Protocolo Hemato 2013

Manual de Hematología. Dpto. Microbiología y parasitología. UNAN-León.
ÍNDICE
CONTENIDO PÁGINA
I. TOMA DE MUESTRA.............................................................................................................. 1
1. ANTICOAGULANTES USADOS EN HEMATOLOGÍA. ................................................ 1
3. PUNCIÓN VENOSA ............................................................................................................ 4
4. PUNCIÓN CAPILAR............................................................................................................ 7
II. BIOMETRÍA HEMÁTICA COMPLETA ................................................................................. 9
1. MICROHEMATOCRITO ...................................................................................................... 9
2. RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS ........................................................................... 11
3. RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS ..................................................................... 13
4. RECUENTO DE PLAQUETAS ........................................................................................ 15
5. DETERMINACION DE HEMOGLOBINA ....................................................................... 18
6. RECUENTO DIFERENCIAL ............................................................................................ 20
7. ÍNDICES CORPUSCULARES ......................................................................................... 30
III. HEMOSTASIA Y COAGULACIÓN ................................................................................. 32
1. TIEMPO DE SANGRÍA ..................................................................................................... 32
2. TIEMPO DE COAGULACIÓN.......................................................................................... 34
3. TIEMPO DE PROTROMBINA (TP) ................................................................................. 36
4. TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA (TPT) .................................................... 39
IV. TINCIONES ESPECIALES ............................................................................................... 41
1. AZUL CRESIL BRILLANTE (RECUENTO DE RETICULOCITOS) .......................... 41
2. MÉTODO DE LA GOTA GRUESA PARA EL DIAGNOSTICO DE MALARIA ....... 44
V. OTROS PRUEBAS ................................................................................................................ 49
1. VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG) .......................................... 49
2. CÉLULAS L.E..................................................................................................................... 52
VI. PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y COLORANTES.................................................. 54
1. SOLUCIÓN DE TURK 2% ................................................................................................ 54
2. SOLUCIÓN DE HAYEN .................................................................................................... 54
3. SOLUCIÓN OXALATO DE AMONIO 1% ...................................................................... 54
4. EDTA .................................................................................................................................... 55
5. CITRATO DE SODIO AL 3.8% ........................................................................................ 55
I
6. COLORANTE DE GIEMSA .............................................................................................. 55

7. COLORANTE DE WRIGHT.............................................................................................. 56
8. SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA AL 0,9% .............................................................. 56
9. SOLUCION AZUL CRESIL BRILLANTE....................................................................... 56
10. SOLUCIÓN DE AZUL DE METILENO FOSFATADO. ............................................ 57
11. SOLUCIÓN ALCOHÓLICA DE GIEMSA................................................................... 57
VII. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 58
II
I. TOMA DE MUESTRA
1. ANTICOAGULANTES USADOS EN HEMATOLOGÍA.
Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total

para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares.
Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado
más parecido al fisiológico, como cuando se encuentran circulando por el torrente
sanguíneo. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los
leucocitos, el tamaño eritrocitario, no producir hemólisis e impedir la agregación
plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el máximo período de conservación de
la muestra.
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible, incluso

mantenida bajo refrigeración (4 ºC) si no pasan de las 2 horas. El tiempo máximo
entre la extracción de la sangre y su procesamiento depende del coagulante de
elección y no debe ser más de 4 horas, a excepción del anticoagulante EDTA
(etilendiaminotetracético) que puede ser hasta 24 horas (en refrigeración a 4 ºC).
EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica, dipotásica o tripotásica del ácido

etilendiaminotetracético.
Actúa mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++), impidiendo el proceso de
la coagulación al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la
realización de recuentos celulares, sobre todo en los autoanalizadores y permite
además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas
después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación
de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio,
por ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del
producto sólido, sin embargo , las tres sales afectan el tamaño del eritrocito,
1
especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por

espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in
Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para
recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del
tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren
para la calibración de los contadores automáticos. El K 2EDTA .2H2O posee un
peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para
una solución al 1% es de 4.8+/-1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a
la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/ml. de sangre total. Esta cantidad es un
compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a
la cual se producen las alteraciones celulares.
Citrato trisódico, C6H5O7Na3.

Actúa impidiendo que el calcio se ionice, evitando así la coagulación. Se utiliza
para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción anticoagulante-sangre,
1:9; así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción
anticoagulante-sangre, 1:4. El citrato sódico se utiliza a una concentración de
0.106 mol/l (31,3 g/L de C6H5O7Na3.2H2O).
Heparina sódica. Heparina de litio.

Es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se
transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. Los frotis
realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las
tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo
tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporción adecuada es de 15-20 UI
(0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.
2
2. CÓDIGO DE COLOR DE TAPONES.
3
3. PUNCIÓN VENOSA
El método mas común y rápido para la obtención de muestras sanguíneas es la

venopunción. La venopunción consiste en perforar una vena superficial con una
aguja hipodérmica, la sangre es colectada dentro de una jeringa o tubo con
anticoagulante.
La venopunción es una técnica que involucra la aplicación de las normas de
bioseguridad para reducir el riesgo de pinchazos accidentales, salpicaduras, que
pudieran perjudicar la salud del flebotomista.
Materiales y equipos requeridos

Algodón.
Alcohol al 70%.
Ligadura o torniquete.
Jeringas de 5 mL o 10mL.
Agujas Agujas 21Gx 1 ¼” (32x8).
Agujas 22Gx1.
Tubos con anticoagulante EDTA.

