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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS

MICROBIOLÓGICAS

Dra. Maria Antonia Malajovich


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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS (2015)


Dra. Maria Antonia Malajovich
Biotecnologia: ensino e divulgação
http://bteduc.com

PROGRAMA

Unidade 1
Apresentação do curso - O laboratório de Microbiologia
O nascimento da Microbiologia: o legado de Semmelweiss; a obra de Pasteur; a teoria dos germes.
Normas de biossegurança. Boas práticas de laboratório.
A1. A distribuição dos microrganismos no ambiente
A2. O lavado das mãos
A3. Trabalhar mantendo a assepsia

Unidade 2
O cuidado do material básico no laboratório microbiológico.
A composição dos meios de cultivo, técnicas bacteriológicas; condições de incubação, esterilização; descarte do material
utilizado.
A4. O pH do meio e o crescimento microbiano

Unidade 3
Microscopia (revisão)
Características morfológicas de bactérias, fungos e algas. Ultraestrutura, formas latentes.
A5. Observações microscópicas de bactérias – métodos de coloração
A6. Observação e cultivo de fungos e algas

Unidade 4
Características bioquímicas dos microrganismos: exigências nutricionais, produção de enzimas. Os sistemas
miniaturizados de diagnóstico.
Cultivo e crescimento de microrganismos. Curva de crescimento típica.
As coleções de cultura (pesquisa)
A7. Obtenção de uma cultura bacteriana pura
A8. Caracterização bioquímica de microrganismos
A9. O número de microrganismos de uma cultura

Unidade 5
Fundamentos do controle dos microrganismos: agentes físicos (revisão) e agentes químicos. Avaliação do poder
antimicrobiano de desinfetantes e antissépticos. O modo de ação dos antibióticos. Resistência aos agentes químicos. O
controle dos microrganismos no cotidiano.
A10. Ação da luz ultravioleta
A11. Ação dos desinfetantes
A12. Ação dos produtos cosméticos (desodorantes)
A13. Ação dos produtos cosméticos (dentifrícios)
A14. Antibióticos e antifúngicos

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

O LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

PRECAUÇÕES BÁSICAS
O local de trabalho deve ser desinfetado com álcool antes do início de cada sessão de trabalhos práticos,
assim como ao termo das manipulações.
Antes e depois de qualquer manipulação, lavar as mãos e passar álcool.
Tomar cuidado com os cabelos.
No caso de ferimento acidental por material séptico, desinfetar-se imediatamente com álcool 70oGL.
Não esquecer que toda picada ou ingestão acidental oferece risco.

OS RECIPIENTES UTILIZADOS
Os recipientes de zinco ou cobre não devem ser utilizados. Esses metais se dissolvem nos meios de cultura,
que então se tornam tóxicos. Os recipientes de vidro são adequados.
As placas de Petri plásticas, estéreis, são atualmente cada vez mais empregadas. Depois de esterilizadas, as
placas de vidro podem ser utilizadas novamente.
Os meios de cultura devem ser acondicionados em tubos de diversos tamanhos, conforme o volume
desejado. Sua distribuição nas placas de Petri é feita após a esterilização das placas vazias.
Os tubos podem ser fechados com algodão em rama, por tarraxas metálicas ou vedados por simples cápsulas
metálicas móveis.
Tanto os recipientes como suas tampas devem estar rigorosamente limpos. Na limpeza, deve-se evitar a
utilização de detergentes que possam persistir após o enxugamento. Terminada a lavagem, o pH dos meios
não deverá sofrer modificações muito apreciáveis após agitação nos recipientes.

PIPETADORES (PERAS)
As peras são de borracha e possuem três “bolinhas” com as letras “A”, “S” e “E”. A primeira serve para retirar
todo o ar da pera antes de esta ser acoplada à pipeta; a segunda serve para fazer o líquido subir e a última
para expulsar o líquido. Além disso, para expulsar a última gota, quando se está trabalhando com pipetas
totais, é só apertar o orifício na extremidade lateral da pêra (ao lado da “bolinha” E).

Procedimento

1. Aperte simultaneamente a letra “A” e a pêra ao mesmo tempo para retirar


todo o ar.
2. Introduza a pêra na parte superior da pipeta.
3. Leve a pipeta até o fundo do recipiente, com cuidado para não bater a parte
inferior no fundo.
4. Suga-se a água contida no béquer apertando a letra “S”.
5. Aferir elevando a pipeta na altura dos olhos, verificando qual a quantidade sugada.
6. Levar a pipeta até o recipiente de destino e deixar escoar (aperta-se a letra “E”) pela parede lateral.
7. Para expulsar a última gota, quando se está trabalhando com pipetas totais, apertar o orifício na
extremidade lateral, ao lado da bolinha E.

Atenção: cuidado redobrado na hora de retirar a pera da pipeta!

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

OS INSTRUMENTOS DE TRABALHO

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NORMAS DE SEGURANÇA

Segundo Pedro Teixeira e Silvio Valle, no livro "Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar", Rio de
Janeiro, Editora Fiocruz, 1996.

As boas práticas no laboratório consistem de um conjunto de normas e procedimentos de segurança, que


visam minimizar os acidentes e aumentar o nível da consciência dos profissionais que trabalham em
laboratórios de pesquisa.

Abaixo, encontram-se listadas algumas das principais normas de Biossegurança:

 Lavar as mãos antes e após a jornada de trabalho;


 Nunca pipetar com a boca. Usar, sempre que possível, os pipetadores automáticos ou as peras de
borracha;
 No laboratório, não fazer refeições ou preparar alimentos, não beber, não fazer higiene bucal ou
maquiagem, não barbear, não fumar, não roer as unhas;
 Os artigos de uso pessoal devem ser guardados em locais apropriados, nunca no laboratório;
 Não trabalhar com calçados abertos, ou seja, use sapatos que protejam inteiramente os pés;
 Cuidado com a formação de aerossóis e respingos é importante. Ter sempre um protocolo com
procedimentos de segurança para estes casos;
 Não trabalhar com material patogênico se houver ferida na mão ou no pulo;
 Quando do uso de luvas, evitar abrir portas e atender telefone;
 Durante a rotina de trabalho, o profissional deverá utilizar roupas apropriadas ao trabalho desenvolvido
como, por exemplo, aventais, jalecos e outros uniformes afins;
 O responsável pelo laboratório deverá criar uma rotina de procedimentos em Biossegurança, enfocando
principalmente os riscos a que está exposta sua equipe;
 As bancadas de trabalho deverão ser lavadas e desinfetadas antes da rotina de trabalho;

 Evitar trabalhar sozinho no laboratório.

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

LOUIS PASTEUR E A TEORIA DOS GERMES

UM POUCO DE HISTÓRIA

Depois de certo tempo, um caldo de carne exposto ao ar apodrece. A observação microscópica mostra muitos
tipos de microrganismos. Já que eles não são observados no caldo recém-cozido, podemos nos perguntar:
de onde eles vieram?

Até 1850-1860 se admitia a teoria da geração espontânea, isto é que os microrganismos podiam surgir
espontaneamente em consequência da alteração dos alimentos.
Baseado em seus estudos sobre as fermentações, Louis Pasteur considera inadequada esta explicação. Para
ele, a alteração dos alimentos é uma consequência da presença de microrganismos. Mas, para convencer os
seus contemporâneos, Pasteur deverá demonstrar de maneira inequívoca a sua teoria.

A POEIRA DO AR

Em 1859 Pasteur analisou o ar de uma rua de Paris. A


observação microscópica da poeira acumulada em um
chumaço de algodão mostrou a presença de centenas de
microrganismos (= germes).

