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Centro Estadual de Educação Profissional de Curitiba

Criopreservação Vegetal
Biotecnologia

Nome(s): Derick Fernandes N° 07


Ananda Scott N° 03
Jamile Araújo N° 12

Curitiba/Paraná
2018
Introdução
O que é Criopreservação.
A metodologia de criopreservação de germoplasma vegetal foi desenvolvida a partir
dos anos 70, expandiu nos anos 80 e foi implementada no final do século 20.
A Criopreservação de materiais genéticos vegetais, é uma tecnologia que possibilita
conservar meristemas, embriões, sementes ou outros tecidos da planta por tempo
indeterminado. É um método laboratorial, que utiliza um conjunto de técnicas que
permite conservar células a temperaturas muito baixas (-196ºC) com a utilização de
nitrogênio líquido, essa técnica paralisa o crescimento da planta e a consequente
multiplicação, possibilitando a formação de um banco de germoplasma em um
espaço reduzido.Essa nova linha de pesquisa está sendo adotada também pelo
Laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa Clima Temperado, em Pelotas/RS.
E qual o objetivo da criopreservação de vegetais.
A exposição das plantas ao nitrogênio, conserva e pode eliminar partículas virais
dos tecidos vegetais, técnica denominada crioterapia. Além de garantir ao
laboratório economia em mão de obra, a Criopreservação possibilita a formação de
um banco de germoplasma em um espaço reduzido, facilita o acesso à esses
bancos pelos pesquisadores e é uma alternativa à manutenção do germoplasma em
condições de campo, onde está sujeito à ação de pragas, além da conservação dos
recursos genéticos. Neste caso, o material livre de doenças pode ser resgatado
diretamente do laboratório.
Em que consiste a tecnica de criopreservação de vegetais.
Para evitar que durante o congelamento em nitrogênio líquido, se formem cristais
de gelo e em decorrência disso hajam injúrias celulatres incapazes de serem
revertidas, toda a água livre congelável das células são removidas, uma vez que o
teor de água favorável ao congelamento do material vegetal é estabelecido, sua
integridade é mantida durante o armazenamento em longo prazo, graças à
inativação da atividade enzimática, redução do metabolismo basal, ausência de
divisão e respiração celulares.
Os avanços obtidos no estabelecimento de protocolos de criopreservação permitem
a conservação de células em suspensão, calos, anteras, pólen, meristemas, ápices
caulinares, gemas apicais e laterais, protoplastos, sementes inteiras, eixos
embrionários crioterápicos, erradicando vírus e fitoplasmas existentes em material
vegetal, para manutenção de duplicata de segurança de coleções de plantas
propagadas vegetativamente, de culturas importantes e de espécies ameaçadas de
extinção.
Metodologias Disponíveis
Congelamento Lento
Os primeiros protocolos de criopreservação de tecidos vegetais utilizavam
congelamento em duas fases, congelamento lento até uma temperatura de pré-
congelamento (-30 a -40 ºC), a uma velocidade de congelamento definida (0,5-2,0
ºC/minuto) usando um congelador programável, seguida de imersão direta em
nitrogênio líquido, durante esse processo, a célula desidrata-se reduzindo a um
mínimo a água livre presente, o que evita a formação de cristais de gelo em seu
interior e previne a ocorrência de injúria. Em condições experimentais, quando as
células atingem a temperatura de pré-congelamento, a maior parte da água livre
congelável já escapou para o ambiente extracelular e a exposição à temperatura
criogênica tem muito pouco efeito adverso.
É uma metodologia relativamente simples e utilizada com sucesso para a
criopreservação de gemas laterais dormentes de espécies de clima temperado,
neste caso, as gemas laterais são coletadas no inverno, estação em que as plantas
encontram-se em estado de dormência e são resfriadas lentamente (1 ºC/hora) até
que a temperatura de -30 ºC seja atingida, em seguida são mergulhadas
diretamente em nitrogênio líquido. Para a avaliação de sua viabilidade as gemas
laterais são descongeladas e enxertadas.
Encapsulamento-desidratação
Este método foi desenvolvido por Fabre & Deureuddre (1990), consiste no
encapsulamento do explante em uma matriz de alginato de cálcio, o que resulta na
formação de “sementes sintéticas” Após sua formação, essas sementes são
submetidas a uma série de tratamentos, ajustando o teor de água por volta de 20-
25%, o que possibilita o congelamento rápido.
Os tratamentos mais comuns consistem no pré-cultivo do material em soluções
altamente concentradas de sacarose (0,3 a 0,7 M) ou combinadas com outras
substâncias crioprotetoras e desidratação por meio de exposição ao fluxo de ar da
cabine de fluxo laminar ou à sílica gel, ou por equilíbrio com soluções salinas
saturadas.
Um procedimento usado com muito sucesso para a criopreservação de uma grande
variedade de espécies de plantas. Na fase de regeneração após descongelamento,
a cápsula propicia a absorção e retenção de substâncias nutritivas do meio de
cultura e de soluções de crioprotetores que contribuem para a regeneração do
explante, à semelhança do que faz os cotilédones e endosperma nas sementes.
Vitrificação ( formação do estado vítreo)
Tem-se os os primeiros relatos de uso da vitrificação de tecidos vegetais em
1989, a vitrificação refere-se ao processo pelo qual a solução celular que está
