Perfusión Normal

Conviene que el día antes de la perfusión se compruebe llenando el sistema de perfusión

con agua que no hay fugas y que todo marcha bien, así de paso se limpian los reciientes
y tubos.
MATERIAL
1. Sistema de perfusión.
2. Caja con reja para sujetar el animal.
3. Fijador. 4%PF en PB 0,1M (pH 7,2 -7,4). Es mejor prepararlo fesco.
Volumen a usar: peso del animal en gr .(Cuando no se perfunde la parte inferior del
animal, de lo contrario seria peso x 1,5)
Volumen a preparar: volumen de uso y 100 ml más por rata para postfijación
Ejem para 300 ml:
Calentar hasta 70ºC un volumen de 200ml de dH2O en microondas y colocar en
un agitador caliente en la campana apagada, añadir 12gr de PF y agitar, encender
la campana, añadir dos o tres gotas de NaOH 1N y tapar, agitar hasta que este
cristalino. Filtrar en una probeta, y cuando esté algo más frío añadir 30 ml de PB
y 24ml de Glutaraldehido (Viene en stock al 25%, queda a concentración de 2%
en los 300ml) y enrasar con dH2O hasta un volumen final de 300ml. Medir pH.
4. Salino. 0,9% ClNa en dH2O.(0,9 gr en 100ml de dH2O)
5. Instrumental quirúrgico. Tijeras, pinzas, bisturí, porta bisturí, tijeras clampar,
gubia
6. Instrumental de perfusión. Cánulas, agujas (grises), jeringuillas de insulina.
7. Botes de orina 100 ml.
8. PB 0,1 M
9. Hielo
10. Hojas seguimiento animales. Numeración , A(Ana)01(año)01(nº animal)
11. Anestesia. Hay varias posibilidades de anestesia y además no son las
mismas dosis para rata que para ratón. Leer el documento de anestesia en el
que se explica todo. Lo mas habitual es utilizar una anestesia de Ketamina
(Ketolar)y Metedomidina (Dormtor). De Ketolar: 75mg/Kg peso para ratón o
50mg/Kg peso para rata y de Dormtor 1mg/Kg peso del animal.
Dormtor). El Ketolar y el Dormotor se mantienen tapados y en nevera.
Para rata sería 0,1 ml Ketolar (stock 50mg/ml) por cada 100 gr de peso animal y para
ratón 0,15 ml Ketolar por cada 100 gr de peso mas un poquito de Dormtor.

PREPARACION DEL SISTEMA DE PERFUSION

1. Colocar el sistema de perfusión con el pie encima de la mesa, llenar toda la vía
del fijador y eliminar las burbujas, cambiar la “T” y pasar el salino y eliminar
las burbujas.

PERFUSION

1. Anestesiar al animal. Intraperitoneal. Coger al animal del pescuezo y las patas

delanteras sin apretar salvo que se mueva. Colocarlo con el vientre hacia arriba,
 retirando el rabo hacia atrás, y pinchar la dosis de anestesia. El lugar ideal seria,
en la mitad de una de las partes que separa la línea alba y más arriba de la vejiga
formando un ángulo de 45º.
2. Colocar el animal en la reja y cortar la piel con un bisturí siguiendo la línea alba
y retirarla dejando al descubierto desde la traquea hasta el abdomen bajo.
3. Con pinzas y tijeras, cortar desde el abdomen hacia los lados y hacia la parte
superior del animal, dejando al descubierto los intestinos que se retiran a un lado
para clampar lar arterias que van a las extremidades inferiores, de esta forma
solo fijamos la parte superior que es la que nos interesa y así usamos menos
fijador. Atención, las tijeras se introducen bastante para cortar mas superficie en
menos tiempo.
4. Cuando ha quedado al descubierto el esternón, se levanta con las pinzas de
modo que podemos cortar con cuidado el diafragma y así dejar al descubierto el
corazón, desde este momento todo ha de ser muy rápido ya que entra en hipoxia.
5. Cortamos lo mas lateral posible las costillas, y se coloca una tijera de clampar en
el esternón para mantener las costillas retiradas del corazón.
6. Con unas tijeras pequeñas y de punta se corta la grasa circundante del corazón y
se retira el timo para poder ver la aorta que tenemos que canular.
7. Sujetamos el corazón con unas pinzas y hacemos un corte en el ventrículo
izquierdo. Para ratas pequeñas no es necesario cortar.
8. Meter la cánula con goteo suave de salino en dirección a la aurícula derecha pero
sin llegar a la aorta, regulamos el flujo de salino.
9. Canulamos la aorta
10. Cortamos la aurícula derecha. Dejamos pasar el salino un tiempo suficiente.
Máximo 2 min.
11. Cambiar la ”T” para meter el fijador. En este momento el movimiento de patas
delanteras y cabeza es señal de que el fijador esta entrando bien, ir comprobando
la dureza de las patas y el ritmo de goteo ya que éste disminuye con el tiempo.
Finalizado el proceso desconectar.

NOTA: la perfusión de la médula puede ser por inmersión, podemos seguir clampando
abajo. A veces se perfunde sin lavar con salino.
POSTFIJACION A 4ºC

1. Cortar la cabeza, se puede cortar con una guillotina, si no, primero con bisturí
luego con las tijeras, a la altura del comienzo de las patas delanteras.
2. Pelar la cabeza y abrir entradas en el cráneo a la altura de los ojos y el inicio de
los bulbos con la gubia o pinzas si es un animal joven. Extraer el cerebro y
mantener toda la noche a 4ºC en un falcon con fijador hasta arriba.
3. Al día siguiente
a. Criostato: crioproteger los cerebros en fijador con 30% sacarosa hasta
que se hundan. Congelar los cerebros en hielo seco.
b. Vibratomo: lavados con PB 0,1M a 4ºC una vez al día durante cuatro
días. Luego pasar a PB 0,1 M con azida al 0.05%.

NOTA: un buen indicativo de una buena perfusión es que la hipófisis esté blanca, ya
que es una glándula muy irrigada.
Fecha de creación 23/10/02 Autor: Marina, revisado Agosto 2012