nutrientes

Artigo

Efeitos benéficos de diferentes flavonóides na função vascular e renal em ratos hipertensos L-

NAME

M. Dolores Paredes [1] [2] , Paola Romecín 1 , Noemí M. Atucha H2 D , Francisco OValle tJ D ,

Julián Castillo [3] , M. Clara Ortiz 1 e Joaquín García-Estan

1 Departamento de Fisiolog í um, Facultad de Medicina e Instituto Murciano de

Investigaciones Biosanitarias, Universidad de Murcia, 30120 Murcia, Espanha;
madopaca@um.es (MDP); paodunromec@gmail.com (PR); ntma@um.es (NMA); clara@um.es
(MCO)

2 Departamento de Anatom í um Patol ó gica, Facultad de Medicina, IBIMER, IBS.Granada,

Universidad de Granada, 18011 Granada, Espanha; fovalle@ugr.es

3 Instituto Universitário de Envejecimiento e Departamento de Pesquisa e

Desenvolvimento, Grupo Nutrafur SA-FRUTAROM, 30820 Alcantarilla (Múrcia), Espanha;
j.castillo@nutrafur.com

* Correspondência: jgestan@um.es ; Tel .: + 34-868-884-880

Recebido em 7 de março de 2018; Aceito: 10 de abril de 2018; Publicado em: 13 de abril de 2018

Resumo: Fundamentos: avaliamos o efeito anti-hipertensivo de diversos extratos flavonóides

em um modelo de rato com hipertensão arterial causada por administração crônica (6 semanas)
do inibidor da síntese do óxido nítrico, L-NAME. Métodos: Ratos Sprague Dawley receberam L-
NAME sozinho ou L-NAME e extratos vegetais ricos em flavonóides (Limão, Toranja + Laranja
Amarga e Cacau) ou flavonóides purificados (Apigenina e Diosmina) por 6 semanas. Resultados:
O tratamento com L-NAME resultou em uma elevação acentuada da pressão arterial, e o
tratamento com extratos de Apigenina, Extrato de Limão e Toranja + Laranja Amarga reduziu
significativamente a pressão sanguínea elevada desses animais. A apigenina e alguns destes
flavonóides também melhoraram a vasodilatação aórtica dependente e independente do óxido
nítrico e a excreção urinária elevada de nitrito. Anormalidades nos órgãos-alvo, como enfartes
cardíacos, arteriopatia hialina e necrose fibrinoide nas artérias coronárias e aorta, foram
melhoradas por esses tratamentos, reduzindo o dano vascular do órgão-alvo. Conclusões: os
flavonóides incluídos neste estudo, especialmente a apigenina, podem ser utilizados como
ingredientes funcionais com potencial benefício terapêutico na hipertensão arterial.

Palavras-chave: flavonóides; óxido nítrico; coração; rim; balanço de

sódio; fenilefrina; acetilcolina
A hipertensão do L-NOME é um modelo muito utilizado de disfunção endotelial. Além disso, já
que a administração de L-NAME induz a hipertensão arterial, ela tem sido usada extensivamente
para o interferir no papel do NO no controle da pressão arterial [ 10 - 12 ]. O rim parece ser um
dos primeiros órgãos que reagem à perda de NO, e uma resposta de natriurese de pressão
reduzida, além do papel reforçado do sistema renina-angiotensina têm sido implicados na sua
fisiopatologia [ 10 - 12 ]. A hipertensão arterial induzida pela administração crônica de L-NAME
é acompanhada de remodelação cardiovascular, muito evidente no coração e também em
condutos e vasos de resistência. Hipertrofia ventricular esquerda e fibrose miocárdica [ 12 , 13
], espessamento da parede da aorta e remodelação das artérias de resistência mesentérica [ 14
] têm sido relatados. Recentemente, a expressão da proteína eNOS foi regulada negativamente
nos vasos sanguíneos e a depleção dos níveis plasmáticos de NO foram descritas em ratos
tratados com L-NAME [ 15 ] , provavelmente contribuindo para um menor relaxamento vascular,
aumento da resistência vascular e da pressão arterial [ 16 ]. Níveis aumentados de marcadores
de estresse oxidativo também foram observados em ratos hipertensos L-NAME [ 14 ] , incluindo
peroxinitrito, um intermediário muito reativo e um dos mais potentes oxidantes conhecidos em
sistemas biológicos, que causa comprometimento de longa duração da resposta vasoativa aos
vasodilatadores [17]. Os produtos derivados do estresse oxidativo não apenas diminuem a
biodisponibilidade do NO, causando comprometimento do relaxamento vascular, mas também
causam o desacoplamento da NOS para produzir superóxido vasoconstritor, em vez do NO
vasodilatador [ 17 , 18 ].

Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos vasculares e renais de diversos
extratos flavonóides em ratos hipertensos tratados com L-NAME. Também examinamos alguns
dos mecanismos envolvidos em seus efeitos benéficos, como a melhoria da biodisponibilidade
de NO e da função endotelial e vascular, a redução dos marcadores de estresse oxidativo e os
efeitos nas alterações morfológicas cardiovasculares.

2 Materiais e métodos

2.1. Animais

Todos os experimentos foram realizados em ratos machos Sprague-Dawley (Harlan Lab.,

Barcelona, Espanha) alojados em um ambiente de temperatura controlada, com ciclo claro-
escuro de 12: 12h no Animal Care Facility da Universidade de Murcia (REGAES300305440012).
). Os animais foram mantidos e tratados de acordo com as diretrizes estabelecidas pela União
Européia para a proteção de animais usados em experimentos (86/609 / EEC). Todos os
procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de
Múrcia (C1310050303).

