PÓLEN DE ABELHAS COMO

BIOINDICADOR DE
CONTAMINAÇÃO
AMBIENTAL POR EQUIPE:
MARIA BEATRIZ
PESTICIDAS GABRIELA MOURA
THAYNARA CARVALHO
TIAGO LOPES
CURSO: ENGENHARIA AMBIENTAL E SANITÁRIA JÚLIA BORGES
DISCIPLINA: QUÍMICA AMBIENTAL NATHIELY AGUIAR
PROFESSOR: BRUNO CÉSAR
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INTRODUÇÃO
PESTICIDAS na agricultura fornecem:
• Controle de pragas; Aumenta a produtividade e Reduz os custos.

• Traz riscos à saúde humana:

• Devido a exposição a água, solo, ar, animais e plantas contaminados.
(Fernandez et al., 2001;Tomita e Beyruth, 2002; Koifman e Hatagima, 2003);

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• PESTICIDAS podem levar:
• Desaparecimento de insetos (abelhas e polinizadores selvagens);
• Promover o surgimento de novas pragas;
• Evolução dos pesticidas resistentes entre a população de pragas.

• As abelhas podem morrer rapidamente após a aplicação de pesticidas, enquanto a exposição

crônica a doses sub-letais pode prejudicar seu comportamento e afetar a saúde e
desenvolvimento da colônia. (Johnston et al., 2010; Gregorc et al., 2012; Pettis et al., 2012; Di
Prisco et al., 2013;Williamson e Wright, 2013).

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• As abelhas cobrem uma área ampla (até 7 km2) em sua busca por néctar e pólen é a razão,
ao quais, o uso de abelhas e produtos apícolas (pólen e mel) como bioindicadores.

O uso de pólen de abelha como bioindicador:

• Desenvolveu-se um método analítico sensível e seletivo;

• Etapa de preparação da amostra apropriada;

• Matriz é altamente complexo;

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• Em relação às técnicas analíticas, o gás cromatografia acoplada a espectrometria de massa
(GC-MS) e cromatografia acoplada a espectrometria de massa em tandem (LC-MS / MS) são
as técnicas mais utilizadas para multiresíduos análise de pesticidas em baixos níveis de
detecção (Berrada et al., 2010; García-Chao et al., 2010; Mullin et al., 2010; Wiest et al.,
2011;Kasiotis et al., 2014).

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METODOLOGIA
•  Produtos Químicos e Reagentes

• Acetocloro, alacloro, dissulfotona, alfa-endossulfam, beta-endossulfam, etrinfos,

fempropatrim, fosalona, epóxido de heptacloro, hexaclorobenzeno, oxifluorfem,
paration de etila, metil paration, pendimetalina, terbufos, aldrina, bifentrina, bioaletrina,
clorpirifos de metilo, DDT (diclorodifenil-tricloroetano), fentoato, fluazifop, malatiom,
permetrina, pirimifos-etilo e trifluralina.
• (26 pesticidas)

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•  Soluções padrão

• Preparou-se em acetona: alacloro, aldrina, bifentrina, bioaletrina, etrinfos, fluazifop,

epóxido de heptacloro, malationo, oxifluorfen, pendimetalina, terbufos e trifluralina;
• Preparados em hexano: DDT, alfa endosulfan, beta endossulfan, fentoato, etil paration,
metil paration, permetrina, pirimifos-etil e fempropatrim;
• O hexaclorobenzeno foi preparado em clorofórmio;
• A abamectina, utilizada nos estudos de sorção, foi preparada em metanol;
• Soluções padrão intermediárias individuais contendo 10,0 µg.mL-1 desses pesticidas e o
lindano padrão interno foram preparados diariamente diluindo 0,10 mL da solução padrão
padrão em 10 mL de acetonitrila.
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•  Soluções padrão

• A mistura I, contendo quinze padrões (incluindo o padrão interno), foi analisada usando o
Método I;

• a Mistura II, contendo treze padrões (incluindo o padrão interno), foi analisada usando o
Método II;

• Todas as soluções padrão foram mantidas em um freezer a -16ºC por até seis meses.

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• Análise por cromatografia gasosa

• Pesticidas       -      Cromatógrafo gasoso Varian 3900 GC, equipado com um espectrômetro de
massas de retenção iônica Saturn 2100 T;
• Os analitos foram separados numa coluna capilar Rxi® 5 Sil (30 m, 0,25 mm id., 0,25 µm);
• Temperatura do forno da coluna:
– 100°C ( durante 2 min) até 150°C ( durante 10 min) a 10°C.min-1;
– Depois a 250°C ( durante 6 min) a 5°C.min-1.
• Temperatura e o volume da injeção:  250°C e 1 mL;
• Temperaturas da armadilha, do coletor e da linha de transferência: 220, 60 e 280°C,
respectivamente;
• Gás transportador: hélio         -         fluxo constante de 1 mL.min-1.
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• 2.3.Monitoramento ambiental Localização: Tanquinho Velho (Jaguariúna - SP).