Caja para descartar material cortopunzante.
Obtención de la muestra
1) Verificar que los elementos por utilizar estén listos, y que el paciente se
sienta cómodo.
2) Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la
flexión del codo o a 10 cm del codo, sujetar con un medio nudo.
4
3) Limpiar la zona con alcohol al 70% o alcohol yodado, en un área de 2

pulgadas.
4) El paciente deberá abrir y cerrar la mano durante unos segundos y después

la mantendrá cerrada, esto ayudará a visualizar las venas superficiales
(Cefálica. Basílica y Mediana Cubital) o palpar la vena si no es posible
observarla.
5) Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de tal manera

que el bisel se encuentre hacia arriba.
6) Se fija la vena y se coloca la aguja en dirección paralela a esta, se perfora

la piel haciendo avanzar la aguja 0,5-1 cm en el tejido subcutáneo, hasta
perforar la vena.
5
7) Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido.

8) Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puño. Se coloca
el algodón seco encima de la punción y se retira la jeringa.
9) Retirar la aguja de la jeringa. Verter la muestra lentamente por las paredes

del tubo con anticoagulante.
10) Mezclar suavemente el tubo para homogeneizar la muestra con el
anticoagulante.
Ventajas de una extracción de sangre venosa

 Pueden hacerse repetidos exámenes con la misma muestra.
 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referencia
futura.
Desventajas de una extracción de sangre venosa

 La punción venosa, por su largo procedimiento, requiere mayor preparación
que el método capilar.
 El método es técnicamente difícil en niños, individuos obesos y pacientes
en shock.
Recomendaciones
 La hemólisis debe ser evitada, pues se puede obtener una disminución en
el recuento de eritrocitos.
 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete, pues
produce hemólisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado
6
inadecuado para el análisis de gases, recuentos celulares, determinación

de pH sanguíneo y algunas pruebas de coagulación.
 La sangre anticoagulada si no es de obtención reciente no debe ser
utilizada en extensiones de sangre, pues algunos anticoagulantes producen
cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones, agregación
plaquetaria y dificultan la identificación de leucocitos.
 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables, los
recuentos de leucocitos y plaquetas e índice de sedimentación deben
realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra.
4. PUNCIÓN CAPILAR
La sangre capilar es la obtenida por punción cutánea. Es una mezcla de sangre

procedente de arteriolas, vénulas y capilares con líquidos intersticiales e
intracelulares; su composición depende fundamentalmente de la cantidad de flujo
sanguíneo en la zona de punción y de la profundidad de penetración de la
lancetas.
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequeña o cuando por

diferentes motivos no pueda practicarse una punción venosa, debe recurrirse a la
punción capilar.
Materiales
Algodón.
Alcohol al 70%.
Lancetas.
Capilares con heparina.
Capilares sin heparina (frotis sanguíneo).
Procedimiento
1) La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anular en
los adultos y del dedo gordo del pie o talón en los niños.
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2) Desinfectar la zona con alcohol al 70%, secar con algodón estéril.

3) Punzar la piel con una lanceta estéril desechable (2 mm de profundidad).
4) Usar gasa estéril para desechar la primera gota y recoger las siguientes en
tubos capilares. Evitar comprimir la extremidad para obtener sangre porque
se altera la composición sanguínea.
Ventajas
 Puede obtenerse con facilidad.
 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre periférica.
Desventajas
 Sólo se pueden obtener pequeñas cantidades de sangre y los exámenes de
repetición requieren nuevas muestras.
 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemoliza
interfiriendo con la mayoría de pruebas de laboratorio.
 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no pueden ser
comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa.
 El dedo no sólo es delicado sino difícil de desinfectar adecuadamente en el
tiempo disponible.
 En pacientes con resistencia disminuida a la infección (aquellos con
leucemia, agranulocitosis, diabetes, uremia y enfermedades con
deficiencias inmunológicas), una muestra tomada del dedo es mucho más
probable que conduzca a una infección que otra tomada del brazo.
 El recuento de eritrocitos y leucocitos, así como el recuento de plaquetas y
reticulocitos, no debe realizarse en sangre capilar debido a la difícil
estandarización del flujo sanguíneo capilar.
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II. BIOMETRÍA HEMÁTICA COMPLETA
1. MICROHEMATOCRITO
Fundamento
El hematocrito se basa en la separación de los elementos celulares del plasma

mediante centrifugación. Después que la sangre es centrifugada en un tubo
capilar, las celulas rojas se desplazan hacia al fondo del capilar, las celulas
blancas y plaquetas forman una pequeña capa por encima de las celulas rojas, y
el plasma conforma la capa superficial.
Se determina midiendo la fracción que comprende a los glóbulos rojos (masa

globular), respecto al volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar,
reportado en porcentaje.
Materiales
Capilares con heparina
Capilares sin heparina.
Microcentrífuga.
Lector de Microhematocrito.
Sera selladora.
Mechero con metanol.
Procedimiento:
1) Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejo
del dedo, o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosa con
anticoagulante EDTA.
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2) Debe llenarse aproximadamente 3/4 del capilar. El Llenado se efectúa por

capilaridad y se realiza poniendo en contacto uno de los extremos del tubo
capilar con la gota de sangre, o introduciéndolo en el tubo de sangre e
inclinando este, posteriormente, para facilitar el proceso.
3) Ocluir (tapar) un extremo opuesto del capilar con plastilina o calor
(mechero).
4) Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centrífuga de
microhematocrito, con el extremo ocluido adherido al reborde externo de la
plataforma.
5) Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm.
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio.
Valores de referencia
Hombres 40% - 50%
Mujeres 36% - 48%
Niños (5 años) 34% - 42%
Lactantes (3 meses) 37% - 42%
Recién nacidos 51% - 60%
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Nota:
 Se debe homogenizar las muestras para asegurar la calidad del ensayo.

