Disciplina de Bioquímica I – Curso de Química - UFSCar

Prática 3- AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS

A - REAÇÕES GERAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE PROTEINAS E AMINOÁCIDOS

A.1. Reação de ninidrina – Identificação de aminoácidos

Monte as seguintes reações:

TUBO Glicina 0,1 M Ninidrina em álcool Água Cor observada

1 2 mL 5 gotas -
2 (branco) - 5 gotas 2 mL

Ferva os tubos durante 1 ou 2 minutos.

Observe e explique o aparecimento de coloração azul na solução por meio de reação
química.

A.2. Prova do biureto – Pesquisa da ligação peptídica

Nos experimentos seguintes, será utilizado Solução de ovoalbumina em água na proporção

1:3 como amostra.

Proceder segundo o protocolo a seguir:

Solução de
TUBO com Gelatina NaOH Cor
ovoalbumina Glicina 0,1 M Água CuSO4 0,5%
tampa 2% 2 mol/L observada
(1:3)
3 2 mL -- -- -- 2 mL 8 gotas
4 -- 2 mL -- -- 2 mL 8 gotas
5 -- -- 2 mL -- 2 mL 8 gotas
6 (branco) -- -- -- 2 mL 2 mL 8 gotas

Misture bem a solução após a adição de cada gota. O aparecimento de uma coloração
violeta indica a presença de ligações peptídicas.
Observe e explique o aparecimento de coloração na solução por meio de reação química.

A.3. Reação de Folin-Ciocalteau

Proceder segundo o protocolo a seguir, utilizando tubos de ensaio grandes. Utilize pipeta
de vidro para a água:

Solução de NaOH H2O Solução de Reagente de Cor

TUBO
tirosina 2 mol/L destilada ovoalbumina 1:3 Folin observada
7 (branco) - 600 µL 8,2 mL - 300 µL

8 200 µL 600 µL 8 mL - 300 µL

9 - 600 µL 8 mL 200 µL 300 µL

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Adicionar o reagente de Folin a todos os tubos lentamente. Discutir as cores observadas

em cada tubo.
Observe e explique o aparecimento de coloração na solução por meio de reação química. A
reação de Folin funciona para qualquer aminoácido? Explique.

A.4. Reação Xantoprotéica

Proceder segundo o protocolo a seguir. Utilize pipeta de vidro para a água:

TUBO Solução de NaOH 12

Ferver por 2 minutos;

Tirosina Glicina HNO3
com ovoalbumina água Cor M
(0,1 M) (0,1 M) concentrado
tampa (1:3)

resfriar
10 (branco) - - - 2 mL 250 µL 250 µL
11 2 mL - - - 250 µL 250 µL
12 - 2 mL - - 250 µL 250 µL
13 - - 2 mL - 250 µL 250 µL

Ferver com cuidado cada tubo por dois minutos em banho-maria;

Após resfriar, adicione, gota a gota o 250 µL da solução de NaOH 12 M;
Misture, observe e anote os resultados.
Observe e explique o aparecimento de coloração na solução por meio de reação química.

B – REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

B.1. PRECIPITAÇÃO IRREVERSÍVEL

B.1.1. Desnaturação pelo calor

No tubo de ensaio D (grande), pipetar 2 mL de Solução de ovoalbumina 1:3. e aquecer em

banho-maria fervente durante 3 minutos. Observar e explicar.
Colocar 5 mL de água e observar se o precipitado dissolve. Explicar.

B.1.2. Desnaturação por ácidos

Montar os tubos conforme a tabela:

Solução de
TUBO TCA 20% (ácido tricloroacético) HNO3 1 mol/L
ovoalbumina 1:3
14 1 mL 1 mL -
15 1 mL - 1 mL

Observar a formação do coágulo e explicar.

B.1.3. Desnaturação por metais pesados

TUBO Sol. de ovoalbumina 1:3 AgNO3 1 mol/L

16 1 mL 1 ml

Observar a formação do coágulo e explicar.

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B.1.4. Desnaturação por solventes orgânicos

TUBO Sol. de ovoalbumina 1:3 Acetona 100% Etanol absoluto

17 1 mL 1 mL -

18 1 mL - 1 ml

Observar a formação do coágulo e explicar o seu aparecimento.

B.2. PRECIPITAÇÃO REVERSÍVEL

B.2.1. Salting-in- solubilização

Adicione 5 mL de H2O à clara de ovo (3 mL) contida no tubo plástico de 50 mL (tipo

“falcon”). Agite vigorosa e rapidamente com um bastão de vidro até observar o aspecto de leve
turbidez e espuma. Pipete 3 mL nos tubos 19 e 20 (reservando o restante para o próximo ensaio),
como na tabela a seguir:

TUBO Clara de ovo + água NaCl 1 M Água Resultado

19 3 mL Goteje até dissolução -
Adicione a mesma quantidade
20 (branco) 3 mL -
usada de NaCl

Observe a diferença entre os tubos e discuta.

B.2.2. Salting-out- precipitação

Da solução restante de proteína obtida no item anterior, pipete 3 mL para o tubo E (grande
com tampa). Proceda como na tabela seguinte. Utilize pipeta de vidro para a água:

Proteína
TUBO (NH4)2SO4 4 M Observar Água Inverter lentamente até Resultado
B.2.1
precipitação redissolução do precipitado
21 2 mL 3 mL 5 mL

Discuta os resultados e o fundamento das técnicas de salting in e salting out.

Questões para o relatório

Nesta aula você realizou a quantificação de proteínas pelo método do biureto. Agora pesquise e
descreva como funcionam os seguintes métodos também amplamente utilizados para a
quantificação de proteínas:
 Método de Lowry
 Método do ácido Bicinchônico
 Método de Bradford
Descreva para cada um desses métodos a metodologia empregada para cada um, os
reagentes utilizados e a sensibilidade de cada teste. Pesquise também sobre a sensibilidade do
método do Biureto.

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