Prácticas de Bioquímica Mgr.

Soledad Bornás Acosta

PRÁCTICA 4

ESPECTROFOTOMETRÍA

1. INTRODUCCION

Muchos experimentos en bioquímica dependen de la medición de absorción de luz

monocromática de una sustancia en solución en la región visible y ultravioleta del espectro
electromagnético. Diversos compuestos sean o no coloreados tienen la capacidad de
absorber luz de una determinada longitud de onda, pero en otros casos, es necesario
transformar la luz en un derivado coloreado usando reactivos apropiados.
Las moléculas de interés biológico adsorben luz en la longitud de onda comprendida entre
200 y 800 nanómetros (nm), como las purinas, pirimidinas, aminoácidos aromáticos, ácidos
nucleicos, proteínas y otros. Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría)
de luz de una solución pueden usarse como medida de su concentración.
Para realizar las medidas de concentración se utiliza un instrumento llamado
espectrofotómetro, el cual contiene un prisma de dispersión entre la fuente de luz y la
muestra para poder seleccionar la longitud de onda analítica adecuada. La
espectrofotometría consiste en comparar la transmisión de la luz a través de una solución
que contiene la muestra.
La ley de Lamber – Beer nos manifiesta que la fracción incidente absorbida por una solución
a una determinada longitud de onda está relacionada con el espesor de la capa absorbente
y concentración de la especie que absorbe. Esta ley está expresada por la fórmula: A =
ɛ.c.l, donde A = Absorbancia (0 - 1), ɛ = Coeficiente de Extinción Molar, C = Concentración
(g/L, mg/mL, ug/Ml, etc.) l = longitud de la cubeta (cm).
Para la transmitancia se aplica la fórmula T = I/Io, donde T = Transmitancia (se expresa de
100 – 0%), I = luz transmitida, Io = Luz incidente. Pueden existir limitaciones en la ley de
Lambert – Beer, debido a diversas desviaciones como instrumental, naturaleza de la muestra
y el investigador. En la presente práctica esta luz debe estar entre el 10 y el 90%
aproximadamente. La determinación de la concentración de una solución se puede realizar
por el factor de calibración, curva de calibración y mediante la ecuación A = ɛ.c.l.

2. OBJETIVOS
 Encontrar la curva espectral de un colorante.
 Determinar la longitud de onda analítica o de mayor absorbancia.
 Poner en evidencia la ley de Lambert – Beer, haciendo uso de concentraciones
progresivas de un colorante.
 Determinar la curva de calibración y factor de calibración mediante concentraciones
progresivas del colorante.
 Determinar la concentración de una sustancia desconocida mediante el uso de la
curva de calibración o factor de calibración.

3. MATERIAL Y METODOS
3.1. MATERIALES

3.1.1. Materiales de vidrio

 Tubos de ensayo
 Pipetas
 Cubetas

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3.1.3. Reactivos
 Anaranjado de metilo 10mg/L
 Anaranjado de metilo desconocido
 Agua destilada

3.1.4. Equipos y otros

 Espectrofotómetro

3.2. METODOS
Mediante la observación y exploración se aplicará el método de absorción utilizando el
espectrofotómetro.

4. PROCEDIMIENTO
4.1. Espectros de absorción y longitud de máxima absorción
 En un tubo medir 2ml de un colorante (anaranjado de metilo) y diluirlo con 1mL de
agua destilada.
 Calibrar el espectrofotómetro a cero utilizando agua destilada como blanco.
 Seleccionar la longitud de onda de mayor absorbancia.

Longitud de onda 380nm 420nm 460nm 500nm 540nm 580nm

4.2. Curva de calibración

 Preparar en tubos de ensayo, diferentes concentraciones con el respectivo colorante
anaranjado de metilo (10mg/L).

1 2 3 4 5 6
Anaranjado de metilo (10mg/L) 0mL 1mL 2mL 3mL 4mL 5mL
Agua destilada 5mL 4mL 3mL 2mL 1mL 0mL

 Medir la absorbancia de los sistemas de tubos a una longitud de onda de máxima
absorción, utilizando agua destilada como blanco.

4.3. Factor de calibración

 Determinar la concentración de anaranjado de metilo en mg/mL y mg/100mL para
cada tubo.
 Encontrar el factor de calibración para el anaranjado de metilo.

4.4. Concentración de una solución desconocida

 En un tubo de ensayo medir 5mL de la solución desconocida.
 Medir la absorbancia de la muestra desconocida, utilizando la misma longitud de
onda de máxima absorción.

5. RESULTADOS
 Esquematizar el procedimiento de los experimentos.
 Mediante el uso de una tabla indicar la longitud de máxima absorción para el
anaranjado de metilo.

Longitud de onda 380nm 420nm 460nm 500nm 540nm 580nm

Absorbancia

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 Luego graficar en papel milimetrado los resultados de la tabla.

 Para la curva de calibración del anaranjado de metilo, elaborar una tabla indicando
la absorbancia y la concentración de cada sistema de tubos según el caso.

Anaranjado de metilo (10mg/L) 1 2 3 4 5 6

Absorbancia
Concentración (mg/mL)
Concentración (mg/100mL)

 Graficar en papel milimetrado los resultados de la tabla anterior.

 Encontrar el factor de calibración para el anaranjado de metido, mediante el uso de
cálculos matemáticos.
 Hallar la concentración de la solución desconocida, usando la curva de calibración
y/o factor de calibración, mediante el uso de una tabla.

Anaranjado de metilo desconocido Curva de Factor de

calibración calibración
Concentración (mg/mL)
Concentración (mg/100mL)

 Ubicar la concentración de la solución desconocida en el gráfico de la curva de

calibración.

6. CONCLUSIONES

7. CUESTIONARIO
7.1. ¿Qué entiende por coeficiente de extinción molar?
7.2. ¿Qué se entiende por factor de calibración?
7.3. ¿Cuándo se usa luz ultravioleta o luz blanca en el método de espectrofotometría?
7.4. ¿Qué es densidad óptica?
7.5. ¿Qué importancia tiene el tubo blanco y el tubo estándar?

8. BIBLIOGRAFIA