QUÍMICA BIOLÓGICA – 2017- ENZIMOLOGÍA

MÉTODOS DE MEDIDA DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. TABLA DE PURIFICACIÓN

1. a) Describa métodos continuos y discontinuos para la determinación de la actividad enzimática y

dé ejemplos. b) Indique y explique brevemente todos los métodos a través de los cuales usted puede
seguir la evolución de las siguientes reacciones, indicando si se trata de métodos continuos o
discontinuos.

NAD+ + lactato  NADH + piruvato Lactato deshidrogenasa

fosfoenolpiruvato + HCO3-  oxaloacetato + Pi Fosfoenolpiruvato carboxilasa

2. La actividad de una muestra de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) pura, de concentración

2 mg/ml, se ensayó por un método discontinuo midiendo la aparición de piruvato mediante un ensayo
colorimétrico. La dinitrofenilhidrazina (DNFH) y el piruvato forman una hidrazona que luego del
agregado de NaOH presenta un máximo de absorbancia a 505 nm. Así, 10 µl de la muestra se
incubaron a 30ºC con concentraciones saturantes de lactato y NAD+ en un volumen final de 3 ml.
Luego de 3 min la reacción enzimática se detuvo por el agregado de 0,5 ml de DNFH. Después de
10 min se adicionaron 1,5 ml de NaOH 0,4 N y se midió absorbancia de la hidrazona formada a
505 nm, obteniéndose un valor de absorbancia de 0,6 una vez restado el blanco.
Para realizar la curva de calibración del método colorimétrico se trabajó en idénticas condiciones
utilizando una solución de ácido pirúvico (PM = 88) 4,4 mg/ml. Los valores obtenidos se muestran en
la tabla.

ml de testigo 0 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40

Abs (505 nm) 0,05 0,15 0,25 0,44 0,66 0,85

a) Calcule la actividad en U/mg. b) Si las concentraciones de los sustratos fueran subsaturantes, ¿el
valor de la actividad sería mayor o menor al obtenido en a)? c) Si la pureza de la muestra de la LDH
fuera del 50%, ¿qué valor de actividad esperaría?

3. La actividad de la enzima malato deshidrogenasa (MDH) purificada de maíz fue medida por un
método discontinuo. La enzima cataliza la siguiente reacción:
Oxaloacetato + NADH  Malato + NAD+
La reacción se llevó a cabo en 1 ml de medio de reacción que contenía 50 mM Tris-HCl pH 8;
concentración saturante de NADH, 10 mM de oxaloacetato (OAA) y 10 µl de la preparación
enzimática (0,1 mg/ml de proteína). Luego de 1 min de incubación a 37°C, se agregaron 5 ml de un
reactivo de color que se utiliza para dosar OAA, obteniéndose luego de 10 min una absorbancia de 0,2
una vez restado el blanco. Como testigo se utilizó una alícuota de 1 ml de OAA 4,6 mM, al que se le
adicionaron 5 ml de reactivo de color, registrándose una absorbancia (ya restado el blanco) de 0,095
luego de 10 min. a) Calcule las U/ml de enzima que posee la preparación. b) Proponga un método
continuo de medida de actividad para esta enzima.

4. Se procedió a purificar a homogeneidad la enzima Glutamato-piruvato transaminasa a partir de

hígado de rata. La enzima cataliza la reacción:
-cetoglutarato + alanina  glutamato + piruvato

Luego de varios pasos de purificación se midió actividad enzimática de la preparación, para lo cual se
contaba con dos métodos alternativos.

0
a) El primer método de medida acopla una segunda reacción catalizada por la enzima Lactato
deshidrogenasa (LDH): Piruvato + NADH + H+  Lactato + NAD+, midiéndose la disminución de la
absorbancia a 340 nm ( NADH = 6,22 mM-1 cm-1). Se incubaron 200 µl de la preparación enzimática en
un volumen final de 1 ml que contenía -cetoglutarato, Ala, NADH y LDH. La disminución de la
absorbancia obtenida fue de 0,62 por minuto. Calcule las UI/ml de la preparación enzimática; b) Por el
otro método alternativo de medida se incubaron 100 µl de la preparación enzimática en un volumen
final de 1 ml con -cetoglutarato y Ala. A los 10 minutos, la reacción se detuvo con el agregado de
0,5 ml de 2,4 dinitrofenilhidrazina y además se agregaron 5 ml de NaOH 0,2 N, obteniéndose una
velocidad de 0,32 U/ml. Sabiendo que 1 ml de testigo de piruvato 1 mM presenta con el mismo
método de medida una absorbancia de 0,2, calcule la absorbancia que obtendría en este caso; c)
Describa las razones por las cuales los valores de velocidad obtenidos difieren entre los dos métodos
utilizados.

5. La acetil-CoA carboxilasa (ACCasa) cataliza la carboxilación, dependiente de ATP, del acetil-

CoA para formar malonil-CoA, primer intermediario en la síntesis de ácidos grasos:
Acetil-CoA + ATP + CO2 Malonil-CoA + ADP + Pi.
La enzima fue aislada a partir de hojas de trigo y se llevaron a cabo los siguientes estudios cinéticos:
Se determinó la actividad enzimática en un volumen final de 200 µl en las siguientes condiciones:
100 mM Tricina-KOH (pH 8,0), 40 mM ATP, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1mM DTT, 30 mM acetil-
CoA, 30 mM [14C] NaHCO3 (3,33x 108 cpm; cpm=cuentas por minuto) y 1,8 g de la proteína
purificada. La reacción comenzó con el agregado de la enzima, transcurrió durante 10 minutos a 30°C
y se interrumpió por la adición de 50 µl de 6 N HCl. La acidificación del medio provoca la
inactivación de la enzima y la eliminación del HCO3- remanente por conversión en CO2. Alícuotas de
50 µl de la mezcla de reacción fueron transferidas a discos de papel de filtro. Los papeles se secaron a
temperatura ambiente y su radioactividad se contó en un contador de centelleo. El valor promedio de
radioactividad por disco correspondió a 3,5 x 106 cpm. Determine la velocidad de reacción en U/mg.