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• 2.3. Monitoramento Ambiental: Área de 130 há.

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Monitoramento Ambiental:Monitoramento Ambiental: Entre as latitudes 22°42'44 ''
e 22°42'55 "S e longitudes 47°00'53" e 47°01'05 "W.

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 Metodologia

● 2.3.Monitoramento Ambiental:
● Coletadas 145 amostras de pólen;
● Apiário experimental (Maio/2012 - Maio/2013);
● Diretamente das 10 colméias;
● Armadilhas de polinização do patamar de entrada;
● Coletor tela com furos 4,5 mm;
● Polén cai em uma gaveta de coleção
● Tela ficou instalada por 3 dias
● E após retirada por + ou - 30 dias,
● Evitar quaisquer impactos negativos no desenvolvimento da colônia.
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 Metodologia

● 2.3.Monitoramento Ambiental:
● Controle de Agrotóxico no ambiente:
● Método estabelecido - PUF;
● Amostradores passivos;
● Discos de espuma de poliuretano (PUF);
● 14 cm de diâmetro x 1,35 cm de espessura;
● Densidade 0,018 g cm³;
● Área superficial 324 cm²
● Massa 3,3 g;
● Volume 184,7 cm³.
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 Metodologia
● Monitoramento Ambiental:
● Os discos: limpos por extração de Soxhlet;
● Diclorometano e acetona (60 ° C, 8 h com cada solvente);
● Ausência de contaminantes e / ou interferências;
● Seco sob uma coifa de extração;
● Papel alumínio e armazenado em temperatura ambiente até o uso.
● Amostragem ambiental:
● 6 amostradores: 1 apiário, 5 mato circundante.
● PUFs: cerca de 30 dias
● Trocados e analisados para cada período de coleta de pólen.
● Acondicionamento: frascos de vidro (pólen de abelha)
Papel alumínio (PUFs)
● Armazenadas em freezer a -16 ° C até a análise. 15
 Metodologia
● Amostras comerciais de pólen de abelha
• 21 amostras comerciais de pólen de abelha;
• Obtidas de apicultores na região de Ribeirão Preto (SP) no outono de 2013;
• 2 dessas pertencentes a colmeias com alta mortalidade de abelhas;
• Sugestivo de contaminação por pesticidas;
• Acondicionamento: recipientes de vidro e armazenadas em freezer a -16°C até a análise.

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 Metodologia
● Levantamento de agrotóxicos a serem incluídos no estudo
• Utilizados na região do entorno do campo experimental;
• Substâncias monitoradas pelo PNCRC do MAPA e pelo PARA da ANVISA.
• Inclusive as proibidas;
• Entrevistas com os agricultores mensalmente.

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 Metodologia
• Método Analítico
• Preparação de amostras de pólen de abelha

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 Metodologia
• Método Analítico
• Preparação de amostras de pólen de abelha

• secas em estufa (40-42 ° C) por até 12 h, moídas e homogeneizadas;

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 Metodologia
• Método Analítico
• Preparação de amostras de pólen de abelha
• Aproximadamente 2 g de pólen ;
• + 15 mL de acetonitrila;
• Tubos de polipropileno (50 mL) e agitados num vortex;
• Foram adicionados 4,0 g de sulfato de magnésio anidro;
• +1,0 g de cloreto de sódio;
• +1 ,0 g de citrato de sódio;
• + 0,5 g de sesqui-hidrato de hidrogenocitrato de sódio;
• Agitação e centrifugação de 13.440 g (5 °C) por 5 min.

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 Metodologia
● Método Analítico
● Preparação de amostras de pólen de abelha
• 1 mL do sobrenadante foi transferida para um tubo de polipropileno (50 mL);
• + 95 mg de sorvente PSA (bondesil-PSA, 40μm);
• + 750 mg de sulfato de magnésio anidro;
• Agitação em vórtice durante 1 min;
• Centrifugação: 10 min de 13,440 g. (5 ° C);
• Sobrenadante foi evaporado até à secura num
evaporador rotativo a 40 ° C;
• O resíduo: dissolvido em 1,0 mL de acetonitrila e analisado por GC-MS / MS (espectrofotómetro de cromatografica
de massa).