2.2. Grupos Experimentais

Ratos de oito a nove semanas de idade, pesando 300-325 g, foram randomizados em sete
grupos: 1. Controle ( n = 6), ratos sem qualquer tratamento; 2L-NAME ( n = 6), ratos que
receberam L-NAME crico (ter metico de N -p-nitro- L- arginina, 10 mg / kg / dia); 3Apigenina (A,
n = 6), ratos tratados simultaneamente com L-NAME mais A (1,44 mg / kg / dia); 4Extrato de
Limão (LE, n = 6), ratos tratados simultaneamente com L-NAME mais LE (2,84 mg / kg / dia);
5Toranja + Extratos de Laranja Amarga (GBO, n = 6), ratos tratados simultaneamente com
extrato de L-NAME mais GBO (9,28 mg / kg / dia); 6Extrato de Cacau (COE, n = 6), ratos tratados
simultaneamente com L-NAME mais COE (2,52 mg / kg / dia); 7Diosmina (D, n = 6), ratos tratados
simultaneamente com L-NAME mais D (7,16 mg / kg / dia).
Um resumo das principais características dos flavonóides utilizados no presente estudo está
disponível como um arquivo suplementar. Os extratos selecionados, foram em virtude de sua
importância no mercado, nível de vendas, etc. e todos eles foram utilizados como ingredientes
em suplementos nutricionais por muitos anos. Todos esses extratos foram usados com razoável
sucesso neste mercado no campo da saúde cardiovascular, embora talvez não especificamente,
dada a diversidade de seus mecanismos potenciais de ação e os efeitos fisiológico-
macroscópicos correspondentes. O estudo utilizou uma dose única (mg / kg peso / dia) com base
no consumo habitual do mercado, com um ajuste mínimo para obter dosagens que supunham
a mesma incidência em dose-custo / dia (ver Tabela S1 no Arquivo Complementar).

Todos os tratamentos foram administrados durante 6 semanas, na água de beber, com exceção
da Diosmina que foi dada misturada com o alimento em pó, em alimentadores de pó (Tecniplast,
Radnor, PA, EUA). Todos os animais tiveram livre acesso a uma dieta padrão de ratos com um
teor de sódio de 0,5% (104 mEq / Kg) e água da torneira, com ou sem tratamentos. As
concentrações das drogas foram ajustadas diariamente de acordo com o peso corporal e a
ingestão de água e alimentos. Todos os produtos, exceto o L-NAME (Sigma, St. Louis, MO, EUA),
foram gentilmente cedidos pelo Grupo Nutrafur SA-FRUTAROM.

A composição dos diferentes extratos usados neste estudo foi determinada por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (HPLC) como descrito anteriormente [ 19 , 20 ] .Os cromatogramas de
HPLC também foram incluídos no arquivo suplementar. Em todos os extratos e compostos
purificados ensaiados, os componentes ativos únicos são os flavonóides. Uma descrição
detalhada e quantitativa é fornecida na Tabela S2. Os demais componentes até 100% da
composição do extrato foram (dependendo de cada extrato): polissacarídeos da fonte vegetal
utilizada para a extração (1-50%), água (3-5%), sais minerais (1- 5%), pectinas (1-5%) e lípidos (1-
2%). As estruturas moleculares dos principais flavonóides são também descrito na Tabela S2.

2.3. Procedimentos experimentais

Os ratos foram mantidos em suas gaiolas até as semanas 4 e 5, quando se acostumaram

progressivamente a gaiolas metabólicas individuais (Tecniplast, Radnor, PA, EUA) três dias por
semana. Então, a semana 6, após dois dias de adaptação, medimos o consumo de alimentos e
água e o volume urinário (diurese) em 24 horas. As amostras de urina foram recolhidas e
centrifugadas (1000 x g, 10 min) para remover o material sólido e então mantido em - 80 ◦ C
para análise posterior.A concentração urinária de sódio foi determinada usando um eletrodo de
sódio (Thermo Scientific Orion, Waltham, MA, EUA). O balanço de sódio (mEq / dia / 100 g) foi
calculado como a diferença entre o consumo de sódio e a excreção urinária de sódio e calculado
pelo peso corporal. O consumo de sódio (mEq / dia) foi obtido pela multiplicação do consumo
de alimentos por dia (g / dia) pelo teor de sódio da dieta (0,104 mEq / g). A excreção urinária de
sódio (mEq / dia) foi determinada como produto da concentração de sódio e volume urinário de
24 h (mL / dia).

2.3.1. Medição da Pressão Arterial e Extração de Amostras

Após o estudo metabólico foi concluído, os animais foram anestesiados com pentobarbital de
sódio (5 mg / kg, ip) e colocado numa mesa aquecida para manter a temperatura corporal a 37
◦ C. Um cateter de polietileno (PE-50) foi colocado no lado direito artéria femoral para medir
pressão arterial média (MAP; transdutor de pressão Hewlett Packard 1280 e amplificador
8805D, Andover, MA, EUA) e coletar amostras de sangue, como descrito anteriormente [ 10 - 12
] .Então, o sangue foi coletado para dentro de tubos heparinizados e o plasma foi obtido por
centrifugação (1000 x g, 10 min, 4 ◦ C).Depois disso, o animal sofreu eutanásia ao abrir o
tórax. Extraímos a aorta torácica descendente e a colocamos em uma placa de Petri contendo
solução de Krebs oxigenada e pré-aquecida para o estudo de reatividade. Finalmente, rins,
coração e aorta abdominal também foram removidos. Todas as amostras foram congeladas ( -
80 ◦ C) e uma pequena porção também foi fixada com solução de formalina a 10% para estudos
anatomopatológicos.