A partir desse momento Pasteur inicia uma série de


experiências que demoliram a teoria da geração espontânea.

PRIMEIRA EXPERIÊNCIA: Um líquido putrescível esterilizado se


conserva indefinidamente se não estiver em contato com o ar.
Crítica dos defensores da geração espontânea: em ausência de
ar, os germes não se desenvolvem.

SEGUNDA EXPERIÊNCIA: Um líquido putrescível


esterilizado se conserva indefinidamente se estiver
em contato com ar esterilizado.

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TERCEIRA EXPERIÊNCIA:

Um líquido putrescível esterilizado se conserva


indefinidamente em presença de ar filtrado ao longo de
um tubo curvo.

Por conseguinte, os germes não surgem por geração


espontânea.
Eles se encontram no ar e caem nos líquidos onde se
desenvolvem alterando o meio.

Sendo assim, qual seria a distribuição dos germes na atmosfera?

QUARTA EXPERIÊNCIA: Os germes estão distribuídos na atmosfera de forma desigual.

LUGAR DE NÚMERO DE FRASCOS


EXPOSIÇÃO CONTAMINADOS
Paris 20/20
Campo 8/20
Montanha 1/20

Crítica dos defensores da geração espontânea as terceira e quarta experiências: os resultados obtidos se
devem ao fato de ter até agora usado líquidos fervidos longamente.

QUINTA EXPERIÊNCIA: O sangue e a urina extraídos de um organismo sadio não se alteram quando
conservados ao abrigo do ar.

UMA REVOLUÇÃO CIENTÍFICA, TECNOLÓGICA E SOCIAL

As evidências experimentais apresentadas por Pasteur levaram seus contemporâneos à substituição da


teoria da geração espontânea pela teoria dos germes. Admite-se que os germes presentes no meio ambiente
são responsáveis pelas alterações dos meios orgânicos (fermentações, putrefação, doenças).

A teoria dos germes abriu novos caminhos na utilização industrial dos processos fermentativos, na
conservação dos alimentos e na luta contra as doenças infecciosas.

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A1. A DISTRIBUIÇÃO DOS MICRORGANISMOS NO AMBIENTE

"Provavelmente, as primeiras formas de microrganismos habitavam a água. Com o passar do tempo, o solo
se tornou infectado e, agora, aí se encontra a maior parte deles. Do solo passam ao ar pelo vento, que levanta
partículas de poeira nas quais os microrganismos estão presentes. Desde que vivemos em contato com o ar,
aspiramos enormes quantidades de microrganismos cada vez que respiramos. O ar deposita-os em nosso
cabelo, roupa e pele. Do ar passam para nosso alimento e bebida. Estamos completamente cercados por
microrganismos e precisamos aprender a viver com eles. Felizmente, a maior parte não causa mal.
Relativamente são poucos que causam prejuízos. É contra os que causam doenças ou estragam nossos
alimentos que devemos nos prevenir" (Neder R.N. Microbiologia, São Paulo, Ed. Nobel, 1992).
Nesta atividade estudaremos a distribuição dos microrganismos em diferentes ambientes.

MATERIAL por grupo: 1 placa de Petri contendo meio nutriente estéril, 1 caneta de retroprojetor.

PROCEDIMENTO

1. Escolher um ponto da escola para colocar a placa de Petri.


2. Rotular a placa com a caneta de retroprojetor, indicando o lugar onde esta será exposta. No lugar
escolhido, destampar a placa como indicado no esquema, aguardar 15 minutos e fechá-la novamente.

3. Incubar a placa no laboratório, a temperatura ambiente, até observar o crescimento de colônias


microbianas.
4. Na aula seguinte, contar o número de colônias na placa.
5. Reunir os dados dos outros grupos para comparar o crescimento de microrganismos (número de
colônias) nas placas expostas em diferentes lugares.

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RESULTADOS
1. Quantas colônias se desenvolveram na placa?
2. Complete a tabela com os dados da turma.
Tabela: Número de colônias em cada placa.

Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8

Lugar de exposição

N0 de colônias

3. Compare os seus resultados com os dos outros grupos.

Onde foi exposta a placa que apresentou um número maior de colônias? Onde foi exposta a placa
que apresentou um número menor de colônias?
4. Em função dos resultados obtidos, qual a distribuição dos microrganismos no ambiente
estudado?

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A IMPORTÂNCIA DO LAVADO DAS MÃOS

Pesquisar na Internet os seguintes temas:


o Ignaz F. Semmelweiss, uma vida trágica.
o Mary “a tifóidea”, uma mulher perigosa.
o Quais os germes em nossas mãos? Pesquisar as imagens disponíveis na Internet (What germs are in your
hands).
Analisar o procedimento recomendado pela Organização Mundial da Saúde. Duração 40 a 60 segundos, ou
dois “parabéns pra você”.

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A2. COMO LAVAR AS MÃOS

Objetivo: verificar a eficiência do lavado das mãos

Material
Por aluno: 1 placa de Petri contendo ágar nutriente por aluno.
Por grupo: pia com água e sabão, álcool gel para as mãos, 1 pilot.

Procedimento
Trabalhar em dupla. Um dos alunos será responsável por abrir e fechar a placa, enquanto o segundo realiza
o procedimento.

1. Anotar na parte superior da placa de Petri contendo meio nutriente o nome do aluno. Na parte inferior,
delimitar com o pilot quatro regiões: A, B, C e D.
2. Com muito cuidado abrir a placa de Petri para que o aluno apoie o dedo polegar da mão dominante na
superfície do ágar. Fechar a placa.
3. Lavar as mãos com água. Deixar secar sem tocar absolutamente nada.
4. Com a ajuda do colega, abrir a placa e apoiar o polegar da mão dominante no setor B. Fechar a placa.
5. Repetir os itens 3 e 4, lavando as mãos com água e sabão e apoiando o polegar da mão dominante no
setor C.
6. Repetir os itens 3 e 4, esfregando as mãos com álcool e apoiando o polegar da mão dominante no setor
D. Sempre com a ajuda do/a colega, abrir a placa e apoiar o polegar da mão dominante no setor C. Fechar
a placa.
7. Em outra placa, o colega repetirá o procedimento, invertendo os roles.

RESULTADOS

Observar o crescimento microbiano nas quatro regiões das placas e registrar os resultados.

Aluno Antes de lavar as mãos Depois de lavar as mãos

Água Água e sabão Álcool

(0) = nenhum crescimento; (+) pouco crescimento; (++) muito crescimento.

Comparar esses resultados com os que foram obtidos pelas outras duplas.

Qual o tratamento mais eficiente? O álcool é suficiente para desinfetar as mãos?

Pesquisa
Nem todos os germes são perigosos. Qual a diferença entre a flora microbiana local e a flora transiente? Qual
é perigosa?

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A3. TRABALHAR MANTENDO A ASSEPSIA

Como os microrganismos se encontram em todas as partes, resulta complicado conservar a esterilidade do


material e dos meios durante as manipulações efetuadas no laboratório. Porém, devemos aprender a
trabalhar em condições de esterilidade já que esta é a única forma de garantir que o único tipo de
microrganismo a crescer seja aquele que foi inoculado.

Nesta atividade distribuiremos caldo de carne em condições estéreis.

Material

Por aluno: 1 tubo com caldo de carne (10%) estéril, 1 pipeta esterilizada, 3 tubos estéreis.

Por grupo: 1 grade, 1 pote, bico de Bunsen.

