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BIG DIA 13.

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Última prova dia 20.11 valendo 50 pontos e + resumo: RNAr e RNAt – vale 10 pontos, manuscrito
ou digitado e última aula pratica contendo trabalho.
27.11 seminário 1 e 2 e trabalho valendo 20
04.12 seminários e trabalho valendo 20
Formação do CAP,
11.12 seminários
cauda poli A e sobre o
12.12 recuperação para quem tiver média menor que 50 splicing – PROVA 30
PONTOS
PROCESSAMENTO DE mRNA EM EUCARIOTOS
Existem 3 tipos principais de RNAs: tRNA, mRNA e rRNA
Para processar RNAm em eucariotos nós precisamos utilizar vários complexos chamados de
ribonucleoproteicos (RNP), formado por várias enzimas, riboenzimas...
Esses RNPs vão processar o RNA de várias formas:
 Eles podem adicionar coisas ao RNA: podem adicionar ao RNA 2 coisas, na extremidade 5’ a
adição do CAP (nucleotídeo tri fosfatado) e na extremidade 3’ a calda poli A (poli adenina –
aproximadamente 200 adeninas).
 Remover: os introns pelo processo chamado splicing. E existem vários splicing:
 O constitutivo: que é o tradicional, onde retiramos os instros e unimos os exons.
 O alternativo: pode tirar o intron inteiro, ou metade de um intron, ou ainda retirar até um exon
e essa reorganização não retirando necessariamente apenas os introns, aumenta a
variabilidade genética.
 E o auto: não preciso do complexo RNP, pois o próprio DNA se cliva.
 Ou ainda fazer uma modificação de nucleotídeos: geralmente se refere a ligação fosfodiester
entre os nucleotídeos, que normalmente é 3’  5’ porem aqui vai acontecer entre a hidroxila do
carbono 2’ do açúcar e o fosfato 5’, criando uma ligação incomum que estimula o splicing
Adição do CAP

 CAP é adicionado na extremidade 5’.


 CAP gaste ATP (energia) para acontecer
 Ele armazena essa energia na forma de 3 fosfatos na molécula de RNA
 Porque uma molécula de RNA precisa de energia, ou seja, porque ela precisa tanto da adição
do CAP? O CAP é a primeira etapa do processamento de RNAm, ou seja, é a primeira coisa
que acontece juntamente com a transcrição. E porque ele precisa acontecer? O CAP precisa
de energia porque ele esta relacionado com a regulação desse RNAm. Então ele vai regular o
que? O fim da transcrição, a produção da calda poli A, o splicing, o transporte do RNAm para o
citoplasma, a tradução, ou seja, todas as etapas vindo após ele, e além disso, ele faz a proteção
do RNAm de enzimas que degradam RNA através das extremidades 5’ que são as
exonucleases 5’.
 RNAm sem CAP não vai para a tradução e geralmente é degradado
 Para a adição do CAP, há duas etapas:
1. Quando se inicia a transcrição e coloca-se o primeiro nucleotídeo que é o da extremidade 5’,
ele deve ter 3 fosfatos, mas como naturalmente ele tem apenas 1 fosfato, ele reage com uma
molécula de ATP ou um GTP e forma um nucleotídeo trifosfatado e mais uma molécula de GMP
ou AMP. Os únicos nucleotídeos que fazem isso (podem reagir com ATP ou GTP e serem
trifosfatados) são os C, G ou A. Então esse nucleotídeo trifosfatado vai reagir com o segundo
nucleotídeo, que é chamado de guanidilato/guanilato. Esse guanilato tem uma guanina, um
açúcar e um fosfato. Só que a ligação dele na molécula é diferente, não é uma ligação
fosfodiester (fosfato-açucar), e sim vai ligar o seu fosfato ao nucleotídeo trifosfatado no 2 fosfato,
então sobra o primeiro fosfato, liberando energia (1 fosfato) e formando o CAP (que nada mais
é que um nucleotídeo trifosfatado com uma guanina). Quem quebra esse fosfato é uma enzima,
a fosfo-hidrolase e quem adiciona a guanilase é guanilil-transferase.
2. É a adição de um CH3 (metil) na posição 7 para diferenciar essa guanina de uma guanina
normal, para as enzimas não reconhece-las. Quem faz isso é a guanina-7-metiltransferase.

