Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Procesos Industriales de Separación

Sergio Huerta Ochoa

UAM-Iztapalapa

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

BIOTECNOLOGÍA ENZIMÁTICA
Y BIOCATÁLISIS
BIOENERGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
BIOCOMBUSTIBLES AGRÍCOLA Y VEGETAL

BIOLOGÍA SISTEMAS Y BIOTECNOLOGÍA DE

CIENCIAS ÓMICAS ALIMENTOS y BEBIDAS

BIOMATERIALES BIOTECNOLOGÍA
NANOESTRUCTURADOS AMBIENTAL
http://www.smbb.com.mx/
BIOTECNOLOGÍA MÉDICO BIOINGENIERÍA Y
FARMACÉUTICA FERMENTACIONES

BIOTECNOLOGÍA FISIOLOGÍA
MARINA MICROBIANA

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

PROCESOS BIOTECNOLÓGICOS
Son procesos basados en la utilización de células vivas (silvestres o sometidas a
manipulación genética) o sus subcomponentes (enzimas).

Farmacia
Medio ambiente

Ciencia de los alimentos

Medicina Agricultura

1
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Esquema de un bioproceso
“UPSTREAM” FERMENTACIÓN
- formulación de medios
- desarrollo de inóculo
- esterilización
- inoculación

“DOWNSTREAM”
- extracción de producto,
purificación y refinamiento
- tratamiento de aguas
- recuperación de
subproducto

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Proceso de bioseparación
El procesamiento de un producto después de la fermentación se denomina
“downstream processing” (procesamiento descendente )
• Definición: Recuperación, aislamiento, purificación y refinamiento de productos
sintetizados por procesos biotecnológicos
• Definición extendida: Etapas de refinamiento final de procesos tales como
tratamiento de efluentes y purificación de agua por biotecnología.

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Problemas específicos:
¡¡¡ El fermentador contiene mucha agua !!!
Varía entre 80 % en el caso de la producción de alcohol y 95 % para algunas proteínas
terapéuticas

El producto puede estar dentro de los

microorganismos (intracelular). Tenemos que
destruir estas células, para obtener el producto.

El caldo de fermentación es una mezcla

compleja, que a menudo contiene compuestos
que se asemejan a los productos,

Además, queremos una alta pureza del producto.

Para aplicaciones médicas a veces 99.999 %

2
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

¿Por qué necesitamos bioseparación?

• Enriquecimiento del producto objetivo

• Reducción de volumen
• Remoción de impurezas específicas
• Mejoramiento de la estabilidad del producto
• Alcanzar las especificaciones del producto
• Prevención de la degradación del producto
• Prevención de otras catálisis diferentes a las deseadas
• Prevención de envenenamiento del catalizador

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Retos en ingeniería de bioseparaciones

•Bajas concentraciones de producto
•Gran número de impurezas
•Termolabilidad de bioproductos
•Estrecho margen de operación de pH y fuerza iónica
•Sensibilidad al esfuerzo cortante de bioproductos
•Baja solubilidad de bioproductos en solventes
orgánicos
•Inestabilidad de bioproductos en solventes orgánicos
•Estrictos requerimientos de calidad
•Porcentaje de pureza
•Ausencia de impurezas específicas

Un proceso ideal de bioseparación debe combinar alta capacidad con alta

selectividad, y debe asegurar estabilidad del producto

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Efecto del producto en el proceso de separación

Calidad
Naturaleza
requerida
del producto
(Mercado)

Extensión y tipo
del proceso de
separación

3
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Material properties have to be considered for the development of bioseparation processes.

The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001)

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Productos biológicos
Producto Naturaleza de la bioseparación
requerida
Bebidas alcohólicas: Clarificación, distilación
Cerveza, vino, licores
Ácidos orgánicos: Precipitación, filtración, adsorción,
Ácido acético, ácido cítrico extracción con solventes
Vitaminas: Precipitación, filtración, adsorción,
Vitamina C, vitamina B12, riboflavina extracción con solventes
Amino ácidos: Precipitación, filtración, adsorción,
Lisina, glicina, fenilalanina extracción con solventes
Antibióticos: Precipitación, filtración, adsorción,
Penicilinas, neomicina, bacitracina extracción con solventes
Carbohidratos: Precipitación, filtración, adsorción
Almidón, azúcares, dextranas
Lípidos: Precipitación, filtración, adsorción,
Glicerol, grasas, ácidos grasos extracción con solventes

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Productos biológicos (cont...)