6. La enzima malato deshidrogenasa dependiente de NADP cataliza la siguiente reacción:

Malato + NADP+  Oxaloacetato + NADPH
A partir de 500 g de hojas de espinaca se obtuvieron 1500 ml de un extracto crudo con una
concentración de proteínas de 20 mg/ml. La actividad se determinó midiendo la aparición de NADPH
a 340 nm en forma continua. Para la determinación se utilizó una alícuota de 30 µl del extracto en un
volumen final de 3 ml, obteniéndose un A/10 min = 1,24, NADPH = 6200 M-1.cm-1.
Se realizó luego una cromatografía en DEAE celulosa recogiéndose 180 ml que contenían 1800 U de
actividad enzimática y 2.250 mg de proteína. El paso posterior fue una columna de hidroxilapatita,
recogiéndose 10 tubos de 4 ml cada uno con actividad deshidrogenasa. La concentración de proteína
en el conjunto fue de 0,94 mg/ml con un rendimiento del 50 % respecto del paso anterior. Como
último paso se realizó una cromatografía en columna de Sepharosa 6B y se recuperaron 760 U de
enzima y 31,4 mg de proteína en un volumen de 15 ml.
En base a estos datos a) Construya la Tabla de Purificación, b) Indique la purificación y el rendimiento
total alcanzados; c) ¿Cuál es la etapa individual que dio mayor purificación y cuál la de mayor
rendimiento? d) Describa el método empleado en el segundo paso de purificación. e) Señale si todas
las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta.

7. Se realizó la purificación de la enzima glucosa-6-fosfatasa que cataliza la siguiente reacción:

Glucosa-6-fosfato  Glucosa + Fosfato

1
Se partió de 200 g de hígado de bovino obteniéndose un extracto inicial de 1200 ml, que tenía una
concentración de proteína de 10 mg/ml. Para medir actividad enzimática se incubó una alícuota de
50 µl con el sustrato a 30°C en 1 ml de medio. La reacción se cortó directamente a los 10 min por el
agregado de 2 ml de reactivo de color para fosfato. La reacción de color se lee a 740 nm en una cubeta
de 1 cm de camino óptico. La Abs740 fue de 0,49 con un blanco de medida de 0,12. El coeficiente de
extinción del producto de la reacción de color es de 3700 M-1.cm-1.
Se realiza luego un corte con (NH4)2SO4 al 50 % rescatándose la fosfatasa en el precipitado, el que fue
redisuelto en 80 ml, recuperándose 1680 mg de proteína con una actividad total de 504 U.
Posteriormente, se realizó una cromatografía en Sephadex G-25 recogiéndose 10 tubos de 12 ml cada
uno con actividad enzimática. La concentración de proteína en el conjunto fue de 10,8 mg/ml con un
rendimiento, respecto del paso anterior del 80%. Como último paso se efectuó una cromatografía de
afinidad y se obtuvieron 144 U de enzima con actividad específica de 3,6 U/mg en un volumen de
20 ml.
En base a estos datos a) Construya la Tabla de Purificación. b) ¿Cuál es la purificación y el
rendimiento total alcanzados? c) ¿Cuál es la etapa individual que dio mayor purificación y cuál la de
mayor rendimiento? d) Describa el fundamento del último paso de purificación empleado. e) Señale si
todas las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta

8. La dihidropicolinato sintetasa (DHDPSasa) se purificó y caracterizó a partir de cultivos de trigo

en suspensión. Dicha enzima cataliza la siguiente reacción, donde ASA y DHDP representan a
aspartato β-semialdehído y ácido 2,3 dihidropicolínico, respectivamente.

Piruvato + ASA  DHDP + 2 H2O

Durante la purificación de la DHDPSasa se obtuvieron 200 ml de extracto crudo, que contenían 0,5 g
de proteína. La actividad se ensayó midiendo piruvato remanente. La reacción se llevó a cabo en 3 ml
de medio de reacción, conteniendo 30 µl de enzima, Tris-HCl 100 mM pH 8, 40 mM de piruvato
sódico y concentración saturante de ASA. Luego de 10 minutos a 30°C, la reacción enzimática se
detuvo por el agregado de 0,5 ml de DNFH (reactivo de color). Después de 15 minutos se adicionaron
1,5 ml de NaOH 0,4 N y se determinó la absorbancia de la hidrazona a 505 nm, en una cubeta de 1 cm
de paso óptico. La absorbancia obtenida fue de 0,8. Como testigo se utilizó una alícuota de 100 µl de
una solución de concentración 31,55 mg/ml de piruvato a la que se le realizó el mismo tratamiento que
a la muestra, obteniéndose una absorbancia A 505 nm de 0,25. PM Piruvato = 88.
A este extracto se le realizó un corte con (NH4)2SO4, precipitando la enzima entre el 30 y 60 % de
saturación. El precipitado se redisolvió y luego de desalado se obtuvo un volumen final de 150 ml, con
una concentración de proteína de 2 mg/ml, y un rendimiento de 80 %. La muestra anterior se separó en
dos fracciones. El 60 % se sembró en una columna de DEAE-celulosa obteniéndose 50 ml de muestra
conteniendo 75 mg de proteína, y un rendimiento con respecto al paso anterior del 45%. El 40%
restante se sembró en una columna de afinidad, obteniéndose 25 ml de muestra que contiene 20 mg de
proteína, purificándose 5 veces con respecto al paso anterior.
En base a los datos: a) Realice la tabla de purificación, b) Indique rendimiento y purificación totales,
c) Justifique cuál de las etapas alternativas elegiría.

9. Se intenta purificar la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP que

cataliza la reacción:

Gliceraldehído 3-fosfato + NADP + Pi  1,3-Difosfoglicerato + NADPH + H+

Se parte de 500 g de hojas de espinaca, obteniéndose 1.500 ml de un extracto crudo con una
concentración de proteína de 20 mg/ml. La medida de actividad se determinó con una alícuota de 30 µl

2
por un método continuo, midiéndose la aparición de NADPH (NADPH = 6200 M-1.cm-1) en una cubeta
de 3 ml y 1 cm de camino óptico, obteniéndose un A/10 min= 1,24.
Se realizó luego una cromatografía en DEAE-celulosa, recogiéndose 180 ml que contenían 1800 U de
actividad enzimática y 2250 mg de proteína. El volumen total de este paso (180 ml) fue dividido en
dos volúmenes iguales. I) Una de las fracciones fue sometida a cromatografía de adsorción
(hidroxilapatita), recogiéndose 5 tubos de 4 ml cada uno, con actividad deshidrogenasa. La
concentración de proteína en el conjunto fue de 0,94 mg/ml, con un rendimiento respecto al paso
anterior del 50%. II) La otra fracción de la columna de DEAE-celulosa fue sometida a una
cromatografía de afinidad; en la que se recuperaron 800 U de enzima y 4 mg de proteína en un
volumen de 15 ml.
a) Calcule el rendimiento y la purificación para cada uno de los procedimientos alternativos empleados
b) La electroforesis en gel de poliacrilamida mostró que la enzima proveniente de uno de los
procedimientos migraba como una única banda de proteína (Rf = 0,33), mientras que la proveniente
del otro procedimiento mostraba la presencia de tres bandas proteicas (Rf = 0,25; Rf = 0,325 y Rf =
0,65). En base a la tabla de purificación podría adjudicar a qué procedimiento de purificación
corresponde cada electroforesis obtenida. Justifique su respuesta.