Essas duas enzimas fazem parte do complexo de RNA pol II e por isso a adição do CAP acontece
rapidamente logo após a transcrição.

Adição da calda poli A


 Acontece após a adição de CAP, mas acontece no final da transcrição
 Também acontece junto com o complexo da RNA pol II, pois ela que tem a enzima que adiciona
essa calda poli A na extremidade 3’
 Para adicionar essa calda poli A, tem que acontecer alguma coisa nesse DNA para sinalizar
que esta na hora de adicionar a cauda poli A.
 A primeira coisa que acontece no final da transcrição, é que como todas as ligações entre os
nucleotídeos são da forma TRANS, entre os últimos nucleotídeos a RNA pol coloca apenas um
nucleotídeo na conformação CIS, e isso causa uma curva no RNA, que sinaliza a adição de
calda poli A, que é o fim da transcrição. Ou seja, a RNA pol II que estava fazendo a transcrição,
encontra essa conformação CIS e ativa o complexo proteico da RNA pol II. E então a enzima
poli-A polimerase adiciona as adeninas formando a calda poli A, só que ela não tem freio, e
nunca para de adicionar adenina, e ela só para quando a proteína PAPB (poli A polimerase
blind) sinaliza (deixa adicionar no máximo 200 adeninas). Então os fatores de clivagem (CPSF,
CstF) se ligam em sequencias especificas e vão ajudar tanto na adição da calda poli A, quanto
na clivagem do RNA na próxima etapa que é o splicing. Esses fatores de clivagem tem locais
próprios para encaixe. Quando tiver a sequência no DNA AUAAAA se liga o fator de clivagem
CPSF (que é de clivagem pois vai auxiliar no splicing, mas ele também estimula a enzima poli-
A-polimerase). E quando tiver uma região com alta % de U e G, ele é reconhecido pelo CstF
(auxilia mais no splicing).
 Funções da calda poli A:
 Não é transcrita e nem traduzida
 Tornar o RNAm apto a tradução, pois sem cauda poli A, não ocorre tradução, pois os
ribossomos reconhecem essa calda poli-A
 Protege a extremidade 3’ das exonucleases 3’. Mas aqui não precisa metilar (CH3), porque
a enzima reconhece a adenina, mas ela não vai clivar todas as 200 adeninas, então se eu
perder algumas A para as exonucleases, não farão falta.
 Controle da localização do RNAm. A calda poli A por ser grande só deixa que esse RNA
saia do núcleo e vá para o citoplasma quando ele tiver sem os intros, que é retirado no
splicing.

Splicing – PROVA EXPLICAR OS PROCESSOS E OS TIPOS DE SPLICING


 Começa com o hnRNA: é o RNA nuclear heterogêneo, que é o RNA bruto, que acabou de ser
transcrito (tem exons, introns, região CAP e poli A e tudo).
 Splicing é como se fosse uma lapidação: onde eu pego um RNA bruto que não pode ser
traduzido e lapido ele até que possa ser transportado e traduzido no citoplasma. E para isso
vamos precisar de algumas enzimas e complexos
 Para lapidar esse RNA, eu tenho que retirar os introns e unir os exons. E há dois tipos de introns
eu eucariotos, o U2 e U12. E disso eu tenho que saber que todos os introns tem que ter uma
região de ramificação (que é uma sequência de nucleotídeos que permite a ligação de
proteínas do splicing e várias proteínas de splicing é o mesmo que spliceossomo).

 Ambos introns U2 e U12 tem regiões de ramificação e o que diferencia ambos é que U2 tem
uma região formada apenas por BN com anéis de pirimidina (Py). E essa região formada por
anéis pirimídicos também permite ligação de proteínas de splicing e facilita a retirada desse
intron. Ou seja, é mais fácil retirar um U2, do que um U12 que não tem Py.
 O splicing é diferente para cada U. Só que na prova vai só o U2

Retirada de U2
 Esse tipo de intron pode estar localizado no DNA de 3 formas, intron entre dois códons (intron
fase 0), dentro de um códon entre o primeiro e segundo nucleotídeos (intron fase 1), intron
dentro de um códon entre o segundo e terceiro nucleotídeos (intron fase 2).