 Cada muestra debe montarse en duplicado; el segundo resultado debe de
variar entre ± 2%.
 Si el resultado varía fuera de ± 2%, deberá repetirse el ensayo.
 Al realizar la lectura del hematocrito solo incluir la capa de glóbulos rojos.
2. RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS
La sangre se diluye en un líquido que nos permite observar claramente los

hematíes, luego esta dilución se coloca en una cámara de Neubauer con la ayuda
de una pipeta automática o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopio a un
objetivo de 40x para calcular el número de glóbulos rojos por mm3.
Procedimiento (dilución 1/200):

1) Rotular los tubos y agregar 3980µl de solución de Hayem.
2) Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar del dedo,
se procede a aspirar 20µl de sangre con la pipeta y limpiar la punta con
papel absorbente.
3) Depositar la sangre en el tubo que contenga solución de Hayem y mezclar
suavemente por inversión de 8 a 10 veces.
4) Monte el cubreobjetos en la cámara de Neubauer (debe estar limpia y
seca).
5) Mezclar la dilución manualmente y depositar 10µl en una de las ranuras de
la cámara de Neubauer.
6) Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las células se sedimenten.
7) Enfocar con el objetivo de 10x y luego con 40x realizar el recuento:
cuadrante central y los cuatro angulares del retículo de Thomas.
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Cálculos:
# de Eritrocitos/mm3 =
Eritrocitos contados en 5 cuadrantes (R. Thomas) Dónde:
Superficie contada x Profundidad x Dilución *Superficie contada= 0.2 mm2

*Profundidad de la cámara=0.1
mm
*Dilución= 1/200
Eritrocitos contados en 5 cuadrantes (R. Thomas)
1/5 x 1/10 x 1/200
Simplificando, obtenemos el factor de multiplicación:
# de Eritrocitos /mm3 = Eritrocitos contados x 10,000
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Valores de referencia.
(Millones de Eritrocitos/mm3).
 Hombres 4 .5 - 5 .5
 Mujeres 4. 0 - 5 .0
 Niños (4 años) 4 .2 - 5 .2
 Lactantes (1 - 6 meses) 3 .8 - 5 .2
 Recién nacidos 5 .0 - 6 .0
3. RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS
La sangre anticoagulada se deposita en un líquido que permite evidenciar los

leucocitos, manteniéndolos visibles, mientras que los eritrocitos son hemolizados.
El recuento del número de leucocitos o glóbulos blancos se expresa por mm 3.

1) Rotular los tubos y agregar 380µl de solución de Turk.
papel absorbente.
3) Depositar la sangre en el tubo que contenga solución de Turk y mezclar en
un rotador automático por 2 ó 3 minutos.
seca).
5) Mezclar la dilución en el rotador automático y depositar 10µl en una de las
ranuras de la cámara de Neubauer.
6) Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las células se sedimenten.
7) Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angulares.
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Lectura.
Se realiza en los 4 cuadrantes. Además de los leucocitos contados dentro de cada
uno de los cuadrantes, se deben contar todos los leucocitos que se encuentren
adheridos en la línea horizontal superior y vertical exterior (en forma de L) o de lo
contrario, todos los leucocitos, adheridos a la línea horizontal inferior y vertical
interior.
Cálculos:
# de leucocitos/mm3 =
leucocitos contados en 4 cuadrantes Dónde:

 Superficie contada=
Superficie contada x Profundidad x Dilución 4 mm2
 Profundidad de la
cámara= 0.1 mm
 Dilución= 1/20
= leucocitos contados en 4 cuadrantes
4 x 1/10 x 1/20
# de leucocitos/mm3 = leucocitos contados x 50
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Corrección de valores para restar eritrocitos nucleados:

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el líquido de dilución, por lo tanto
pueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con los
leucocitos. Cuando se encuentran 10 ó más normoblastos por 100 leucocitos
contados en el diferencial el recuento leucocitario debe ser corregido usando la
siguiente fórmula:
La concentración del número de Normoblastos (por mm3) es:
Normoblastos/mm3 = # de normoblastos contados x Leucocitos/mm 3

100 + # normoblastos contados
Leucocitos/mm3 Corregidos = Leucocitos/mm3 – Normoblastos/mm3
Valores Normales.
Adultos: 5,000 – 10,000 Leucocitos/mm3
Recién nacidos: 10,000 – 25,000 Leucocitos/mm3
Niños: 8,000 – 15,000 Leucocitos/mm3
4. RECUENTO DE PLAQUETAS
Las plaquetas son fragmentos del citoplasma del megacariocito, su vida media es
de 9.5 días, sus funciones principales son: coagulación y mantener la integridad
de las paredes de los vasos. El recuento de plaquetas se efectúa en sangre
obtenida de punción venosa anticoagulada con EDTA, y sometida a hemólisis por
acción de una solución hipotónica de oxalato de amonio en agua destilada.

