CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (CLAR o HPLC)

Los avances obtenidos en el desarrollo de la instrumentación científica consiguieron que al final

de la década de 1960 fuese posible el análisis de mezclas complejas por cromatografía de gases
en cuestión de minutos o incluso segundos, pudiéndose detectar, en las condiciones más
favorables, cantidades de sustancias del orden de los nano-gramos, y algunas veces de los pico-
gramos. Sin embargo, para muestras no volátiles, la cromatografía líquida clásica, a pesar de
haber demostrado un gran poder de separación, no alcanzaba la eficiencia y la sensibilidad de
la CG, ya que, en muchas ocasiones, era necesario invertir horas para la elución, recoger
fracciones de forma manual conteniendo miligramos o gramos de material eluido y utilizar litros
de disolvente. Era, pues, necesario lograr que la CL proporcionase unas prestaciones similares
a las logradas con la CG. Para ello, tenía que acelerarse, automatizarse y adaptarse a muestras
mucho más pequeñas. Como consecuencia de los esfuerzos efectuados en estas direcciones,
surgió la moderna Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR o HPLC)
PRINCIPIOS BASICOS
El primer aspecto considerado en orden a optimizar la CL fue incrementar la velocidad de la fase
móvil, lo cual puede hacerse sin demasiados problemas mediante la utilización de bombas
adecuadas y conexiones de tubos que impidan fugas, al estar sometido el líquido a presiones
elevadas. Sin embargo, con fases estacionarias convencionales, el empleo de altas velocidades
de fase móvil implica una pérdida de resolución. Para mejorar ésta, se hace necesario modificar
el empaquetamiento de la fase estacionaria, lo cual se considerará seguidamente en conexión
con la ecuación de van Deemter:

que, aunque desarrollada para cromatografía en fase gaseosa, es razonable considerar que el
ensanchamiento de las bandas en CL se debe al mismo tipo de factores. La resolución en
cromatografía líquida se mejora al disminuir el tamaño de las partículas de la fase estacionaria,
lo cual, en primer lugar, reduce el término A de la ecuación de van Deemter, ya que las
trayectorias seguidas por la fase móvil son más uniformes en el caso de partículas de menor
tamaño. En relación con la difusión longitudinal, B/u, este término es importante en cromatografía
de gases, pero como la difusión es mucho más lenta en los líquidos, el ensanchamiento de las
bandas por este motivo en CL solo es significativo cuando la velocidad de flujo es excesivamente
lenta. El término de resistencia a la transferencia de masa, Cu, es fundamental, ya que, con
velocidades de flujo elevadas, se conseguirán bajas resoluciones, al menos que la transferencia
de solutos entre las fases móvil y estacionaria sea muy rápida. A esto colabora decisivamente la
reducción del tamaño de las partículas de la fase estacionaria. Los materiales que normalmente
se utilizan en cromatografía líquida convencional están constituidos por partículas de tamaño
relativamente grande (150 µm ó más) y con poros profundos, como se representa en la (Figura
1. a.). Estos poros se llenan con porciones estancadas de fase móvil y es posible que las
moléculas de soluto penetren en ellos a una profundidad tal que su regreso por difusión al líquido