 Quais proteínas que formam o splicessomo? As proteínas U1, U2, U3, U4, U5, U6, U7, U8, U9,
U10, U11 e U12. Só que nem sempre todas elas estão presentes, e variam para cada eucarioto.
 Humanos tem a U1,2,4,5,6,8,11 e 12.
 Tem nome com U pois são proteínas dos introns que se chamam U.
 O a retirada do intron do DNA depende de 2 etapas, ou seja, acontece em 2 reações:
1. Para a primeira etapa acontecer eu tenho que formar o splicessomo. E como? As proteínas
desse splicessomo podem ser chamadas de snRNP. Pois são proteínas pequenas que estão
no núcleo. Então o primeiro que se liga é o snRNP U1 e se liga na região 5’ do intron, formando
o complexo E, um complexo que não gasta energia. Quando U1 se liga, ele gera um local de
ligação para U2, que se liga numa região rica em anéis pirimídicos. Esse ligação de U2 ao
RNA gasta energia e forma o complexo A. Então isso estimula a formação do splicessomo
inativo (complexo B inativo), atraindo muitas outras proteínas, por ex. a U4, U5, U6, etc. para
tornar esse complexo ativo é necessário acontecer 2 coisas: liberação do U1 (só servia para
atrair as outras proteínas e agora inativa o complexo), e ligação do U6 no local onde estava
U1, formando o complexo B ativo, que tem ação catalítica, ou seja, ação para retirar o intron
do local.

Como intron é ligado nas duas extremidades aos exons por meio das ligações fosfodiester entre os
nucleotídeos, a primeira quebra acontece quando se forma o complexo B ativo, na região 5’ do
intron. Porém, antes de acontecer a primeira quebra, troca-se a ligação 5’  3’ entre o intron e entre
o exon para 5’  2’, que é uma ligação anormal/incomum que gera uma “dobra” no RNA que é
chamado de laço. Ao formar o laço no RNA a extremidade 3’ do intron fica ao lado da extremidade
5’ do intron.
2. Clivo a extremidade 3’ do intron que esta 5’ com exon e permite uma ligação da extremidade 5’
do exon com a hidroxila 3’ do exon anteriormente liberado.
 U12 é igual, o que muda é que troca os snRNP por outros.

O splicing tem que ser finamente REGULADO. Para evitar 2 erros comuns:
1. Exon skipping: um erro onde invés de tirar somente introns, retiro sequencias de exons
erroneamente
2. Sitio de splicing críptico: o corte é errado. Eu deixo um pedaço de intron, tiro um pedaço de
exon, etc.
OBS: qualquer um desses erros podem gerar proteínas anômalas e principalmente doenças
genéticas, inclusive câncer.
Então para evitar anomalias, nós vamos ter algumas PROTEÍNAS QUE VÃO REGULAR:
A. Proteínas SR: essa proteína SR vai garantir que o splicing aconteça no lugar correto, como?
Elas se ligam nas extremidades dos exons onde se ligam os introns, para evitar que ocorra
cortes desses exons.
B. Reforçadores de splicing intrônicos (ISEs): isso é geralmente para quando eu tenho exons
pequenos, que não tem essas extremidades com SR limitadas, então esses ISEs se ligam no
lugar delas, para que não sejam degradados.
C. Silenciadores de splicing exônicos: caso ocorra algum erro em algum splicing, esse
silenciador faz com que esse RNA seja degradado.
TIPOS DE SPLICING:
 Constitutivo: já visto antes: U12 e U2

 Alternativo:
 São os chamados de brutos (hnRNAs)
 Quando tenho o splicing alternativo, serve para que um RNA bruto possa formar muitos
tipos de RNAs maduros, e assim formando múltiplas proteínas.
 Podem acontecer 4 tipos, que só serve para ver porque gera mais de um RNA maduro.
Exemplos:
A. No caso A, eu posso por exemplo tirar um intron e gerar esse RNA maduro, com 2 genes
(vermelho e bege) ou eu posso deixar uma partezinha do intron da extremiadade 5’ junto com
esses 2 genes.
B. Mesmo processo anterior, só que deixei um pedaço do intron na extremidade 3’.
C. Caso teja um exon facultativo, eu posso excluir ou incluir ele.
D. Deixar o intron inteiro no RNA maduro.

 Esse é um exemplo de um gene que codifica hormônios e proteínas relacionados a tireoide.


