QUÍMICA BIOLÓGICA

Trabajo Práctico Nº3: Metabolismo de carbohidratos

Catabolismo de la glucosa en levaduras

Introducción
La glucosa ocupa una posición central en el metabolismo de plantas,
animales y algunos microorganismos. Los destinos principales de la glucosa son
los siguientes: síntesis de heteropolisacáridos destinados al espacio extracelular
(animales y plantas) o como constituyentes de paredes celulares de
microorganismos, almacenamiento bajo la forma de homopolisacáridos y
sacarosa, oxidación por la vía de las pentosas fosfato para obtener ribosa 5-
fosfato utilizada en la síntesis de nucleótidos y NADPH para biosíntesis reductiva
y oxidación a un compuesto de tres carbonos, piruvato, vía glucólisis para
proporcionar ATP e intermediarios metabólicos. Esta última es la principal vía
catabólica de la glucosa en la mayoría de los organismos y tejidos, siendo la
velocidad con que es consumida dependiente del nivel energético existente en
la célula.
La mayoría de las levaduras utilizan azúcares como principales fuentes
de energía y carbono para su metabolismo a través de la vía glucolítica. Los
azúcares no pueden atravesar libremente las membranas lipídicas, por lo cual el
primer paso del catabolismo de estos carbohidratos tiene como objetivo el
transporte de tales compuestos a través de la membrana plasmática. Este
transporte es catalizado por sistemas específicos denominados permeasas.
Algunos disacáridos no son transportados al interior de la célula por permeasas,
sino que son hidrolizados en espacio periplásmico. La capacidad de hidrolizar
tales compuestos depende de la especie de la levadura y de la naturaleza del
azúcar.
En anaerobiosis la glucosa que ingresa a la vía glucolítica permite obtener
energía en estos microorganismos mediante la fermentación alcohólica, por
acción sucesiva sobre el piruvato de la piruvato decarboxilasa y la alcohol
deshidrogenasa. En aerobiosis, parte del piruvato es oxidado completamente a
CO2 mediante la respiración celular. Sin embargo, una proporción de la glucosa
que depende de la especie considerada sigue siendo metabolizada mediante
fermentación láctica, aun en aerobiosis.
Por razones históricas, Saccharomyces cerevisiae, ha dominado el
panorama científico y ha sido considerada sinónimo de levadura. Sin embargo,
S. cerevisiae es una entre las casi 800 especies descriptas. Por otro lado existen
las denominadas levaduras no convencionales o no Saccharomyces cerevisiae.
Un ejemplo de interés lo constituye Pichia pastoris. Esta especie es considerada
un fermentador débil, debido a que durante su crecimiento aerobio una
proporción menor del 30% de glucosa es fermentada, presentado así una
velocidad de respiración muy alta, comprendida entre 150-250 μmoles de O2·g
células-1.min-1. Esta propiedad permite cultivar a estas levaduras a elevadas
densidades celulares, pues no hay formación significativa de subproductos del
metabolismo fermentativo que puedan inhibir la proliferación celular, tales como
el etanol, y hace que sea un microorganismo muy utilizado en biotecnología, por
ejemplo para la producción a gran escala de proteínas recombinantes.

