BIOQUIMICA.

Práctica 6. Estudio del efecto de la concentración de

sustrato [s] sobre la velocidad de reacción enzimática:
Determinación de la constante de Michaelis-Menten
(Km) de la Ureasa.

0
INDICE

Índice de cuadros 2

Índice de figuras 2

Introducción. 3

Revisión de literatura 4

Materiales y métodos 6

Resultados y discusión 7

Conclusiones 11

Bibliografía. 11

1
Índice de cuadros
Cuadro 1. Resultados del experimento en los tubos de ensayo……………… 9
Cuadro 2. Inversos de la concentración y Velocidad inicial de los tubos de
ensayo……………… …………………………………………………………….10
Cuadro 3. Velocidades y concentraciones de los tubos de ensayo con su Km y
Vmax……………… ………………………………………………………………10

Índice de figuras.

Figura 1. Representación del cambio en la energía libre de una reacción catalizada

enzimáticamente (línea continua) y la misma no catalizada (línea punteada)……. 3

Figura 2. Titulación de la muestra……………………………………………………… 6

Figura 3. A la izquierda matraces ya titulados, a la derecha matraces sin titular…7

Figura 4. Gráfica de concentración y velocidad inicial de los tubos de ensayo

(ecuación de Lineweaber y Burk)……………………………………………………. 10

Figura 5. Gráfica de los inversos de concentración y velocidad máxima de los

tubos de ensayo (ecuación de Michaelis-Menten)………………………………….11

2
INTRODUCCION

Las enzimas catalizan reacciones específicas, las enzimas poseen energía libre de
activación lo que ocasiona que la velocidad de una reacción aumente. Las
reacciones ocurren cuando la enzima se une a la molécula que va a ser
transformada llamada sustrato (S), a través de interacciones no covalentes,
formándose un complejo enzima-sustrato [ES], el que en una etapa posterior se
descompone en el producto [P].

A la actividad enzimática le pueden afectar varios factores, como la temperatura, el

pH, la concentración de sustrato, las propiedades de la misma enzima o los
inhibidores, los cuales afectarían claramente la formación del producto. Ya que la
acción de una enzima se puede perder o ser mínima en caso de que estas variables
están en exceso o en deficiencia, respectivamente.

El funcionamiento de las enzimas, este ligado a la contante de Michaelis y Menten

(Km) y la velocidad máxima (Vmax), ya que la Km corresponde a la concentración
de sustrato con la cual la velocidad de reacción enzimática alcanza un valor igual a
la mitad de la velocidad máxima. La Km nos da una idea la afinidad que tiene la
enzima por su sustrato, cuanto mayor es Km menor es la afinidad (predominan las
formas E (enzimas) y S(sustratos) libres), cuanto menor es Km mayor es la afinidad
(predomina la forma ES- complejo enzima-sustrato).

La Km es independiente de la concentración de la enzima [E] y también varía con

el pH, con la temperatura y con la estructura del sustrato, de tal forma que si una
enzima posee dos sustratos tendrá una Km para cada sustrato.

La Vmax seria la velocidad que obtendríamos cuando toda la enzima se encuentra

unida al sustrato. Y esta seria toda la actividad de la enzima en determinada
reacción.

Asimismo, cabe mencionar que, Las enzimas no cambian la constante de equilibrio

de una reacción (Keq). La Keq depende sólo de la diferencia entre los niveles de
energía de los reactivos y los productos ( G) y las enzimas no cambian el G° de

3
una reacción, las enzimas sólo rebajan la energía de activación, pero no cambian la
diferencia de energía entre los reactivos y los productos

Las reacciones catalizadas por las enzimas se clasifican en 6 clases: Clase 1:

Oxidorreductasas, Clase 2: Transferasas, Clase 3: Hidrolasas, Clase 4: Liasas,
Clase 5: Isomerasas, Clase 6: Ligasas.

Para realizar la presente practica se realizó la experimentación para el estudio del

efecto de la variación de concentración de sustrato [S] sobre la velocidad de
reacción.

REVISIÓN DE LITERATURA

Los enzimas son biomoléculas especializadas en la catálisis de las reacciones químicas

que tienen lugar en la célula. Son muy eficaces como catalizadores ya que son capaces de
aumentar la velocidad de las reacciones químicas mucho más que cualquier catalizador
artificial conocido, y además son altamente específicos ya que cada uno de ellos induce la
transformación de un sólo tipo de sustancia y no de otras que se puedan encontrar en el
medio de reacción.

Características de las enzimas

Las enzimas presentan una serie de características notables como las siguientes:

1. Son proteínas que poseen un efecto catalizador al reducir la barrera energética de

ciertas reacciones químicas.
2. Influyen sólo en la velocidad de reacción sin alterar el estado de equilibrio.
3. Actúan en pequeñas cantidades.
4. Forman un complejo reversible con el sustrato.
5. No se consumen en la reacción, pudiendo actuar una y otra vez.
6. Muestran especificidad por el sustrato.
7. Su producción está directamente controlada por genes.
8. Especificidad

¿cómo funciona una enzima?