1) Rotular los tubos y agregar 1980µl de solución de Oxalato de amonio al 1%.
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papel absorbente.
3) Depositar la sangre en el tubo que contenga solución de Oxalato de amonio
al 1% y mezclar en un rotador automático por 2 ó 3 minutos.
4) Dejar reposar por 15 minutos.
seca).
6) Mezclar la dilución en el rotador automático y depositar 10µl en una de las
ranuras de la cámara de Neubauer.
7) Deje reposar por espacio de 15 minutos en cámara húmeda y oscuridad.
8) Enfocar con el objetivo de 10x y luego con 40x realizar el recuento:
cuadrante central y los cuatro angulares del retículo de Thomas.
Cálculos:
# de Plaquetas /mm3 =
Plaquetas contadas en 5 cuadrantes (R. Thomas) Dónde:

2
*Superficie contada= 0.2 mm
Superficie contada x Profundidad x Dilución
*Profundidad de la cámara=0.1
mm
Plaquetas contadas en 5 cuadrantes (R. Thomas) *Dilución= 1/100
1/5 x 1/10 x 1/100
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# de Plaquetas /mm3 = Plaquetas contadas x 5,000
Primera semana de vida: 150 - 340,000 plaquetas/mm3
1 semana a 2 meses: 200 - 400,000 plaquetas/mm3
2 meses a adultos: 150 - 450 000 plaquetas /mm3
Causas de aumento (trombocitosis):

 La trombocitosis puede ser secundaria a un estímulo medular inespecífico
(posthemorrágica o tras una crisis hemolítica), paraneoplásica o posquirúrgica.
Es especialmente importante la que se produce tras la esplenectomía.
 La trombocitopenia esencial aislada es muy rara, pero puede aparecer
asociada a trastornos mieloproliferativos. En estos casos, las plaquetas pueden
ser funcionalmente inoperantes y cursar, paradójicamente, con hemorragias.
Causas de disminución (Trombopenia):

 Es fundamental descartar que no se haya producido un error de lectura como
consecuencia de una agregación parcial de las plaquetas en la muestra
estudiada. Especialmente llamativos son los casos en los que existe una
agregación precisamente en presencia de EDTA, que es el anticoagulante
utilizado para mantener incoagulable la muestra de sangre en la que se ha de
realizar la lectura.
 Las verdaderas trombopenias pueden obedecer a una causa central
(generalmente asociada a leucopenia y anemia), periférica (inmunológica,
secuestro, consumo) o mixta (vírica). La púrpura trombocitopénica idiopática es
relativamente frecuente.
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5. DETERMINACION DE HEMOGLOBINA
Fundamento.
La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y

mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina. La intensidad del color
formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la
muestra ensayada.
Materiales.
Micropipetas.
Agua destilada
Rotador automático
Tubos de ensayo 12x75mm.
Reactivo de hemoglobina
Espectrofotómetro.
Procedimiento.
1) Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera BLANCO (BL), y

Muestra (Mx).
2) Dispensar:
Hb Hb
BL Mx
2.5 ml de H2O destilada 2.5 ml de H2O destilada

+ +
1 gota de Reactivo de Hb 1 gota de Reactivo de Hb
+
10 µl de sangre/EDTA
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3) Mezclar e incubar 3 minutos a Temperatura ambiente.

4) Seleccionar la prueba # 5 “hemoglobina/540 nm” en el espectrofotómetro.
5) Colocar el tubo de ensayo para la lectura del blanco y luego la muestra.
6) Anotar la concentración que está dada en g/dL.
Valores normales.
Edad g/dL
Recién nacido 13.5 – 19.5
Tres meses 9.5 – 12.5
1 año 11.0 – 13.0
3 a 6 años 12.0 – 14.0
10 a 12 años 11.5 – 14.5
Adulto (hombre) 14.0 – 18.0
Adulto (Mujer) 12.0 – 16.0
Interpretación de los resultados.

La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la
sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de
oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. Cuando el nivel de
hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede
obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades
renales o hemorragias.
Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o
estancia en lugares de gran altitud.
Notas:
 Linealidad hasta 20 g/dL.
 Usar anticoagulantes como EDTA, heparina u oxalato.
 Estabilidad de la muestra: 1 semana a 2-8ºC.
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6. RECUENTO DIFERENCIAL
FROTIS SANGUINEO
La evaluación de un frotis sanguíneo es una parte rutinaria de la Biometría
Hemática Completa (BHC). Tinciones son aplicadas a los frotis sanguíneos para
que los elementos formes de la sangre (glóbulos rojos, glóbulos blancos y
plaquetas) puedan ser observados, identificados y evaluados usando en
microscopio como en el conteo diferencial.
Un frotis sanguíneo correctamente preparado permite al bioánalista clínico
observar los elementos formes de la sangre lo más cercano a su estado natural.
La morfología o estructuras de los elementos formes puede ser estudiada.
Partes del Frotis sanguíneo
Materiales
Láminas portaobjetos 25.4x76.2mm.
Láminas portaobjetos 25.4x76.2mm con bordes esmerilados.
Tubos capilares sin anticoagulante.
Micropipeta.
Procedimiento
1) Una vez extraída la sangre con cualquiera de las metodologías, se coloca
una pequeña gota de sangre (5µL) sobre un portaobjeto a 2 cm
aproximadamente de uno de los extremos.
20
2) Colocar un extremo del portaobjeto esmerilado (portaobjeto extensor)

