Departamento de Ciencias Químico Biológicas

Licenciatura en Químico Biólogo Clínico

Laboratorio de Microbiología General

Reporte de práctica #13 y #14:

Efecto de los Metales Pesados y
Control de microorganismos utilizando Luz UV

Equipo #4:
Barba Mejía Ramón Alexis
Fong Coronado Pedro Alejandro
Zazueta Chinchillas Austin Alejandro

cDra. Gricelda Nuñez Mejía

Lunes 11:00-13:00 horas

A 10 de noviembre de 2019. Hermosillo, Sonora, México.

 OBJETIVO
● Identificar técnicas para inhibir el crecimiento de Microorganismos.
● Identificar los metales pesados que causan mayor inhibición de
Microorganismos.

INTRODUCCIÓN
Diariamente empleamos productos químicos para controlar el crecimiento
microbiano, tanto en el ámbito doméstico como en el laboral. Un agente
antimicrobiano es un compuesto químico, natural o sintético, que mata o inhibe el
crecimiento de los microorganismos. Los agentes que matan microorganismos se
denominan agentes -​cida, ​un prefijo que indica el tipo de microorganismos que
matan. Así, tenemos agentes bactericidas, fungicidas y virucidas que matan
bacterias, hongos y virus, respectivamente. Los agentes que no matan, sino que
sólo inhiben el crecimiento se llaman agentes ​-estáticos, ​como por ejemplo, los
agentes bacteriostáticos, fungistáticos y virustáticos.
Otras técnicas para controlar el crecimiento bacteriano son los métodos físicos.
Entre ellos, se encuentra la esterilización por radiación; las microondas, la radiación
ultravioleta (UV), los rayos X, las radiaciones gamma y los electrones son tipos de
radiación que pueden reducir el crecimiento microbiano de forma eficaz si se aplican
en la dosis y durante el período de tiempo adecuados. Sin embargo, cada tipo de
radiación actúa de un modo específico. La radiación UV entre 220 y 300 nm de
longitud de onda tiene suficiente energía para causar modificaciones o incluso
roturas en el DNA, que en ocasiones provocan la alteración del DNA y la muerte del
organismo expuesto. Esta luz UV —casi visible— se utiliza para desinfectar
superficies, aire y otros materiales como el agua que no absorben la radiación UV.
(Madigan, 2009)
 MATERIALES Y REACTIVOS
EFECTO DE LOS METALES PESADOS Y DETERGENTES
Material
● Tubos de 18x150mm con tapón de rosca
● Hisopos estériles
● Pinzas de disección
● Discos de papel
Reactivo
● AgNO​3
● MgSO​4
● Cu​2​SO​4
● Cloruro de benzalconio al 1%
● Etanol
Cepas
● S. aureus
● E. coli

CONTROL DE MICROORGANISMOS UTILIZANDO LUZ ULTRAVIOLETA

Material
● Hisopos estériles
● Asa de punta redonda
● Lámpara de luz UV
Cepas
● S. aureus
● E. coli

PROCEDIMIENTO
EFECTO DE LOS METALES PESADOS Y DETERGENTES

1. Se dividió 2 placas petri de agar Nutritivo en cuatro secciones y se numeró

del 1 al 4
2. Se inocularon cepas de ​S. aureus ​y ​E. coli ​mediante el método de siembra
masiva. Una cepa en cada placa.
3. Se impregnó discos de papel filtro con los diferentes químicos a probar, en el
siguiente orden:
1) Cloruro de benzalconio al 1%
2) AgNO​3
3) Sulfato de cobre
4) Sulfato de magnesio
4. Se marcó cada caja de Petri con el nombre de la cepa y con la clave del
agente químico distribuyendolos separados y presionarlos ligeramente con la
punta de las pinzas de disección estériles.
5. Se incubó las cajas a 37°C por 24 horas.
6. Se midió en mm el diámetro del halo de inhibición del crecimiento (zona
transparente alrededor del disco de papel).