Proteínas: Filtración, precipitación,
Alimentos y sus aditivos centrifugación, adsorción,
Nutracéuticos cromatografía, separaciones
Enzimas industriales basadas en membranas
Hormonas
Enzimas farmacéuticas
Productos derivados de plasma
Anticuerpos monoclonales
Factores de crecimiento
Trombolíticos
Proteínas derivadas de r-DNA
Proteínas de diagnóstico
Vacunas
Productos basados en DNA: Filtración, precipitación,
Pruebas de DNA, plásmidos, centrifugación, adsorción,
nucleótidos, oligonucleótidos cromatografía, separaciones
basadas en membranas

4
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Un buen proceso de separación:

• Asegura la pureza deseada del producto

• Asegura la estabilidad del producto
• Mantiene costos bajos
• Es reproducible
• Es escalable
• Cumple con las regulaciones establecidas

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

La economía del proceso está determinada por:

• Capital invertido
• Costos de operación
• Otros factores
– Eficiencia de las operaciones unitarias individuales
– Pérdidas en cada etapa
– Destrucción o degradación del producto durante el proceso
– Estado físico del producto al final de cada etapa
– Costo del tratamiento del efluente

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología
Correlación entre concentración de producto antes de la
purificación y precio de venta
10 5
Agua
Etanol
Ácido cítrico
10 3
Penicilina
Treonina
Cefalosporina
Amino ácidos Gentamicina
Ácido giberélico
10 1 Antibióticos
Glucosa Hormona humana de crecimiento
Proteasas oxidasa Activador plasminógeno
microbianas de tejido
Amilasas Vacuna B hepatitis
10 -1
Insulina
Enzimas Renina Glicerofosfato
deshidrogenasa
10 -3
Enzimas de Luciferasa
Anticuerpos
diagnóstico Enzimas
monoclonales
terapéuticas
Factor VIIII
10 -5

Urokinasa

10 -7
10 -3 10 -1 10 1 10 3 10 5 10 7 10 9 10 11

Precio de venta ($/kg) (Knight, 1989)

5
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Importancia económica de la ingeniería de la
bioseparación
Costo de bioseparación
Producto Precio relativo Costo del proceso de
aproximado separación (%)
Etanol 1 15
Proteína unicelular 0.8 20
Biomasa de levadura 2 20
Ácido cítrico 3.2 30-40
Glutamato monosódico 5 30-40
Xantanas 20 50
Penicilina G 60 20-30
Enzimas a granel 100 40-65
Proteínas >500 60-80
terapéuticas/DNA

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Importancia de los procesos de separación

a diferentes niveles de producción

Nivel de producción Alto1 Medio 2 Bajo 3

Fuente m.o. m.o. mutados m.o.
seleccionado y DNA recomb. DNA recomb.
Pureza requerida Bajo Mediana a alta Alta
70 - 99 % 90 - 99 % 99.95 - 100 %
Eficiencia de recuperación 90 - 100 % 50 – 90 % 5 – 50 %
Costo recup./costo de producción 0.1 – 0.2 0.3 – 0.7 0.5 – 0.9
Costo recup./(costo de producción 0.1 – 0.2 0.1 – 0.5 0.01 – 0.2
+ costo de desarrollo)
1 Ácido cítrico, 300,000 TON/año (1987)
2 Insulina, 1 TON/ año (1987)
3 Interferon, 10-5TON/año (1987)

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Estrategias para bioseparación

Están disponibles un gran número de métodos de bioseparación
La estrategia está basada en como estos métodos pueden ser mejor
utilizados para una separación dada

Se necesita tomar en cuenta lo siguiente:

• El volumen de la corriente de proceso
• La abundancia relativa del producto en esta corriente de
proceso
• El uso que se le intenta dar al producto, esto es,
requerimientos de pureza
• El costo del producto
• Requerimientos de estabilidad

6
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Las tecnologías de separación pueden clasificarse de acuerdo a su principio fundamental

(Las barras representan el costo relativo de cada proceso)

The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001)

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Proceso de purificación cromatográfica de macromoléculas

Pureza
Refinamiento

Pureza final

Purificación
intermedia
Remoción de:
proteínas, ácidos nucléicos,
endotoxinas y virus
Captura
•Purificación inicial
•Estabilización
•Clarificación
•Concentración

Etapas

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Selección y combinación de técnicas de purificación