2.3.2. Estudo de reatividade vascular

A aorta torácica foi limpa de gordura aderente e tecido conjuntivo; cuidados foram tomados
para não perturbar o endotélio vascular, como descrito anteriormente [ 21 ] .Em seguida, a aorta
foi cortada em quatro anéis (3-4 mm) e montada em 10 mL de órgãos (sistema de banho
orgânico LE 01004, Panlab, Barcelona, Espanha) contendo uma solução fisiológica de Krebs com
a seguinte composição (mM): NaCl, 118; KCl, 4,7; CaCl2, 2,5; MgSO4, 1,2; NaHCO 3 , 25; KH 2 PO
4 , 1,2; edetato de cálcio dissódico 0,026; e glucose, 5.6.A solução de Krebs foi mantida em 37 ◦
C e borbulhado continuamente com uma mistura de 95% de O2 e 5% de CO 2.Os anéis são
conectados a transdutores de força isométricos (TRI202P, Panlab) para detectar mudanças de
tensão que foram adquiridas e analisadas com um sistema de aquisição de dados (AD
Instrument, Oxford, UK) que consiste em um amplificador de ponte (FE228), um hardware de
aquisição de dados (PowerLab 8/30) e um software (LabChart 6,0). Os anéis aórticos foram
equilibrados durante pelo menos 45 minutos a uma tensão de repouso de 2 g antes de qualquer
protocolo experimental específico ser iniciado. Durante este período, a solução de banho foi
substituída a cada 15 min e, se necessário, o tom basal reajustado para 2 g. Após o período de
estabilização, os anéis aórticos foram constringidos usando uma curva dose-resposta cumulativa
para fenilefrina (Phe, 10 - 9 -10 - 4 mol / L), administrada em bolus de 0,1 mL.Em seguida, os
anéis foram lavados (geralmente 2-3 vezes) até o repouso a tensão foi atingida novamente e um
segundo período de estabilização de 30 minutos foi permitido. Para avaliar as respostas
vasodilatadoras à acetilcolina (Ach), os anéis aórticos foram pré-contraídos com um submáximo
dose de Phe (10 - 6 mol / L).Uma vez atingido um patamar estável, foi realizada uma curva dose-
resposta cumulativa para o Ach (10 - 9 -10 - 4 mol / L) para avaliar a vasodilatação dependente
do endotélio. Posteriormente, os anéis foram freqüentemente lavados novamente e um terceiro
período de estabilização de 30 min foi permitido e seguido por um período de incubação de 30
min com o inibidor de NOS L-NAME (10 - 4 M) para inibir a síntese de NO.Em seguida, uma curva
cumulativa concentração-resposta para Ach foi novamente realizada, para avaliar o papel do NO
na vasodilatação dependente do endotélio. Finalmente, nós adicionamos um único dose de
nitroprussiato de sódio (SNP, 10 - 4 M) para testar as respostas vasodilatadoras independentes
e funcionalidade do músculo liso. As respostas a Phe são expressas em gramas e o relaxamento
para Ach e SNP como a porcentagem do efeito máximo de Phe. Soluções de estoque dessas
drogas foram preparado em água destilada e mantido congelado a - 20 ◦ C. As soluções de
trabalho foram preparadas diariamente na solução de Krebs. As concentrações do fármaco são
expressas como concentrações finais no banho. Todos os reagentes e Os compostos vasoativos
foram comprados da Sigma-Aldrich e Panreac (Barcelona, Espanha).

2.4. Procedimentos analíticos

TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) no plasma e tecido renal foram

determinados como uma medida de peroxidação lipídica usando um método colorimétrico [ 17
] .Resumidamente, 0,5 mL de potássio tampão fosfato (0,1 M, pH 7,4) foi adicionado a 100 pL
de amostra de plasma misturada ou 50 pL de rim lisado de tecido. Após a mistura, 1 mL de
solução reagente [1 mmol / L de mesilato de deferoxamina, 7,5% ( p / v ) de ácido tricloroacético,
0,25 mol / L de HCl e 0,37% de ácido tiobarbitúrico] foi adicionado e a mistura foi vórtice-
misturado, coberto com folha de alumínio para evitar a evaporação e aqueceu-se a 90 ◦ C
durante 15 min num aquecedor de bloco seco (Heatblock II, VWR, Thorofare, New Jersey,
EUA).Depois que a mistura retornou ao quarto temperatura ambiente, TBARS de padrões
(preparados a partir de 1,1,3,3-tetraetoxipropano) e extraído em 1 mL de butanol. Após uma
vigorosa mistura em vórtice e uma breve centrifugação (1000 x g por 5 min), a absorbância da
camada de butanol foi lida a 532 nm em um espectrofotômetro (Eppendorf Biophotometer Plus,
Hamburgo, Alemanha), e o valor foi expresso em nmol / mL de plasma ou nmol / mg de proteína
renal.A concentração de proteína foi medida na urina e nos lisados usando o método baseado
em ácido bicinconínico (Sigma). A excreção plasmática e urinária de nitrito foi determinada pela
reação de Griess. Resumidamente, volumes de amostra de 100 pL foram misturados com 50 pL
de 1% de sulfanilamida em 5% de fosfato de potássio.Em seguida, 50 p L de 0,1% de N - (1-naftil)
etil-Enediamine adicionou-se dicloridrato e incubou-se durante 15 min. A concentração de
nitrito foi quantificada em espectrofotômetro a 540 nm em relação aos padrões e subtraindo-
se um branco de cada indivíduo amostra. A concentração final foi expressa em pg / mL para
plasma ou pg / dia para amostras de urina.

2.5. Análise histopatológica

Amostras de tecido aórtico, cardíaco e renal foram fixadas em formaldeído tamponado a 10% e
então processadas, embebidas em parafina e seccionadas (4 p m) como relatado anteriormente
[ 22 , 23 ] .Corte renal renal, coração ventricular e aorta torácica e abdominal foram corados
com coloração de hematoxilina-eosina e ácido periódico-Schiff. O estudo morfológico foi
realizado por um patologista em secções aleatórias cegas dos tecidos, com microscopia de luz e
utilizando a coloração mais adequada para cada lesão. As medidas histomorfométricas foram
realizadas com o software ImageJ 1,47 [ 24 ] (NIH, Bethesda, MD, EUA).Na aorta, a espessura da
parede foi medida em três diferentes, regiões selecionadas aleatoriamente e também três vezes
em cada região. No coração, diferentes parâmetros de As lesões cardiovasculares foram
analisadas em três cortes transversais em diferentes níveis do ventrículo: (1) a espessura do
septo interventricular foi avaliada na região central central das cavidades cardíacas; (2) o
número de todos os infartos cardíacos foi contado nas três lâminas de cada coração para avaliar
a ausência (0) ou a presença (1) de infartos cardíacos; (3) arteriopatia hialina e (4) necrose
fibrinóide foram também medidas de maneira dicotômica dependendo da ausência (0) ou
presença (1) dessas alterações; e (5) a relação entre o diâmetro luminal e a espessura da parede
nas artérias coronárias principal e intramural foi obtida a partir de cinco medidas de cada
artéria. No rim, avaliamos as principais alterações observadas em cortes transversais que
incluíam córtex e medula. Estes foram: (1) ausência ou presença de arteriopatia hialina em todas
as artérias vistas em toda a seção; (2) a relação entre o diâmetro luminal e a espessura da parede
na principal artéria renal ou ramos principais (se a primeira estiver ausente); e (3) ausência (0)
ou presença (1) de cilindros / cilindros tubulares na região cortical e medular de toda a seção do
rim. Não observamos nenhuma lesão glomerular apreciável e apenas outras lesões vasculares e
tubulares escassas. Finalmente, a fim de estimar a lesão vascular global, pontuamos (0) se
apenas um dos dois órgãos, coração ou rim, foi danificado e (1) se ambos os órgãos foram
afetados no mesmo animal.