delante de la gota de sangre y desplazarlo suavemente hacia atrás hasta
alcanzar la gota para que se extienda por capilaridad.
3) Formando un ángulo de 45º, deslizar suave y uniformemente el portaobjeto

en sentido longitudinal, a velocidad moderada, hasta que la gota de sangre
quede bien extendida hasta 1 cm del extremo final del portaobjeto.
4) Secar el frotis a temperatura ambiente y en posición horizontal.
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Frotis sanguíneo preparados inadecuadamente
El grosor del frotis sanguíneo puede variar según sea el ángulo que formen entre
sí ambos portaobjetos.
Factores que afectan la calidad del frotis sanguíneo

 La cantidad de sangre depositada en él portaobjeto.
 El ángulo formado por la lámina extensora y el portaobjeto.
 La velocidad de extensión de la sangre
Si es superior a 45º, la extensión obtenida será gruesa y corta, si es inferior a 45º

será larga y fina.
Notas:
 La sangre con anticoagulante debe mezclarse antes de realizar el frotis

sanguíneo. Únicamente debe utilizarse anticoagulante EDTA porque otros
pueden alterar la morfología y las características de las celulas en la tinción.
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El frotis sanguíneo debe realizarse dentro de 2 horas después de colectada

la muestra.
 Las láminas portaobjetos deben estar libre de grasa y polvo. Estas pueden
comprarse previamente limpias o lavar con agua y jabón, enjuagar con
agua caliente y posteriormente con agua destilada, por ultimo sumergir en
etanol al 95% y secar con una toalla libre de pelusas. Una vez limpias
pueden almacenarse en etanol al 95%.
TINCIÓN CON COLORANTE DE WRIGHT
Fundamento
Con el fin de estudiar satisfactoriamente los frotis sanguíneos, es necesario

colorearlos. En la mayoría de los laboratorios los colorantes más empleados para
la tinción hematológica se basan en el de Romanowsky constituido
fundamentalmente con la mezcla de eosina (ácido) y azul de metileno (básico).
Además se han incorporado el empleo de derivados por oxidación del azul de
metileno que se conoce con el nombre de azures (A, B, C). Son los azures los
responsables de la coloración púrpura o roja de ciertas estructuras.
Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de
pH de las diferentes estructuras celulares, de forma que las que tienen carácter
básico fijan la eosina mientras que las que poseen propiedades ácidas fijan
principalmente el azul de metileno.
Esto explica que las estructuras basófilas se tiñan de color azul mientras que los
competente acidófilas adquieren un color rosado. La diferente afinidad de ciertas
granulaciones citoplasmáticas por dichos colorantes permite clasificar a los
leucocitos polimorfonucleares en 3 grupos:
Granulocitos eosinófilos, en los que la granulación específica contiene sustancias

de carácter básicos que fijan los colorantes ácidos y se tiñen de color rojo-naranja.
23
Granulocitos basófilos, en los que la granulación específica posee sustancias de

carácter ácido que fijan los colorantes básicos y se tiñen de color azul oscuro.
Granulocitos neutrófilos, en los que la granulación específica posee compuestos

de carácter neutro por lo que fijan ambos colorantes simultáneamente, de ahí que
se tiñen de color pardo.
Dentro del grupo de colorante tipo Romanowsky los más utilizados son el de
Wright, Giemsa y May- Grünwald-Giemsa, entre otras.
Materiales
Colorante de Wright
Puente de tinción
Solución amortiguada tamponada (H20 destilada)
Pizeta
Papel filtro
Embudo
Beaker.
Algodón con alcohol.
Procedimiento
1) Una vez obtenido el frotis sanguíneo, se le dejará secar entre 15 y 20
minutos.
2) Luego se coloca la preparación en un soporte y se cubre con el colorante
de Wright, dejándolo por espacio de 4 minutos.
3) Posteriormente se añade solución amortiguada tamponada (H 20 destilada)
en partes iguales hasta obtener un brillo metálico, dejando 4 minutos
adicionales.
4) Finalmente se lava con agua corriente, se deja secar y limpiar con un
algodón con alcohol el reverso de la lámina.
24
5) Se coloca en el microscopio y, con pequeño aumento, se revisa la calidad