Procedimento

1. Com a pipeta, distribuir 2 mL de caldo de carne estéril em cada um dos três tubos.

2. Incubar a temperatura ambiente.

Resultados

Houve contaminação em algum tubo? Em qual?

Discussão

1. Poderia dizer em que momento houve contaminação do material? Justifique sua resposta

2. O que se entende por “Boas Práticas de Laboratório”?

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MICRORGANISMOS: NÍVEIS DE RISCO E BIOSSEGURANÇA

Textos extraídos do livro "Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar", de Pedro Teixeira e Silvio Valle,
Rio de Janeiro, Editora Fiocruz, 1996.

“Os agentes biológicos apresentam um risco real ou potencial para o homem e para o meio ambiente. Por
esta razão, é fundamental montar uma estrutura que adapte a prevenção aos riscos encontrados nos
laboratórios de pesquisa.

Os agentes biológicos se dividem em quatro grupos, onde são considerados como critérios: a patogenicidade
para o homem; a virulência; o modo de transmissão, a endemicidade e a existência ou não de profilaxia e de
terapêutica eficazes.

Segundo a resolução nº1 de 1988 do Conselho Nacional de Saúde, Cap. X art. 64, atualizada na portaria n0
1914 de 2011 do Ministério da Saúde, os microrganismos que afetam o homem, os animais e as plantas
podem ser classificados em grupos de risco de 1 a 4 por ordem crescente.

Classe de risco 1 (baixo risco individual e para a comunidade): inclui os agentes biológicos conhecidos por
não causarem doenças no homem ou nos animais adultos sadios. Exemplos: Lactobacillus sp. e Bacillus
subtilis.

Classe de risco 2 (moderado risco individual e limitado risco para a comunidade): inclui os agentes biológicos
que provocam infecções no homem ou nos animais, cujo potencial de propagação na comunidade e de
disseminação no meio ambiente é limitado, e para os quais existem medidas terapêuticas e profiláticas
eficazes. Exemplos: Schistosoma mansoni e o vírus da Rubéola.

Classe de risco 3 (alto risco individual e moderado risco para a comunidade): inclui os agentes biológicos que
possuem capacidade de transmissão por via respiratória e que causam patologias humanas ou animais,
potencialmente letais, para as quais existem usualmente medidas de tratamento e/ou de prevenção.
Representam risco se disseminados na comunidade e no meio ambiente, podendo se propagar de pessoa a
pessoa. Exemplos: Bacillus anthracis e o vírus da Imunodeficiência Humana (HIV).

Classe de risco 4 (alto risco individual e para a comunidade): inclui os agentes biológicos com grande poder
de transmissibilidade por via respiratória ou de transmissão desconhecida. Até o momento não há nenhuma
medida profilática ou terapêutica eficaz contra infecções ocasionadas por estes. Causam doenças humanas
e animais de alta gravidade, com alta capacidade de disseminação na comunidade e no meio ambiente. Esta
classe inclui principalmente os vírus. Exemplos: Vírus Ebola e o vírus Lassa.”

Pesquisar: em que grupo de risco é classificado o agente da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis)?

O nível de segurança (Biosafety Level) dos laboratórios depende dos microrganismos com os quais se
trabalhe. A estrutura e os métodos de trabalho são diferentes em cada nível. Veja na apresentação do filme
OUTBREAK (1996).

NO LABORATÓRIO DE ENSINO SÓ SE TRABALHARÁ COM MICRORGANISMOS CLASSIFICADOS NO NÍVEL DE RISCO 1

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TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS: SEMEADURA EM TUBO

Toda vez que se fizer semeadura é interessante seguir as regras que recomendamos, para que o material não
seja contaminado.

Tomando todas as precauções de esterilidade, como flambado das bocas dos tubos, alças de platina, etc.,
uma alçada do material a ser semeado é introduzida no tubo. Deixar esse material na parede interna do tubo,
logo acima de líquido. Recolocar o tampão, após flambar a boca do tubo e mexer por rotação para permitir
completa mistura do meio com o material semeado.

A alça e o fio de platina devem ser flambados antes de depois de qualquer operação de semeadura. Para
tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama duas a três vezes.

O material não deve ser colhido com alça quente; esta deve ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio.
A posição exata para flambar a alça é em ângulo de 45·, em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado
o cone interno da chama do bico de Bunsen.

Toda vez que se fizer semeaduras utilizando-se tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos
imediatamente após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. Este nunca deve ser deixado
sobre a mesa de trabalho; deve ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão direita.

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SEMEADURA EM TUBOS COM MEIO LÍQUIDO

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A4. O pH DO MEIO E O CRESCIMENTO MICROBIANO


Para a maioria das bactérias, o pH ótimo de crescimento se localiza entre 6,5 e 7,5. Embora poucos
microrganismos possam desenvolver-se nos limites extremos de pH, as variações mínimas e máximas estão
entre pH = 4 e pH = 9. Quando as bactérias são cultivadas num meio originalmente ajustado a um pH
determinado (pH = 7, por exemplo), é provável que este pH se altere, como resultado das substâncias
produzidas pelo germe, que podem ser tanto ácidas como básicas.

Objetivo: Observar como o pH afeta o crescimento microbiano e como o crescimento microbiano afeta o pH.

Material
o Teste com E.coli: 1 tubo com caldo nutriente estéril pH = 4, 1 tubo com caldo nutriente estéril pH = 6, 1
tubo com caldo nutriente estéril, 1 tubo com caldo nutriente estéril pH = 10. Um estante, 1 frasco com
desinfetante, indicador universal, 1 alça, bico de Bunsen, caneta pilot, cultura de E. Coli.
o Teste com S. Cerevisiae: Os mesmos elementos, com meio nutriente sacarosado e um cultivo de S.
Cerevisiae.
o Controles: Prever duas séries de tubos como controles da mudança de cor.

Procedimento

1. Rotular os tubos (E.coli ou S.Cerevisiae).


2. Colocar 6-8 gotas de indicador em cada tubo.
3. Em condições assépticas, inocular os tubos correspondentes com E. Coli ou com S. Cerevisiae.
5. Incubar os tubos a temperatura ambiente por 24 a 48 horas.

Resultados:

1. Complete a tabela indicando a cor observada nos tubos:

TUBOS pH4 pH6 pH8 pH10


E.coli
Controle
S.Cerevisiae
Controle

2. Como se sabe que os microrganismos cresceram? Como se sabe que houve alguma mudança de pH?

Discussão

1. Em função dos resultados da turma, qual dos dois microrganismos cresce entre valores mais amplos de
pH?
2. Para um microrganismo, qual seria a vantagem de crescer em uma faixa de pH mais ampla?
3. Sugira alguma razão para as mudanças de pH observadas.
4. Pesquise alguma aplicação ligada à tecnologia de alimentos.

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MICROSCOPIA / NORMAS DE USO DOS MICROSCÓPIOS

1. Ligue o microscópio.

2. Aumente a intensidade da luz até uma posição média.

3. Abaixe a platina e coloque a lâmina no chariot, com a lamínula voltada para cima.

4. Ajeite a distância entre as lentes oculares, de maneira a trabalhar em posição confortável. A menos de
trabalhar individualmente, evite ajustar as lentes oculares a seus olhos.

5. Torça o parafuso macrométrico até chegar bem próximo da lâmina. (ATENÇÃO: Esta operação deverá ser
realizada pelo lado de fora e não pela ocular, pois assim procedendo você evitará quebrar a lamínula,
estragando o material e perdendo tempo).