2.6. Métodos estatísticos

Os dados são apresentados como a média ± erro padrão.As diferenças entre os grupos foram
comparadas principalmente pela análise de variância unidirecional (ANOVA). Nas expericias de
reactividade vascular, os valores de CE 50 foram calculados a partir das curvas individuais e
expressos como o logaritmo negativo (pEC50).As diferenças foram consideradas
estatisticamente significativas em um nível de p inferior a 0,05.
3 Resultados

O peso corporal e o hematócrito de todos os grupos experimentais estão listados na Tabela 1.

Após o período de estudo de seis semanas, os ratos L-NAME mostraram um peso corporal
significativamente menor em comparação aos ratos controle e todos os tratamentos com
flavonóides mostraram uma tendência para um peso corporal normal quando comparados aos
controles, especialmente no caso da apigenina. O hematócrito de todos os grupos
experimentais foi muito semelhante, sem diferenças significativas entre eles.

Tabela 1. Valores de peso corporal e hematócrito nos grupos experimentais.

Peso HematócritoIngestão Ingestão deDiurese Balanço de

Natriurese
Corporal Alimentar (g /Água (mL /(mL / 24 sódio (mEq /
(mEq / 24 h)
(g) (%) 24 h) 24 h) h) 24 h / 100 g)
429,73 ± 12,83 ±
C 47,38 ± 0,47 23,05 ± 0,68 35 ± 0,54 0,41 ± 0,08 0,15 ± 0,05
6,36 1,46
345,73 ± 7,85 ±
LN 47,20 ± 1,20 21,1 ± 1,21 31,25 ± 4,7 0,22 ± 0,06 0,43 ± 0,11 *
22,29 * 1,69
426,90 ± 17,37 ±
UMA 50,67 ± 2,38 20,83 ± 0,63 30 ± 0,22 0,47 ± 0,02 0,04 ± 0,05 t
11,46 3,85
404,72 ± 13,45 ±
LE 49,83 ± 1,21 18,6 ± 0,49 * 25 ± 1,67 * 0,33 ± 0,08 0,15 ± 0,11
16,96 2,79
392,65 ± 16,88 ± 2,4810,65 ±
GBO 48,75 ± 3,35 16,1 ± 1,49 * 0,26 ± 0,08 0,17 ± 0,11
14,98 * 1,87
399,38 ± 21,84 ±
COE 49,40 ± 1,47 16,58 ± 0,9 * 31,24 ± 5,6 0,24 ± 0,06 0,19 ± 0,04
20,57 4,52

Abreviaturas: C, controle; Grupo tratado com éster metílico de LN, N (G) -Nitro- L- arginina; A
(Apigenina); LE (extrato de limão); GBO (Grapefruit + extrato de laranja amarga); COE (extrato
de cacau) e D (Diosmin). Os dados são médios ± SEM * p <0,05 vs. Controle; t p <0,05 vs. L-NAME.

3.1. Pressão Arterial e Variáveis Urinárias

Os dados da pressão arterial média (PAM) são mostrados na Figura 1 . A administração oral de
L-NAME por seis semanas causou um aumento significativo na pressão arterial média. Os
tratamentos com extratos A, LE e GBO reduziram significativamente a MAP associada à inibição
crônica da NOS. Diurese e natriurese não foram estatisticamente diferentes nos grupos
experimentais 1 ) , embora o grupo L-NAME tenha tendência a valores mais baixos.Em relação
ao balanço de sódio, um maior balanço de sódio foi encontrado no grupo tratado com L-NAME,
indicativo de retenção de sódio. Os grupos tratados com flavonóides não apresentaram
diferenças estatísticas no balanço de sódio quando comparados aos grupos controle ou L-NAME,
embora o grupo tratado com apigenina tenha apresentado menor balanço de sódio do que o
grupo L-NAME (Figura 2 ) .
Figura 1. Pressão arterial média (PAM) nos grupos experimentais. Abreviaturas: L-NOME: ( éster
metílico de N (G) -Nitro- L- arginina), LE (extrato de limão), GBO (grapefruit + extrato de laranja
amarga),

COE (extrato de cacau). Dados são média ± SEM * p <0,05 vs. Controle; + p <0,05 vs. L-NAME.

Figura 2. Balanço de sódio nos grupos experimentais. Abreviaturas: L-NOME: ( N (G) -Nitro- L-
arginina metil éster), LE (extrato de limão), GBO (Toranja + extrato de laranja amarga), COE
(extrato de cacau).Dados são média ± SEM * p <0,05 vs. Controle; + p <0,05 vs. L-NAME.
A curva de dose-resposta para Phe foi significativamente deslocada para cima nos animais
tratados cronicamente com a L-NAME (Figura 3) e valores de pEC50 foram significativamente
aumentados em comparação com os controlos (Tabela 2 ) .As respostas dos grupos tratados
com L-NAME e flavonóides não foram significativamente diferentes, mas GBO, COE e D também
apresentaram um pEC 50 maior do que o grupo controle.Vasodilatação máxima induzida por
Ach (Figura 4 ) foi significativamente reduzida nos anéis aórticos de ratos L-NAME hipertensos
em comparação aos ratos controle (Tabela 2 ) .O relaxamento de Ach melhorou na aorta de
ratos tratados com A, LE e COE, mas o relaxamento ainda permaneceu menor do que em ratos
controle. Após administração de L-NAME agudo (10 - 4 mol / L) a estes anéis aórticos (Figura 5
), as respostas relaxantes foram ainda mais reduzidas, mas houve algumas respostas residuais
nos grupos A e COE.

Figura 3. Resposta pressora à fenilefrina em anéis aórticos. Abreviaturas: L-NOME: ( éster

metílico de N (G) -Nitro- L- arginina), LE (extrato de limão), GBO (grapefruit + extrato de laranja
amarga), COE (extrato de cacau).

