Mg.

SANCHEZ ARAUJO, VICTOR GUILLERMO

Ing. CASTAÑEDA DUEÑAS, JULIO CESAR
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
HUANCAVELICA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA
FACULTAD DE INGENIERIA

INFORME N° 03
COLORACION DE MICROORGANISMOS
(TINCION DE GRAM)

ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA

CICLO Y SECCION: “V”

DOCENTE: Mg. SANCHEZ ARAUJO, VICTOR GUILLERMO

Ing. CASTAÑEDA DUEÑAS, JULIO CESAR

INTEGRANTES:

 CONDOR GASPAR, JUAN CARLOS

 DE LA CRUZ VELÁSQUEZ, SENDY GIMENA
 GUARDIA CURASMA, LEONEL HANS
 PAYTAN TAIPE, BETSY DIANA
 PAREDES CCENTE, DEYSI CATALINA
 TAIPE CRISPIN, EDERZON
 TITO TAIPE, MICHAEL

HVCA-2019
A nuestros padres por darnos la existencia, cuidarnos y
apoyarnos siempre en las buenas o en las malas.
A los ingenieros por enseñarnos nuevas cosas útiles, a
nuestros compañeros y amigos por estar en los
momentos más difíciles.
LOS INTEGRANTES DEL GRUPO
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PRACTICA N°3
COLORACION E IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS
(TINCION DE GRAM)
I. INTRODUCCION

La adecuación y la calidad de muestra o espécimen recibidos son de vital importancia para su

análisis en el laboratorio de microbiología. Si las muestras son recolectadas de manera
inadecuada o son manipuladoras sin el debido cuidado los resultados del laboratorio carecen
de validez.
En el muestreo no deben hacerse concesiones en la utilización del equipo de muestreo estéril
ni en el empleo de la técnica aséptica, los cuales deben unirse siempre. Todos los materiales
deben esterilizarse siempre ya sea n autoclave o en el horno.

Para poder visualizar las bacterias se recurre al uso de colorantes, de tal manera que se
pueda evidenciar ciertas estructuras como la pared celular, flagelos, capsulas, esporas, etc.

Generalmente se emplean colorantes en solución acuosa en alcohol, y en muchos de los

casos se hacen uso de soluciones mordientes. Entre las colaboraciones más conocidas
tenemos a Gram, Wirtz, Maneval, entre otras.

II. OBJETIVOS

• Adiestrar los estudiantes en la toma de muestras para exámenes microbiológicos.

• Diferenciar las bacterias por su capacidad de retener los colorantes
• Observar las diferentes formas de bacterias.
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III. MARCO TEORICO

Tinción: Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder
realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no
presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden
observarse claramente sin algún tratamiento previo. De acuerdo a la reacción que ocurre,
existen diferentes tipos de tinción:
a) Tinción simple:
El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.

b) Tinción diferencial:
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre partes
de una misma célula. Estas técnicas utilizan mas de un colorante o bien ciertos reactivos
complementarios para la tinción. Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen, etc.
Colorantes
Los colorantes más utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son catiónicos y se
combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos (las envueltas externas de los microorganismos están por
lo general cargadas negativamente).
Tinción diferencial de Gram:
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Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló
en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en
dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo
no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos
morfológicos distintos de bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la
siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se
cubre con solución Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con
mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 –
2 min. Lavar y secar.
Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula
bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo, así como para prevenir la lisis
osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano.
La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de
peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la
célula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado,
contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por
una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo
10% - 20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano.

Descripción de la tinción de GRAM:

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal
violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el
exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las Gram positivas como las
Gram negativos, están teñidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente
activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y
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forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células Gram
positivas como las Gram negativas se encuentran en la misma situación.
Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias
en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no
se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos
dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se
debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la mezcla de
alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la
célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La
delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
célula se decolora. Las células Gram positivas, a causa de sus paredes celulares más
espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente,
provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular.
Después de la decoloración las células Gram positivas son todavía azules, pero las Gram
negativas son incoloras.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después
de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram
positivas permanecen azules.
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IV. MATERIALES

MATERIALES

CULTIVOS DE
DIFERENTES
MICROORGANISMOS

Lámina que sirve de

soporte para las
LÁMINAS preparaciones o los
PORTAOBJETOS cuerpos que se
observan en un
microscopio.

Se emplea para
transportar, arrastrar
microorganismos
desde la solución de
ASA DE SIEMBRA
trabajo también
llamada “solución
madre” al medio de
cultivo a otro.

Posibilita una mejor

visibilidad de los
MICROSCOPIO elementos u objetos
de menor tamaño,
ÓPTICO obteniendo una
imagen aumentada
de los mismos.
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Se utiliza
principalmente como
contenedor de
líquidos y sólidos a
TUBOS DE ENSAYO las cuales se les va a
someter a reacciones
químicas u otras
pruebas.

Se utiliza cuando no
se necesita un gran
poder calorífico,
MECHERO poseen una mecha
impregnada de
alcohol, que es la que
arde.