móvil sea lento. Esto es favorable en CL convencional, que trabaja con lentas velocidades de
flujo, pero cuando se opera con velocidades de flujo elevadas, se origina un ensanchamiento de
bandas excesivamente grande.
 Figura 1: Columnas y fases estacionarias en CL. a) CL convencional. b) HPLC con partículas
peliculares. c) HPLC con partículas microporosas.
Los primeros intentos satisfactorios para mejorar las prestaciones en el sentido indicado,
condujeron a la utilización de fases estacionarias de partículas peliculares, constituidas por
partículas esféricas de un material sólido no poroso (frecuentemente bolitas de vidrio de unos 40
µm de diámetro) recubiertas de una capa superficial porosa y de espesor muy pequeño (entre 1
y 3 µm ). Esta capa puede ser gel de sílice, alúmina o geles de poliamida (figura 1.b.). De esta
forma, la presencia de poros superficiales facilita considerablemente el proceso de transferencia
de masa. Sin embargo, debido al pequeño espesor de la película porosa, el volumen de la fase
estacionaria, VS, es pequeño, por lo que este tipo de columnas no resultan adecuadas para
cromatografía preparativa. En época relativamente reciente se ha incrementado el uso de una
nueva generación de materiales de partículas micro-porosas con tamaños inferiores a 30 µm y
que son totalmente porosos (figura 1.c.). Estas fases estacionarias no pueden conseguirse
mediante simple pulverización, ya que de esta forma se obtienen partículas muy irregulares, sino
que requieren la utilización de una tecnología diferente. En cualquier caso, tanto con partículas
peliculares como con partículas micro-porosas, el precio a pagar es la elevada resistencia al flujo.
Por ello, es necesario utilizar presiones elevadas para forzar el paso de líquido a través de la
columna. Normalmente, se requieren presiones que pueden llegar a ser de hasta 200 atmósferas
para velocidades de flujo de 0.5 a 5 mL/min. La utilización de columnas de pequeño diámetro
presenta ciertas ventajas, sobre todo en análisis de trazas, si bien, aunque la reducción del
diámetro de la columna a niveles capilares también aumenta la resolución, tales columnas no
son de uso común en HPLC.
INSTRUMENTACION
Los componentes básicos de un sistema para HPLC se han representado esquemáticamente
en la figura 2. y son:
* Depósitos para la fase móvil.
* Sistema de bombeo para proporcionar presión a la fase móvil.
* Dispositivo para la introducción de la muestra.
* Columna cromatográfica.
* Detector.
* Sistema para el tratamiento de datos y registrador.
Como algunas fases móviles usadas en HPLC pueden ser químicamente activas, como ácidos,
bases o líquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema estén fabricados con
materiales resistentes a esos posibles ataques. La mayoría de las partes del cromatógrafo en
contacto con la fase móvil suelen estar fabricadas con acero inoxidable, previamente pasivado
con ácido nítrico 6 M, de forma que en esas condiciones, su superficie es resistente al ataque de
la mayoría de los disolventes, con excepción del ácido clorhídrico. Las mayores ventajas del
acero residen en su coste relativamente bajo, la facilidad para construir con él los distintos
componentes y la resistencia mecánica, lo que permite operar a presiones muy elevadas.