Mesa 2. Resposta contrátil à fenilefrina e relaxamento máximo à acetilcolina e nitroprussia

sódica nos grupos experimentais.

Phenylephrine Acetylcholine SNP

pEC 50 (molContração Relaxamento Após agudo L-Relaxamento

Grupo
/ L) máxima (g) Máximo (%) NAME Máximo (%)
-6,45 ±
C 2,37 ± 0,15 82,70 ± 2,50 27,38 ± 6,54 99,38 ± 1,62
0,086
-6,83 ±
LN 2,54 ± 0,12 19,88 ± 4,14 * 4,55 ± 2,70 * 89,71 ± 2,03 *
0,064 *
-6,56 ± 0,09
UMA 2,76 ± 0,37 35,87 ± 6,89 * 18,47 ± 3,92 + 96,14 ± 1,73
+
LE - 6,77 ± 0,122,16 ± 0,10 31,57 ± 8,23 * 5,74 ± 3,93 * 91,65 ± 3,12
-7,22 ± 0,18
GBO 2,18 ± 0,49 21,96 ± 5,32 * 7,67 ± 1,02 * 84,74 ± 2,93 * ' +
*
-7,08 ± 0,14
COE 2,09 ± 0,02 29,63 ± 3,99 * 13,65 ± 2,40 + 90,50 ± 1,57 *
*
-7,00 ± 0,14
D 2,01 ± 0,34 13,78 ± 4,77 * 5,23 ± 1,81 * 91,59 ± 3,13
*
Os dados são média ± abreviaturas SEM como na tabela 1. pEC 50 é o logaritmo negativo do
meio efetivo máximo concentração (EC50). * p <0,05 vs. controle; + p <0,05 vs. L-NAME.

Figura 4 Resposta vasodilatadora à acetilcolina em anéis aórticos pré-constritados com

fenilefrina. Abreviaturas como na figura 1.

Figura 5 Resposta vasodilatadora à acetilcolina em anéis aórticos pré-constritados com

fenilefrina, na presença de L-NAME agudo. Abreviaturas como na Figura 1 .
3.2. Função vascular

Vasorelaxamento em resposta ao SNP foi ligeiramente, mas significativamente menor nos ratos
L-NAME não tratados com flavonóides quando comparados com os ratos controle. O SNP
induziu respostas semelhantes em todos os grupos tratados com flavonóides, embora A tenha
apresentado um aumento significativo do relaxamento quando comparado ao grupo L-NAME
não tratado (Tabela 2 ) .

3.3. Efeito dos extratos de flavonóides no estado de estresse oxidativo

Valores de TBARS, nitrito e excreção urinária de proteínas são mostrados na Tabela 3. Em relação
aos TBARS, houve aumento significativo apenas nos rins dos animais tratados cronicamente com
L-NAME quando comparados aos controles. O restante dos grupos não mostrou diferenças
significativas. Além disso, a excreção urinária de nitrito foi significativamente menor no grupo L-
NAME, mas a apigenina e a diosmina aumentaram significativamente em comparação ao grupo
tratado com L-NAME. Não houve alterações significativas na proteinúria nos grupos
experimentais, exceto no grupo tratado com L-NAME, mostrando aumento da excreção urinária
de proteína, em comparação com o controle.

Tabela 3. Medidas de TBARS, nitrito e proteinúria nos grupos experimentais.

Plasma
Nitrito
TBARS do rimTBARS na Urina Excreção UrináriaExcreção Urinária de
TBARS Plasma
(nmol / mg(nmol / mg prot / de Nitrito ( p g / 24Proteína (mg / 24 h /
prot) 24 h) h) kg pc)
(nmol / ( pg / mL)
mL)
1,25 ±
C 1,5 ± 0,31,5 ± 0,1 576 ± 65 11,83 ± 1,31 367,58 ± 11,19
0,18
1,02 ±
LN 1,8 ± 0,22,0 ± 0,3 * 437 ± 37 6,39 ± 0,46 * 468,60 ± 39,52 *
0,05
1,26 ±
UMA1,7 ± 0,31,6 ± 0,2 512 ± 46 13,40 ± 1,82 t 360,64 ± 40,15
0,09
0,88 ±
LE 1,6 ± 0,31,1 ± 0,3 488 ± 69 11,02 ± 1,63 373,50 ± 61,90
0,04
1,02 ±
GBO 1,3 ± 0,21,6 ± 0,0 458 ± 51 9,05 ± 1,64 426,51 ± 18,81 *
0,02
0,99 ±
COE 1,3 ± 0,21,4 ± 0,3 482 ± 108 14,12 ± 4,97 498,51 ± 67,17
0,11
1,11 ±
D 1,4 ± 0,11,5 ± 0,1 546 ± 78 12,02 ± 1,03 t 420,13 ± 75,24
0,12

Os dados são média ± abreviaturas SEM como na tabela 1. * p <0,05 vs. controle, t, p <0,05 vs.
L-NAME.
3.4. Resultados Histopatológicos

Os corações de análise (Tabela 4 e figura 6 ) revelaram que o grupo tratado com L-NAME
apresentava mais zonas de infarto, arteriopatia hialina e necrose fibrinoide quando comparado
ao grupo controle não tratado. Os tratamentos tendem a diminuir todos esses
parâmetros. Relação parede-lúmen das artérias coronárias diminuiu nos ratos L-NAME não
tratados quando comparados com o controle e, novamente, a maioria dos tratamentos mostrou
uma tendência a aumentar os valores, mas sem ser estatisticamente
significativa. Interventricular A espessura do septo cardíaco foi significativamente maior nos
animais não tratados com L-NAME ratos controle e todos os tratamentos apresentaram valores
mais baixos, mas apenas a diminuição foi significativamente diferente nos grupos tratados com
GBO e D. No que diz respeito à espessura abdominal e torácica aorta, o tratamento com L-NAME
aumentou significativamente e os tratamentos com LE e COE reduziram-no a níveis comparáveis
aos controles.

Tabela 4 Resultados histopatológicos do coração e da aorta.