6. Olhando pela ocular e torcendo o parafuso macrométrico no sentido contrário, você suspenderá
vágarosamente o canhão, até ver alguma coisa. Se não aparecer nada, é por que você não centralizou o
corte. Use os parafusos do charriot para mexer a lâmina e coloque a parte corada bem na passagem da
luz.

7. A focalização final deverá ser feita com o micrométrico, torcendo-o para frente e para trás até conseguir
o ponto onde a imagem tem maior nitidez, o foco. Não gire o parafuso micrométrico indefinidamente
para mover o canhão, pois poderá estragar o seu delicado mecanismo. Use-o somente para ajustar o
foco e para as observações de profundidade.

8. Certifique-se de que a região que quer observar se encontra no médio do campo antes de girar o revolver
e passar para a objetiva de médio aumento (10x). Melhore o foco se for necessário. As objetivas secas
são parafocais, ou seja, se a estrutura está focalizada com uma, estará muito perto de sê-lo com outras.

9. Repita o mesmo procedimento para usar o maior aumento (40x). Se você não estiver conseguindo foco,
não force o microscópio. Volte para o menor aumento, veja se a lamínula está voltada para cima e tente
outra vez. Se não conseguir, chame o professor.

10. Quando acabar o trabalho com o microscópio, retire da platina o que estiver observando, coloque a
objetiva de menor aumento e eleve a platina. Coloque a intensidade de luz no mínimo, verifique que o
condensador se encontra elevado e o diafragma aberto. Desligue o microscópio.

Observação: A finalidade do condensador é a de reunir toda a luz num feixe estreito, mas de grande
intensidade luminosa. Junto ao condensador existe o diafragma, que funciona da mesma maneira que o
diafragma das máquinas fotográficas, ou melhor, que funciona como sua íris, aumentando ou diminuindo o
tamanho da pupila, regulando assim a entrada de luz. Só mexa no condensador e no diafragma em condições
especiais. Normalmente o condensador funciona elevado e o diafragma aberto.

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

LEMBRE QUE

o O aumento de uma imagem vista ao microscópio óptico é sempre o produto dos aumentos fornecidos
pela ocular, multiplicado pelos aumentos fornecidos pela lente objetiva usada. Portanto, se você estiver
usando uma ocular de 10X e uma objetiva de 45X, a imagem observada estará aumentada quantas vezes?
________

o Toda vez que for usar o microscópio, use sempre a objetiva de menor aumento em primeiro lugar, pois
ela lhe dará maior visão do material. Em seguida, use o segundo aumento. Repare que quanto maior for
o aumento, menor será a área observada.

o A objetiva 100X deverá ser usada em microscopia de imersão, isto é, coloca-se sobre a lâmina uma gota
de óleo de cedro e sobre esta gota, mergulha-se a objetiva. A função do óleo de cedro é proporcionar
maior iluminação ao canhão evitando a dispersão dos feixes luminosos.

OS CUIDADOS COM O MICROSCÓPIO

1. Para transportá-lo use as duas mãos, uma segurando o braço do microscópio e a outra o sustentando pela
base. NUNCA carregue o aparelho usando apenas uma das mãos!!!

2. Não gire o micrométrico indefinidamente para mover o canhão, pois poderá estragar o seu delicado
mecanismo. Use-o somente para ajustar o foco e para as observações de profundidade.

3. Não passe os dedos nas lentes para limpá-las. O vidro das lentes é facilmente arranhável (mais que o vidro
comum), por isso, só devemos usar um papel especial, bem macio, para limpá-las.

4. Evite molhar o microscópio enquanto estiver trabalhando. Se isso ocorrer, seque-o com um pano bem
macio.

5. Não desmonte qualquer parte do microscópio. Este é um instrumento muito caro, portanto, todo cuidado
é pouco.

6. Quando acabar o trabalho com o microscópio, retire da platina o que estiver observando, coloque a
objetiva de menor aumento e abaixe o canhão. Guarde o aparelho num local adequado, tendo o cuidado
de verificar se está pronto para ser usado.

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A5. OBSERVAÇÃO E CULTIVO DE FUNGOS E ALGAS

5.1. OBSERVAÇÃO DE LÂMINAS PRONTAS

5.2. MONTAR LÂMINAS A PARTIR DE UM CULTIVO DE ALGAS EM MEIO LÍQUIDO

Material: Lâminas, lamínulas, papel toalha, papel de filtro, pinça.

Procedimento.

1. Colocar sobre uma lâmina limpa e


desengordurada uma gota de líquido.

2. Tomar uma lamínula, também limpa e


desengordurada, e encostar um dos lados na
lâmina, bem próximo à gota, de modo que o
líquido se espalhe em toda extensão da lamínula.

3. Vagarosamente, abaixar a lamínula, só a


soltando quando o ângulo formado entre a lâmina
e a lamínula for bem pequeno. Procedendo assim,
se evitará a formação de bolhas de ar que poderão
prejudicar o trabalho.

4. Se houver excesso de água por fora da lamínula


ou se a lamínula estiver frouxa, absorver o excesso
de água com papel de filtro.

5. Repetir o procedimento até conseguir montar


lâminas sem bolhas.

Pesquisar: Qual a composição de um meio de cultivo líquido para algas? Poderíamos cultivar algas em meio
sólido?

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

5.3. MONTAR LÂMINAS A PARTIR DE UM CULTIVO DE FUNGOS EM MEIO SÓLIDO

Os fungos e seus esporos encontram-se, nas mais diversas condições ambientais. A colheita, isolamento e
cultura não apresentam, por isso, dificuldades. O problema é, ao contrário, o de não deixar contaminar por
fungos as culturas de outros organismos, especialmente de bactérias.

Os fungos podem manter-se e crescer no laboratório de 3 maneiras:


o No substrato original, como pão, folhas, frutas em decomposição, corpos de insetos
o Em ou sobre meios fluídos de composição conhecida (cite um exemplo)
o Em meios nutritivos sólidos, tendo o ágar como agente de solidificação. Estes meios podem encontrar-
se já preparados nas firmas especializadas. Porém, no laboratório resulta, às vezes, mais econômico usar
um meio como o ágar de farinha de milho que se prepara como a seguir:

Misturar 6,0 g de farinha de milho com água até obter uma papa e ferver até obter
um mingau. Filtrar por gaze. Juntar 1,5 g de ágar. Aquecer até o ágar estar dissolvido.
Completar o volume até 100 mL com água, distribuir em tubos pequenos e esterilizar
na autoclave (ou na panela de pressão) durante 20 minutos (121oC).
A cultura em lâminas permite acompanhar o desenvolvimento de um fungo sem que os esporos se espalhem
pelo ar contaminando outras culturas e eventualmente, desencadeando reações alérgicas. O procedimento
mais simples é o de colocar um pedaço de fita durex sobre as hifas e cola-lo na lâmina. Contudo, se quisermos
observar o crescimento dos fungos, o melhor procedimento é o seguinte:

A. Inocular um tubo de ágar nutriente, liquefeito e resfriado (45-50oC), com uma cultura de fungos em pão
ou fruta; rolar o tubo entre as palmas da mão para distribuir bem o inoculo;

B. Flambar uma lâmina e uma lamínula, pingar uma gota da cultura na lâmina e colocar a lamínula de tal
maneira que o ágar se espalhe até mais ou menos 5 mm de seus bordos;

C. Colocar a lâmina em uma placa de Petri contendo uma bolota de algodão carregado de água; a umidade
do algodão retarda o ressecamento do meio; incubar por 2 a 4 dias à temperatura ambiente.

D. Fazer observações microscópicas periódicas e desenhar – ou fotografar - o aspecto dos fungos na cultura.
Identificar as estruturas.