Acción de distintos efectores sobre el consumo de glucosa

Podemos considerar que si un efector modifica algunos de los pasos o
cambia el porcentaje de azúcar catabolizada a favor de la respiración o la
fermentación, el balance energético de la célula podría cambiar y en
consecuencia modificarse la velocidad a la cual es consumida la glucosa.
En primer lugar, el aporte de O2 a un cultivo de levaduras creciendo en
anaerobiosis, producirá una disminución de la velocidad de consumo de la
glucosa, proceso que se denomina efecto Pasteur, debido a la inhibición
principalmente de la fosfofructoquinasa por la eficiente producción de ATP que
ocurre durante la respiración en comparación con la fermentación. Cuando, por
otro lado, el cultivo es tratado con un inhibidor de la citocromo oxidasa, por
ejemplo cianuro o azida, la velocidad de consumo en algunas levaduras se
incrementa nuevamente por incrementarse el proceso fermentativo, como ocurre
en S. cerevisiae. Por otro lado, otras levaduras como Pichia pastoris, presentan
una vía respiratoria alternativa y son insensibles a la inhibición por cianuro. En
efecto, esta respiración es mediada por una oxidasa alternativa que acepta
electrones de la ubiquinona y los transfiere al oxígeno. Sin embargo, este paso
no es acompañado por síntesis de ATP.
Otra particularidad de algunas levaduras, entre las que se encuentra S.
cerevisiae, es la presencia del efecto Crabtree. Este consiste en el cambio de
metabolismo mixto fermentativo-respiratorio a puramente fermentativo cuando la
concentración de glucosa externa supera 0.8 mM en presencia de O2. Se piensa
que los elevados niveles de glucosa exceden la capacidad de reacción de la
piruvato deshidrogenasa, generando un sobreflujo sobre la piruvato
decarboxilasa y dirigiendo el metabolismo hacia la producción de etanol. Otra
posible explicación es la represión de genes que codifican para enzimas
respiratorias por glucosa. La mayoría de las especies de levadura, entre las que
se encuentra Pichia pastoris, no presentan este efecto y por lo tanto la
respiración no es afectada por los niveles de glucosa.
En ausencia de anión fosfato la glucólisis se inhibe dado que este es
necesario para la reacción de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. Sin
embargo, en ausencia del mismo la glucólisis puede proseguir si en el medio
está presente el anión arseniato. Como este es química y estructuralmente
semejante al fosfato, la mencionada enzima puede tomar al arseniato como parte
de su reacción específica. Los compuestos orgánicos de arsénico son menos
estables que sus análogos de fósforo. Por ejemplo, los acil-arseniatos se
descomponen rápidamente por hidrólisis en ausencia de catalizadores. Por lo
tanto, el acil-arseniato que se forma en lugar del 1,3-bisfosfoglicerato pasará a
3-fosfoglicerato en ausencia de la fosfoglicerato quinasa y sin producción de
ATP. Ello significa que el rendimiento energético de la glucólisis será inferior en
presencia de arseniato por competencia con el fosfato y disminución en la
producción de ATP.
El ion fluoruro inhibe tanto la fermentación como la respiración. Esto es
debido a la inhibición de la enolasa, enzima glucolítica que cataliza la
deshidratación reversible de 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato. La enzima
contiene dos subunidades, cada una de las cuales presenta dos Mg2+.Uno
induce un cambio conformacional en la enzima y el otro se une al complejo
enzima sustrato induciendo la catálisis. El complejo enzima inhibidor se presenta
según la estequiometría enolasa-Mg2F2Pi.

Objetivos
Determinar la velocidad de consumo de glucosa en cultivos de
Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris en distintas condiciones
metabólicas.

Materiales
Glucosa 200 mM
Fosfato de Sodio 500 mM, pH 5,5
Fluoruro de Sodio 200 mM
Buffer MES-NaOH 25 mM, pH 5,5
Azida de Sodio 50 mM
Reactivo comercial para dosar glucosa (Wiener)
Cultivos de S.cerevisiae y de P. pastoris.
Baño de 30 ºC
Microcentrífuga
Pipetas automáticas
Baño de hielo
Gradillas
Material descartable
 Métodos
Preparación de los cultivos de las levaduras
Las levaduras (mantenidas a -80 °C) fueron crecidas 16 horas a 30 °C y
180 rpm en 5 mL de medio YPD (10 g.L-1 extracto levadura, 2 g.L-1 peptona de
caseína y 2 g.L-1 glucosa). A continuación, las células fueron recuperadas por
centrifugación y resuspendidas en un Erlenmeyer conteniendo 250 mL de medio
YPD. Luego de 24 h de crecimiento a 30 °C, se adicionaron 80 mL de glicerol 80
% v/v, y el cultivo fue fraccionado y almacenado a -80 °C hasta su uso.

Lavado de las levaduras

Para eliminar los contaminantes presentes en el medio de cultivo que
puedan interferir en el análisis (como glucosa residual y glicerol), se procederá a
la centrifugación del cultivo de levaduras y a su resuspensión en buffer. Por cada
grupo de trabajo, se centrifugarán dos eppendorfs de P. pastoris y uno de S.
serevisiae (conteniendo cada uno 1 mL del cultivo de levaduras) durante 5 min
a 5000 rpm, se descartarán los sobrenadantes y cada pellet será resuspendido
en 1 mL de buffer MES pH 5,5. Posteriormente, se mezclarán ambas muestras
en un tubo eppendorf (para el caso de Pichia) y se realizará un segundo lavado.
Se pesarán los pellets en un tubo previamente tarado y se llevarán a 0.2 ml
finales con buffer MES. Dejar en hielo.

Mezcla de incubación
Se ensayará el consumo de glucosa por S.cerevisiae y P. pastoris bajo
cuatro condiciones diferentes: basales, en presencia de fluoruro de sodio y en
presencia de dos concentraciones distintas de azida sódica. Los volúmenes
están expresados en microlitros.

