Pós-Graduação em Biociências

Disciplina: Genética Humana Molecular

Docente responsável: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

Dra. Fernanda da Silva Manoel Caetano

Pós-doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Biociências
MUTAGÊNESE

Processo que
produz mutações
 Ambiente celular

Moléculas de DNA não são

absolutamente estáveis

Cada par de base na dupla

hélice do DNA

Probabilidade de sofrer mutação

 Sequência de DNA nuclear é  99,5%
idêntica entre dois seres humanos não
aparentados.
Variabilidade
 0,5% geneticamente
determinada

• Intolerância alimentar
• Suscetibilidade à infecção
• Reação a medicamentos
• Traços de personalidade (aptidão atlética, talento
artístico
Células somáticas: Células germinativas:
Mutação somática Mutação herdável
Mutação - Definição
Mutação - Tipos
 ✓ Classificação das mutações gênicas

1. Mudanças na - Substituições
sequência do DNA - Inserções e deleções (Indel)
- Inversão

-Silenciosa
2. Mudanças -Sentido trocado
Funcionais -Sem sentido
-Mudança de matriz de leitura

3. Mudanças -mudanças em regiões não-

Extragênicas codificadoras (introns e região
reguladora)
 ✓ Classificação das mutações gênicas
1. Mudanças na sequência de DNA
Mutação de ponto

1.1. Substituições:
TRANSIÇÕES Pirimidina para Purina para
pirimidina purina

TRANSVERSÕES Pirimidina para Purina para

purina pirimidina
 ✓ Classificação das mutações gênicas

1.2. Inserção ou deleção:

1pb ou grandes trechos

1.3. Inversão: excisão de

uma parte da dupla hélice
seguida de reinserção na
mesma posição, mas em
orientação inversa.
 ✓ Classificação das mutações gênicas

2. Mudanças Funcionais:

2.1. Mutação Silenciosa – sem alteração do produto

gênico
 ✓ Classificação das mutações gênicas

2.2. Mutação de sentido trocado (missense):

O códon para um aminoácido é substituído por um códon para
outro aminoácido
 ✓ Classificação das mutações gênicas

Mutação missense
– Origem
mutacional da
hemoglobina
falciforme
(hemoglobina S)
 ✓ Classificação das mutações gênicas

2.3. Mutação sem sentido (nonsense):

O códon para um aminoácido é substituído por um códon de
terminação.

“proteína truncada”
 ✓ Classificação das mutações gênicas

2.4. Mudança da matriz de leitura: adição ou deleção de pb

não múltiplos de 3 (perda completa da função da proteína
normal)
 ✓ Classificação das mutações gênicas

3. Mutações extragênicas:

3.1. Processamento de RNA: destroem sítios

de processamento de introns e de
poliadenilação.

3.2. Mutações reguladoras: afetam a ligação

do fator de transcrição.
Mutação - Causas

Replicação do DNA
DNA polimerase: Fidelidade
 ✓ Bases moleculares das mutações gênicas

NOVAS MUTAÇÕES

ESPONTÂNEAS INDUZIDAS
Espontâneas: Ocorrência natural
❖ Erros na replicação: pareamento errôneo durante a
síntese do DNA levando à substituição de bases
- mudança tautomérica, transições, transversões,
mudança de matriz de leitura, deleções e duplicações

❖ Lesões espontâneas
- desaminação; depurinação; dano oxidativo

Induzidas: Agentes mutagênicos

❖ Agentes físicos
❖ Agentes químicos
❖ Agentes biológicos
Mutação Espontânea
 Mutações espontâneas
• Erros na replicação
Cada uma das bases no DNA
pode se apresentar como
tautômeros (isômeros que
diferem nas posições e nas
ligações entre seus átomos
 Mutações espontâneas
• Erros na replicação do DNA:
– mudanças tautoméricas: pareamentos errôneos
 Mutações espontâneas
• Erros na replicação do DNA:
– Mutação por mudança tautomérica
 Mutações espontâneas
• Erros na replicação do DNA
– Deleções e duplicações
ocorrem geralmente em
sequências repetidas
– Grandes duplicações
geram múltiplas cópias de
genes
– Grandes deleções
removem genes do
genoma
MUTAÇÃO ESPONTÂNEA
LESÕES ESPONTÂNEAS
MUTAÇÃO ESPONTÂNEA
LESÕES ESPONTÂNEAS
MUTAÇÃO ESPONTÂNEA
LESÕES ESPONTÂNEAS
 Mutações espontâneas
• Lesões espontâneas
– Dano oxidativo