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

A6. OBSERVAÇÕES MICROSCÓPICAS DE BACTÉRIAS – MÉTODOS DE COLORAÇÃO

6.1. EXAME MICROSCÓPICO DE LÂMINAS PRONTAS

6.2. MÉTODOS DE COLORAÇÃO

Material
Lâminas de vidro, algodão, álcool 95 o GL, álcool 90 oGL, papel absorvente, cultura de Bacillus megatherium,
padrões Gram negativos (G-) e Gram positivos (G+), soluções corantes (azul de metileno, cristal violeta,
fucsina ou safranina, lugol), nigrosina (= tinta da índia), bico de Bunsen, alça de Níquel-cromo, microscópio.

Procedimento

ATENÇÃO!!! Antes de iniciar o trabalho, limpe e desengordure as lâminas com um pedaço de


algodão embebido em álcool a 90 o GL. Quando finalizar o trabalho limpe cuidadosamente a
objetiva de imersão do microscópio com algodão embebido em xilol ou solução éter-
clorofórmio.

A - PREPARO DOS ESFREGAÇOS

1. Após flambar a alça, colocar uma gota de suspensão mista de bactérias na lâmina identificada com o nome
do aluno.
2. Deixar secar espontaneamente.
3. Fixar o esfregaço à lâmina, segurando-a com um pregador de madeira e passando-a três vezes sobre a
chama do bico de Bunsen, com a parte do esfregaço para cima.

B - MÉTODO DE COLORAÇÃO SIMPLES

1. A lâmina fixada é tratada com solução de azul de metileno durante 1 a 2 minutos.


2. Lavar ligeiramente com água. Escorrer.
3. Enxugar entre dois papéis de filtro, com cuidado sem esfregar.
4. Adicionar sobre o esfregaço corado uma pequena gota de óleo de cedro e examinar
ao microscópio com objetiva de imersão (100 x).
5. Comentar brevemente as observações.

NOTA: Com outros corantes como o cristal violeta ou a fucsina, o procedimento pode
ser o mesmo bastando alterar o tempo de tratamento (2 a 60 segundos com cristal
violeta e 15 a 30 segundos com fucsina).

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

C. MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM

1. A lâmina fixada é tratada com


solução de cristal violeta durante 1
a 2 minutos.
2. Lavar ligeiramente com água.
Escorrer.
3. Cobrir o esfregaço com lugol
durante 1 a 2 minutos.
4. Descorar rapidamente pelo álcool a
95 oGL.
5. Lavar ligeiramente com água.
Escorrer.
6. Cobrir com solução de fucsina (ou
safranina), durante 30 segundos
para contra-corar.
7. Lavar.
8. Enxugar entre dois papéis de filtro,
com cuidado, sem esfregar.
9. Adicionar sobre o esfregaço corado
uma pequena gota de óleo de cedro
e examinar ao microscópio com
objetiva de imersão (100 x).
10. Com ajuda dos padrões G- e G+,
interpretar o esfregaço.

Quais as dificuldades encontradas?

Pesquisar. Qual a importância da coloração de Gram no diagnóstico?

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

OS MEIOS DE CULTURA
OS MEIOS DE CULTURA

A composição dos meios de cultura varia ao infinito. No entanto podemos, grosseiramente, dividir os meios
em duas categorias:

o Os meios ditos complexos cuja composição não é bem definida (extrato de carne, de levedura, de
peptona, de malte, etc.).
o Os meios sintéticos de composição determinada

Os meios que servirão de substrato para o cultivo bacteriano podem se apresentar como meios líquidos ou
sólidos. Geralmente, se acrescenta como agente solidificante o ágar, um açúcar obtido a partir de algas
marinhas. Este suporta perfeitamente o autoclavado (salvo a pH < 4 ou a pH > 9), derrete quando a
temperatura passa de 900C e solidifica quando a temperatura desce de 500C.

PREPARAÇÃO DE MEIO DE DILUIÇÃO

a) Dissolver 8,5 g de cloreto de sódio em água destilada.


b) Adicionar água destilada até completar 1000 mL.
c) Esterilizar.
d) Distribuir assepticamente conforme necessário.

PREPARAÇÃO DE MEIO LÍQUIDO

Composição do caldo nutritivo (= caldo de carne


simples)
Extrato de carne 3g
Peptona 5g
Água destilada 1000 mL

a) Misturar os componentes nas proporções indicadas e adicionar água destilada até completar o volume
desejado. Se for necessário, para dissolver os componentes, esquentar no Banho Maria.
b) Determinar o pH e ajustá-lo se necessário.
c) Distribuir o meio em tubos sem enchê-lo totalmente.
d) Tampar
e) Esterilizar.

Observação

Na falta dos componentes acima, o caldo pode ser preparado como a seguir: Cortar em pedaços pequenos
500 g de carne sem gordura, acrescentar 900 mL de água e manter na geladeira por 12 horas. Esquentar
devagar e ferver por 10 minutos. Acrescentar 5 g de sal (não iodado). Tirar a espuma, deixar esfriar e filtrar
duas vezes. Completar o volume a 1000 mL.

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

PREPARAÇÃO DE MEIO SÓLIDO

Composição do ágar nutriente (= ágar


simples)
Extrato de carne 3g
Peptona 5g
Ágar 15 g
Água destilada 1000 mL

a) Molhar o ágar em um pouco de água destilada fria.


b) Acrescentar o estrato de carne e a peptona nas proporções indicadas e adicionar água destilada até
completar o volume desejado.
c) Esquentar no Banho Maria até dissolver os componentes.
d) Determinar o pH e ajustá-lo se necessário.
e) Distribuir o meio em erlenmeyer ou tubos sem enchê-los totalmente.
f) Tampar.
g) Esterilizar.

A ESTERILIZAÇÃO

A esterilização pode ser definida como a destruição completa de todo organismo vivo por processos de
aquecimento, filtração ou qualquer outro método físico ou químico.

ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO

Esteriliza-se no calor seco o material de vidro. A


esterilização é obtida na estufa, a 180 C durante
2 horas.

ESTERILIZAÇÃO POR CALOR ÚMIDO

Esterilizam-se no calor úmido os recipientes que


contêm meio de cultura. A esterilização é obtida
na autoclave ou na panela de pressão, a 120C, 2
atmosferas, durante 20 minutos.

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO

Algumas soluções (vitaminas, antibióticos, etc.) não podem ser esterilizadas por calor sem sofrer graves
alterações. As preparações que contêm compostos termolábeis são esterilizadas por filtração. Todo o
equipamento de filtração é previamente esterilizado em autoclave.

As membranas Millipore são esterilizadas por ebulição suave durante 20 minutos em água destilada; deve-
se tomar cuidado para que não toquem as paredes do recipiente. Deixa-se esfriar, e retiram-se as membranas
da água com uma pinça estéril, colocando-as imediatamente sobre o respectivo disco de suporte.

Sistema Millipore

Também se podem esterilizar meios líquidos com filtros descartáveis que podem ser acoplados a seringas.
Este método é de grande utilidade na preparação de meios de cultivo para células vegetais porque permite
esterilizar hormônios sem perda de atividade.

Pesquisa: Existem outras formas de esterilização? Quais? Quais as vantagens e as desvantagens desses
métodos?

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

A SEMEADURA EM PLACA

A TÉCNICA BÁSICA

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

A TÉCNICA DE ESGOTAMENTO DO INÓCULO

Em uma amostra de microrganismos colhida na natureza encontraremos diversos tipos misturados. Para
poder caracterizar a atividade de cada um deles devemos estudar culturas contendo um único tipo de
microrganismo (cultura pura).
Somente com semeadura em placa é que podem ser obtidas colônias isoladas. É perda de tempo e material
simplesmente espalhar a amostra sobre a placa, esperando fazer um diagnóstico bacteriológico. A arte da
semeadura só é aprendida através de repetidas práticas diárias.