CONTROL DE MICROORGANISMOS UTILIZANDO LUZ ULTRAVIOLETA.

1. Se tomó caldos de cultivo de 24 horas de ​S. aureus ​y ​E. coli y se inoculó
completamente en 10 placas de agar Nutritivo (5 de ​S. aureus y 5 de ​E. coli)​
mediante el método de siembra masiva.
2. Se rotuló cada placa de la siguiente manera (según su tiempo de exposición
a luz UV):
1) Control (no se expone)
2) 30 segundos
3) 2 minutos
4) 5 minutos
5) 10 minutos
3. Se llevaron a campana y se retiró la tapa de la placa Petri durante la
exposición a la luz UV según el tiempo indicado.
4. Se incubaron todas las placas a 37ºC durante 24-48 horas
5. Se anotó las variaciones que se producen en el crecimiento de los cultivos,
según el tiempo de exposición a la fuente de luz UV.
 RESULTADOS
EFECTO DE LOS METALES PESADOS Y DETERGENTES EN SOLUCIÓN
SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO.

Al término de la incubación, se observó la formación de un halo alrededor de

determinados discos, como se ve en la siguiente imagen para el cultivo de ​E. coli:​

IMAGEN 1. Efecto de inhibición del sulfato de cobre en ​E. coli

Se midieron los halos de los discos que lo presentaban y dichos resultados se

resumen en el siguiente recuadro:

Cloruro de Sulfato de
Microorganismo benzalconio al 1% Nitrato de plata Sulfato de cobre magnesio

E. Coli Sin halo 3 mm 6.5 mm Sin halo

S. Aureus 5.5 mm 1 mm 3 mm Sin halo

TABLA 1. Efecto de metales en los microorganismos

 CONTROL DE MICROORGANISMOS UTILIZANDO LUZ ULTRAVIOLETA

Al término de la incubación, se observó un decrecimiento en la proliferación de las

colonias según fue mayor el tiempo de exposición a la luz ultravioleta. Los
resultados se resumen en el siguiente recuadro:

Microorganismo Control 30 s 2 min 5 min 10 min

E. Coli Crecimiento Crecimien Poco Nulo Nulo

total to medio crecimiento crecimiento crecimiento
(casi nada)

S. Aureus Crecimiento Crecimien Poco Nulo Nulo

total to medio crecimiento crecimiento crecimiento
(casi nada)