10. Dos grupos de trabajo presentan independientemente protocolos para la purificación de una
enzima desde un mismo tejido de plantas. Para medir la actividad enzimática se incuba una alícuota de
30 l de enzima con el sustrato en 1 ml de medio de reacción. La reacción se corta a los 5 minutos por
el agregado de 2 ml de reactivo de color específico para el producto de la reacción ( =3700 M-1 cm-1)
Se utiliza una cubeta de 1 cm de camino óptico. La medida del blanco de reacción da un valor = 0,1.
Los volúmenes indicados se refieren a la cantidad recuperada en cada paso.
Protocolo 1: I) Extracto Crudo: 200 ml, Abs=0,56, [proteína]= 50 mg/ml; II) Fraccionamiento con
PEG: 300 ml. Se purifica 10 veces la enzima, con un rendimiento de 80%; III) Cromatografía en
DEAE-celulosa: 280 ml, Act Específica = 5 y 280 U de enzima; IV) Cromatografía en columna de
Hidroxilapatita: 25 ml, 84 U de enzima y 8,4 mg de proteínas.
Protocolo 2: I) Extracto Crudo: 400 ml 2,5 U/ml y una Act Específica = 0,05; II) Columna de
Sephadex: 500 ml Se purifica 2 veces la enzima, con un rendimiento del 50%; III) Precipitación con
(NH4)2SO4 y desalado: 200 ml, 1 U/ml y 0,3 U/mg; IV) Cromatografía en Affigel Blue: 30 ml.
Purificación parcial de 10 veces, y un rendimiento parcial del 80%

a) Indique la purificación y rendimiento de cada protocolo y compárelos. b) Proponga un posible

protocolo alternativo (consistente en extracto crudo más tres pasos) para mejorar la purificación.
Justifique brevemente.

11. Durante la purificación de la enzima ureasa (Urea + H2O  2 NH4+ + CO2) se obtuvo 900 ml de
Extracto Crudo (EC) con una concentración de proteína de 3,33 mg/ml. Su actividad se midió
siguiendo la disminución de la Absorbancia a 340 nm utilizando la reacción acoplada NH4+ + KG +
NADH + H+ Glu + NAD+ ( NADH = 6200 M-1 cm-1). El agregado de 20 l de EC a 1 ml de la mezcla
de reacción produjo un A = - 0,800 en 4 minutos en una cubeta de 1 cm de camino óptico. Un corte
con (NH4+)2SO4 dio lugar a un precipitado que se redisolvió con buffer hasta 150 ml de volumen final.
De esta manera la ureasa se purificó 10 veces con un rendimiento del 82,8 %. Luego de pasados por
una columna de Sephadex G-25 se recolectaron 80 ml con 45 mg de proteína, purificándose 50 veces
respecto del EC con un rendimiento del 90 % respecto del paso anterior. Su actividad se determinó por
el método discontinuo (NH4+ + Fenol + Hipoclorito  Azul de Indofenol) cuya curva de calibración
de NH4+ presentó una pendiente de 0,6557 UA/mol NH4+. Las condiciones de la colorimetría fueron
las mismas para la curva y la muestra. a) ¿Cuál fue la absorbancia al cabo de un minuto por este último
método para la muestra si se emplearon 40l de ureasa obtenida en la última etapa? Tenga en cuenta

3
que para la ureasa una unidad de actividad enzimática (1 UI) se define como la cantidad de enzima que
cataliza el consumo de 1 μmol de sustrato (urea) por minuto en las condiciones especificadas.
b) Construya la tabla de purificación.

12. La enzima málica cataliza la reacción: Malato + NADP+  Piruvato + CO2 + NADPH + H+. Se
intentó purificar esta enzima a partir de hojas de maíz. Para ello se realizaron distintas etapas que
incluyeron la preparación de un extracto crudo, precipitación con (NH4)2SO4, cromatografía de
exclusión molecular en Sephadex G-100 y cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa. La
medición de proteínas se realizó por el método de Gornall. Para ello, alícuotas de 20 µl de la
preparación enzimática se incubaron con 2 ml del reactivo de Biuret durante 15 min a 37°C. El testigo
de ovoalbúmina (10 mg/ml) procesado de la misma manera produjo un valor de absorbancia de 0,650
medido a 545 nm. La actividad enzimática se determinó en 1 ml de medio de reacción que contenía
50 mM Tris-HCl pH 8,0, cantidades saturantes de los sustratos y 10 µl de la preparación enzimática. A
los 10 min de incubación a 30°C, la reacción se detuvo por el agregado de 2 ml de
dinitrofenilhidracina. Como testigo se utilizó 1 ml de piruvato (PM=88) de 0,5 mg/ml que produjo un
valor de absorbancia de 0,040 medido a 505 nm. En base a los datos suministrados, a) Construya la
tabla de purificación calculando el rendimiento y la pureza total alcanzados; b) Proponga otro método
de medida de la actividad enzimática.

Etapa Volumen Abs 545 nm Abs 505 nm

(ml)
Extracto crudo 30 0,390 0,050
(NH4)2SO4 8 0,253 0,166
Sephadex G-100 4 0,163 0,208
DEAE-celulosa 2 0,097 0,375

13. Se intenta purificar la enzima Gliceraldehído 3P deshidrogenasa que cataliza la siguiente

reacción:
Gliceraldehído-3P + NADP+  3P-Glicerato + NADPH + H+
Luego de obtener el extracto crudo y realizar varios pasos de purificación a partir de hojas de espinaca
se obtuvieron 75 ml con una concentración de proteína de 2 mg/ml. La medida de actividad se realizó
con una alícuota de 20 µl midiéndose por método continuo la aparición de NADPH a 340 nm
(ε= 6200 M-1. cm-1) en una cubeta de 4 ml y 1 cm de camino óptico, obteniéndose un A de 0,31 en
4 minutos.
Con el fin de elegir qué paso era más conveniente para continuar la purificación, se toman
distintas alícuotas de la muestra y se procede de la siguiente manera:
1. 40 ml fueron sometidos a una cromatografía de exclusión molecular en la que se recuperaron
100 ml que contenían 100 U de actividad y 80 mg de proteína.
2. 25 ml fueron sometidos a una cromatografía de adsorción obteniéndose un rendimiento del 50%
y recogiéndose 10 tubos de 1 ml, con una concentración de proteína de 0.03125 mg/ml.
3. Con los últimos 10 ml se realizó una DEAE-celulosa obteniéndose 5 ml con una actividad
específica de 2.5 U/mg y 5 mg de proteína.
En base a los datos: a) Calcule rendimiento y purificación para cada uno de los tres procedimientos.
b) ¿Qué procedimiento elegiría si su objetivo fuera obtener la enzima lo más pura posible?