A técnica de esgotamento do inóculo é uma técnica de rotina para o isolamento de bactérias em culturas
puras. Se a semeadura não for satisfatória, não se obtêm colônias isoladas, devendo-se requisitar nova
amostra.

A placa de Petri deve conter um meio de cultura, no qual o organismo a ser isolado cresça
caracteristicamente. O meio de cultura deve estar bem seco, pois se estiver úmido, a água de condensação
pode arrastar as bactérias sobre a superfície da placa.

As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen, para evitar contaminação com germes do
ar. A figura abaixo mostra as três formas possíveis de segurar a placa durante o procedimento. Experimente
as três com uma placa vazia antes de escolher a que melhor se adapte a suas possibilidades.

Uma alça do material a ser semeado é colocada na parte superior do meio de cultura. Tocar somente a
superfície do meio, tratar de não perfurar o ágar. Esse é o chamado inóculo inicial.

Flambar a alça de platina e, a partir do inóculo inicial, semear em ângulos retos ao inóculo, retirando linhas
de semeadura, paralelas umas às outras. Virar a placa e semear em ângulos retos às linhas paralelas já feitas,
de modo que o resultado seja uma série de linhas formando pequenos quadrados sobre a superfície do meio.

As colônias isoladas devem aparecer no final da semeadura. Se houver crescimento de bactérias nos centros
dos quadrados formados pelo processo da semeadura, será obviamente contaminação.

Uma vez semeadas, as placas devem ser incubadas com a tampa voltada para baixo.

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A7. OBTENÇÃO DE UMA CULTURA BACTERIANA PURA

Objetivo: Obter colônias a partir de uma suspensão bacteriana mista.

Material

Placa de Petri contendo meio de cultura, tubo com solução salina estéril, pipeta estéril, alça de níquel-cromo,
caneta pilot, bico de Bunsen, suspensão mista de bactérias.

Procedimento

1. Transferir, com uma pipeta estéril, 0,1 mL da suspensão mista de bactérias para um tubo contendo 4,9 mL
de solução salina estéril (diluição 1:50).
2. Agitar bem e homogeneizar.
3. Flambar a alça e retirar uma gota pequena de suspensão mista de bactérias diluída e semeá-la sobre a
superfície de um meio sólido (ágar simples).

ATENÇÃO: A semeadura deve ser feita por estrias, de acordo com o esquema apresentado a
seguir (método de esgotamento). Entre um setor e outro, a alça deve ser esterilizada.

4. Rotular a placa e incubá-la a temperatura ambiente, durante 24 horas.

Resultados

1. Desenhe a aparência da placa (ou fotografe a placa) mostrando a distribuição do material inoculado.

2. Descreva as diferentes colônias isoladas, caracterizando-as quanto ao tamanho, bordos, elevação e


coloração. Utilize os critérios descritos na página seguinte.

3. Comparar os resultados obtidos pelos diferentes grupos.

Desafio

Como você procederia para obter uma cultura pura de uma das colônias observadas?

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

OS CRITÉRIOS UTILIZADOS

1. TAMANHO

2. FORMA

3. ELEVAÇÃO

4. BORDOS

5. ESTRUTURA

6. BRILHO: transparente, translúcida, opaca.

7. COR: incolor, pigmentada.

8. ASPECTO: viscosa, úmida, membranosa, gelatinosa, leitosa etc.

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A8. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE MICRORGANISMOS

Seres vivos visíveis a olho nu são relativamente fáceis de classificar pelas suas características morfológicas.
Microrganismos só podem ser vistos com ajuda do microscópio e sendo muito parecidos resulta impossível
diferenciá-los. Por isso é necessário estudar as características metabólicas, quer dizer a maneira pela qual o
microrganismo desenvolve os processos bioquímicos vitais. Atualmente, a utilização de sistemas
miniaturizados simplifica a tarefa.

Objetivo: Utilizar alguns testes bioquímicos para caracterizar diferentes microrganismos (E. coli, B. subtilis
e M. luteus).

Material

Três culturas bacterianas diferentes (A, B e C), placas de Petri contendo ágar nutriente, placa de Petri
contendo ágar-leite, placa de Petri contendo ágar-amido, 3 tubos contendo caldo glicosado e indicador de
pH, 3 tubos contendo caldo lactosado e indicador de pH, 3 tubos contendo caldo com sacarose e indicador
de pH, solução desinfetante, alça, pipetas Pasteur estéreis, bico de Bunsen, fita adesiva, caneta pilot.

Procedimento

A. INOCULAÇÃO DAS PLACAS.

1. Dividir cada placa de Petri em 4 seções (A, B, C e D).


2. Em condições assépticas semear com a alça a cultura A no setor correspondente das 3 placas
contendo ágar nutriente, ágar-leite e ágar amido respectivamente.
3. Repetir o item anterior com a cultura B.
4. Repetir o item B com a cultura C.
5. Incubar o material a temperatura ambiente.

B. INOCULAÇÃO DOS TUBOS.

1. Rotular os tubos.
2. Em condições assépticas inocular com a pipeta Pasteur a cultura A nos três tubos contendo caldo
glicosado, caldo lactosado e caldo sacarosado respectivamente.
3. Repetir o item anterior com a cultura B.
4. Repetir o item B com a cultura C.
5. Incubar o material a temperatura ambiente. .

Resultados

1. Descreva as colônias A, B e C.
2. Quais das 3 culturas produzem amilase?
3. Quais das 3 culturas produzem protease?
4. Houve fermentação de carboidratos? Como pode ser acompanhada?

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

5. Reúna a informação obtida na tabela seguinte:

Morfologia Produção de Produção de Fermentação Fermentação Fermentação


Cultura das colônias amilase protease de lactose de glicose de sacarose

Discussão

Identifique as culturas A, B e C sabendo que as colônias de E. coli e B. subtilis são brancas e as M. luteus são
amarelas; M. luteus e B. subtilis produzem proteases e fermentam a sacarose; B. subtilis produz amilases;
M. luteus, B. subtilis e E. coli fermentam a glicose; E. coli fermenta a lactose.

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

A9. O NÚMERO DE MICRORGANISMOS DE UMA CULTURA

O número de microrganismos em uma cultura pode ser estimado colocando um volume determinado desta
em ágar nutriente a 37.0C de maneira que cada célula possa se multiplicar dando origem a uma colônia.
Depois de 24 á 48 horas de incubação poderemos observar e contar as colônias. Aceitando que cada uma
delas resulta da multiplicação de um indivíduo isolado é possível calcular o número de microrganismos na
cultura.

Material: cultura de E.coli (diluição / 10-4), placas de Petri contendo meio nutriente, 5 tubos de ensaio com
4,5 mL de água destilada estéril, 1 tubo de solução salina, desinfetante, seringa de 1 mL pipeta
Pasteur calibrada, fita adesiva, caneta pilot, estufa a 370.C.

Procedimento.