TABLA 2. Resultados del efecto de Luz UV sobre crecimiento bacteriano

DISCUSIÓN.
EFECTO DE LOS METALES PESADOS Y DETERGENTES
Primeramente, el cloruro de benzalconio es un líquido
descolorido y también conocido BZK, BKC, BAC, entre
otros. Es una sal orgánica derivada de un compuesto
amonio cuaternario (chembasket, s/f). Los cuatro
átomos de hidrógeno del ion amonio están
reemplazados por una cadena alquílica larga (grupo
hidrofóbico), un grupo aromático alquil sustituido y dos metilos. Es conocida su
propiedad de antiséptico y desinfectante. ​Su espectro antimicrobiano es muy
amplio e incluye bacterias gram positivas​, hongos (​Epidermophyton,
Trichophyton y​ ​Candida albicans)​ y protozoarios (​Entamoeba histolytica ​y
Trichomonas vaginalis)​ . No actúa contra endosporas, virus y ​algunas bacterias
gramnegativas (​Pseudomonas, Mycobacterium; ​ ntéricos
e gramnegativos​).
(Access Medicina, s/f). Esto último coincide con los resultados obtenidos en la
práctica; las colonias de ​Escherichia coli no se vieron afectadas por la acción de
este compuesto ya que corresponde a la familia de las Enterobacterias. Siendo este
uno de los tipos de bacterias gramnegativas que no se ven afectadas por el cloruro
de benzalconio. En cambio, en las colonias de cocos grampositivos ​S. aureus se
formó halo de inhibición, lo que corresponde con la bibliografía.
El nitrato de plata tuvo un efecto de inhibición en las colonias. Generalmente, se
considera que la plata iónica interactúa con múltiples sitios “​target” (objetivos)
microbianos. Su actividad antimicrobiana resulta de la combinación y alteración de
proteínas microbianas, con eventual disrupción estructural y metabólica. Para la
plata iónica, uno de los principales sitios “​target” ​se encuentra a nivel de membrana
de la célula bacteriana, donde puede inhibir la fuerza motriz de protones y el
transporte de electrones de la cadena respiratoria, lo que puede afectar la
permeabilidad de la membrana resultando en la muerte de la célula bacteriana.
(Cardoso, 2016)
El tercer y último compuesto que desarrolló la inhibición de colonias fue el sulfato de
cobre. La actividad antimicrobiana de iones de cobre, específicamente Cu​+2 es
reconocida en la literatura desde 1993. Actúa como un agente bacteriostático en
concentraciones de 25 - 150 ​µM o bactericida en concentraciones superiores. El ion
Cu​+2 interviene directamente: 1) inhibiendo la síntesis de proteínas; 2) alterando la
membrana celular del M.O. causando peroxidación, ya que induce daño oxidativo de
lípidos que son claves en el intercambio de moléculas del medio intra y extracelular;
3) alterando o destruyendo los ácidos nucléicos de bacterias y virus. (Febré et al,
2016)
En cuanto al sulfato de magnesio, este pertenece a un grupo de sales minerales que
son la fuente de aniones y de cationes para la célula que contribuyen para su
desarrollo. El ion magnesio (Mg​+2​) estabiliza ribosomas, membranas y ácidos
nucléicos. También actúa como factor en muchas reacciones, como por ejemplo, la
transferencia de grupos fosfato. (UGR, s/f)
 CONTROL DE MICROORGANISMOS UTILIZANDO LUZ ULTRAVIOLETA
Un importante conjunto de investigaciones científicas ha demostrado la capacidad
de la luz UV para inactivar una extensa lista de bacterias patógenas, virus y
protozoos. Los microorganismos se desactivan por medio de la luz UV como
resultado del daño a los ácidos nucleicos. El ADN y el ARN celular absorben la
energía alta asociada con la energía UV de longitud de onda corta, principalmente a
254 nm. Esta absorción de energía UV forma nuevos enlaces entre nucleótidos
adyacentes creando dobles enlaces o dímeros.
La dimerización de las moléculas adyacentes, especialmente de las timinas,
constituye el daño fotoquímico más frecuente. La formación de numerosos dímeros
de timina en el ADN de bacterias y virus impide la replicación y la capacidad de
infectar (TROJAN UV, s/f). Entonces, a mayor tiempo de exposición mayor será la
cantidad de los residuos del ADN y ARN que absorben la luz UV, desembocando en
la muerte del microorganismo.

CONCLUSIÓN
El cloruro de benzalconio tiene un efecto inhibidor en ​S. aureus y no tiene efecto en
E. coli;​ el nitrato de plata tiene un efecto letal en ​E. coli ​y ​S. aureus por modificación
de las proteínas bacterianas; sulfato de cobre tiene efecto inhibidor (bacteriostático)
tanto en ​E. coli ​como en ​S. aureus;​ sulfato de magnesio proporciona el ion
magnesio que tiene un efecto promotor en la proliferación de las colonias.
A mayor exposición de luz UV, mayor cantidad de residuos del material genético de
E. coli ​y ​S. aureus se verá afectado formando dímeros, desembocando en la muerte
de la bacteria.