Resolución

Velocidad Capacidad

Recuperación

Minimice el manejo de la muestra Cada técnica ofrece un balance

Minimice el número de etapas Entre resolución, capacidad,
Use diferentes técnicas en cada etapa Velocidad y recuperación

7
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Propiedades de las técnicas de purificación comúnmente usadas

Técnica Propiedad Capacidad Resolución Rendimiento Costo Composición Composición
explotada promedio muestra producto
Precipitación por Carga Alta Muy baja Medio Bajo >1 mg ml-1 Volumen pequeño
pH Concentración alta

Precipitación con Hidrofobicidad Alta Muy baja Alto Bajo >1 mg ml-1 I alto
(NH4)2SO4 Volumen pequeño
Concentración alta
Extracción en dos Mezcla Alta Muy baja Alto Bajo Puede Concentración de
fases acuosas Bioafinidad Alta Alta Variable Alto contener polímero alta (PEG)
sólidos
Cromatografía de Carga Media Media Medio Medio I Bajo I alto
intercambio iónico pH correcto pH diferente

Cromatografía de Hidrofobicidad Media Media Medio Medio I alto I bajo

interacción pH diferente
hidrofóbica

Cromatoenfoque Carga / pI Baja Alta Medio Alto I bajo Presencia de anfolitos

Cromatografía de Mezcla Media Alta Medio Medio I bajo I alto

afinidad de teñido pH neutral pH diferente

Cromatografía de Bioactividad Media-Baja Muy alta Bajo Alto Dependiente Condiciones de

afinidad de ligando sobre el desnaturalización
ligando potencial
Cromatografía de Tamaño Muy baja Baja Alto Medio Volumen bajo Diluido
permeación en gel

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Estrategia convencional:

• Recuperación, aislamiento, purificación y refinamiento

• Basado en arreglos lógicos de métodos de bioseparación
• Las técnicas de baja resolución, alta capacidad (por ejemplo,
precipitación, filtración, centrifugación, cristalización) se usan
primero para recuperación y aislamiento
• Las técnicas de alta resolución (por ejemplo, adsorción,
cromatografía, electroforesis) son entonces usadas para
purificación y aislamiento

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Métodos de bioseparación
Baja resolución – alta capacidad
• Ruptura celular
• Precipitación
• Centrifugación
• Extracción líquido-líquido
• Percolación
• Filtración
• Extracción con fluídos supercríticos
• Microfiltración
• Diálisis
Alta resolución – baja capacidad
• Ultracentrifugación
• Adsorción
• Cromatografía de lecho empacado
• Separación por afinidad
• Electroforesis

8
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Métodos de bioseparación (cont...)

Alta resolución-alta capacidad

• Ultrafiltración
• Cromatografía de lecho fluidizado
• Cromatografía de membrana
• Cromatografía de columna de “Monolith”

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Captura
Definición: Purificación inicial de la molécula objetivo de un material crudo
Meta: Rápido aislamiento, estabilización y concentración
Resolución

Velocidad Capacidad

Recuperación
Use una técnica de alta capacidad para reducir el volumen de la muestra
Concéntrese en lo robusto y simple de la primera etapa de purificación

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Purificación intermedia
Definición: Nueva remoción de contaminantes
Meta: Purificación y concentración
Resolución

Velocidad Capacidad

Recuperación
Use diferentes técnicas en cada etapa
Minimice el número de etapas

9
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Refinamiento
Definición: Remoción final de contaminantes traza, Ajuste de pH, sales o
aditivos para almacenamiento
Meta: Producto final de alto nivel de pureza requerido
Resolución

Velocidad Capacidad

Recuperación

Use diferentes técnicas en cada etapa

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Planeando las estrategias de purificación

Elección de las técnicas

Capacidad (C)
Resolución (R)
Rendimiento de proteína
Costo

Ordenando las técnicas

Precipitación (alta C y baja R)
Intercambio iónico (mediana C y mediana R)
Cromatografía de afinidad (mediana/baja C y alta R)

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Reducción del volumen de operación en cada etapa

Sobrenadante

Precipitado

Centrifugación

Precipitación

Intercambio iónico
Diálisis

Filtración en gel
Reducción Enzima
Secado
del volumen en polvo

10
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

In bioseparation, the challenge is to find and adapt the relevant types of separation technologies. Abbreviations: E,
evaporation separation process; M, membrane separation process; S, sorption (ab/adsorption) separation process.
The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001)