# Infartos HA FN LWR IVS TAT AOT

C 0,0 0,0 0,0 3,01 ± 0,582,41 ± 0,03 131,9 ± 3,1 110,7 ± 7,9
LN 4,33 ± 3,840,67 ± 0,330,67 ± 0,332,22 ± 0,953,20 ± 0,10 *176,3 ± 4,2 * 159,1 ± 6,5 *
UMA0,67 ± 0,670,33 ± 0,330,0 2,39 ± 0,442,62 ± 0,25 178,0 ± 14,8 * 112,1 ± 5,9 t
LE 3,33 ± 3,330,0 0,0 2,97 ± 0,102,71 ± 0,16 141,4 ± 2,4 * , t137,7 ± 3,7 * , t
GBO 3,67 ± 1,860,33 ± 0,330,33 ± 0,331,99 ± 0,402,42 ± 0,22 t 157,5 ± 8,5 * 144,5 ± 9,6 *
COE 2,67 ± 1,450,0 0,0 2,49 ± 0,063,11 ± 0,36 155,9 ± 5,4 * , t135,2 ± 5,4 * , t
D 4,00 ± 4,000,33 ± 0,330,33 ± 0,332,74 ± 0,942,22 ± 0,08 t 164,3 ± 7,2 * 116 ± 4,4 t

Os dados são média ± abreviaturas SEM como na tabela 2. HA, arteriopatia hialina; FN, necrose
fibrinoide; LWR, lumen relação parede das artérias coronárias; SIV, septo interventricular ( ^ m);
TAT, espessura da parede da aorta torácica ( ^ m); AOT, espessura da parede da aorta abdominal
( ^ m); * p <0,05 vs. controle; t p <0,05 vs. L-NAME.
Figura 6 Microfotografias representativas de lesões cardíacas. Superior esquerdo: artéria
intramiocárdica ( A ) de um rato controle não tratado (sem alterações morfológicas, PAS, 10 x );
( B ) arteriopatia hialina (AH) em uma artéria coronária de ratos tratados com L-NAME (PAS, 10
x ); ( C ) dano vascular intenso com infiltrado inflamatório (II) e lesões miocárdicas em coração
de ratos tratados com L-NAME (PAS, 10 x ); ( D ) necrose fibrinóide (FN) em uma artéria coronária
de ratos tratados com L-NAME (PAS, 10 x ).

Em relação ao rim (Tabela 5 e figura 7 ) , não encontramos diferenças significativas entre os

grupos em qualquer um dos parâmetros medidos, embora para HA todos os grupos tratados
apresentassem valores os do grupo L-NAME, observando no caso da apigenina, uma
recuperação completa. No entanto, a presença de cilindros tubulares ainda era evidente em
todos os grupos tratados. Finalmente, ao avaliar o dano vascular global (coração e rim juntos),
parece que a maioria dos tratamentos reduziu-o, com A, LE e COE apresentando menores
valores de dano vascular, semelhantes aos controles. Figura 8 mostra uma microfotografia
representativa do efeito benéfico da apigenina nas lesões renais e cardíacas.

Tabela 5 Resultados histopatológicos do rim.

LWR HA TC Dano Vascular Combinado

C 1,80 ± 0,050 0 0
LN 1,72 ± 0,320,67 ± 0,330,33 ± 0,330,67 ± 0,33
UMA1,85 ± 0,270 0,33 ± 0,330
LE 1,07 ± 0,190,17 ± 0,170,50 ± 0,290
GBO 2,97 ± 1,070,33 ± 0,330,37 ± 0,330,33 ± 0,33
COE 1,63 ± 0,450,33 ± 0,331,00 ± 0,000
D 1,53 ± 0,090,33 ± 0,330,67 ± 0,330,33 ± 0,33
Os dados são média ± abreviaturas SEM como na tabela 2. HA, arteriopatia hialina; TC, cilindros
tubulares.

Figura 7 Microfotografias representativas de lesões renais. ( A ) artéria renal ( A ) de um

controlerato não tratado (sem alterações morfológicas, PAS, 20 x ); ( B ) hipertrofia muscular e
redução da luz em uma artéria renal (V) de ratos tratados com L-NAME (PAS, 20 x ); ( C )
arteriopatia hialina (HA) e redução da luz em uma artéria renal de ratos tratados com L-NAME
(PAS, 10 x ); ( D ) necrose fibrinóide (FN) em uma artéria renal de ratos tratados com L-NAME
(PAS, 20 x ).

Figura 8. Microfotografias representativas de lesão cardíaca e renal no grupo Apigenina. ( A )

menoslesão arterial e muscular (PAS 10 x ); ( B ) gesso tubular e arteriopatia hialina leve sem
necrose fibrinóide no tecido renal (PAS, 10 x ).
4 Discussão

Os resultados do presente estudo mostram que alguns flavonóides, especialmente A, LE e GBO,

nas doses estudadas, reduziram os níveis pressóricos elevados atingidos pela administração
crônica de L-NAME. Este efeito foi acompanhado, no caso da apigenina, com uma normalização
da reatividade vascular reduzida aos vasoconstritores e uma menor retenção de sódio. Foi
também observada uma capacidade vasodilatadora aumentada, relacionada com uma produção
aumentada de NO, juntamente com alterações benéficas nos parâmetros histopatológicos no
coração e no rim.

A dose escolhida de cada um dos tratamentos responde a um critério objetivo de possível uso
posterior em humanos. As doses ingeridas diariamente pelos animais são muito baixas
comparadas àquelas utilizadas em outros estudos com compostos similares. Além disso, doses
muito superiores às aplicadas na terapia humana são geralmente utilizadas (5, 14, 18, 24). Além
disso, precisávamos de doses que pudessem ser usadas com realismo econômico no caso de
uma futura aplicação no campo da farmácia ou nos chamados suplementos nutricionais.

Em todos os casos, as doses utilizadas custariam 2-3 cêntimos de euro por dia, valor
normalmente estabelecido referência neste tipo de produtos.