de la coloración, la cantidad aproximada de glóbulos blancos y se escoge el
sitio para iniciar el recuento. Se coloca una gota de aceite de inmersión y se
enfoca a un aumento de 100x.
Una extensión de sangre bien teñida debe caracterizarse por una buena
diferenciación de las estructuras subcelulares en los leucocitos, una coloración
rosada de los hematíes y la ausencia de precipitados.
Los defectos más frecuentes observados en la tinción del frotis sanguíneo son:
 Coloración excesivamente azul, debido a:
Frotis excesivamente grueso.
Lavado insuficiente.
Tinción muy prolongada.
Empleo de colorante excesivamente alcalino.
 Coloración con una tonalidad rosada: el colorante, el tampón o el agua de
lavado tienen un pH demasiado ácido.
 Presencia de precipitados: obedecen a una acción excesiva del colorante.
Esto se puede evitar con la filtración.
RECUENTO DIFERENCIAL DE GLÓBULOS BLANCOS
Fundamento
El propósito del conteo diferencial es determinar el porcentaje de cada tipo de
celulas blancas en sangre periférica.
En la sangre se encuentran los leucocitos o glóbulos blancos que son las células
móviles del sistema inmunitario. Todos ellos difieren en cuanto a su función y
morfología. Los leucocitos no desempeñan sus funciones cuando se encuentran
en sangre, sino cuando abandonan ésta y entran a los tejidos linfoides o a las
zonas donde hay inflamación intensa. En este sentido, la sangre es un medio de
25
transporte, que le permite a las células sanguíneas recircular entre los diferentes
tejidos del cuerpo.
Normalmente en sangre se encuentran cinco tipos de leucocitos: monocitos,

linfocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Además de estas células, se
encuentran presentes las plaquetas, que son fragmentos citoplasmáticos de los
megacariocitos que se asientan en la médula ósea.
Los leucocitos se estudian en preparaciones coloreadas por dos razones: a fin de

determinar la apariencia normal o anormal de las células y sus porcentajes
relativos en el diagnóstico de ciertas enfermedades.
Materiales
Microscopio óptico.
Contador manual para diferencial de celulas.
Aceite de inmersión.
Uso del objetivo de inmersion
Enfocar primeramente la lamina con el objetivo de menor aumento, rotar

ligeramente el objetivo hacia un lado. Colocar una gota de aceite de inmersion en
el portaobjeto justamente encima del condesador. El objetivo de inmersion ahora
es rotado cuidadosamente sobre la gota de aceite y la imágenes enfocada con el
tornillo micrometrico. El condensador se eleva al maximo, el diafragma se abre
completamente y se usa la luz maxima.
Lectura del diferencial

Se realiza en la zona donde los glóbulos rojos apenas se tocan entre si. Las
celulas se identifican más fácilmente en esta área debido a que tienen una forma
algo aplanada, lo que permite una mejor observación de los componentes
celulares.
26
El conteo diferencial se realiza al contar e identificar 100 glóbulos blancos y

reportando el porcentaje de cada tipo celular.
CARACTERÍSTICAS Y DIFERENCIACIÓN DE LOS LEUCOCITOS
27
CARACTERÍSTICAS Y DIFERENCIACIÓN DE LOS LEUCOCITOS
28
Cálculos:
Valores absolutos de glóbulos blancos cells/mm3=
Recuento total de glóbulos blancos cells/mm3 x % del tipo de glóbulo blanco

100
9,000 cells/mm3 x 60% neutrófilos segmentado

100
= 5,400 Neutrófilos segmentados/mm3
Estimación del Recuento Total de Leucocitos

Con el objetivo de 40x localizar la zona ideal de conteo, examinar 10 campos en
esta área y determinar el número promedio de leucocitos por campo y multiplicar
por 2,000.
Leucocitos/ mm3 = promedio de leucocitos en 10 campos x 2,000
Estimación de Recuento Total de Plaquetas

Con el objetivo de 100x localizar la zona ideal de conteo, examinar 10 campos en
esta área y determinar el número promedio de plaquetas por campo y multiplicar
por 20,000.
Plaquetas/ mm3 = promedio de plaquetas en 10 campos x 20,000
29
VALORES
VALORES DE REFERENCIA DE
ABSOLUTOS
RECUENTO DIFERENCIAL (%)
CELULAS/UL
Tipo de Célula 1 mes 6 años 12 años Adultos Adultos
Neutrófilos (seg) 15 -35 45-50 45-50 50-65 2,250 - 7,150
Neutrófilos (band) 7-13 0-7 6-8 0-7 0 – 770
Eosinófilos 1-3 1-3 1-3 1-3 45 - 330
Basófilos 0-1 0-1 0-1 0-1 0 - 110
Monocitos 5-8 4-8 3-8 3-9 135 - 990
Linfocitos 40-70 40-45 35-40 25-40 11,125 - 4,400
7. ÍNDICES CORPUSCULARES
Volumen corpuscular medio

Representa el volumen que, por término medio, tiene un hematíe. Mediante la
técnica clásica, el cálculo se realizara dividiendo el volumen globular comprendido
en 1 mm3 de sangre entre el número de hematíes contenidos en ese mismo
volumen.
VCM (fL)= Hematocrito (%) x 10

# Eritrocitos en millones/mm3.
VN: 82 – 94 fl
30
Hemoglobina corpuscular media

Es la proporción real de hemoglobina que corresponde, en promedio, a cada
glóbulo rojo en cifras absolutas. Relaciona la cantidad de hemoglobina con el
recuento de glóbulos rojos.
HCM (pg) = Hemoglobina (g/dl) x 10