CUESTIONARIO
EFECTO DE LOS METALES PESADOS Y DETERGENTES
1) Todos los agentes químicos utilizados en la práctica se disolvieron en
agua ¿ Por qué? ​Se hace para generar el el efecto oligodinámico. Este
efecto antiséptico en todos los metales es causa de la formación de iones de
distintos metales, causa de su presencia en agua, para ser transportados
 posteriormente a la célula bacteriana, por la misma agua, y fijarse a nivel de
proteínas o ADN, causando la muerte o inhibición de la bacteria.
2) Si los agentes químicos se hubieran disuelto en etanol ¿Se habrían
obtenido resultados diferentes? Explique. Aunque el etanol es un
compuesto polar, su diferente polaridad, comparado con el agua, causaría un
menor efecto de solvatación del metal, por consecuente habría un menor
número de iones disueltos que pudieran causar un efecto antiséptico en la
bacteria, el efecto oligodinámico sería menor.
3) La concentración del nitrato de plata utilizada en esta práctica es más
baja que la de los otros agentes. Explique la razón. ​Debido a su
parámetro de toxicidad LD50 es 1.173 mg/kg; tiene una alta toxicidad a
concentraciones muy bajas.

CONTROL DE MICROORGANISMOS UTILIZANDO LUZ ULTRAVIOLETA

1. Definir los siguientes términos:
Esterilización​: Eliminación de todas las bacterias y otros organismos de un
objeto.
Desinfectantes: Productos químicos que matan microorganismos, aunque
no necesariamente endosporas, y se usan en objetos inanimados. Por
ejemplo, etanol y detergentes catiónicos.
Antiséptico: ​Agentes químicos que matan o inhiben el crecimiento de
microorganismos, y cuya toxicidad es lo bastante baja como para poder ser
aplicados a tejidos vivos.
Bactericida: ​Un efecto bactericida es aquel que produce la muerte a una
bacteria y está provocado por alguna sustancia.
Bacteriostático: ​Un efecto bacteriostático es aquel que aunque no produce
la muerte a una bacteria, impide su reproducción; la bacteria envejece y
muere.
 REFERENCIAS
● Madigan, M. T., J. M. Martinko & J. Parker, 2003. Brock. Biología de los
microorganismos. 10ª Ed. Prentice Hall Iberia. España. pp. 14, 866, 869,
875-876.
● Baccaglioni Fabio, 2017. Esta cuchara tal vez no esté tan sucia: El efecto
oligodinámico. Recuperado el 13 de noviembre de 2019, desde:
https://www.fabio.com.ar/7316
● Iañez Enrique, 1998. Acción de los agentes físicos sobre las bacterias.
Recuperado el 13 de noviembre de 2019, de Universidad Nacional del
Nordeste Sitio web:
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/18_micro.htm
● Anónimo, s/f. Benzalconio: Antisépticos y desinfectantes. Desde Access
Medicina. Recuperado el 13 de noviembre de 2019, desde:
https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1552&sectionid
=90367593
● Cardoso Patricia, 2016. Nanopartículas de plata: obtención, utilización como
antimicrobiano e impacto en el área de la salud. De Revista Pediatría.
Recuperado el 13 de noviembre de 2019, desde:
http://revistapediatria.com.ar/wp-content/uploads/2016/04/260-Nanoparti%CC
%81culas-de-plata.pdf
● Febré Naldy, Silva Viviana, Báez Andrea, Palza Humberto, Delgado
Katherine, Aburto Isabel & Silva Victor, 2016. Comportamiento antibacteriano
de partículas de cobre frente a microorganismos obtenidos de úlceras
crónicas infectadas y su relación con la resistencia a antimicrobianos de uso
común. De Revista Médica de Chile. Recuperado el 13 de noviembre de
2019, desde:
https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-9887201600
1200003
● Anónimo, s/f. Nutrición microbiana. De Universidad de Granada. Recuperado
el 13 de noviembre de 2019, desde:
https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/11nutrientes.htm
● Anónimo, s/f. Introducción a la desinfección por UV. Desde TROJAN UV.
Recuperado el 13 de noviembre de 2019, desde:
https://www.trojanuv.com/es/uv-basics
● Carl Roth, 2018. Ficha de datos de seguridad: Nitrato de plata. Recuperado el
13 de noviembre de 2019, desde:
https://www.carlroth.com/downloads/sdb/es/9/SDB_9370_ES_ES.pdf