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● Preparação de amostras de PUF
Metodologia
• 1º Descongeladas no refrigerador (5°C);
• 2º Temperatura ambiente e cortadas em pequenos pedaços;
• 3º Soxhlet extraído com diclorometano a 60°C por 8 h.
• 4º Os extratos foram coletados em balão de fundo redondo e evaporados até a secura em evaporador rotativo a
40°C.
• 5º Os resíduos dissolvidos em 5,0 mL de acetonitrila;
• 6º Transferidos para tubos de polipropileno de 12 mL.
• 7º Os extratos foram evaporados até a secura;
• 8º Os resíduos foram dissolvidos em 1,0 mL de acetonitrila;
• 9º Análise por GCMS / MS(espectrofotómetro de cromatografia de massa).

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• Análise por cromatografia líquida de alta performance de abamectina
• Determinada em pólen pelo método descrito por Dionisio e Rath (2016);
• Sistema: Agilent Series 1200 HPLC, equipada com uma bomba quaternéria G1311A, um detector
de fluorescente G1321A (FLD), uma coluna G1316A e um auto-amostrador G1329A;
• A abamectina foi separada numa coluna LiChroCART® 55-4 Purospher® STAR RP-18 (4,0 mm x
50 mm, 3 µm) (Merck, Alemanha) a 30°C;
• A fase móvel foi 98:2 (v/v) metanol:água, a uma taxa de fluxo de 0,8 mL.min-1;
• Volume de injeção: 5 µL;
• Comprimentos de onda de excitação: 365nm;
• Comprimento de onda de emissão: 470 nm.
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• Desenvolvimento e validação de métodos

• GC-MS / MS     -        Método desenvolvido para a determinação de resíduos de pesticidas em

pólen de abelha     -      Validado com base na diretriz SANCO (SANCO / 10684/2009);

• Método do padrão interno        -        Lindano (200 ng.mL-1);

• A seletividade do método foi avaliada pela análise de seis diferentes amostras comerciais
de pólen, a fim de identificar qualquer interferência de co-extrativos derivados da
matriz da amostra;

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• Desenvolvimento e validação de métodos

• Efeitos da matriz: avaliados comparando as curvas de calibração obtidas utilizando os

extratos de pólen de abelha em branco fortificado (10.0, 25.0, 50.0, 100.0, 200.0 e 300.0
ng.mL-1) e as curvas de calibração obtidas nos mesmos níveis de concentração utilizando
solvente.

• Para cada nível de concentração, o efeito da matriz foi expresso como a porcentagem de
redução ou aumento do sinal no extrato, em relação ao padrão preparado no solvente;

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• Desenvolvimento e validação de métodos

• Os limites de detecção (LODs) e quantificação (LOQs) foram determinados pela análise de

amostras de pólen de abelha em branco fortificadas com concentrações decrescentes de
analito (300,0, 200,0, 100,0, 50,0, 25,0 e 10,0 ng.g-1), avaliando a precisão e exatidão do teste;
• O limite de detecção (LOD) foi igual à concentração detectável mínima de cada analito
presente na amostra fortificada, com base em uma relação sinal-ruído de 3;
• O limite de quantificação (LOQ) foi igual à concentração mínima de cada analito presente na
amostra enriquecida, com base em uma relação sinal-ruído de 10;
– Poderia ser quantificada pelo método analítico com precisão adequada (menor que 20%)
e precisão (recuperação entre 70 e 120%).

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• Análise Palinológica

• Dez amostras de pólen apícola coletadas na região de Ribeirão Preto (SP) foram
encaminhadas para análise palinológica no Centro de Pesquisa em Palinologia do Instituto de
Botânica do Departamento de Meio Ambiente de São Paulo;

• Estudo da constituição, estrutura e dispersão do pólen;

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•  Experimentos de sorção

• Cinética de sorção e isotermas de sorção foram determinadas para aldrina, malation e

abamectina.
– método descrito no guia da OCDE 106 para testes de adsorção / dessorção de produtos
químicos em amostras de solo (OECD, 2000).
• Os tempos para os pesticidas atingirem o equilíbrio foram determinados usando uma relação
pólen: água de 1:100 (w/v);
• O pólen foi extraído com 10 mL de acetonitrila;
• Os extratos foram filtrados (0,22 µm) e analisados por GCMS/MS para aldrina e malatião  e por
HPLC-FLD para abamectina.
28
• Experimentos de sorção

• A quantificação dos analitos no pólen de abelha foi realizada usando as curvas de calibração
matriciais, e as concentrações obtidas (em µg.g-1 de pólen) foram usadas para calcular as
quantidades de analito sorvido para cada tempo de equilíbrio (qt);
• O tempo de equilíbrio foi estimado pela plotagem da porcentagem de sorção em função do
tempo;
• Para as isotermas de sorção, suspensões contendo 100 mg de pólen e 10 mL de água foram
agitadas por 12 h em tubos Falcon (aldrin e abamectin) ou plástico (malathion) (50 mL):
– As amostras de pólen foram analisadas conforme descrito na Seção 2.10.