# Eritrocitos en millones/mm3
VN: 27 – 32 pg
Concentración de hemoglobina corpuscular media

Es la concentración de hemoglobina por glóbulo rojo en porcentaje. Relaciona la
hemoglobina con el hematocrito. Expresa el tenor hemoglobínico en forma
porcentual respecto al paquete eritrocitario.
CHCM(g/dL) = Hemoglobina (g/dl) x 100
Hematocrito (%)
VN: 32 – 36 g/dL
Clasificación morfológica de las anemias.
31
III. HEMOSTASIA Y COAGULACIÓN
1. TIEMPO DE SANGRÍA
Fundamento
El tiempo de sangría prueba la función de las plaquetas y de los capilares
sanguíneos al medir el tiempo requerido para que una pequeña incisión en la piel
deje de sangrar.
Materiales
Algodón
Alcohol al 70%
Lancetas
Papel filtro
Cronómetro
Procedimiento
1. Limpie con suavidad el lóbulo de la 2. Haga la incisión en el lóbulo de la

oreja utilizando algodón embebido en oreja, al mismo tiempo cronometrar.
alcohol al 70%. Deje fluir la sangre sin exprimir el lóbulo
de la oreja.
32
3. Después de 30 segundos. Recoja la 4. Espere otros 30 segundos y recoja la

primera gota de sangre en una esquina segunda gota de sangre.
del papel secante. No toque la piel con
el papel.
5. Cuando las gotas de sangre dejen de fluir, detener el

cronómetro.
Cálculo
Anote el tiempo transcurrido según el reloj, o contar el número de gotas recogidas
en el papel filtro y multiplicarlo por 30 segundos.
Redondee al medio minuto más cercano.
Valor de referencia
1 a 4 minutos.
33
Propósito de la prueba
 Diagnosticar ciertos padecimientos hemorrágicos.
 Antes de realizar operaciones quirúrgicas.
 Antes de efectuar una punción en el hígado o el bazo.
Nota: No realizar la prueba en pacientes que han tomado aspirina en los últimos
8-10 días.
2. TIEMPO DE COAGULACIÓN
Fundamento
El tiempo de coagulación evalúa la función de los factores plasmáticos que
intervienen en la coagulación como la globulina antihemofílica, protrombina y
fibrinógeno, o que la dificultan como la antitrombina al medir el tiempo que tarda
en coagular una muestra de sangre venosa en un tubo de ensayo a 37 ºC.
Materiales
Algodón
Alcohol al 70%
Torniquete
Jeringa de 3 ml
Tubos de ensayo 12x75mm
Baño maria
Cronómetro
34
Procedimiento
1. Mediante una jeringa extraiga poco 2. Llenar 2 tubos de ensayo con 1 mL

más de 3 mL de sangre venosa, de sangre. Taponar con algodón.
Cronometrar el tiempo desde el Colocar en baño maría a 37 ºC.
momento que la sangre entre a la
jeringa.
3. Después de 3 a 5 minutos sacar el 4. Examine el segundo tubo

primer tubo del baño maría. Inclinar en inmediatamente después que haya
posición horizontal en rotación a coagulado la sangre del primero, lo que
intervalos de 30 segundos hasta que la por lo general es inmediato.
sangre coagule. Cronometrar.
Cálculos
Se notifica como tiempo de coagulación la media de los dos tubos.
Valor de referencia
5 a 10 minutos a 37 ºC.
35
Interpretación
El tiempo de coagulación está prolongado cuando hay severa deficiencia de todos
los factores de coagulación, excepto en la trombocitopenia y deficiencia de factor
VII o XIII. También está prolongado en presencia de heparina o anticoagulantes
circulantes endógenos. Un tiempo de coagulación normal no excluye un desorden
de la hemostasia.
3. TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)
Fundamento.
Desde su descripción por Quick en 1935, el Tiempo de Protrombina (PT) o Tiempo

de Quick ha servido para determinar trastornos de la coagulación, la PT es la
determinación más frecuente junto con la APTT.
Mide el tiempo que tarda en coagular una muestra de plasma, desprovisto de

plaquetas y anticoagulado con citrato sódico, al ponerlo en contacto con una
suspensión de tromboplastina cálcica (sustituto de la tromboplastina tisular
fisiológica). Explora la vía extrínseca y común de la coagulación en las que
intervienen los factores I (fibrinógeno), II (protrombina), V, VII y X.
Es una prueba de gran interés y muy utilizada con fines de screening, diagnóstico
y control del tratamiento con anticoagulantes orales.
Materiales.
Suspensión de tromboplastina cálcica.

Plasma.
Micropipeta.
Cubeta con balín.
Incubadora.
Coagulometro.
36
Obtención del plasma:
 Centrifugar la muestra a 1500 x g 15 min. y transferir el plasma a tubos de

ensayos.
 Los plasmas turbios, ictéricos, lipémicos o hemolizados pueden dar
resultados erróneos.
 La muestra es estable 2 horas a temperatura ambiente (15-25ºC) o 4 horas
a 2-8ºC.
Procedimiento.
1) El tubo conteniendo la tromboplastina cálcica debe ser incubado a 37 ºC

(dependiendo del volumen 5 a 10 minutos).
2) Encender y esperar que el coagulometro alcance su temperatura optima.
3) Aparecerá en la pantalla “0.0” lo que indica que el equipo está listo.
4) Agregar un balín y 100 uL de plasma del paciente en una cubeta.
5) Colocar la cubeta en la ranura central del coagulometro y poner a incubar
“incubation” 180 a 300 segundos.
6) Tomar con una pipeta 200 uL de tromboplastina cálcica y presionar “Start”,
el equipo realizara una cuenta regresiva de tres segundos. Cuando llegue al
último segundo agregar la tromboplastina cálcica en la cubeta.
7) Anotar la lectura y reportar en segundos.
8) Presionar “Start” para obtener el valor de INR.
Cálculos
Los valores se pueden expresar en segundos, pero se recomienda expresarlos en