Pareia erroneamente com A,

resulta em transversão G → T
 PREVENÇÃO DE ERROS

• Alguns sistemas enzimáticos neutralizam compostos

potencialmente danosos, antes que reajam com o DNA
• Exemplos: desintoxicação de radicais superóxido
produzidos durante os danos oxidativos
• a- Enzima superóxido dismutase catalisa a conversão
dos radicais superóxido peróxido de hidrogênio
• b- Enzima catalase converte peróxido de hidrogênio
em água
 MUTAÇÕES INDUZIDAS –
Agentes mutagênicos
Agentes físicos: Agentes químicos:
•Radiação UV •Análogos de bases
•Radiação ionizante: •Alquilantes
raios X, gama (metilação)
•Desaminantes
•Intercalantes

Agentes biológicos:
•Vírus mutação insercional
 MUTAÇÕES INDUZIDAS
AGENTES FÍSICOS

•Radiação ultravioleta •Radiação ionizante

 AGENTE FÍSICO
RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA

Absorção da luz UV (200-400nm) Estado excitado de uma

base púrica ou pirimídica Ligação covalente entre
duas pirimidinas adjacentes
Anel ciclobutano:
• dímeros de timina (TT) → mais estável
• dímeros menos estáveis: CT, CC, TU e UU
 RADIAÇÃO IONIZANTE
raios cósmicos, elementos radioativos naturais (rádio, plutônio, C14 e
H3), raios X, gama e beta, etc

Expulsão de um ou mais elétrons → íons

ou radical livre instável

Podem induzir lesões no DNA

(quebras→ deleções, duplicações,
inversões e translocações)
Máquinas de raios X Testes com bombas atômicas Acidentes c/radiação
Radiação ,  e  de isótopos radioativos Resíduo e lixo radioativo
 Acidente de Goiânia com césio-137

- 2º maior acidente radiológico do mundo ocorrido em 13 de setembro de 1987;

- Marcou a história dos moradores de Goiânia, deixando quatro mortos e 249
contaminados.

Dois catadores de recicláveis acharam um

aparelho de radioterapia abandonado,
desmontaram e o venderam a um ferro-
velho de Goiânia.

Continha um pó de coloração azul

Aparelho de radioterapia abandonado no desativado

Instituto Goiano de Radioterapia (IGR). césio-137
 MUTAÇÕES INDUZIDAS
AGENTES QUÍMICOS

•Bases análogas
•Agentes alquilantes- Metilação
•Agentes desaminantes: Desaminação
•Agentes intercalantes: Intercalação
 ✓ Mecanismos de indução de mutação

Atuam por 3 mecanismos diferentes:

1. SUBSTITUIR UMA BASE DE DNA

2. ALTERAR UMA BASE DE DNA

3. DANIFICAR UMA BASE DE DNA

 1. SUBSTITUIÇÃO DE UMA BASE NO DNA

INCORPORAÇÃO DE ANÁLOGOS DE BASE – compostos químicos similares às bases

nitrogenadas que se ligam ao DNA

Uma vez no DNA, eles tem

propriedades de pareamento 5-BROMOURACILA é análogo
diferentes das bases normais da TIMINA
ocorrendo mutação, pois
nucleotídeos incorretos são
inseridos no DNA.
 2- Alteração de Bases
Agentes Alquilantes
Alguns mutágenos não são incorporados ao DNA, mas
alteram uma base, causando mau pareamento específico:
-EMS (ETIL METANOSSULFATO)

-NG (NITROSOGUANIDINA)

(C2H5) (CH3)

Adicionam grupos Alcil (etila e metila, respectivamente)

2- Alteração de Bases
Agentes Alquilantes
2- Alteração de Bases
Agentes desaminantes
 2- Alteração de Bases
Agentes Intercalantes

• Constituem moléculas longas e achatadas que

mimetizam pares de bases;
• Intercalam-se entre dois pares de bases adjacentes
• Na duplicação ➔ INSERÇÃO OU DELEÇÃO
• Exemplos:

Acridina
Laranja:
estrutura
química 
base púrica
Griffiths, 2001
 2- Alteração de Bases
Agentes Intercalantes

Exemplo de Corante:
Brometo de Etídeo

Inserções de pares
únicos de
nucleotídeos ou
deleções

Eletroforese em gel de
agarose
AFLATOXINA B1: forma 3- Dano as Bases
um produto de adição
na posição N7 da
guanina

Quebra a ligação
entre a base e o
açúcar

SÍTIOS
APURÍNICOS Leva a inserção de uma adenina
 MUTAÇÕES INDUZIDAS
AGENTES BIOLÓGICOS
➢ Vírus: HPV, Hep. B

➢ Transposons
Alteram as sequências do material genético do hospedeiro

HPV

HBV
Sociedade moderna depende do uso extensivo
de químicos

Indústria e agricultura

Novas substâncias químicas são produzidas a

cada ano
Mutagenicidade e carcinogenicidade
devem ser testadas
Teste de Ames para mutagenicidade
• 1970: Bruce Ames → forte correlação entre a
habilidade de compostos causar câncer e sua
habilidade para causar mutações

– medida das taxas de mutação em sistemas

bacterianos seria eficiente para avaliar a
mutagenicidade de compostos
– nem todos os carcinógenos sozinhos são
mutagênicos, porém alguns metabólitos de
carcinógenos produzidos no corpo por reações
enzimáticas no fígado são agentes mutagênicos: tais
reações enzimáticas não aconteceriam em bactérias
 Teste de Ames para mutagenicidade

• método rápido, sensível e barato

• utilizado para identificar químicos que possam ser carcinogênicos
http://mbioscience.com/ames-test.html
Fontes de danos no DNA
 Resposta ao dano no DNA (DDR- DNA damage response)

Garantir a
integridade do
genoma

CÂNCER
Sancar et al., 2004 INSTABILIDADE GENÔMICA
LESÕES NO DNA E MECANISMOS DE REPARO
 REPARO DIRETO

• reversão ativa da lesão → sem retirar a

base danificada → muito eficiente
• O6-metilguanina → transição G:C para A:T
(produzida endogenamente ou mutagênicos
químicos→ alquilantes)
•Enzima MGMT (metil guanina
metiltransferase) → remove o grupo metil
• alto custo energético → uma molécula da
enzima é inativada para cada lesão corrigida
 Reparo direto: remoção do grupo metil

Reparo da alquilação da O6-metilguanina

O6-metilguanina metiltransferase (MGMT)

Uma cisteína sobre a MGMT se liga ao grupo metil na guanina

Reparo por Excisão de Base – Base Excision Repair (BER)

• Depois da leitura de prova (DNA

proofreading) pela DNA polimerase, é o
mecanismo de reparo mais importante para a
remoção de bases danificadas ou incorretas.
• Sistema de reparo que depende da
complementariedade da fita molde.
 REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER

Reconhecimento base
danificada e remoção: DNA
glicosilase Sítio AP

Endonuclease: incisão 5’
Exonuclease: excisão

Síntese: DNA polimerase

Ligação: DNA ligase
 REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER

Base danificada Quebra de

cadeia simples

*
Reconhecimento
DNA XRCC1 PARP
e formação do Reconhecimento
glicosilase
sítio AP da quebra

Reconhecimento
APE1 PNK
e incisão 5’ do Incisão 5’
sítio AP
DNA pol FEN1
DNA pol Excisão da
PCNA Excisão e
XRCC1 porção açúcar-P
e síntese de DNA Síntese DNA

DNA DNA ligase I

XRCC1 Ligação da Ligação da
ligase III
cadeia cadeia

VIA CURTA 1 nucleotídeo VIA LONGA 2-13 nucleotídeos

Reparo por Excisão de Nucleotídeo – Nucleotide
Excision Repair (NER)

• Principal sistema de reparo para a remoção de

lesões volumosas no DNA formadas pela exposição à
radiação ou químicos
• Reparo por excisão de nucleotídeo acoplado à
transcrição (TC-NER): repara regiões transcritas de
DNA e é ativado por complexos de transcrição
paralisados
• Reparo genômico global (GGR): corrige lesões em
qualquer lugar do genoma e é ativado por forquilhas
de replicação paralisadas
Reparo por Excisão de
Nucleotídeo