Esse gene é formado por vários exons (6), e as partes brancas são os introns; se eu tiver só os
genes 1,2,3 e 4 eu vou ter a tradução da calcitonina (relacionado a pele, retenção de cálcio,
estrutura óssea). Se por acaso eu tirar o gene 4, e deixar o 1,2,3,5 e 6, eu gero o peptídeo
CGRP que atua na tireoide.

 Regulação: é critica
 Exons fortes: são aqueles que vão induzir o splicing constitutivo tradicional
 Exons fracos: são os exons que se ligam de forma fraca aos RNPs (complexo
ribonucleoproteico). Então o splicessoma esta ligado fracamente. Oque significa que esse
exon não é constitutivo e pode ser facultativo. E ai entra a regulação, onde acontece
principalmente pelas proteínas SR, ESEs, etc. que permitem que esse exon saia ou
permaneça.
OBS: esse controle evita doenças.

 Existem splicing do tipo:


 Cis splicing: é quando as alterações acontecem dentro de um mesmo RNA, chamado de
intramolécular
 Trans splicing: acontece entre dois RNAs distintos. É mito mais difícil e raro e aumenta e
muito o repertorio de proteínas.
O trans acontece da seguinte forma: eu tenho 2 RNAs. E para acontecer o trans splicing tem que
ter uma sequência chamada de SL em alguns dos RNAs. Esse SL é uma sequência
(aproximadamente 39 nucleotideos) chamada de líder, que vai indicar se esse trans splicing
acontece ou não. Esse RNA líder ao atacar, acontece vários rearranjos e nesse caso ele roubou
do outro RNA o gene 1, que passa a ser chamado de cistron.
Vale lembrar, que esse rearranjo pode ser policistronico: vir vários genes de vários RNAs, ou
monocistronico, quando vem apenas um. Se é policistronico ele precisa ter uma sequencia líder
(SL) 2, e quando é monocistronico, uma SL1.
Quando é monocistronico ele pode fazer depois o splicing do tipo CIS, que pode ignorar ou aceitar
esse exons, chamado de cistron. Quando é policistronico não.

 Auto
 Não acontece com os introns U2 e U12, e sim contece com os introns especiais do grupo I, II
e III
 Esses introns são capazes de se autoexcitar sozinhos, ou seja, esses RNAs conseguem
mandar seus introns embora sozinhos. Como? Os introns se dobram sobre ele mesmo,
aproximando suas extremidades, e o próprio RNA se cliva e liga os exons, sem
splicessomo.
 Passa isso acontecer, os introns do grupo I fazem isso de uma forma, e os do II e III fazem de
outra.
 Introns do grupo I: possuem 10 regiões importantes na sua estrutura (que chamamos de P,
seguido de números, ex. P1, P2...) que permitem que ele se auto quebre sozinho. Entre o P1 e
o P10 há 3 blocos. O P4, P5 e P6 forma um domínio que chamamos de estrutural, que é quem
permite que o intron se dobre sobre ele mesmo; Ai o P3, P7 e P9 formam o domínio catalítico
que vai dentro do intron e permite que ele se quebre; E por último o P1 e o P10 que são
chamados de complementares ou guia interna, que serve pro intron saber que ele tem que ter
sua acao catalítica no P1 e P10, pois são as extremidades.
Então o auto-splicing do grupo I consome ATP e precisa de uma guanina externa. Ela (G) fica
energética e consegue atacar P1 do intron (5’) e então se liga a 5’ do intron e ele se desliga do
exon por ação do domínio catalítico. O exon que ficou sozinho ataca o outro exon e o intron todo
é liberado.

 Introns do grupo I são liberados na forma linear.


 Introns do grupo II e III são liberados na forma de laço.

 Introns grupo II e III: são iguais, o que difere são o tipo de proteínas. Eles estão juntos e o
mecanismo é igual porque só eles fazem retrotransposição (migração para sítios aleatórios no
RNA). Introns tem unidades importantes: VI – sitio de ramificação (lugar de ligação); V –
catalítico; IV – proteina IEP promove retrotransposição.
A adenosina do local VI ataca a região 5’ do intron, ativa o domínio V, quebra 5’ e forma um laço.
Depois o exon ataca 3’ de outro exon, quebra o outro lado do intron, e o intron sai em forma de laço
e fica ligado um exon no outro.

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