REACTIVOS
El cristal violeta (colorante catiónico)
penetra en todas las células
CRISTAL VIOLETA bacterianas (tanto gram positivas
como gram negativas) a través de la
pared bacteriana.
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Sirve para hacer una tinción de

SAFRANINA contraste que pone de manifiesto las
bacterias gram negativas.

Es una solución de yodo (1%) y

yoduro de potasio (2%) en agua
destilada. Este reactivo funciona con
LUGOL algunos polisacáridos; almidones;
glucógenos generando un complejo
de termo hábil que se caracteriza por
ser colorido.
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Son sustancias transparentes con

ACEITE DE las propiedades ópticas y las
características de viscosidad
INMERSIÓN necesarias para su uso en
microscopía.

Se utiliza para aclarar, deshidrata las

paredes de los microorganismos
ALCOHOL ACETONA gram positivos, tratados con
mordiente, y forma una barrera que
la laca no puede atravesar.
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V. METODOS (PROCEDIMIENTO)

MEDIOS DE CULTIVOS CON LAS COLONIAS BACTERIANAS

Primero se recoge los medios

de cultivos con ya las colonias
bacterianas crecidas.
El ing. Julio nos explica cómo
vamos a hacer la identificación
de las bacterias dentro de los
medios de cultivos.
Método (TINCION DE GRAM)

TINCION DE GRAM (PROCEDIMIENTO)

Al conocer el método que se va

a usar, se empieza con el
procedimiento. Para ello se
necesita una muestra de las
bacterias dentro del medio de
cultivo.

Para tomar la muestra se harán

uso de la asa Bacteriológica.
Previamente a esto todos los
materiales a usar fueron
esterilizados.

Se hace la toma de una pequeña

muestra de la bacteria, con el asa
bacteriológica previamente
esterilizada.
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COLORACIONES
Coloración de Gram

Se realiza un frotis de la muestra

en el medio del portaobjetos
(previamente esterilizado) con
ayuda del asa bacteriológica y
agua destilada para esparcir la
muestra.

Se procede a usar el cristal de

violeta.
Para eso se hecha unas gotas
pequeñas a la muestra
bacteriana que se encuentra en
el porta objetos hasta que la
tape por completo.
Una vez tapado se deja reposar
por 1 minuto.

Después de dejar reposar la

muestra dentro de 1 a 2
minutos se procede a enjuagar
la muestra con agua del caño a
chorro suave para no afectar la
muestra.
Una vez enjuagado la muestra
se procede a sacudir el
portaobjeto y se sigue el
procedimiento.
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Una vez ya enjuagado la

muestra se agrega el lugol
sobre la muestra y se deja
reposar la muestra por 1 a 2
minutos

Pasado los 1 a 2 minutos se

procede a enjuagar
nuevamente con agua del
caño a chorro suave.
De ahí se sacude la muestra
y se procede con el
siguiente paso.

Una vez ya teniendo la

muestra enjuagada se hecha
acetona a la muestra para
sacar todo el colorante que
hay.
Se tiene que escurrir por la
muestra hasta que se note
que no haya
desprendimiento de
coloración de la muestra
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Ya limpio la muestra del

colorante se procede a
enjuagar la muestra
nuevamente con agua del
caño a chorro suave.

Ya enjuagado la muestra se
cubre con safranina por un
tiempo de 30 segundos.

Se vuelve a enjugar la
muestra con agua del caño a
chorro suave.
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Se seca la muestra con el

mechero a una distancia
aceptable para que no se
queme la muestra ni se
rompa el vidrio.

Después verter con el aceite

de inmersión sirve para
aumentar la resolución de
un microscopio mediante la
inmersión del lente objetivo
y el espécimen en un aceite
transparente de alto índice
de refracción.
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OBSERVACION EN EL MICROSCOPIO
Se procede a ver las muestras dentro del microscopio como parte de los resultados
para poder identificar si es una bacteria Gram positiva o una bacteria Gram negativa y
que tipo de bacteria se parece.

Se observa la muestra con

ayuda del microscopio.

Observar a (100×), con el

objetivo de diferenciar las
bacterias si son cocos o
bacilos y también reconocer
el color de GRAM positivo
y GRAM negativo

Resultado bacteria de gran positivo color azul

Las Gram + aparecen violeta.
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Resultado bacteria de gran negativa color rojo

Las Gram – aparecen rojas.
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VI. RESULTADOS

 Se extrajo de la incubadora las placas Petri con los microorganismos ya crecidos.

 Se logró identificar con el microscopio sobre una porta objeto, las bacterias presentes
en la placa Petri extraídas de la incubadora de la practica anterior realizada.
 En la tinción Gram se realizó de una forma adecuada y los resultados fueron exitosos
por que se logró ver los microorganismos.
 Los Gram positivos estaban de color violeta morados y había puntos que se miraban
de color guindo rojizos
 Que nos da a conocer que son el grupo de las Gram negativas
 Como podemos observar en la figura 2 hay presencia de los grupos Gram positivos
lo que significa que nuestro cultivo es todo un éxito.
 Con la observación con el objetivo 10 x del microscopio se logró visualizar los
microorganismos tanto las Gram positivas como la gran negativa.