- 4 fases:
- Reconhecimento do dano
- Montagem do complexo
multiproteico
- Excisão da fita danificada acima
e abaixo do dano
- Uso da fita não danificada como
molde para a DNA polimerase
Reparo de mal pareamento – Mismatch repair )MMR)

• Principal via que corrige erros remanescentes da replicação

• Reduz a taxa de erro para  10-9 : reconhece e repara bases
mal pareadas e pequenos loops causados por inserção e
deleção de nucleotídeos durante a replicação
• 3 passos:
– reconhecimento dos pares de base mal pareados
– determinação de qual base do par está errada
– excisão da base incorreta e síntese de nova base

• atua na cadeia recém-sintetizada (não

metilada) → logo após a replicação do DNA
•Genes em humanos: MSH, MLH e PMS →
as proteínas formam complexos (heterodímeros)

•Genes em procariotos: MutS, MutL e MutH

 E. coli

http://gizmodo.com/dna-repair-earned-the-nobel-prize-in-chemistry-and-her-1735347676
Junção de extremidades não-homólogas –
Nonhomologous end joining (NHEJ)

• Sistema de reparo propenso a erro

• Ativado quando fitas não
danificadas ou cromátides-irmãs
não estão presentes

KU80 e KU70:
Processamento
das extremidades

XRCC4 /DNA ligase IV:

ligação das extremidades

DNA reparado com

baixa fidelidade
Recombinação homóloga – Homologous Recombination
(HR)
▪ Mecanismo livre de erro
▪ Ativado quando DSBs ocorrem após a replicação de uma
região cromossômica de uma célula em divisão

•Etapas
•Reconhecimento da quebra e pareamento do cromossomo homólogo intacto
com o cromossomo que apresenta a quebra dupla
•Degradação das extremidades danificadas
•Deslocamento da cromátide-irmã intacta para o sítio a ser reparado
•A cromátide-irmã serve como molde para síntese de DNA → restaura a
sequência original
•Ligação das extremidades
 Recombinação homóloga – Homologous Recombination (HR)

http://mpmp.huji.ac.il/maps/dsbRecomb.html
UV ou outros
agentes Reparo normal Integridade do Sem
do DNA genoma doença

Reparo Morte celular Envelhecimento

defeituoso aumentada acelerado e
câncer
 SÍNDROMES COM DEFEITOS NO REPARO DO DNA:
ENVELHECIMENTO (PROGÉRIA)

Síndrome Genes mutados Processo Afetado

Cockayne CSA, CSB, XPB, TCR-NER

XPD, XPG
Tricotiodistrofia XPB, XPD, TTDA NER

Rothmund-Thomson RECQL4 Deficiência helicase

(reparo de danos oxidativos)

Hutchison-Gilford LMNA função da lâmina nuclear

(Progéria)
 SÍNDROMES COM DEFEITOS NO REPARO DO DNA:
CÂNCER

Síndrome Genes mutados Processo Afetado

Câncer mama BRCA1, BRCA2 Reparo Homólogo

familial (quebras duplas)

Li-Fraumeni TP53 Checkpoint G1-S

Câncer colorretal não- MSH2, MLH1 Mismatch repair

polipose hereditário (MMR)
(HNPCC)
 SÍNDROMES COM DEFEITOS NO REPARO DO DNA:
PROGÉRIA + CÂNCER
Síndrome Genes mutados Processo Afetado

Xeroderma pigmentoso XPA-XPG NER

S. Bloom BLM Deficiência helicase

(recombinação mitótica)
Anemia de Fanconi FANC Reparo DNA crosslink

Ataxia telangiectasia ATM Reparo DSB

S. Werner WRN Deficiência helicase
(recombinação/reparo DNA
manutenção dos telômeros)

Adolescência - 40 anos
 DOENÇAS HUMANAS HEREDITÁRIAS COM DEFEITOS
NO REPARO DO DNA

Xeroderma Pigmentoso
Síndrome de Cockaine
Tricotiodistrofia SÍNDROMES DE
Anemia de Fanconi
INSTABILIDADE
CROMOSSÔMICA
Ataxia telangiectasia
Síndrome de Bloom