(S ó P) (S ó P) F (S ó P) A (S ó P) A+

Glucosa 0.2 M 50 50 50 50

Fosfato 0.5 M 20 20 20 20

NaF 0.2 M __________ __________ _________ __________

NaN3 0.05 M __________ __________ 20 60

Levaduras (S ó P) 200 200 200 200

MES 0.25 M, pH 5.5 730 530 710 670

 Cada tubo será colocado en hielo, y en cada uno se colocarán las
soluciones descriptas en la tabla, agregando por último las levaduras. Las
muestras se homogeneizarán y de cada uno de los tubos se tomarán alícuotas
de 150 l y se colocarán en eppendorf debidamente rotulados para cada
condición para los distintos tiempos de incubación. Por ejemplo, para
Saccharomyces incubados en presencia de fluoruro, los tubos quedarán
rotulados de la siguiente manera: SF0, SF7.5, SF15, SF30 y SF60. Posteriormente,
estos tubos se colocarán en un baño a 30 °C, y luego de 7.5, 15, 30 y 60 minutos
de incubación, se tomarán alícuotas de 150 l de cada uno de los tubos y se
centrifugarán durante 1 minuto a máxima velocidad y se separarán 50 l de los
sobrenadantes para ser procesados a posteriori. El tubo correspondiente a
tiempo cero se procesará de la misma manera salvo que no se colocará en el
baño de 30 ºC.

Cuantificación de la glucosa presente mediante el método de la glucosa

oxidasa - peroxidasa
Para cuantificar la glucosa remanente en los sobrenadantes, se rotularán
nuevos tubos eppendorf y se añadirá a cada uno de ellos 990 l de reactivo más
10 l de sobrenadante. Se procesará un blanco y 10 l de estándar cuya
concentración es de 5.56 mM. Los tubos se incubarán durante 20 minutos a 30
°C y luego se leerá la absorbancia a 505 nm contra el blanco de reacción. El
fundamento de la reacción es el siguiente:

GOD

glucosa + O2 + H2O ácido glucónico + H2O2

POD

2 H2O2 + 4-AF + 4-OH-BZ quinonimina roja

4-AF: 4-aminofenazona
4-OH-BZ: 4-hidroxibenzoato
GOD: glucosa oxidasa
POD: peroxidasa
 Análisis de los resultados
Transformar las absorbancias medidas a 505 nm en moles de glucosa y
graficar los moles de glucosa remanentes en función del tiempo, para cada
condición y especie de levadura. Mostrar en un gráfico para Saccharomyces y
en otro para Pichia las curvas para las cuatro condiciones elegidas. Expresar los
resultados en moles de glucosa consumida. min-1. g-1 de levaduras. Explicar los
resultados obtenidos en cada uno de los casos en base a sus conocimientos
sobre el metabolismo de la glucosa en estos microorganismos.

Cuestionario de orientación
1) De acuerdo a la teoría, en cuál de todas las condiciones se esperaría observar
la mayor velocidad de consumo de glucosa en cada especie de levadura con que
se trabajó? Fundamentar ¿Coincide con los resultados obtenidos?
2) ¿Qué condición produjo la menor velocidad de consumo? ¿Cuál sería el
fundamento teórico del resultado obtenido?
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3) Se prepararon varios tubos de ensayo que contenían 1 ml de levaduras (2.10
células/ml) + 1 ml de una solución reguladora + 3 ml de una solución de glucosa
5 mM. A tiempo 0 se pusieron a incubar a 30°C con los agregados (1 ml en total)
que se detallan en la columna A de la tabla y se tomó una alícuota de 1 ml de la
mezcla, se centrifugó y a 0,5 ml de sobrenadante se lo hizo reaccionar por el
método de la glucosa oxidasa, obteniéndose los valores de concentración de
glucosa que se indican en la columna B de la tabla. A los 30 min. se repitió la
operación (los datos obtenidos figuran en la columna C).
Una con flechas los datos de la columna C a los de la columna A según lo
esperado para el consumo de azúcar en cada condición. Determine en cada caso
la velocidad de consumo de glucosa en µmol/min.

A B C
AGUA 2,5 mM
Pi 50 mM 2,5 mM
Pi + NaN3 1 mM
Pi + NaF 2.5 mM 2,5 mM
ARSENIATO 50 mM 0,32 mM
Pi + ARSENIATO 0,625 mM
ARSENIATO + NaN3 1,5 mM
SACAROSA + Pi 1,5 mM
SACAROSA 0,90 mM
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