4
 PARÁMETROS CINÉTICOS: CÁLCULOS Y APLICACIONES

1. Un investigador purifica una enzima de una bacteria Gram-positiva (I) y de hígado de ratón (II).
Decide realizar la caracterización de la misma de ambas fuentes y realiza los siguientes estudios: a)
Determinación de la masa molecular en columna de exclusión molecular en condiciones nativas: I=
200 kDa; II= 200 kDa; b) Determinación de la masa molecular en SDS-PAGE: I= 50 kDa; II= 50
kDa; c) Medición de la velocidad de reacción a concentraciones saturantes del
sustrato (S): I=10 U/mg; II= 10 U/mg; d) Determinación de la concentración de S que da una
velocidad de 5 U/mg: I= 1 mM; II= 1 mM. Cuando estudia la cinética de la reacción obtiene los
siguientes resultados mostrados en las tablas. a) ¿Qué puede decir sobre la cinética seguida por cada
enzima? b) Sabiendo que la enzima tiene un solo sitio de unión del sustrato por subunidad, ¿qué puede
decir acerca de las interacciones de los sitios activos en cada caso? c) ¿Qué gráfico realizaría para
avalar su propuesta? d) ¿Encuentra alguna diferencia sobre la regulación que cada enzima podría
presentar in vivo por la concentración de sustrato? Explique.

Enzima I Enzima II
[S] (mM) V (U/mg) S (mM) V (U/mg)
0,1 0,9 0 0
0,5 3,3 0,5 0,5
1 5 1 5
2 6,6 2 9,5
4 8 4 10
10 9,1 10 10

1,4
2. Caracterice a las enzimas A (círculos vacíos) 1,2
1,0
y B (círculos llenos) lo mejor posible indicando
0,8
log (Vmax-v)/v

para cada una de ellas: a) comportamiento cinético, 0,6

b) gráfico de velocidad versus [S]; c) ecuación de 0,4 A
velocidad; d) número de Hill. 0,2
0,0
-0,2 B
-0,4
-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

log [S]

3. Las beta-lactamasas son enzimas que hidrolizan antibióticos de la familia de los beta-lactámicos,
ampliamente utilizados para combatir infecciones bacterianas. El estudio de estas enzimas tiene como
objetivo entender las bases de la resistencia de algunos patógenos frente a estos antibióticos y el diseño
de estrategias eficaces para combatirlos. En base a los datos mostrados en la tabla indique a) ¿cual
antibiótico es más eficazmente hidrolizado por EBR-1? b) ¿Considera que el uso de bencilpenicilina
podría ser efectivo en el tratamiento de una infección con Chryseobacterium indologenes? c) GOB-1 y
BlaB son beta-lactamasas de dos aislados de Chryseobacterium meningosepticum, ¿alguna de las dos
enzimas tiene mayor eficiencia frente a antibióticos beta-lactámicos?

5
4. Teniendo en cuenta la ecuación de Michaelis y Menten, indique si las siguientes afirmaciones
son verdaderas o falsas:

a) La constante de Michaelis, Km
* Varía con la velocidad de la reacción enzimática
* Es constante para una enzima determinada sea cual fuera el sustrato usado.
* Es la constante de velocidad para la descomposición del complejo ES.
* Es la concentración de sustrato a la cual se obtiene una velocidad igual a la máxima.

b) El valor de V resulta el 95% de Vmáx cuando la concentración de sustrato:

* es igual a 19*Km
* es igual a 2*Km
* es igual a 0.5*Km

5. Se estudió para una proteína X la dependencia de la actividad enzimática con la concentración de

sustrato y se obtuvieron los siguientes valores de velocidad (µmoles/min.mg):

[S] (mM) 0,25 0,50 0,67 1,00

V 33 50 57 67

Teniendo en cuenta que el peso molecular de la proteína es 300.000: a) Calcule los valores de Km,
Vmax. b) Exprese el valor de velocidad máxima en Katal/mg. c) Calcule el número de recambio y
explique el significado del mismo.

6
6. Dos estudiantes (A y B) aislaron independientemente la enzima uresa de semillas de soja. Esta
enzima cataliza la siguiente reacción:

urea + H2O  2 NH3 + CO2

Una vez obtenida una solución concentrada de enzima, midieron actividad (µmol/min.mg proteína) en
presencia de distintas concentraciones de urea obteniendo los siguientes datos:

[urea](M) 2.10-6 5.10-6 1.10-5 5.10-5 1.10-4 2.10-4 1.10-3

Act.
A 16 33 50 83 90 99 100
B 25 50 75 125 136 148 150

a) Sin graficar, estime aproximadamente Km y Vmax. Justifique. b) Proponga una explicación para la
discrepancia observada entre los parámetros cinéticos estimados por A y B. c) ¿Qué variables
graficaría para obtener Km y Vmax? Justifique.

7. En base a los datos del ejercicio 3 de la guía anterior y considerando que el valor de Km para el
OAA de la enzima es 10 μM, el peso molecular es 200.000 y que la enzima posee 4 sitios activos por
molécula, calcule el índice de recambio.

8. Se purificó a homogeneidad la enzima málica dependiente de NADP (EM-NADP) de PM 15.000

Da que cataliza la siguiente reacción:
malato + NADP  piruvato + CO2 + NADPH.

Se estudió la actividad enzimática a concentraciones de sustratos saturantes midiendo el aumento de

absorbancia a 340 nm ( NADPH = 6,22 mM-1 cm-1)
El medio de reacción contenía 20 µl de Malato 200 mM, 2 µl de NADP 50 mM y 20 µl de la
enzima pura (2,2 mg/ml) en un volumen final de 1 ml. Al cabo de 2 min de reacción enzimática se
obtuvo una variación de absorbancia de 0,78. El índice de recambio de la proteína es de 10,5 min-1.
a) Determine la concentración (mM) de sitios activos de la preparación enzimática. b) Determine
cuántos sitios activos posee cada molécula.

9. Una enzima cataliza la reacción S  P. Con los siguientes datos estime el valor de Km para dicha
enzima: I) Índice de recambio: 3800 min-1, II) PM de la enzima: 62 kDa. III) Número de sitios activos
por molécula de enzima: 3 IV) concentración de enzima de 1,5 mg/ml y V) la actividad enzimática,
ensayada en un medio de reacción de 1,5 ml que contenía 10 µl de una solución del sustrato 200 mM
dio un valor de 12 UI/ml de la preparación enzimática.