➢ defeitos nos mecanismos de reparo e replicação do DNA

➢ freqüência  aberrações cromossômicas
➢ incidência  câncer
 XERODERMA PIGMENTOSO (XP)
➢ AR
➢ Clínica
manifestações cutâneas (1,5 anos)
anomalias oculares (4 anos)
anomalias neurológicas progressiva (6 meses)
primeiro câncer de pele (8 anos)

➢ Xeroderma (pele seca)

➢ Incidência:
1/250.000 (USA) e 1/40.000 (Japão)
XP: defeito no reparo de excisão de nucleotídeos
(NER)
XERODERMA PIGMENTOSUM (XP)

• indivíduos extremamente sensíveis à luz do sol

• risco elevado de desenvolver câncer de pele
• deficiência de reparo de dano no DNA induzido
por UV (dímeros de T) - NER
• resulta de defeitos de qualquer um de 8 genes diferentes
(XPA, XPB, XPC, XPD XPE, XPF, XPG e XPV)
• ~30% dos indivíduos XP desenvolvem anormalidades
neurológicas progressivas
XERODERMA PIGMENTOSUM (XP)

- Araras, povoado com cerca de 800 moradores a 40

quilômetros de Faina, região noroeste de Goiás.

- A taxa de incidência registrada na comunidade - de

1 para cada 40 habitantes - é a maior do mundo,
segundo a Associação Brasileira de Xeroderma
Pigmentoso (AbraXP).

Casamentos consanguíneos
 TRATAMENTO
proteção da pele da luz solar
chapéus
óculos que absorvem luz UV
Crianças da Lua bloqueadores solares
roupas protetoras
acompanhamento periódico por
dermatologista

Criança com XP protegida do sol usando máscara e luvas

resistentes a luz UV: não apresenta lesões na pele
• Síndrome de Cockayne

• Características:
- Anormalidades esqueléticas: face
parecida com a de um passarinho
- Cáries, cifose e osteoporose em pacientes
de idade avançada.
- Degeneração neurológica progressiva:
início precoce, desenvolvimento
psicomotor atrasado, defeitos no modo
de andar e retardo mental.
- Microcefalia
- Perda da audição, retinopatia pigmentar,
cabelos finos e cataratas
Morte: 12,5 anos
- Sensibilidade à luz UV (sem risco de
principais causas: pneumonia e
câncer de pele) infecções respiratórias
• Alterações genéticas:
• Dois genes com mutações foram identificados
nesta síndrome: CSA e CSB.

• O gene CSA, responsável pela síndrome de

Cockayne do tipo 1→ cromossomo 5.

• O gene CSB, responsável pela síndrome de

Cockayne do tipo 2 → cromossomo 10q11.
• Reparo defeituoso: TCR-NER
TRICOTIODISTROFIA (TTD)
➢ AR
➢ Clínica
-cabelos quebradiços (deficientes S)
-iquitiose (escamas de peixe)
-retardo mental e físico
-fácies distintivas orelhas protuberantes
queixo retraído
❖ descrita 1968 Pollitt e colaboradores

❖ 50% pacientes fotossensibilidade NER defeituoso

❖ TTD não desenvolvem câncer de pele

TTDA

XPB XPD

Helicases do fator de reparo/transcrição TFIIH

ANEMIA DE FANCONI (FA)

- AR
- Clínica
anemia aplástica (90% casos)
alterações da pigmentação da pele (64%)
baixa estatura (62%)
malformações do rádio (50%) e
deformidades do dedo polegar
anomalias oculares (41%), renais (34%),
microcefalia (37%), deficiência mental
(25%)
 descrita 1927 Guido Fanconi
➢ incidência: 1/22.000 a 1/476.000 indivíduos
➢ 8 grupos de complementação: FA-A, FA-B, FA-C, FA-D1, FA-D2,
FA-E, FA-F e FA-G heterogeneidade genética
➢ células FA: sensíveis à agentes químicos que causam ligações
cruzadas entre as fitas de DNA: mitomicina C (MMC),
diepoxibutano (DEB), mostarda nitrogenada (NM), cisplatina , ...
➢ freqüência  de neoplasias: leucemias e tumores hepáticos
➢ quebras cromossômicas espontâneas, figuras tri, quadri e
multirradiais.
 SÍNDROME DE BLOOM (SB)