1. Rotular a cultura (A) e os tubos de ensaio (B, C, D, E


e F).
2. Transferir com a seringa 0,5 mL da amostra de (A)
para (B). Misturar o conteúdo de (B). Por que se
deve misturar bem o conteúdo do tubo depois da
diluição?
3. Transferir com a seringa 0,5 mL de líquido de (B)
para (C). Misturar o conteúdo de (C).
4. Continuar a série de diluições até (F).
5. Secar a placa de Petri na estufa, e rotulá-la como o
indicado.
6. Evitando contaminações, retirar com a pipeta calibrada
uma pequena quantidade de líquido de (F). Abrir a placa
de Petri e deixar cair uma gota no lugar correspondente. Fechar a placa e devolver o excesso de líquido
a (F).
7. Repetir o procedimento com os tubos (E, D, C, B e A). Descartar a pipeta no desinfetante. Por que as
diluições são semeadas na ordem F, E, D, C, B e A?
8. Fechar a placa e colocá-la na estufa.

Resultados:

1. Algumas gotas têm entre 10 e 20 colônias? Quais?

2. Todas as colônias têm a mesma aparência?

3. Quantas vezes a cultura original foi diluída nessa gota? (Dica: de A para B a cultura foi diluída 10 vezes)

4. Conhecendo o volume da gota semeada na placa de Petri calcule o número de microrganismos


existentes na cultura (A).

Discussão: Sugira diferentes aplicações para esta técnica. Como poderia melhorá-la? Prepare um protocolo
apropriado.

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A10. AÇÃO DA LUZ ULTRAVIOLETA

Lâmpadas especiais que emitem luz UV com comprimento de onda microbicida são utilizadas para reduzir o
número de microrganismos no ar, em superfícies de salas cirúrgicas e em salas assépticas onde produtos
esterilizados são distribuídos em garrafas ou ampolas estéreis.

Nesta atividade estudaremos a ação germicida da luz ultravioleta sobre diferentes tipos de microrganismos,
tais como E. coli, B. subtilis, M. luteus, S. cerevisiae ou Rhodotorula.

Material (por grupo): 4 placas de Petri estéreis com meio nutriente para as bactérias e com meio nutriente
sacarosado para as leveduras; swab estéril; 1 pipeta Pasteur estéril, culturas de vários
microrganismos, 4 cartões de cartolina preta vazados, fluxo laminar com luz UV.

Procedimento:

1. Rotular uma placa como C (controle) e numerar as outras


seis.
Esvaziar uma forma de
2. Com um cotonete, em condições assépticas, inocular a 0,2 cm de largura,
superfície do ágar de todas as placas, espalhando um tapete aproximadamente
do microrganismo.

3. Colocar as 4 placas no fluxo laminar.

4. Substituir a tampa de vidro das placas 1 a 3 pelos cartões


vazados, como indicado no esquema. Deixar a placa 4 com a
sua respectiva tampa de vidro.

5. Expor as placas à luz UV durante 1 min. (placa 1), 5 min. (placa 2), 10 min. (placa 3) e 20 min. (placa 4).

6. Incubar as placas à temperatura adequada por 24-48 h.

Resultados

1. Observe o crescimento dos microrganismos na região da placa correspondente à área vazada dos cartões.
Registre as observações de seu grupo no quadro a seguir.

Microrganismo _________________________________

TEMPO 1 min. 10 min. 20 min. 20 min. (com


tampa)

CRESCIMENTO

( ++) : crescimento normal (+) : crescimento intermediário ( 0 ) : ausência de crescimento

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

2. Complete acrescentando os dados dos outros grupos:

MICRORGANISM 1 min. 10 min. 20 min. 20 min. (c/tampa)


O

( ++) : crescimento normal (+) : crescimento intermediário ( 0 ) : ausência de crescimento

Discussão

1. Caracterize a luz UV do ponto de vista físico


2. Qual o mecanismo de ação da luz UV que explica sua ação germicida?

3. Quais os fatores que modificam o efeito da luz UV

4. A luz UV agiu do mesmo modo sobre os diferentes microrganismos? Se a resposta for negativa, explique.

5. Uma caneta de luz UV é utilizada em alguns países para descontaminar os telefones celulares. Você acha
esse método adequado?

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A11. AÇÃO DOS DESINFETANTES

A propaganda de muitos desinfetantes se refere a “ação germicida” destes produtos. Nesta atividade vamos
pesquisar a ação de diversas concentrações de um desinfetante sobre culturas de Escherichia coli.

Material (por grupo):

Discos de papel de filtro de 5 mm de diâmetro, água sanitária (diluição 50%), 1 placa de Petri contendo ágar
nutriente estéril, 4 tubos com 1,5 mL de água esterilizada, 1 pipeta de 1 mL estéril, 1 pipeta Pasteur estéril,
desinfetante, 1 tubo com 5 mL de ágar nutriente estéril (ágar brando), pinças, bico de Bunsen, estufa a 30C,
cultura pura de Escherichia coli, pilot.

Observação 1: com outros desinfetantes recomenda-se partir de 0,2 mL e preparar a diluição seriada em
tubos com 1,8 mL de água esterilizada.
Observação 2: O ágar derrete quando temperatura passa de 900C e solidifica quando a temperatura desce
de 500C.

Procedimento

A. PREPARAÇÃO DOS DISCOS


Esterilizar os discos por imersão em etanol 96 0 durante uma noite. Secar.

B. PREPARAÇÃO DA PLACA
Em condições assépticas

1. Inocular o tubo contendo ágar nutriente liquefeito (ágar brando) com 1 mL de uma cultura pura
de Escherichia coli. Misturar bem.
2. Verter o conteúdo do tubo na placa. Deixar
solidificar.

C. PREPARAÇÃO DAS DILUIÇÕES


1. Rotular os tubos de ensaio. Colocar desinfetante no tubo D.
2. Com a pipeta volumétrica estéril, transferir 1,5 mL do desinfetante ao tubo 1. Agitar bem.
3. Continuar a série de diluições (tubos 2, 3 e 4) com a mesma pipeta.

D. O TESTE
Depois de rotular a placa dividindo-a em 5 setores, trabalhar em condições assépticas:
1. Acrescentar no centro da placa um disco-controle.
2. Molhar um disco com o desinfetante diluído (tubo 4), abrir a placa e colocá-la na superfície do
meio.
3. Repetir o procedimento com as outras diluições do desinfetante (tubos 3, 2 e 1).
4. Incubar a 30C durante 48 horas antes de proceder à leitura do teste.

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

Resultados

1. Prepare um desenho (ou fotografia) mostrando a aparência da placa e indicando o diâmetro das zonas
de inibição ao redor dos discos.

2. Em quais diluições não se observou crescimento microbiano?

3. Que aconteceu em redor do controle?

Discussão:

1. Qual a diferença entre um antisséptico e um desinfetante?

2. Qual o uso doméstico dos desinfetantes?

3. O desinfetante estudado é eficiente quando concentrado?

4. O desinfetante estudado é eficiente na diluição recomendada na embalagem do produto?

5. A descarga de água no vaso sanitário dilui os desinfetantes. Comente em função de seus resultados.

6. Compare os resultados obtidos na turma com outros desinfetantes.

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

A12. AÇÃO DOS PRODUTOS COSMÉTICOS (DESODORANTES)

Diferentes tipos de microrganismos se desenvolvem na pele, isto é nas dobras e partes mais úmidas
associadas às glândulas sudoríparas. O cheiro da transpiração é o resultado da ação destes microrganismos.

Os desodorantes inibem o crescimento dos microrganismos responsáveis pelo cheiro da transpiração. Nesta
atividade estudaremos a ação de diferentes desodorantes sobre o crescimento de Micrococcus luteus.

Material

1 placa contendo ágar nutriente estéril, 1 cultura de Micrococcus luteus, 1 pipeta estéril, 1 alça de Drigalsky,
3 desodorantes diferentes (A, B e C), 4 discos de filtro esterilizados, 1 pinça estéril, caneta pilot, bico de
Bunsen.