Ratos tratados com L-NAME apresentaram menor peso que os controles e o tratamento com
flavonóides preveniu a diminuição do peso corporal durante o tratamento concomitante com L-
NAME (Tabela 1 ) .este o efeito ocorreu apesar de um nível mais baixo de ingestão de alimentos
nestes grupos tratados com flavonóides + L-NAME em comparação com L-NAME sozinho. Este
efeito provavelmente está relacionado ao efeito anti-hipertensivo desses tratamentos, como
outros estudos têm mostrado com tratamentos mais específicos, como o bloqueio do sistema
renina angiotensina [ 12 ] , um efeito semelhante no peso corporal.No entanto, outros
mecanismos, como o papel da NOS neuronal no hipotálamo, o regulador central da ingestão
alimentar, podem estar envolvidos. É possível que os flavonóides, aumentando a
biodisponibilidade do NO neuronal, possam prevenir a diminuição do peso corporal.

Assim, estudos iniciais mostraram que os inibidores competitivos da NOS produziam uma
reversibilidade da L -arginina diminuição da ingestão alimentar [ 25 ] , resultado não encontrado
nos estudos atuais, uma vez que a diminuição do peso corporal foi acompanhado por uma
diminuição na ingestão de alimentos. Essa contradição pode ser explicada pelos efeitos dos
flavonóides no gasto de energia e na eficiência digestiva, como demonstrado recentemente
naringenina [ 26 ] .

A inibição crônica da NOS leva à retenção de sódio, também encontrada nos resultados atuais,
uma vez que o NO é diurético e natriurético e promove pressão natriurética [ 10 , 11 ] .Embora
os tratamentos tenham mostrado uma tendência a melhorar a excreção de sódio 2 ) , não houve
diferenças significativas entre os grupos.

Muitos estudos relataram uma redução na pressão arterial após o consumo de produtos ricos
em flavonóides. Estudos in vitro relataram que flavonóides como genisteína, quercetina e ( - ) -
epicatechina regulavam (direta ou indiretamente) a produção de NO em vasos ou células
endoteliais cultivadas [ 8 , 27 , 28 ] .No entanto, a maioria deles não estabelece uma clara relação
dose-estrutura-atividade.

Nossos resultados concordam com os estudos mostrando que alguns dos tratamentos
alcançaram redução de MAP, especificamente GBO e LE e, em menor nível, A e D (Figura 3 ) .Nós
aqui sugerem que existem elementos estruturais no esqueleto molecular dos flavonóides que
provavelmente este efeito de abaixamento de BP. A ordem de preferência estrutural na redução
da PA foi semelhante quando comparando a eficácia dos flavonóides ativos com a de uma
predominância de flavanona-glicosídeo em a estrutura molecular, como GBO e LE. Um nível mais
baixo seria o das configurações de flavona, A e D, que são caracterizados por uma dupla ligação
entre os carbonos 2 e 3 conjugados com o C -4 grupo carbonilo (Tabela 1 ) .Também é possível
que a estrutura do anel B tenha alguma responsabilidade nesse efeito anti-hipertensivo, uma
vez que a estrutura 4- hidroxiflavona / flavanona (A e naringina no GBO) parece ser mais ativa
que a 3 / -hidroxi-4 / -metoxiflavona (D)O anel B modelo 3 Z , 4- dihidroxi (LE), assim, o grupo
catecol é provavelmente a estrutura mais ativa em igual concentração. Além disso, esta
estrutura parece ser essencial para o efeito inibitório sobre a atividade da enzima conversora de
angiotensina, que desempenha um papel fundamental na regulação da pressão arterial,
independente da presença do estrutura de flavonóides flavona ou flavanona [ 20 ] .Estudos
futuros serão necessários para definir melhor relação estrutura-atividade-dosagem dessas
drogas.

Um mecanismo responsável pelo aumento da PA durante o tratamento com L-NAME está

associado com deficiência de NO. Níveis mais baixos de NO permitem maior expressão de
vasoconstritores e atenuação de vasorelaxamento em diferentes leitos vasculares, como os
presentes resultados confirmam pela diminuição da CE 50 do grupo tratado com L-NAME.Como
observado (Tabela 3) , apenas a apigenina (4 '-hidroxi flavona) normalizaram a EC 50 alterada
desses animais, embora tenha havido também alguma melhora no LE grupo ( 3Z , 4 / -di-hidroxi-
flavanona).Essa menor capacidade vasoconstritora pode estar relacionada a um produção de
alguns vasodilatadores, uma vez que a vasodilatação induzida por Ach também foi melhorada
pela apigenina 3 , figuras 4 e 5 ) , especialmente no grupo em que o NO foi agudamente inibido.
Curiosamente, um componente independente do NO parece participar também da melhora da
vasodilatação demonstrada por A e COE, uma vez que um vasorelaxamento residual ainda foi
observado após a inibição aguda do L-NAME.

Esse relaxamento vascular promovido pelos flavonóides poderia explicar parcialmente a

capacidade dessas substâncias para reduzir a pressão arterial. Os resultados para A ( 4Z-
hidroxiflavona) e a menor eficácia significativa de D (3 \ 4 / -metoxi flavona-7- O- glicosídeo)
sugerem que a combinação de uma dupla ligação entre os carbonos C2 = C3 (flavonóides)
estrutura plana) como uma forma Glycon (sem radicais de açúcar) e com um anel de tipo B-4 z-
hidroxi pode ser de importância para produzir relaxamento vascular e a melhoria de expressão
de eNOS.Além disso, parece que um pequeno volume molecular é favorável para um
determinado flavonóide para se tornar ativo [ 29 , 30 ] .Nossos dados estão, portanto, de acordo
com achados anteriores de outros estudos [ 31 - 33 ] .

Outros mecanismos têm sido sugeridos para explicar o aumento da biodisponibilidade do NO

endotelial promovido por flavonóides. Vários estudos mostraram que um consumo regular de
flavonóides ou alimentos ricos em flavonóides podem melhorar significativamente o estado
oxidativo, bem como a função endotelial [ 8 ] .