➢ AR
➢ Clínica
 peso ao nascimento
retardo de crescimento pré e pós-natal
(145 cm Homem; 130 cm Mulher)
telangiectasias e fotossensibilidade (borboleta)
cabeça alongada, microcefalia, inteligência
normal
imunodeficiência: infecções (respiratórias e
gastrointestinais)
Incidência: 1/58.000
ascendência judaica Ashkenazi

➢ Frequência aumentada de quebras

cromossômicas figuras quadrirradiais

➢ mutações no gene BLM

15q26.1

DNA helicase ( RecQ)

papel na replicação e reparo do DNA

Risco maior de câncer: carcinomas,

leucemias e linfomas
 ATAXIA TELANGIECTASIA (AT)
SÍNDROME DE LOUIS-BAR
➢ AR
➢ Clínica
- Degeneração cerebelar progressiva- Ataxia
(12-14 meses) disfunção neuromotora
-telangiectasia dos olhos e pele (3 e 5 anos)
- retardo de crescimento (70%)

incidência neoplasias (linfoma e

leucemia linfóide) e imunodeficiências
incidência: 1/40.000
risco  câncer de mama heterozigotos AT
➢ células AT sensíveis a radiação ionizante e agentes
radiomiméticos (N-acetoxi-N-2-acetil-2-aminofluoreno - 4-
NQO)

➢ linfócitos AT rearranjos espontâneos dos cromossomos 7 e 14

➢ mutações gene ATM
gene ATM (11q23) proteina ATM participa diversas vias:
controle transdução de sinal
checkpoint ciclo celular
resposta celular ao dano no DNA induzido por radiação
 ATAXIA TELANGECTASIA (AT)
• mutações no gene ATM (11q22-23)

http://www.nature.com/nrg/journal/v2/n3/fig_tab/nrg0301_196a_F2.html
Por quê indivíduos com algumas destas doenças
hereditárias com defeitos
no reparo do DNA apresentam risco elevado de
desenvolver alguns tipos
de câncer
Instabilidade Genética – uma característica evolutiva
do câncer

• Formas de instabilidade genética em câncer

– instabilidade cromossômica (aberrações
numéricas e estruturais)
– instabilidade de microssatélite (expansão ou
contração de repetições de oligonucleotídeos em
sequências de microssatélite)
– frequência aumentada de mutações de pares de
base
Formas de instabilidade
genética em cânceres
hereditários

Mutações em genes de Fornece suporte para a

reparo do DNA “hipótese do mutador”

A instabilidade genética está presente em

lesões pré-cancerosas e direciona o
desenvolvimento do tumor
Por aumentar a taxa de mutação
espontânea
Instabilidade genética
em leões pré- Mutações em genes
“guardiões” (caretaker genes)
cancerosas

Genes que funcionam

primariamente para manter a
estabilidade genômica (TP53, ATM)
 TP53 e ATM - Resposta aos danos no DNA

http://clincancerres.aacrjournals.org/content/14/13/4032/F1.expansion.html
 CÂNCERES HEREDITÁRIOS

➢Mutações na linhagem germinativa tendo como alvo genes

de reparo estão presentes em todas células do corpo do
paciente

➢ Um único evento (perda do alelo selvagem remanescente)

levaria à instabilidade genômica e direcionaria o
desenvolvimento do tumor (hipótese do mutador)
http://sphweb.bumc.bu.edu/otlt/MPH-Modules/PH/PH709_Cancer/PH709_Cancer4.html
http://www.nature.com/ncb/journal/v11/n3/full/ncb0309-228.html
microRNAs X DNA Damage Response

Liu and Lu, 2012

 miRNAs na DDR

• Defeitos na DDR e repressão global de miRNA são atualmente

consideradas características de muitos tipos de câncer humano

• Várias proteínas cruciais da via DDR são reguladas por miRNAs

• miRNA regulados pela DDR e miRNAs que regulam os genes da DDR

estão envolvidos na iniciação e progressão da tumorigênese

• podem fornecer uma nova visão para a sensibilidade ou resistência

das células cancerosas às drogas genotóxicas e possivelmente levar
ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas

Han et al., 2012

Assim...
Fim