10. En mamíferos existen 4 isoenzimas hexoquinasa (HK): glucosa + ATP  glucosa6P + ADP,
cada una de ellas con diferentes propiedades estructurales, cinéticas y regulatorias. La HK-I se localiza
en el citosol de células del cerebro, donde se estructura como un heterodímero de subunidades de 50
kDa, con una subunidad cumpliendo un rol regulatorio. Por otra parte, las HK-II y HK-IV se localizan
en músculo e hígado, respectivamente, y se estructuran como homodímeros de subunidades de 50 kDa.
Dos de estas isoformas de la HK cumplen el rol de proveer un suministro constante de glucosa6P al
órgano, independientemente de las fluctuaciones en los niveles sanguíneos de glucosa. La otra enzima
es la responsable de que la concentración de glucosa en sangre no exceda los 5 mM con el objetivo de

7
evitar un shock hiperglicémico luego de las comidas. La siguiente tabla resume los parámetros
cinéticos de la HK-I, HK-II y HK-IV.

Km glucosa Vmax kcat

(mM) (U/mg) (s-1)

HK-I 0,06 75 125

HK-II 0,1 150 125
HK- 8,4 250 208
IV

a) Considerando que los valores sanguíneos de glucosa varían en el rango de 0,5 (entre comidas) a 5
mM (pos-ingesta), indique para cuales de las isoformas la actividad enzimática será dependiente de
la [glucosa]. b) En función de los parámetros cinéticos asigne el rol de cada isoforma. Justifique. c)
Como explica que HK-I y HK-II presenten igual kcat pero difieran en su valor de Vmax?

11. La enzima fumarasa (FUM) cataliza la hidratación reversible del fumarato a malato:

Actividad FH

+ H2O
Actividad MD

La reacción directa (actividad fumarato hidratasa o FH) e inversa (actividad malato deshidratasa o
MD) pueden ser seguidas espectrofométricamente cuantificando la desaparición o formación,
respectivamente, del doble enlace del fumarato a 240 nm (= 2,34 mM-1 cm-1; b= 1cm). a) Con los
datos de la siguiente tabla calcule kcat, estime Km y determine la eficiencia catalítica para las actividades
FH y MD de la FUM, considerando que la enzima se ensambla como un homotetrámero de subunidades
de 50 kDa con 4 sitios activos por estructura cuaternaria. b) Bajo qué condiciones deben realizarse las
terminaciones de las actividades FH y MD? c) Comparando las eficiencias catalíticas, que conclusión
puede sacar acerca del rol fisiológico de la FUM?.

Sustrato saturante Actividad (U/mg) kcat Km kcat/Km

a sustrato subsaturante (s-1) (mM) (s-1*mM-1)
vol. cc. prot Vol. Δabs/ [fumarato]= [malato]=
enzima (mg/ml) reacción min 0,7 mM 0,9 mM
(µl) (ml)
FH 1 0.18 38.5 -
MD
1.0 1
2 0.26 - 18.0

8
 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

1. La acetilcolinesterasa es una enzima presente en tejido nervioso cuya función es intervenir en la

regulación de los niveles del neurotransmisor acetilcolina. En la enfermedad de Alzheimer la
inhibición de esta enzima es una estrategia terapéutica ya que en las personas que padecen esta
enfermedad los niveles de acetilcolina son anormalmente bajos. Por otra parte, compuestos tóxicos
como el gas Sarín (metilfosfonofluoridato) y el malatión (insecticida) también tienen como blanco de
acción a la acetilcolinesterasa, pero a diferencia de los fármacos inhibidores, estos compuestos inhiben
a la acetilcolinesterasa de manera irreversible potenciando su acción inhibidora. En un estudio del
efecto de dos nuevos inhibidores X e Y sobre la actividad de la acetilcolinesterasa se obtuvieron los
resultados mostrados en la gráfica y la tabla. a) ¿Son X e Y inhibidores? b) Si lo son, ¿qué tipo de
inhibición ejercen? c) ¿Cuál sería candidato para pruebas clínicas en pacientes con Alzheimer?
Actividad (U)
[X]=100M
1/v µl de Enzima 100 µM X 100 µM Y Sin inhibidor
[Y]=100M 1 0 7,5 10
2 0 15 20
Sin inhibidor 3 0 22,5 30
4 10 30 40
5 20 37,5 50
6 30 45 60
1/[S]

2. Luego de purificar la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa se procedió a determinar el

valor de Vmax y Km para el gliceraldehído 3-fosfato a pH 8,0. Los valores obtenidos fueron los
siguientes: Vmax = 20 U/ml; Km = 1 mM. Luego se volvieron a determinar estos parámetros cinéticos
en presencia de cuatro sustancias conocidas A, B, C y D, obteniéndose en cada caso los siguientes
valores:

Km (mM) Vmax (U/ml)

En presencia de A 2,0 20
En presencia de B 0,5 10
En presencia de C 1,0 10
En presencia de D 6,0 10

En base a estos datos, indique que tipos de sustancias son A, B, C y D. Justifique.

3. La enzima hexoquinasa cataliza la siguiente reacción: Glucosa + ATP  Glucosa-6-P + ADP.

Al observar que la enzima es inhibida por piruvato, se intentó estudiar el mecanismo de la inhibición.
Para ello se determinó la velocidad de reacción a distintas concentraciones de glucosa, en ausencia y
en presencia del inhibidor y a concentraciones saturantes de ATP. Los resultados obtenidos se
muestran en la tabla. a) Determine qué tipo de inhibición presenta el piruvato con respecto a la glucosa
sobre la enzima y esquematice el mecanismo de inhibición. b) Calcule Km, Vmax y la constante de
disociación del complejo hexoquinasa-piruvato. c) Calcule la velocidad de reacción cuando la
concentración de glucosa es igual al valor de Km aparente, si el piruvato está presente a una
concentración de 0,4 mM.

9
 Piruvato (mM)
0 0,4
Glucosa (mM) Actividad (U/mg)
0,1 9,98 7,14
0,2 15,02 10,72
0,3 17,89 12,86
0,4 20,05 14,28

4. Sobre una enzima que cataliza la reacción S  P se prueba el efecto de dos inhibidores X e Y,
obteniéndose los siguientes datos de velocidad. a) Determine la naturaleza de cada inhibidor haciendo
un esquema de la inhibición. b) Calcule Km, Vmax y Ki.

Velocidad (U/ml)
[S] (mM) Sin agregado + 12 µM X + 60 µM Y
2,00 50,00 40,00 22,22
2,50 55,56 45,45 25,00
3,33 62,47 52,63 28,56
4,00 66,67 57,14 30,77
5,00 71,42 62,50 33,33

5. Cuando la reacción enzimática catalizada por la LDH (lactato deshidrogenasa) se lleva a cabo en
presencia de una concentración 0,3 mM de un inhibidor X, tanto Km como Vmax disminuyen a un
tercio del valor obtenido en ausencia del inhibidor. Responda el siguiente cuestionario: a) ¿Qué tipo de
inhibición presenta X sobre el sistema enzimático? b) ¿Cómo es la afinidad aparente de la enzima por
su sustrato en presencia del inhibidor, comparada con la afinidad real que se observa en ausencia del
inhibidor? ¿Por qué se produce ese cambio en la afinidad? c) Estime Ki del inhibidor X lo más
exactamente que pueda con los datos disponibles. Si usted necesitase calcular Ki con una exactitud
mayor ¿qué experimentos realizaría?