Figura 2: Componentes básicos de un sistema para HPLC

En cromatografía de gases se hacía necesario un control bastante estricto de la temperatura de
trabajo. Sin embargo, en cromatografía líquida, este control no suele ser tan necesario, debido a
que la transmisión de calor del soluto entre las fases móvil y estacionaria es mucho más pequeña.
Por ello, los cambios en la temperatura ejercen menos influencia sobre el grado de retención y
la resolución. Esto hace que en muchas aplicaciones no sea necesario un control estricto de esta
variable y las columnas trabajen a temperatura ambiente. De cualquier forma, es posible el
control de la temperatura mediante el empleo de hornos que la regulan desde la del ambiente
hasta 150 ºC, o bien mediante el encamisado de la columna.
CARACTERISTICAS DE LAS FASES MOVILES Y SISTEMAS DE ELUCION
Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase móvil (y las tuberías que la conduzcan)
tienen que ser inertes, esto es, el disolvente no deberá extraer especie alguna del material con
que estén construidos. Generalmente se usan botellas de vidrio y tubos de teflón, provistos éstos
últimos de un sistema de filtros para eliminar cualquier partícula que pueda contener la fase móvil.
Los disolventes más utilizados en HPLC suelen ser agua, disoluciones tampón acuosas y
disolventes orgánicos tales como metanol, acetonitrilo o diferentes mezclas. En cualquier caso,
todos los disolventes deberán ser espectroscópicamente puros, exentos de partículas sólidas y
desgasificados. Esto puede llevarse a cabo por filtración a vacío a través de filtros de 0.22–0.45
µm, o mediante el burbujeo con un gas inerte muy poco soluble, como nitrógeno o helio. La des-
gasificación reduce la posibilidad de formación de burbujas en la válvulas de las bombas y en los
detectores. Asimismo, es importante porque se reduce el ruido de fondo cuando se utiliza un
detector ultravioleta, y porque se evita la interferencia del oxígeno disuelto en la detección
fluorimétrica. Además, es fundamental cuando se utiliza elución por gradiente en fase inversa,
especialmente con gradientes de presión baja, ya que de esta forma se evita la formación de
burbujas de aire cuando se mezclan el agua y el disolvente orgánico. Aunque la separación de
muchas mezclas se lleva a cabo utilizando un disolvente de composición constante (elución
isocrática), en ocasiones se usa la elución por gradiente, en la cual se cambia la composición de
la fase móvil durante el desarrollo del cromatograma. Con ello se consigue aumentar la eficiencia
de la separación, con unos efectos similares a los producidos por la programación de temperatura
en cromatografía de gases. El esquema representado en la figura 2. corresponde a un sistema
de este tipo con dos disolventes.
SISTEMAS DE BOMBEO
Como consecuencia de las elevadas presiones de trabajo, debido al pequeño tamaño de las
partículas de la fase estacionaria, es necesario utilizar bombas que proporcionen un flujo
aceptable de eluyente. Los sistemas de bombeo usados en HPLC deberán reunir las siguientes
características:
* Estar construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados.
* Suministrar un flujo de eluyente libre de pulsaciones, en el margen comprendido entre 0.1 y
10 mL/min con una precisión del 0.5 %.
* Generar presiones superiores a 6000 psi (lb/in2).
La mayor parte de los sistemas de HPLC utilizan las denominadas bombas recíprocas, cuyo
principio de funcionamiento se ilustra en la figura 3. Estas bombas consisten en un pistón de
zafiro situado en el interior de una cámara de volumen reducido (35–400 µL) que,
alternativamente succiona eluyente contenido en un depósito a baja presión y lo impulsa hacia
la columna a presión alta, mediante un sistema de válvulas como el representado
esquemáticamente en la figura 3. Con este dispositivo se consiguen presiones elevadas y se
suministra un caudal constante, pudiéndose adaptar fácilmente a la técnica de elución con
gradiente, debido a su pequeño volumen interno. Sin embargo, producen un flujo pulsante que
se ha de amortiguar convenientemente, para lo cual se utiliza en ocasiones un sistema
constituido por dos pistones.

Figura 3: Principio de funcionamiento de una bomba recíproca.

Las bombas de desplazamiento se utilizan mucho menos que las anteriores y básicamente
consisten en una cámara relativamente grande equipada con un mecanismo de tornillo (figura
4.). Suministran un flujo libre de pulsaciones, pero presentan el inconveniente de su capacidad
limitada (≅250 mL).
 Figura 4: Bomba de desplazamiento
Las bombas neumáticas hacen uso de la presión de un gas aplicado al recipiente conteniendo la fase móvil.
Estas bombas son muy sencillas y no provocan pulsaciones, si bien, están limitadas a presiones
relativamente bajas.

INTRODUCCION DE LA MUESTRA

La introducción de las muestras en la columna cromatográfica es frecuentemente el factor controlante de

la reproducibilidad de las medidas. Los volúmenes a inyectar deberán ser pequeños, para evitar la
sobrecarga de la columna y se ha de introducir la muestra sin despresurizar el sistema. La forma más
simple de inyectar la muestra es utilizar un diafragma ("septum") análogo al utilizado en cromatografía
de gases, si bien este sistema está limitado a una presión máxima de operación de 1500 psi. El método
más utilizado en HPLC consiste en usar válvulas de inyección con bucles de volumen conocido, figura 5.

Figura 5: Válvula de inyección. a) Llenado. b) Inyección

En la posición de llenado (figura 5.a.), la fase móvil pasa directamente a la columna, y la muestra se
introduce en el bucle mediante una micro-jeringa. Una vez lleno el bucle, se gira la válvula a la posición
de inyección (figura 5.b.) en la que la fase móvil impulsa la muestra hasta la columna. Un inconveniente
que presenta este sistema es que la precisión de la inyección varía con el tamaño del bucle.

COLUMNAS, FASES ESTACIONARIAS Y FASES MOVILES

Las características físicas de las columnas usadas en HPLC (longitud, diámetro) se han indicado
anteriormente (ver figura 1.), así como los tamaños de las partículas que constituyen la fase estacionaria
(partículas peliculares, partículas micro-porosas). En cuanto a la resolución, lo normal es operar con
columnas que tienen entre 40000 y 60000 platos teóricos por metro.