Para esclarecer e entender isso, é importante notar que a atividade antioxidante dos flavonóides
não está relacionada apenas a uma atividade simples, como fazem os sequestradores de radicais
livres de oxigênio. Outros mecanismos que os flavonóides usam para regular o estado oxidativo
estão relacionados a uma atividade como agentes epigenéticos (aumentando a expressão de
enzimas antioxidantes endógenas como superóxido dismutase, glutationa) e / ou como
inibidores de enzimas pró-oxidantes (ciclooxigenase, lipoxigenase) do araquidônico via [ 34 - 37
] .No presente estudo, detectamos um aumento significativo nos níveis de ROS, medido como
TBARS (MDA: malonil dialdeído), no tecido renal. É importante notar que o MDA, um índice de
peroxidação lipídica, foi encontrado para ser aumentado pelo tratamento com L-NAME [ 12 , 38
, 39 ] .É provável que a redução do TBARS renal, observada em alguns dos grupos tratados com
flavonóides (Tabela 4 ) , é contribuindo também para a normalização da pressão arterial. Embora
os resultados obtidos não mostrem significância estatística, pode ser interessante considerar
que os tratamentos com maior eficácia antioxidante específica são aqueles com flavonóides com
estrutura de catecol do anel B (3 \ 4 z- dihidroxi), LE (eriocitrina) e COE (compostos de
catequina). Os níveis de excreção de nitrito urinário (Tabela 4 ) dos ratos tratados com L-NAME
foi menor que a do grupo controle.Nos grupos de tratamento, apenas A e D, portanto,
flavonóides com estrutura de flavona, parecem gerar uma maior produção de metabólitos de
NO. A menor eficácia é mostrada por LE e COE, os extratos de flavonóides contendo catecol.

Sabe-se que o déficit crônico de NO geralmente resulta em elevação da pressão arterial

sistêmica, aumento da pressão capilar glomerular e redução do coeficiente de
ultrafiltração. Essas alterações estão associadas à presença de proteinúria e ao desenvolvimento
da glomeruloesclerose [ 40 ] , como mostram nossos dados (Tabela 4 ) .Os tratamentos com
flavonóides mostram, para a maioria deles, uma redução na proteinúria, indicando, assim, uma
redução do dano glomerular renal. O comportamento de A e LE é notável, pois mostram valores
semelhantes aos do grupo controle.

As alterações metabólicas e hemodinâmicas da hipertensão do L-NAME também estão

associadas ao desenvolvimento de anormalidades estruturais, como hipertrofia ventricular
esquerda, fibrose cardíaca, necrose e remodelamento protéico, bem como com hipertrofia da
parede vascular [ 12 ] , também mostrada no presente estudo. resultados. A deficiência de NO
pode, assim, resultar no aumento da adesão de monócitos e plaquetas, o que, ao liberar fatores
de crescimento, contribuiria para o espessamento da parede vascular. A proliferação foi limitada
à mídia, o que está de acordo com os achados de outros [ 41 - 43 ] Embora as lesões tivessem
uma tendência a uma melhoria nos grupos tratados com flavonóides, não foram observados
efeitos significativos na maioria deles. Apenas A, LE e COE mostraram efeito benéfico na
espessura da aorta. Em relação às alterações estruturais renais, embora não tenhamos
encontrado diferenças significativas entre os grupos, todos os grupos tratados apresentaram
valores inferiores ao grupo L-NAME. Finalmente, quando o dano vascular global (coração e rim
juntos) foi avaliado, parece que a maioria dos tratamentos reduziu-o, com A, LE e COE
mostrando valores de dano vascular mais baixos, semelhantes aos controles.

5 Conclusões

Nossos resultados sugerem que os flavonóides incluídos neste estudo, e já presentes no

mercado como suplementos nutricionais, podem ser utilizados como ingredientes alimentares
com potencial benefício terapêutico na hipertensão arterial. Mais estudos são necessários para
elucidar os mecanismos envolvidos no seu efeito anti-hipertensivo, incluindo uma avaliação da
relação dose-atividade para determinar as estruturas moleculares mais ativas. De qualquer
forma, nossos resultados concordam com achados anteriores [ 43 ] e sugerem que o efeito
redutor da pressão arterial desses flavonóides pode estar relacionado a uma combinação de
ações vasodilatadoras e antioxidantes.

Materiais Suplementares: Os seguintes itens estão disponíveis on-line em

http://www.mdpi.com/2072-6643/10/4/484/s1 , Tabela S1, Custo-dose por dia de flavonóides
utilizados.Documento: principais características dos flavonóides utilizados e cromatogramas
típicos dos produtos; Tabela S2: Características dos flavonóides utilizados.
Agradecimentos: Este relatório foi apoiado por uma doação do Programa Nacional Espanhol de
P & D CENIT do Ministério de Ciência e Tecnologia da Espanha, denominado “Dietas de pesquisa
industrial e alimentos com características específicas para idosos”, CEN-20091006; Sigla:
SENIFOOD Não recebemos fundos para cobrir os custos de publicação em acesso aberto.Nós
reconhecemos a assistência de Justin Davis com a língua inglesa.

Contribuições dos Autores: JC, MCO e JG-E. concebi e projetei os experimentos; O MDP realizou
a maioria dos experimentos; PR e NMA realizaram os experimentos de reatividade vascular; FO
contribuiu com a histopatologia; JG-E. escreveu o jornal.

Conflitos de Interesse: Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

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[1] Introdução
[2] Estudos em animais usando alimentos ricos em flavonóides são uma alternativa válida para
avançar na compreensão dos mecanismos subjacentes aos seus efeitos hipotensores em
modelos experimentais de hipertensão arterial [ 1 ] .A ingestão de polifenóis tem sido
relacionada com um efeito benéfico que reduz o risco de hipertensão [ 2 ] .De fato, estudos
epidemiológicos descobriram que um aumento no consumo de alimentos e bebidas ricos em
flavonóides está relacionado a um risco reduzido de morte cardiovascular [ 3 , 4 ] .Além disso, o
uso de produtos de origem natural que podem causar poucos efeitos colaterais é uma
possibilidade atrativa a ser considerada para o tratamento de diversas patologias [ 5 ] .Vários
estudos descreveram que o consumo de alimentos ricos em flavonóides ou compostos isolados
melhora vários parâmetros cardiovasculares, tais como dilatação mediada por fluxo e
biomarcadores de risco cardiovascular [ 6 , 7 ] .Além disso, muitos flavonóides induzem a
liberação de fatores vasodilatadores derivados do endotélio, como o óxido nítrico (NO) ou o
fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) e diminuem a liberação de substâncias pró-
inflamatórias, induzindo uma melhora da função endotelial [ 8 , 9 ] .
[3] Nutrientes 2018 , 10 , 484; doi : 10.3390 / nu10040484