6. En un estudio de inhibición por GMP de la malato deshidrogenasa dependiente de NADP

(MDH) que cataliza la reacción:

Oxaloacetato + NADPH + H+  Malato + NADP+

se obtuvieron los valores de A340 nm/min que figuran en la tabla. La actividad enzimática se midió con
10 µl de la MDH en una cubeta de 1 ml y 1 cm de camino óptico y concentraciones saturantes de
Oxaloacetato. En base a la misma: a) Indique qué tipo de inhibidor es GMP con respecto a NADPH. b)
Calcule Ki mendiante gráficos secundarios y de Dixon c) Calcule Km para NADPH y Vmax de la
enzima (U/ml). (0= 6200 M-1. cm-1).

NADPH (mM) 0,25 0,50 0,67 1,00

GMP (mM) A340 nm/min
0,0 0,365 0,564 0,654 0,775
1,0 0,248 0,413 0,497 0,620
3,0 0,151 0,270 0,336 0,443

10
 4,0 0,127 0,230 0,289 0,388
5,0 0,109 0,200 0,254 0,344

7. La enzima málica dependiente de NADP es una proteína homotetramérica que cataliza la

reacción: L-malato + NADP  CO2 + piruvato + NADPH.
Para determinar el modo de acción de succinato con respecto a malato, se estudió la velocidad de la
reacción enzimática en ausencia y en presencia de distintas concentraciones del mismo, a
concentraciones saturantes de NADP. Los resultados se resumen en la siguiente tabla. En base a los
datos: a) Determine gráficamente los valores de Km Malato y Vmax de la enzima. b) Indique que tipo
de inhibidor es el succinato con respecto a malato y calcule su Ki. c) Represente los gráficos
secundarios y de Dixon para éste sistema.
Tabla
succinato 0 0,4 0,8 1,2 1,6
(mM)
malato Actividad (U/mg)
(mM)
0,1 9,98 7,14 5,55 4,55 3,85
0,2 15,02 10,72 8,33 6,82 5,77
0,3 17,89 12,86 10,02 8,18 6,92
0,4 20,05 14,28 11,11 9,09 7,69

8. Para el tratamiento de una enfermedad, un laboratorio farmacéutico está tratando de desarrollar

un nuevo medicamento consistente en un inhibidor que se combine únicamente con la forma libre de la
enzima E involucrada en dicha enfermedad. Para ello analiza a los inhibidores X e Y obteniendo los
siguientes resultados:
V (moles min-1 mg-1)
1/ S ( M )-1 X 0mM X 2 mM
0,33 10,4 6,0
0,20 14,5 9,1
0,10 22,5 15,15
0,03 33,8 28,4
0,01 40,5 37,9

Al medir velocidad inicial de la reacción enzimática (U/mg) en función de la concentración de sustrato

S en ausencia y en presencia de 2 mM de Y y luego de realizar la representación de Lineweaver-Burk,
se obtuvieron dos rectas intersectantes en un mismo punto en el eje de las ordenadas. La pendiente de
la recta obtenida en presencia de Y fue de 0,66.
En base a los datos: a) Calcule Km y Vmáx de la enzima E. b) ¿Qué tipo de inhibidores son X e Y?
Justifique. Indique los valores de Km y Vmáx en presencia de X e Y. c) ¿Cuál/es de los inhibidores sería
útil para el tratamiento de la enfermedad? En caso de que ambos lo sean, diga cuál sería el más
efectivo. Justifique su respuesta teniendo en cuenta el valor de Ki.

11
 EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA

1. El gráfico adjunto muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad máxima de una enzima.
a) Indique las causas por las que varía la actividad enzimática en función de la temperatura
estableciendo efectos directos y efectos indirectos. b) ¿Qué experimento le permitiría distinguir entre
efectos reversibles e irreversibles? c) Indique que zona del gráfico utilizaría para obtener la energía de
activación (Ea) de la reacción y como la calcularía. Defina Q10. ¿Cuál metodología considera más
apropiada para el cálculo de la Ea?

40
Actividad (mol/min.mg)

30
Vmax

20

10

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80

Temperatura (ºC)

2. Se purificó la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de músculo de peces carpa (goldfish)

adaptados a vivir en lagos fríos (temperaturas promedio de 8°C) o en lagos templados (temperaturas
promedio de 25°C). Una vez purificadas las enzimas (LDH8°C y LDH25°C), se determinaron los
parámetros cinéticos (Km y kcat) a distintas temperaturas. a) Describa la metodología que permitió
obtener los parámetros cinéticos a varias temperaturas. b) Calcule el Q10 para la enzima proveniente de
cada grupo de animales. c) Explique los perfiles de Km y kcat vs. temp. d) Explique las diferencias entre
los perfiles de cada enzima relacionándolas con la fisiología de cada grupo de animales. d) Que puede
inferir acerca de la naturaleza de las enzimas purificadas?. Que experimentos realizaría para probar su
hipótesis?

0.50 3.0
LDH (8°C) LDH (8°C)
0.45
2.5
LDH (25°C) LDH (25°C)
0.40
Km piruvato (mM)

kcat (seg-1*1000)

2.0
0.35
1.5
0.30

0.25 1.0

0.20
0.5
0.15
0.0
0.10
5 10 15 20 25 30 35 40 45 5 10 15 20 25 30 35 40 45
o o
Temperatura ( C) Temperatura ( C)

12
3. Al ensayar la actividad de una enzima a diferentes temperaturas se obtuvieron los datos
mostrados en la línea A. Cuando la enzima se preincubó a distintas temperaturas durante 15 min y
luego se determinó actividad a temperatura óptima, se obtuvieron los datos de la línea B. Ambos
experimentos se realizaron a concentraciones de sustratos iguales a 100 veces los valores de Km.

T (°C) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Act. (U/mg)
A 1,1 2 4 10 15 22 30 25 20 12 6 2
B 2,5 2,5 5 30 30 30 30 20 10 7,5 2,5 1,5

En base a estos datos: a) Indique la T óptima de la enzima. b) ¿Por qué la actividad enzimática cuando
se ensayó a la temperatura óptima no fue constante para todas las muestras previamente incubadas a
las distintas temperaturas? c) Calcule el Q10 y la energía de activación.