Figura 2: observación con el microscopio Figura 1 : puntos de color violeta hay

y aceite de inmersión presencia de las Gram positivas
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VII. DISCUSION O COMENTARIOS

 Como ya hemos visto este método es útil para la identificación de bacterias según,
en los resultados vistos se ven que hay dos tipos de bacterias tanto como Gram+
como Gram- y esto se demuestra también con el color al verse, la forma de las
bacterias. Este método diferencia las bacterias por el medio de su color y en los
resultados quedo demostrado.
 Una sugerencia seria de que al momento de mojar la muestra en el caño que el
chorro de agua sea suave ya que podría alterar la muestra o limpiar también a las
bacterias.
 También tener un cronometro y estar al tanto del tiempo de cada paso.

VIII. DESARROLLO DE LA ACTIVIDAD

¿CUAL ES EL FUNDAMENTO DE LA TINCION GRAM?

Para la realización de la tinción Gram se utilizan dos colorantes. Uno de carácter primario,
como es el cristal violeta, y el otro de contraste, como la safranina. También se utiliza un
mordiente para la safranina, como el lugol y un decolorante, como el alcohol acetona.
Esta tinción pone de manifiesto la afinidad tintorial de la pared, a cual depende su
composición para que el microorganismo sea Gram+ o Gram- (Rodriguez, 2017)

TIPOS DE TINCION PARA BACTEREOLOGIA

• TINCION DE WRIGHT: se utiliza para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en

el campo de la parasitología.

• TINCION DE ZIEHL-NEELSEN: se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas

como la tuberculosis, que preserva e identifica los componentes estructurales de los hongos.

• TINCION FLUORESCENTES: tinciones de determinadas estructuras como del esporo,

flagelos.
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IX. CONCLUSIONES

 La tinción de Gram es un método de coloración bacteriana muy eficaz para

determinar la presencia de bacterias Gram Positivas y Gram Negativas. El resultado
de la aplicación de esta técnica constituye uno de los criterios más importantes en el
esquema de identificación para el diagnóstico microbiológico en las áreas clínica,
farmacéutica, ambiental, sanitaria, de alimentos, agrícola y en la biotecnológica.

 Cuando adicionamos Yodo – Lugol a la muestra el propósito es formar complejos con

el cristal violeta ya que este actúa como mordiente, en ese punto del procedimiento si
observáramos al microscopio la muestra, todas las bacterias ya sean Gram
Negativas o Gram Positivas se verían de color purpura.

 Con la decoloración por alcohol acetona se arrastra el cristal violeta fuera de la célula
Gram Negativas por lo que estas quedan incoloras mientras en las bacterias Gram
positivas ocurre lo contrario la pared se deshidrata impidiendo la salida del complejo
cristal violeta – yodo por lo que la célula permanecen teñidas de color purpura.

 La safranina tiene la función de contrastar con el cristal violeta para que sea fácil
distinguir a las bacterias Gram – Negativas de las Gram – Positivas.

 Es importante adicionar una gota de aceite de inmersión (aceite de cedro) a las

muestras antes de observarlas por microscopio ya que este corrige el desvío de la
luz al pasar por la muestra.
 El uso de los colorantes y reactivos actúa directamente con la pared celular y el
citoplasma de las bacterias y no con el medio que los rodea. La diferencia de las
bacterias Gram Positivas y Gran Negativas se debe probablemente a la naturaleza
física de sus paredes celulares.

 El peptidoglicano actúa como barrera de permeabilidad evitando la pérdida del cristal

violeta.
La tinción de Gram tiene ciertas limitaciones ya que algunas bacterias no tienen
pared celular como las clamidias y no se podrán identificar al igual que los virus.

 Posiblemente el decolorante etanol o cetona en las Gram positivas (+), contrae los
poros del grueso peptidoglicano, reteniendo el cristal violeta. Mientras sucede lo
contrario con el fino peptidoglicano de las Gram negativas.
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X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Forbes BA, Sahm D, Weissfeld A. Bailey & Scott. Diagnóstico microbiológico. 12a ed. Editorial
Médica Panamericana S.A.; 2009
Beveridge TJ. Mechanism of Gram variability in select bacteria. J Bacteriol. 1990; 172: 1609-
1620.

Rodriguez, F. (2017). Tincion de Gram. Blog de Laboratorio Biomedico, www.franrzmn.com.

https://seleccionesavicolas.com/pdf-files/2012/2/6536-diferenciando-bacterias-gran-y-
gram.pdf

https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4
.pdf
http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/urgencia/capitulo1_1.pdf
https://prezi.com/sbpof86zr0ys/tincion-en-microorganismos/
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XI. ANEXOS
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