBI, cupatesony ont espace dpi omens ‘a'w'H ‘eT TeasTaded Baptistella, M.A.D. As mitocéndrias sao muito evidentes no citoplasma da maioria das células eucariéticas. Nas células aerébicas, as mitocéndrias so as principais produtoras do ATP, que se difunde a todas as partes da célula e fornece energia para o trabalho celular. Os cloroplastos podem ser considerados usinas, com a importante diferenga de que os cloroplastos usam a energia solar, enquanto as mitocéndrias usam a energia quimica dos compostos oxidaveis, VIABILIDADE E VITALIDADE —. 34 p8).006 12 ¥0h A viabilidade expressa a quantidade de células vivas de leveduras em %. Os métodos de andlises utilizados para a sua determinagao séo: ~~ 1 - Replicagdo de Células. - Baseados na capacidade de reprodugdo das células viaveis (contagem em placas (UFC /mL, 2 a 4 dias para resposta). ~ Micro-colénias (células inoculadas em lamina contendo meio de cultivo, e analisadas ao microscépio apés 18 horas de incubacao). 2 - Coloragdo de células. ~ Método mais utilizado devido a simplicidade, apresenta resultado instantaneo, esta baseado na integridade da membrana, as células mortas sdo incapazes de reduzir os corantes. ~~ - Baptistella, M.A.D. 3-Medidas dos Componentes Celulares. - Concentragéo de ATP - Concentragéo de NADH = Razo do Fluxo Glicolitico ~~ Apesar de rapidos, estes parametros muitas vezes ndo representam a realidade, j4 que medem apenas um componente especifico dentro de um processo metabélico complexo da levedura 4 Outros: absorbancia, microcalorimetria, capacitancia. A vitalidade expressa o vigor ou estado fisiologico em que a levedura encontra-se. Em outros termos seria a “SAUDE” das leveduras. Os parametros mais utilizados para a determinago da vitalidade das leveduras so: 1 - Atividade Metabdlica (ATP, NADH, Viabilidade) 2 - Componentes Celulares (Glicogénio, esterdis) 3 - Capacidade Fermentativa (CO,, Mini-fermentagao) 4 - Poder de Acidificagéo 5 - pH Intracelular 6 - Taxa de Consumo de Oxigénio 7 - Teste de Liberagdo de Magnésio Ha muitas variaveis, durante o processo fermentativo, que levam as leveduras sentirem condigées estressantes. Portanto, o Baptistella, M.A.D. estado fisiolégico da levedura 6 o fator mais importante para uma fermentagao eficiente. Deixando, evidente, a necessidade de se estabelecer um método para determinar a sua vitalidade. Atualmente, nao existe método perfeito para determinar a vitalidade das. leveduras, pois cada processo fermentativo tem a sua particularidade. Os mais usados sao: a avaliagao da taxa de produgado de CO, em curto espago de tempo (teste rapido de mini-fermentagao) e teste de poder de acidificagao. A analise da viabilidade das leveduras € extremamente Util, rapida e simples de ser realizada, mas nem sempre, uma levedura, com elevada viabilidade, indica seu melhor estado fisioldgico. Entretanto, qualquer modificagao na composig&io da sua membrana pode “mascarar” o resultado da viabilidade, pois a célula viva acaba absorvendo 0 corante. A analise da vitalidade seria outro indicativo da performance da fermentagao, utilizada como ferramenta para auxiliar um melhor conhecimento das condigdes da fermentagao, visando maior eficiéncia., 3 - VIABILIDADE CELULAR N&o existe um método absoluto para determinagao da viabilidade celular de uma populagao de células de levedura. Para estimar a proporgao de células viaveis em uma cultura ou processo fermentativo, métodos baseados no plaqueamento ou observacdo microscépica tem sido usados. Entretanto, até o momento nao existe um método que dé resultados totalmente seguro na determinagao da viabilidade celular. Baptistella, M.A.D. Este aspecto é extremamente importante, porque a tolerancia da levedura ao seu produto de fermentagdo, o etanol, 6 bastante significante em relagéo a eficiéncia de produgéo de alcool em fermentagdes em escala industrial. Tem sido verificado, também, que a presenga de alcoois superiores (n-butanol, iso-amilico), Acido graxos e seus ésteres, mesmo em baixas concentragées, juntamente com o etanol, agem de maneira sinergistica, intoxicando a célula de levedura, levando-a a morte e, conseqtientemente, diminuindo a viabilidade celular. No controle da viabilidade celular nos processos de produgéo de levedura (fermento prensado) e fermentagao alcodlica (Alcool) a coloragéo das células da levedura com azul de metileno ou eritrosina e 0 cultivo por plaqueamento sdo os mais empregados. Dadas as facilidades e a rapidez da andlise, nas industrias de produgao de alcool, o emprego dos corantes azul de metileno e eritrosina sAo os mais indicados. COLORAGAO COM AZUL DE METILENO Esta técnica consiste em se misturar partes iguais da suspenséo de levedura (amostra) adequadamente diluida e da solugao corante (azul de metileno). As células com alta atividade fisiolgica nado se colorem, enquanto as células inativas (mortas) apresentar-se-do coloridas de azul. A porcentagem ou o numero de células viaveis/mL sera determinada transferindo-se com uma pipeta de Pasteur a amostra ja colorida para a camara de Newbauer. Nesta contar-se-do as células incolores ¢ as coloridas de azul, em microscépio de campo claro utilizando-se a objetiva de imers&o (100x) ou aumentos menores (40x). A contagem, com Baptistella, M.A.D. imersdo, permitira. uma observagao mais precisa das células da levedura quanto a sua estrutura celular. Deverdo ser contadas no minimo 500 células por camara, o que sera regulado pela diluigao adequada da amostra. Para maior precisao da andlise, a diluigéo da amostra devera ser tal que ndo mais que cingllenta células de levedura sejam encontradas por quadriculo da camara, e, nao menos que dez quadriculos da camara, escolhida ao acaso sejam contados. COLORAGAO COM ERITROSINA O procedimento para a determinagdo da viabilidade celular e/ou numero de células vidveis por mL é o mesmo descrito para a técnica de coloragao com azul de metileno, entretanto, neste caso, as células nao viaveis se colorem de rosa intenso. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL TECNICA © Caso a amostra se apresente numa concentragao em torno de 13 a 14%, é necessario fazer uma diluigdo da amostra, para que sejam contadas no minimo 500 células por camara, Portanto, a diluiga&io da amostra devera ser, tal que, nao mais que cinqenta células de levedura sejam encontradas por quadriculo da camara, e, néo menos que dez quadriculos da camara, escolhida ao acaso sejam contados. ° Portanto, deve-se pegar 1 mL da amostra, transferir para baléo de 50 mL e completar com agua destilada. Baptistella, M.A.p. Para a coloragéo da amostra deve-se misturar 1 mL da amostra diluida e 1 mL da solugo corante. Preparar a camara de Newbauer. Para contar em objetiva 40x, deve-se escolher 10 quadriculos e contar todos os seus reticulos. Para contar na objetiva de imersdo - contar as células contidas nos quatro reticulos centrais dos 25 quadriculos. CAMARA DE NEUBAUER Profundidade: 0,1 mm Contém 25 quadriculos Cada quadriculo contém 16 reticulos Area do reticulo: 0,0025 mm’. Volume de liquido em cada reticulo: 0,00025 mm*. Total de reticulos: 400 Volume da camara de Neubauer =0,1 mm®. CALCULOS VIABILIDADE CELULAR A viabilidade celular indica a porcentagem de levedures vivas na populagao de leveduras da amostra considerada. Total células vivas % cel. vidveis =——~-—-------—_________- x 100. Total cel. vivas + mortas Baptistella, M.A.D. BROTAMENTO Indica a porcentagem de leveduras vivas que estado se multiplicando Total brotamento vivos % brotamento = ——------ x 100 Total célula viva POPULAGAO DE LEVEDURAS Total cel. vivas x 4000 Populagao leved./mL = —~-----—-_____—__ x D x 10° Total reticulos contados. onde: D = diluigao da amostra 4~ PROTEINAS As proteinas séo as macromoléculas mais abundantes nas células vivas. Elas ocorrem em todas as células e em todas as partes destas. ia também ocorrem em grande variedade, milhares de diferentes tipos, desde peptideos de tamanho relativamente pequeno até enormes polimeros com pesos moleculares na faixa de milhdes, podem ser encontrados em uma Unica célula. o As suas subunidades monoméricas relativamente simples fornecem a chave para a estrutura de milhares de proteinas diferentes. Todas as proteinas, sejam das linhagens mais antigas Baptistella, M.A.p, de bactérias, sejam das formas mais complexas de vida, sao construidas com o mesmo conjunto de 20 aminodcidos, ligados covalentemente em seqiiéncias lineares caracteristicas

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