29
30
RESULTADOS E DISCUSSÃO

• Seleção dos pesticidas e desenvolvimento do método multiresidual

• Campo experimental da Embrapa em Jaguariúna, junto a relatórios e pesquisas

• Programa Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC), ANVISA, Programa de

Análises de Pesticidas Residuais em Alimentos

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RESULTADOS E DISCUSSÃO
• O objeto era estabilizar um método para concentrações abaixo de 100 ng/g

• Lindane foi usado como substituto interno nos dois métodos

• Quechers

• Procedimento de extração sólido-líquido simples usando acetonitrila

• A otimização do processo de preparação de amostras levou em consideração as eficiências

de extração e os efeitos de matriz
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MÉTODO QUECHERS

33
EFICIÊNCIA DE EXTRAÇÃO USANDO O QUECHERS E A EXTRAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDA COM
ACETONITRILA; QUANTIDADE DE AMOSTRA: 2G, CONCENTRAÇÃO DE PESTICIDAS: 200 NG/G

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EFEITO MATRIZ USANDO O QUECHES OU EXTRAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDA COM ACETONITRILA;
QUANTIDADE DA AMOSTRA: 2G

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36
• Experimentos de sorção

• Interações hidrofóbicas e diferentes Kow (Aldrin, Malathion e Abamectin)

• Depois de 20h, as porcentagens de sorção foram 90%, 62%, e 82%.

• A capacidade de sorção do pólen depende mais dos sítios ativos lipofílicos do que das
concentrações do analito em solução

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PARÂMETROS DE SORÇÃO DOS PESTICIDAS DE PÓLEN APÍCOLA

38
 Fig. 3. Produção de pólen de cada
colmeia.

De baixo para cima: março de 2012; maio de 2012; março de 2013; abril de 2013 e maio de 2013.
39
40
41
CONCLUSÃO
• Método de armadilha de iões GC-MS / MS desenvolvido ;
• Determinação de 26 pesticidas em pólen de abelha ;
• Os limites de detecção e quantificação variaram de 5,0 ng g1 a 50,0 ng g1 e de 10,0 ng g1
• a 100,0 ng g1 respectivamente;

• Obs : A etapa de preparação da amostra é importante:

• Para quantificar os baixos níveis de concentração com alta seletividade.

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CONCLUSÃO
• Abordagem QuEChERS foi mais apropriada para este propósito do que a extracção com
solvente com acetonitrilo.

• Estudos de sorção :
• Indicaram que os pesticidas poderiam ser sorvidos Pólen de abelha;
• Relações diretas entre as afinidades da pesticidas para o pólen de abelha e seus coeficientes
de partição octanol-águalog Kow);
• Observados para os três pesticidas avaliados(thion, abamectina e aldrin).

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 CONCLUSÃO
• Comportamento pode fornecer uma útil indicação dos pesticidas com maior potencial
encontrado em pólen de abelha;
• O pólen de abelha pode ser usado como indicador de contaminação ambiental;

• Níveis baixos ou indetectáveis de pesticidas nas abelhas coletadas nas amostras de pólen
durante o monitoramento ambiental poderiam ser devido:

• A redução da atividade agrícola durante a coleta;

• A localização privilegiada das colmeias na mata nativa. 44

CONCLUSÃO
• Análise das amostras de PUF utilizadas como controle de amostragem passiva:

• Não mostraram níveis detectáveis dos pesticidas investigados;

• sugerindo o não uso dessas substâncias no campo experimental e a região mais ampla;

• A ausência de transporte dos países vizinhos áreas.

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CONCLUSÃO
• Presença de pesticidas em 33% das amostras fornecidas por apicultores de Ribeirão Preto
confirmou:

• A eficiência do método analítico validado;

• Necessidade de monitorização da presença de resíduos de pesticidas.

• Obs: A concentração das medidas foram semelhantes às encontradas em outros estudos.

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 REFERÊCIAS
OLIVEIRA, Renata Cabrera de; QUEIROZ, Sonia Claudia do Nascimento; LUZ, Cynthia
Fernandes Pinto da Luz; PORTO, Rafael Silveira Porto; RATH, Susanne; Bee pollen as a
bioindicator of environmental pesticide contaminationBee pollen as a bioindicator of
environmental pesticide contamination Chemosphere ed. 163 p.525-534, 2016.

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