supersaturada em decorrência da desidratação, sofre uma mudança para um estado
sólido amorfo ao ser submetida à temperatura do nitrogênio líquido. Essa transição
envolve apenas mudanças físicas na viscosidade do líquido, o que lhe confere as
propriedades mecânicas de um sólido, embora não se forme uma estrutura
cristalina.
Os procedimentos baseados na vitrificação, simplificaram o procedimento de
crioproteção, são aplicados a uma ampla variedade de tecidos vegetais, eliminaram
a necessidade de congeladores programáveis e permitiram que explantes
complexos pudessem sobreviver ao congelamento rápido.
Existem outros dois métodos derivados da vitrificação, a gota-vitrificação e a
lâmina-vitrificação, em ambos, os explantes são submetidos ao tratamento de
vitrificação com soluções crioprotetoras, sendo que o diferencial está na fase
do congelamento. No primeiro, após a vitrificação, gotas da solução de vitrificação
contendo um único explante são transferidas para uma tira de alumínio sobre a qual
os explantes são congelados. No segundo, os explantes são encapsulados sobre
uma lâmina de metal antes do tratamento de vitrificação
Na criopreservação de sementes ortodoxas em bancos convencionais de
germoplasma (-20 ºC) pode haver perda de viabilidade no decorrer do tempo,
resultados observados em bancos genéticos e modelos matemáticos sugerem que a
longevidade de sementes ortodoxas armazenadas a temperaturas criogênicas pode
ser até 175 vezes maior que a -20 ºC.
A criopreservação de sementes ortodoxas é recomendada especialmente para a
conservação de material elite como espécies nativas endêmicas, ameaçadas,
genótipos raros ou ainda coleções nucleares. Estas coleções são estabelecidas
como cópias de segurança para coleções que estão mantidas a -20 ºC.
Por outro lado, as sementes recalcitrantes são sensíveis à dessecação e às baixas
temperaturas, dificultando o seu armazenamento por longo período, entretanto, é
possível realizar a criopreservação de sementes recalcitrantes realizando pesquisas
para cada espécie.
Fatores que interferem na criopreservação de vegetais.
Vários fatores estão relacionados com a sobrevivência e a regeneração de material
criopreservado e, dentre eles tem-se o tamanho e estágio de desenvolvimento do
material, desidratação, congelamento, descongelamento e regeneração.
Devido ao fato de serem menores, as sementes apresentam vantagens na
criopreservação, são mais apropriadas para o congelamento já que a desidratação e
o congelamento são realizados de forma mais rápida e uniforme em material vegetal
de menor tamanho.
O teor de água no material determina o sucesso da criopreservação, quando baixos,
podem ocasionar desidratação excessiva e morte das células, e quando altos,
podem favorecer a formação dos cristais de gelo no interior das células com
consequente colapso e morte celular. Os crioprotetores podem ser usados para
reduzir os efeitos danosos da água em nível celular quando o material vegetal for
submetido ao nitrogênio líquido. Porém, os crioprotetores podem ter efeitos
negativos como serem tóxicos ou causarem estresse osmótico, ocasionando a
morte das células ou modificando sua resposta morfogenética.
Até que o protocolo se torne rotineiro, alterações físicas do germoplasma podem
ocorrer devido à inadequação da dessecação e da taxa de congelamento ou
descongelamento. O desenvolvimento e a otimização de protocolos de
criopreservação têm favorecido a manutenção da integridade genética, física e
bioquímica e minimizado os processos deteriorativos e de senescência de várias
espécies de plantas. Ainda que não haja registros de alterações morfológicas, em
análises bioquímica, cromossômica e molecular, há relatos sobre a susceptibilidade
do germoplasma a distintos tipos de estresses (hídrico, térmico, oxidativo), assim
como, a mudanças epigenéticas durante a criopreservação (Kaczmarczyk et al.,
2012; Engelmann & González-Arnao, 2013).
Quais as aplicações da criopreservação de vegetais.
As diferentes metodologias de criopreservação desenvolvidas, testadas e
disponibilizadas comprovam que esta técnica pode ser efetivamente utilizada para a
conservação de germoplasma de um grande número de espécies de plantas.
Entretanto, sua aplicabilidade ainda não atingiu o mesmo nível para todos os tipos
de estruturas e tecidos vegetais, como é o caso das sementes recalcitrantes.

CONCLUSÃO:
Observa-se, uma grande diversidade de resposta entre diferentes espécies de
plantas, o que dificulta a generalização do uso da tecnologia de criopreservação e o
desenvolvimento de protocolos de caráter universal, entretanto, existem ainda várias
abordagens técnicas que podem ser desenvolvidas e utilizadas para melhorar a
eficiência dos protocolos e aumentar a aplicabilidade da criopreservação.
A padronização e universalização das metodologias desenvolvidas, sua aplicação
em caráter de rotina para a conservação em larga escala de recursos genéticos
vegetais vegetais bem como a validação e de metodologias e otimização de
protocolos, serão os principais desafios e prioridades futuras.
Referências:

-https://www.embrapa.br/
-https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CNPA/16667/1/DOC115.PDF
-https://www.embrapa.br/documents/1355163/2005846/doc319.pdf/1655456c-5129-
4fda-8646-e98ca951183b

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