4. Cuando se intenta purificar la enzima nucleótido pirofosfatasa de Proteus vulgaris se determina

que inevitablemente copurifica con un inhibidor. Debido a que el mencionado inhibidor es termolábil,
se decide calentar a 100 oC para eliminarlo. Sin embargo, al realizar este procedimiento se encuentra
que la enzima se desnaturaliza. Si se repite el calentamiento a 100 oC, con el agregado adicional de una
sustancia X (cuya unión a la enzima ha sido previamente descripta), se observa que la enzima no
pierde su actividad. a) Explique estos resultados. b) ¿Qué tipo de sustancia puede ser X?

5. El objetivo de su trabajo es buscar una enzima para la producción de un producto P a escala

industrial. En este proceso la enzima es inmovilizada en una matriz sólida y es sometida a varias
rondas de catálisis a 40°C, es decir, se incuba la enzima con el sustrato S, luego de un período se retira
el medio de reacción que contiene ahora al producto P y se vuelve a incubar la enzima con un nuevo
medio de reacción con el sustrato S. Para la elección de la enzima, posee tres candidatos: E1, E2 y E3,
los cuales son sometidos a los ensayos A y B.

A) Medidas de actividad máxima y estabilidad a 20, 30 y 40°C.

Vmáx preincubación

20°C 30°C 40°C 20°C 30°C 40°C

(U/mg) (U/mg) (U/mg) (U/mg) (U/mg) (U/mg)

E1 150 ± 4 200 ± 5 175 ± 6 201 ± 5 198 ± 6 150 ± 3

E2 170 ± 6 202 ± 7 175 ± 8 200 ± 7 200 ± 8 199 ± 4

E3 150 ±14 178 ±15 175 ±10 177 ±10 174 ±11 176 ±12

B) Determinación de parámetros cinéticos a 40°C.

1/v (U/mg)-1
E3

E1 = E2

0,0056

0,67 0,2 1/S (mM)-1 13

a) Sabiendo que la solubilidad de S en las condiciones de reacción es de 10 mM, cuál enzima eligiría
para el proceso industrial? Justifique su elección. b) E1 y E2 presentan a 40ºC menor actividad que a
30ºC. Indique posibles causas de esta observación.

6. El gráfico adjunto muestra el efecto del pH sobre la actividad de una enzima medida a
concentraciones de sustrato constante y subsaturante. a) Enumere las causas por las que la actividad
enzimática puede variar en función del pH. b) Plantee un diseño experimental para distinguir entre los
posibles efectos del pH. c) De acuerdo al gráfico ¿a qué pH trabajaría para realizar los estudios
cinéticos de esta reacción enzimática? d) Si la enzima es estable y el sustrato no sufre cambios de
ionización en el rango de pH estudiados, ¿a qué corresponderían los puntos de inflexión de la curva
(pH 4 y 8)?

7. Indique si los gráficos que se muestran sugieren ionización de la enzima libre o ionización del
complejo enzima-sustrato. Suponga que en ese rango de pH no hay desnaturalización de la enzima,
como así tampoco del sustrato. Justifique brevemente.

2.2 3.0
A 2.7
2.0
2.4
Log Vmax

1.8 2.1
pKm

1.6 1.8
1.4 1.5
1.2
1.2 0.9
1.0 0.6
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH pH
2.5 2.5
B
2.0 2.0
Log Vmax

1.5 1.5
pKm

1.0 1.0
0.5 0.5
0.0 0.0
-0.5
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH pH
8. Un investigador purifica a homogeneidad la enzima malato deshidrogenasa y realiza un estudio
de la actividad de la enzima en función del pH utilizando una concentración de sustrato subsaturante.

14
Obtiene la gráfica A. Sin embargo cuando preincuba la enzima a distintos valores de pH entre 2 y 10 y
luego mide la actividad a pH óptimo observa que la enzima presenta actividad máxima entre pH 4.0 y
8.0. Con el fin de determinar qué aminoácidos estaban implicados en la catálisis determina la actividad
de la enzima a concentraciones variables de sustrato y a tres valores de pH, obteniendo el gráfico B.
Teniendo en cuenta que el sustrato no sufre cambios de protonación en el rango de pH estudiado,
indique: a) El rango de estabilidad de la malato deshidrogenasa, el pH óptimo de la enzima. b)
Proponga un modelo (con un esquema) que explique los resultados obtenidos en la gráfica B.
c) Cuando el investigador grafica los distintos valores de Km a distintos valores de pH, obtiene que un
grupo con un pKa de 6,2 está implicado en la catálisis. Sin embargo, al estudiar la secuencia primaria
de la enzima y compararla con otras secuencias encuentra que, de todos los residuos ionizables, sólo
un residuo de Glu está conservado (pKa COO-=4,0). ¿Podría ser dicho grupo el responsable de los
cambios de la actividad de la enzima? ¿Por qué podría presentar ese valor de pKa?

12

1/Actividad (U/mg)-1
10 A B pH 4.0

-1
Actividad (U/mg)

9 pH 6.0
8
6
6 pH 8.0
3
4
actividad (U/mg)

0
1/actividad (U/mg)

2 4 6 8 10 12
0 1 2 3 4
pH
pH
1/[S] (mM)-1

9. El gráfico A muestra los resultados de los estudios de la estabilidad de la enzima malato

deshidrogenasa purificada de mitocondrias y glioxisomas a distintos pH. Cuando se procedió a realizar
la determinación del pH óptimo se obtuvo el gráfico B a) Indique el pH óptimo de las isoenzimas y
establezca el rango de pH en el cual ambas enzimas son estables. b) Analice las posibles causas de la
disminución de la actividad a pH mayores y menores al pH óptimo en cada caso. c) Explique como
realizaría el estudio de estabilidad en función del pH, especificando todos los parámetros a tener en
cuenta. d) Según los resultados obtenidos en el caso de la enzima mitocondrial a pH mayores a 8,5
indique qué grupo/s ionizable/s de la enzima podría/n estar implicado/s en los cambios de actividad
observados. ¿Qué estado de ionización presenta dicho grupo en la enzima activa?

120
100 MDH mitocondrial A MDH mitocondrial B
MDH glioxisomal MDH glioxisomal
100
Actividad (%)

Actividad (%)

80
80

60
60

40 40

20 20

0
0
3 4 5 6 7 8 9 10 11
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH
pH

15
 CINÉTICA DE DOS SUSTRATOS

1. Describa tres modelos cinéticos para una reacción enzimática en la que participan dos sustratos.
Describa también métodos de diagnóstico para determinar el modelo cinético seguido por una reacción
enzimática que involucre dos sustratos.