El mecanismo de acción de una enzima se puede entender desde dos perspectivas. La

primera trata a la catálisis desde el punto de vista de los cambios en energía que ocurren

4
durante la reacción; las enzimas proveen una vía alterna, energéticamente favorable que
es diferente de la reacción no catalizada. La segunda describe cómo el sitio activo facilita
químicamente la catálisis de la enzima.

Cambios de energía que ocurren durante la reacción.

Virtualmente todas las reacciones químicas tienen una barrera energética que separa a los
reactivos, reactantes o substratos de los productos. Esta barrera se denomina energía libre
de activación que es la diferencia en energía que existe entre los reactivos y los productos.
El lugar donde la energía libre de activación es máxima, se denomina estado de transición.
En la siguiente figura se ejemplifica la transformación del reactivo A en el producto B a
través del estado de transición T*:

A D T* D B

Figura 1. Representación del cambio en la energía libre de una reacción catalizada

enzimáticamente (línea continua) y la misma no catalizada (línea punteada).

Regulación de la actividad enzimática

Una molécula de enzima no tiene por qué actuar siempre a la misma velocidad. Su actividad
puede estar modulada por:

 Tiempo
 Temperatura
 Concentración de enzimas
 Concentracion de sustrato

5
  Ph

A veces, un enzima requiere para su función la presencia de sustancias no proteicas que

colaboran en la catálisis: los cofactores. Los cofactores pueden ser iones inorgánicos como
el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores.
Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama coenzima. Muchos de estas
coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas.

Algunos enzimas no se sintetizan como tales, sino como proteínas precursoras sin actividad
enzimática. Estas proteínas se llaman proenzimas o zimógenos. Para activarse, los
zimógenos sufren un ataque hidrolítico que origina la liberación de uno o varios péptidos.
El resto de la molécula proteica adopta la conformación y las propiedades del enzima activo

Algunos enzimas no se sintetizan como tales, sino como proteínas precursoras sin actividad
enzimática. Estas proteínas se llaman proenzimas o zimógenos. Para activarse, los
zimógenos sufren un ataque hidrolítico que origina la liberación de uno o varios péptidos.
El resto de la molécula proteica adopta la conformación y las propiedades del enzima activo.

MATERIALES Y MÉTODOS.
OBTENCIÓN DE UREASA. Se pesaron 10
gramos de harina de soya integral y se colocaron
en un vaso de 100 cm3. Se agregaron 50 cm3 de
acetona al 32% y se mezclaron perfectamente
con un agitador. Se coloco en baño María a 37
°C por 10 minutos. Se estuvo agitando y
posteriormente se filtro con ayuda de un embudo
y una gasa doble.
Para la segunda parte de la práctica “ESTUDIO
DEL EFECTO DE LA VARIACIÓN DE [S]
SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN”.

Figura 2. Titulación de la muestra.

6
Se prepararon 8 tubos de ensayo, el
primero se tomó como blanco de
reactivos. A los otro siete se les
colocaron Urea, buffer, H2O (excepto al
blanco de reactivos), después de 5 min
de pre-incubación se agregó ureasa y
por último posterior a una incubación de
30 minutos a 50 °C se agregó HgCl2
(gotas) (excepto blanco de reactivos).
Se tomaron muestras de 5 cm3 de la
harina de soya y se agregaron a los
tubos además de, una gota de indicador
de pH y se tituló con HCl 0.1 molar hasta
"el vire" del indicador, (de verde a rosa-
grisáceo). Figura 3. A la izquierda matraces ya titulados, a la
derecha matraces sin titular.

CÁLCULOS Y RESULTADOS

1. Calcular la “Titulación Corregida” (TC) restando el valor obtenido en

cada tubo, el volumen empleado en el “Blanco de Reactivos” (BR).

TC= (valor del tubo) – (valor del BR)

Tubo #1: TC= 1.6 - .6= 1

Tubo #2: TC= 2.3 - .6= 1.7

Tubo #3: TC= 3.7 - .6= 3.1

Tubo #4: TC= 4.7 - .6= 4.1

Tubo #5: TC= 4.8 - .6= 4.2

Tubo #6: TC= 5.5 - .6= 4.9

Tubo #7: TC= 4.9 - .6= 4.3

2. Calcular la velocidad inicial (V0) en micromoles de producto min-1,

mediante la siguiente fórmula:

7
 𝑇𝐶 (50 𝑚𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3 )1.1
𝑉0 =
30 𝑚𝑖𝑛