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

The bioseparation needs of tommorrow: (a) selective separation methods; (b) scale-up of separation technologies to
meet technical and economic requirements; (c) the combination of traditional and novel methods and (d) cost-effective
large-scale processes.
The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001)

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología
Producción de celulasas (Ghose y Pathak, 1973)

Cultivo sumergido

Cultivo sólido
(Técnica koji)

11
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Producción de enzimas
Cultivo microbiano

Fermentador para siembra

Cultivo sumergido Cultivo sólido

Extracto crudo

Precipitación
Adición de Cromatografía
estabilizantes
Secado
Enzima en solución Enzima en polvo

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Ubicación de las enzimas

Enzimas Enzimas
extracelulares Centrifugación o filtración intracelulares

Rompimiento
celular

Centrifugación
o filtración

Precipitación Cromatografía
Extracción
Secado Ultrafiltración líquido-líquido

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Estrategia de purificación

Producción Calidad

Cantidad
Enzima

Economía

12
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Preservando la actividad
Minimizar

a) Desnaturalización
b) Proteólisis

c) Inactivación

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

El problema más común es la pérdida de

actividad repentina, debida a:

• Falla del ensayo

• Composición incorrecta del buffer
• Impureza de los reactivos
• Proteólisis
• Precipitación
• Presencia de un inhibidor
• Pérdida de un inhibidor o cofactor

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Conceptos de purificación de proteínas

• Factor de purificación
– Es la relación entre la actividad específica después de una
técnica de purificación y la actividad específica en el
extracto crudo

• Rendimiento
– Es la evaluación de la cantidad de actividad o proteína
activa obtenida después de una técnica de purificación.
Generalmente es reportada en %.
Siendo el 100% la actividad del extracto crudo

13
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Frecuentemente se necesitan muchas etapas de separación en

un proceso
En cada etapa puede perderse producto y resultar en una gran pérdida

Por ejemplo: Rendimiento Rendimiento

Si esperamos una pérdida del No. de Etapas
Por etapa (%) global
10 % del producto de cada Después de 1 etapa 0.90 0.90
etapa. El rendimiento en 5 Después de 2 etapas 0.90 0.81
etapas sería: 0.59 %
Después de 3 etapas 0.90 0.73
Esto significa que el número de Después de 4 etapas 0.90 0.66
etapas es muy importante !!! Después de 5 etapas 0.90 0.59

• Otro problema en biotecnología es la gran cantidad de residuos, principalmente

contaminación del agua.
• Podemos reducir las pérdidas de producto y desechos mediante una elección inteligente
de las fases del proceso y la forma de ordenarlos en la cadena de proceso.

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Construcción de una tabla de purificación

Etapa Actividad Proteina Actividad Factor de

Volumen Total Total Específica purifcación Rendimiento
(mL) (U) (mg) (U/mg) (%)
EC (1) 500 3,000 15,000 1.00 100
SA (2) 100 2,400 4,000
CII (3) 45 1440 500
FG (4) 50 1000 125

Etapas: (1) Extracto crudo. (2) Precipitación con Sulfato de amonio.

(3) Cromatografía de intercambio iónico. (4) Filtración en gel

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Intensificación de procesos
La definición de intensificación de procesos (PI) incluye: equipos novedosos,
técnicas de procesamiento y métodos de desarrollo de procesos que, en
comparación con los convencionales, ofrecen mejoras sustanciales en la fabricación
y procesamiento de productos (bio) químicos.
(Moulijn et al. Process intensification and process systems engineering: A friendly symbiosis. Computers and Chemical Engineering 32 (2008) 3–11)

El objetivo para la ingeniería de los

sistemas de proceso (PSE), es mejorar
la toma de decisiones para la creación
y funcionamiento del descubrimiento,
diseño, fabricación y distribución de
productos (bio) químicos.

PI como objetivo y área de habilidad.

14
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Objetos y escalas de estudio en PI y PSE

Moulijn et al. (2008) Process intensification and process systems engineering: A friendly symbiosis.
Computers and Chemical Engineering, 32: 3–11.

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Moulijn et al. (2008) Process intensification and process systems engineering: A friendly symbiosis.
Computers and Chemical Engineering, 32: 3–11.

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología
La intensificación de procesos es una de las tendencias más importantes en la
ingeniería química actual y en las industrias de procesos .
(Hui Zhou et al. 2010. Challenges and innovations in green process intensification. Sci. China-Chemistry, 53: 1470-1475).

Comparación de un proceso de extracción de tres fases con el proceso de extracción convencional

15
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

16