2. La glutamato-oxaloacetato aminotransferasa, llamada comúnmente transaminasa GOT, es una

enzima que interviene en el metabolismo de los aminoácidos y posee importancia clínica para el
diagnóstico de patologías hepáticas. La enzima posee fosfato de piridoxal como grupo prostético y
cataliza la siguiente reacción:
Glutamato + Oxaloacetato  Aspartato + 2-Cetoglutarato.
En una investigación sobre el mecanismo cinético se analizó la dependencia de la actividad enzimática
con la concentración de glutamato, a dos concentraciones diferentes de oxaloacetato. Los resultados
obtenidos se resumen en la tabla:

Glutamato (mM) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,8

Experimento Velocidad (U/mg)
+ 0,1 mM oxaloacetato 2,0 3,4 4,4 5,0 5,8 6,6
+ 0,2 mM oxaloacetato 2,2 4,2 5,8 6,6 8,0 10,0

Por otra parte, el aspartato se comportó como un inhibidor competitivo respecto del glutamato, cuando
se agregó oxaloacetato en concentraciones saturantes. Proponga en forma esquemática un modelo
cinético que sea compatible con estas observaciones experimentales.

3. Una enzima cataliza la reacción S1 + S2  P1 + P2. Cuando se mide la actividad a

concentraciones variables de S2, manteniendo constante la concentración de S1 se obtienen los valores
de velocidad (µmoles/min.mg) que se presentan en la siguiente tabla:

[S2] (mM) 1 2 4 6 10
[S1] (mM) Velocidad (µmoles/min.mg)
5 4 6,7 10 12 14,3
10 7,7 12,5 18,2 21,4 25

El efecto de los productos se resume en la tabla siguiente:

S1 Variable S2 Variable
S2 Subsat. S2 Sat. S1 Subsat. S1 Sat.
P1 NC --- C C
P2 NC NC NC AC

16
a) Indique si la reacción sigue un mecanismo secuencial o ping-pong. Justifique brevemente. b) En
caso que corresponda indique el orden de adición de sustratos y de salida de los productos.
Esquematice el modelo de reacción.

4. La enzima citrato sintasa de mitocondrias participa en el metabolismo catabólico de los hidratos

de carbono en todos los organismos aeróbicos, catalizando la siguiente reacción:
Oxaloacetato + Acetil-CoA  Citrato + CoA
En una investigación sobre el mecanismo cinético de esta enzima se llevó a cabo un estudio de la
variación de la actividad enzimática en función de la concentración de oxaloacetato, a dos
concentraciones diferentes de Acetil-CoA. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla:

OAA (mM) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 4,0

Experimento V (U/mg)
+ 0,1 mM Acetil-CoA 0,67 1,10 1,45 1,65 1,85 2,2
+ 0,2 mM Acetil-CoA 2,00 3,35 4,15 5,00 5,55 6,65

Por otra parte, el citrato se comportó como un inhibidor competitivo tanto respecto a oxaloacetato
como respecto a acetil-CoA, y otro tanto ocurrió con la Coenzima A. Proponga en forma esquemática
un modelo cinético que sea compatible con estas observaciones experimentales.

5. Un estudiante purifica una quinasa de un sustrato A (A + ATP  A-P + ADP) y decide estudiar
su mecanismo de reacción. Así, incuba la enzima con ATP marcado con 32P. Al cabo de 1 h precipita
la enzima, observando que la radiactividad inicial en el sobrenadante ha disminuido un 50%,
detectándose también ADP no marcado. a) Plantee un mecanismo de reacción posible de esta quinasa.
b) Indique qué tipo de gráficos esperaría obtener al graficar 1/v vs 1/[A] a distintas concentraciones de
ATP. c) ¿Esperaría obtener radiactividad en la fracción proteica? Explique su respuesta.

6. Una vez purificada la enzima L-Aspartato aminotransferasa, enzima que cataliza la reacción:
aspartato + oxoglutarato  glutamato + oxaloacetato
Se procedió a estudiar el efecto de la concentración de aspartato a concentraciones constantes de
Oxoglutarato sobre la velocidad inicial. Los valores de velocidad inicial obtenidos (µmol/min.mg) se
transcriben a continuación:

[Aspartato] 0,5 mM 1 mM 2,5 mM 5 mM 10 mM

[Oxoglutarato] Velocidad (µmol/min.mg)
Saturante 18,2 33,4 66,6 100,0 125,0
5 mM 16,7 28,6 50,0 66,6 77,0
1 mM 15,4 25,0 40,0 50,0 55,0

a) Determine gráficamente los valores de Vmax y Km para el aspartato. Indique el valor de Vmax en
UI/mg y en katal/mg. b) ¿Cuál es el índice de recambio, asumiendo que la enzima posee un PM de
50 kDa y que posee 2 sitios activos por molécula. c) Indique el mecanismo de reacción de esta enzima.
Fundamente brevemente.

17
7. En un sistema enzimático multisustrato del siguiente tipo:

A + B P + Q

Los reactivos A y B se adicionan al enzima E completamente al azar. Cuando se representa 1/v vs

1/[A] a distintas concentraciones de B, se obtienen rectas que se intersectan en un punto cuyo valor
sobre el eje de las abscisas es de –10 mM-1. El valor de  (el factor de interacción entre A y B) es
0,28. a) Esquematice el mecanismo de la reacción catalizada enzimáticamente. b) Calcule el valor de
Km para A y el valor de KA. c) La enzima posee 4 subunidades de 200 kDa cada una, con 1 sitio activo
por subunidad. Calcule el número de recambio, sabiendo que Vmax es 0,5 U. Considere que la
velocidad de reacción se mide por un método continuo en una cubeta de volumen final de 1 ml, y que
se utilizaron 20 l de una preparación enzimática pura de concentración 2 mg/ml. d) ¿Qué otros
experimentos deben realizarse para confirmar el mecanismo de la reacción enzimática?

8. La enzima malato deshidrogenasa (MDH) cataliza la reacción:

Malato + NAD  Oxaloacetato (OAA) +NADH

Para caracterizar el mecanismo de reacción y el sitio activo de la enzima se llevaron a cabo dos
experimentos. En el 1° experimento se estudió el efecto de los productos de la reacción sobre la
actividad enzimática a concentraciones subsaturantes de malato obteniéndose los datos que figuran en
la Tabla 1. En el 2° experimento, 150 µg de enzima preincubada durante 30 min en presencia de los
productos de la reacción o en ausencia de los mismos fueron tratadas 2 hs con N-etilmaleimida (agente
modificador de residuos de cisteína) obteniéndose los datos de la Tabla 2. El control de la enzima sin
tratar con etilmaleimida dio un valor de actividad de 100U/ml. En base a los resultados: a) indique el
posible mecanismo de reacción de la enzima, justifique; b) ¿Qué puede concluir acerca de los
aminoácidos involucrados en el sitio catalítico?

Tabla 1 Actividad (U/ml)

NAD (mM) Sin agregados + NADH + OAA
0,025 33,3 20,0 16,7
0,033 40,0 25,0 20,0
0,050 50,0 33,3 25,0
0,100 66,7 50,0 33,3

Tabla 2 Actividad (U/ml)

Sin agregados 16
+ NADH 91
+ OAA 34

18