1 (50 𝑚𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3 )1.1

Tubo #1: 𝑉0 = = 1.83
30 𝑚𝑖𝑛

1.7 (50 𝑚𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3 )1.1

Tubo #2: 𝑉0 = = 3.11
30 𝑚𝑖𝑛

3.1 (50 𝑚𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3 )1.1

Tubo #3: 𝑉0 = = 5.68
30 𝑚𝑖𝑛

4.1 (50 𝑚𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3 )1.1

Tubo #4: 𝑉0 = = 7.51
30 𝑚𝑖𝑛

4.2 (50 𝑚𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3 )1.1

Tubo #5: 𝑉0 = = 7.7
30 𝑚𝑖𝑛

4.9 (50 𝑚𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3 )1.1

Tubo #6: 𝑉0 = = 8.98
30 𝑚𝑖𝑛

4.3 (50 𝑚𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3 )1.1

Tubo #7: 𝑉0 = = 7.88
30 𝑚𝑖𝑛

3. Calcular las concentraciones de UREA (S) en micromoles cm-3 o

milimolar (nM) empleando la siguiente fórmula:

(𝑐𝑚3 𝑑𝑒 𝑈𝑅𝐸𝐴)(250 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3 )

(𝑆) =
11 𝑐𝑚3

(0.5)(250 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3

Tubo #1: (𝑆) = = 11.36
11 𝑐𝑚3

8
 (1.0)(250 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3
Tubo #2: (𝑆) = = 22.72
11 𝑐𝑚3

(2.0)(250 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3

Tubo #3: (𝑆) = = 45.45
11 𝑐𝑚3

(5.0)(250 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3

Tubo #4: (𝑆) = = 113.63
11 𝑐𝑚3

(7.5)(250 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3

Tubo #5: (𝑆) = = 170.45
11 𝑐𝑚3

(8.0)(250 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3

Tubo #6: (𝑆) = = 181.81
11 𝑐𝑚3

(9.0)(250 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑚3

Tubo #7: (𝑆) = = 204.5
11 𝑐𝑚3

4. Elaborar un cuadro con los datos obtenidos y cálculos realizados y

elaborar las gráficas de: a) Michaelis y Menten y b) Lineweaber y Burk.

Reactivo Tubo

Blanco 1 2 3 4 5 6 7
de
Reactivo
s

Urea 0.25 M (cm3 ) 9.0 0.5 1.0 2.0 5.0 7.5 8.0 9.0

Buffer (gotas) 1 1 1 1 1 1 1 1

H2O (cm3 ) 0.0 8.5 8.0 7.0 4.0 1.5 1.0 0.0

HgCl2 (gotas) 4 0 0 0 0 0 0 0

PRE-INCUBACIÓN A 50°C POR 5 MIN

Ureasa (cm3 ) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

INCUBACIÓN A 50°C POR 30 MIN

HgCl2 (gotas) 0 4 4 4 4 4 4 4

V0 1.83 3.11 5.68 7.51 7.7 8.98 7.88

(S) 11.36 22.72 45.45 113.63 170.45 181.81 204.54

Cuadro 1. Resultados del experimento en los tubos de ensayo.

Vmax 59.5238095
9
Km 11.4345238
1/Vo 1/(S)
0.54644809 0.08802817
0.32154341 0.04401408
0.17605634 0.0220022
0.13315579 0.00880049
0.12987013 0.00586682
0.11135857 0.00550025
0.12690355 0.00488902
Cuadro 2. Inversos de la concentración y Velocidad inicial de los tubos de ensayo
con su Km y Vmax.

1/(S)
0.1
0.09 y = 0.1921x - 0.0168
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Figura 4. Gráfica de concentración y velocidad inicial de los tubos de ensayo

(ecuación de Lineweaber y Burk).

Vo (S)
1.83 11.36
3.11 22.72 Vmax 0.01675322
5.68 45.45 km 0.45830122
7.51 113.63
7.7 170.45
8.98 181.81
7.88 204.54
Cuadro 3. Velocidades y concentraciones de los tubos de ensayo con su Km y
Vmax.

10
 (S)
250
200 y = 27.356x - 59.697
150
100
50
0
0 2 4 6 8 10
-50

Figura 5. Gráfica de los inversos de concentración y velocidad máxima de los

tubos de ensayo (ecuación de Michaelis-Menten).

CONCLUSIONES.

A mayor concentración de sustrato (UREA) aumenta considerable mente la

velocidad inicial (v0).

BIBLÍOGRAFIA.

Juan Manuel Gonzalez Mañas. (10 Octubre del 2000). cursos de biomoleculas .
06 de Mayo del 2018, de de apartamento de Bioquímica Sitio web:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/index.htm

Alejandro Porton Andion. (05 Enero de 2001). Enzimas. 06 de Mayo del 2018,
de DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA Sitio web:
http://www.bionova.org.es/biocast/tema14.htm

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