Procedimento

1. Dividir a parte inferior da placa de Petri em 4 setores (A, B, C e D).


2. Em condições assépticas, colocar umas gotas da cultura de Micrococcus luteus no ágar nutriente da placa
de Petri. Distribuir com a alça de Drigalsky ou com um swab.
3. Em condições assépticas, colocar com a pinça no setor D um disco de papel de filtro estéril (controle).
4. Em condições assépticas colocar com a pinça no setor A um disco de papel de filtro molhado com o
desodorante A. Lavar a pinça com água e esterilizar na chama do bico de Bunsen durante 2 a 3 segundos.
5. Repetir o procedimento com os desodorantes B e C.
6. Rotular a placa e incubar a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas. Observar o crescimento
bacteriano na placa.

Resultados

Desenhe esquematicamente (ou fotografe) a aparência da placa de Petri.

Discussão

1. Os desodorantes estudados têm alguma ação sobre as bactérias?

2. Qual a principal função dos desodorantes?

3. Qual a composição dos desodorantes?

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A13. AÇÃO DOS PRODUTOS COSMÉTICOS (DENTIFRÍCIOS)

Diferentes tipos de microrganismos se desenvolvem na


cavidade oral. Muitos são inofensivos, outros não.

Algumas bactérias fermentam os carboidratos


(predominantemente a sacarose) produzindo ácido que
dissolve os sais de cálcio, num processo de desmineralização.
A destruição localizada do tecido dental forma a cárie
dentária.

Nesta atividade estudaremos a ação de diferentes


dentifrícios sobre o crescimento de Micrococcus luteus.

Material

1 placa contendo ágar nutriente estéril, 1 cultura de Micrococcus luteus, 1 pipeta estéril, 1 alça de Drigalsky,
3 dentifrícios ou três soluções anti-placa bacteriana (A, B e C), 4 discos de filtro esterilizados, 1 pinça estéril,
pilot, bico de bunsen.

Procedimento

1. Dividir a parte inferior da placa de Petri em 4 setores (A, B, C e D).


2. Em condições assépticas, colocar umas gotas da cultura de Micrococcus luteus no ágar nutriente da placa
de Petri. Distribuir com a alça de Drigalsky ou com o swab.
3. Em condições assépticas, colocar com a pinça no setor D um disco de papel de filtro estéril (controle).
4. Em condições assépticas colocar com a pinça no setor A um disco de papel de filtro molhado com o
dentifrício A. Lavar a pinça com água e esterilizar na chama do bico de Bunsen durante 2 a 3 segundos.
5. Repetir o procedimento com os dentifrícios B e C.
6. Rotular a placa e incubar a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas. Observar o crescimento
bacteriano na placa.

Resultado

Desenhe esquematicamente (ou fotografe) a aparência da placa de Petri.

Discussão

1. Os dentifrícios estudados têm alguma ação sobre as bactérias? Qual é o mais eficiente?

2. Alguns dentifrícios contêm substâncias que inibem o crescimento bacteriano. Quais os outros
ingredientes de um dentifrício e qual a sua função?

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

A14. ANTIBIÓTICOS E ANTIFÚNGICOS

Na natureza, a produção de substâncias antibióticas pelos microrganismos desempenha um papel


importante na competição interespecífica, seja porque matam outros microrganismos seja porque inibem
seu crescimento ou sua reprodução. O homem utilizou essa propriedade para desenvolver medicamentos
que lhe permitissem lutar contra as infeções.

O uso indiscriminado de antibióticos na clínica teve como consequência um aumento de formas resistentes,
dificultando o combate aos microrganismos. Atualmente, no Brasil, a venda de antibióticos só é possível com
receita médica.

Então, como levar a ação germicida ao laboratório de ensino? Desinfetantes, dentifrícios e desodorantes
representam algumas das opções possíveis. Outra possibilidade são as soluções antifúngicas de uso tópico
destinadas ao tratamento de micoses superficiais, de baixo custo e venda livre nas farmácias. Estes produtos
podem ser testados com Saccharomyces cerevisiae, uma levedura vendida comercialmente que é utilizada
habitualmente nas atividades práticas por não apresentar risco nenhum.

Desvio de função de um produto comercial? Não, se tivermos em conta que Não temos a pretensão de avaliar
sua eficiência. Para isso, a sociedade conta com organizações específicas que seguem protocolos estritos
antes de dar a autorização correspondente.

Objetivo
Evidenciar a ação germicida de uma solução antifúngica de uso tópico e venda livre nas farmácias.

Materiais
Uma placa contendo ágar nutriente estéril (Sabouraud), 1 cultura em caldo de Saccharomyces cerevisiae, 1
pipeta estéril, 1 swab estéril, uma solução antifúngica, 5 discos de papel de filtro estéreis, 1 pinça estéril,
pilot.

Procedimento

1. Rotular a placa e dividir a parte inferior em 4 setores (A, B, C e D).


2. Em condições assépticas, colocar umas gotas da cultura de Saccharomyces cerevisiae no ágar nutriente
e distribui-las com um swab.
3. Em condições assépticas, colocar com a pinça um disco de papel de filtro estéril (controle) no centro da
placa.
4. Mantendo a assepsia, colocar com a pinça um disco de papel de filtro embebido no produto em cada
setor (A, B, C e D).
5. Incubar a placa a temperatura ambiente (30 C aproximadamente) durante 48 a 72 horas. Observar o
crescimento das leveduras e a aparição de halos de inibição.

Perguntas

O produto testado mostrou alguma ação germicida sobre as leveduras?

Qual a função do papel colocado no centro da placa?

Qual a função das repetições B, C e D?

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INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

Como interpretaria a eventual aparição de colônias dentro do halo de inibição?

BIBLIOGRAFIA

MALAJOVICH M.A. Microrganismos. Capítulo 3 do livro “Biotecnologia 2011”.


Biotecnologia: ensino e divulgação http://bteduc.com

PELCZAR M., REID R e KRIEG N. R. Microbiologia. São Paulo, Makron Books, 1996

VERMELHO A.B. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2006.

WYMER P. Practical Microbiology and Biotechnology for Schools. London, Mac Donald and Co., 1987

SITES DE INTERESSE NA INTERNET

AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY HTTP://WWW.ASM.ORG/

ANBIO (ASSOCIAÇÃO NACIONAL DE BIOSSEGURANÇA) HTTP://WWW.ANBIO.ORG.BR

BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO HTTP://BTEDUC.COM

EXPLORATORIUM MICROSCOPE IMAGING HTTP://WWW.EXPLORATORIUM.EDU/IMAGING_STATION/INDEX.PHP

FUNDAMENTALS OF MICROBIOLOGY (UNIVERSITY OF WASHINGTON)


HTTP://WWW.SLIC2.WSU.EDU:82/HURLBERT/MICRO101/PAGES/101HMPG.HTML

MICROBIOLOGY ONLINE HTTP://WWW.MICROBIOLOGYONLINE.ORG.UK/

SCIENCE IN THE REAL WORLD: MICROBES IN ACTION HTTP://WWW.UMSL.EDU/%7EMICROBES/

THE BIG PICTURE BOOK OF VIRUSES


HTTP://WWW.TULANE.EDU/%7EDMSANDER/BIG_VIROLOGY/BVHOMEPAGE.HTML

VIRTUAL MUSEUM OF BACTERIA HTTP://WWW.BACTERIAMUSEUM.ORG/

YOU TUBE HTTP://YOUTUBE.COM

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