Actividad porcentual (%), en Tasa de PT (PR), o en tasa internacional normalizada
(INR).
Tasa de PT (PR) = PT del paciente en segundos
PT de plasma normal (pool %) en segundos.
37
Índice Internacional de Sensibilidad (ISI).
La Tasa de PT (PR) se puede convertir a su correspondiente valor internacional

usando el índice internacional de sensibilidad (ISI). De esta manera se obtiene la
ISI
tasa normalizada internacional (INR): INR = PR
PT (segundos) 13-17 seg

PT (porcentaje) 70-120%
PT (tasa) 0,9– 1,2
El tiempo de protrombina es expresado en segundos con el valor del control (cada

cual es la media de pruebas duplicadas). El valor del control (y paciente) depende
de la tromboplastina y de la concentración del citrato y hematocrito. Un tiempo de
protrombina prolongado indica deficiencia de los factores II, V, VII o X también
está prolongado en la hipofibrinogenemia y heparinemia.
El tiempo de protrombina es utilizado como una prueba de despistaje y también

como control para pacientes anticoagulados con drogas antagonistas de la
vitamina K.
Notas:
 No usar como anticoagulante oxalato sódico, EDTA o heparina.

 Anticonceptivos orales, corticoides o terapias con anticoagulantes pueden
influir en los resultados.
38
4. TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA (TPT)
Fundamento.
Esta prueba determina anormalidades en los factores VIII, IX, XI y XII,

precalicreína y quininógeno (vía intrínseca de la coagulación) y factores II, V, X y
fibrinógeno (vía común de la coagulación).
La cefalina es un extracto de lípidos del cerebro, que funciona como un sustituto

de plaquetas. El sílice micronizado es usado como un activador de los factores XI
y XII. Cuando estos reactivos y el cloruro de calcio son agregados al plasma
citratado, los factores de la vía intrínseca son activados, el tiempo para la
coagulación del plasma se mide.
Materiales.
Plasma.
Micropipeta.
Cubeta con balín.
Incubadora.
Coagulometro.
Tromboplastina parcial (cefalina).
Cloruro de calcio 0,025 M.
Obtención del plasma:

 Centrifugar la muestra a 1500 x g 15 min. y transferir el plasma a tubos de
ensayos.
 Los plasmas turbios, ictéricos, lipémicos o hemolizados pueden dar
resultados erróneos.
 La muestra es estable 2 horas a temperatura ambiente (15-25ºC) o 4 horas
a 2-8ºC.
39
Procedimiento.
1) La tromboplastina parcial y cloruro de calcio debe ser incubado a 37 ºC

(dependiendo del volumen 5 a 10 minutos).
2) Encender y esperar que el coagulometro alcance su temperatura optima.
3) Aparecerá en la pantalla “0.0” lo que indica que el equipo está listo.
4) Agregar un balín, 100uL de Tromboplastina parcial y 100 uL de plasma del
paciente en una cubeta.
5) Colocar la cubeta en la ranura central del coagulometro y poner a incubar
“incubation” 180 a 300 segundos.
6) Tomar con una pipeta 100uL de Cloruro de calcio y presionar “Start”, el
equipo realizara una cuenta regresiva de tres segundos. Cuando llegue al
último segundo agregar el Cloruro de calcio en la cubeta.
7) Anotar la lectura y reportar en segundos.
25 a 43 segundos.

El TPT es una prueba importante de despistaje, detectando las deficiencias más
insignificantes (debajo de 25% de los niveles normales) de los factores XII, XI, IX,
VIII, X, V. Esta prueba es mucho más sensible que el tiempo de coagulación para
la detección de estas deficiencias. Su utilidad más importante es en la detección
de las deficiencias congénitas de los factores VIII y IX. No detecta deficiencias del
factor plaquetario tres y factores VII y XIII. Esta prueba es útil en el monitoreo de
terapias con heparina.
40
IV. TINCIONES ESPECIALES
1. AZUL CRESIL BRILLANTE (RECUENTO DE RETICULOCITOS)
Los reticulocitos son glóbulos rojos inmaduros formados por ARN y protoporfirina
en el citoplasma.
Fundamento
Los reticulocitos contienen una fina red de ARN y protoporfirina que se puede teñir
con el azul de cresil brillante. Este colorante en combinación con una misma
cantidad de sangre anticoagulada se mezcla y con la ayuda de la temperatura
(baño maría) se produce la coloración de estos eritrocitos jóvenes visualizándose
en los frotis sanguíneos por microscopía.
Materiales y reactivos
Pipetas Pasteur 230mm

Baño maria
Láminas porta objetos 25.4x76.2mm (1”x3”).
Microscopio óptico
Azul cresil brillante
Aceite de inmersión
Procedimiento
1) En el tubo de ensayo colocar 3 gotas de sangre total con anticoagulante.

2) Inmediatamente adicionar con la ayuda de una pipeta Pasteur la misma
cantidad de Azul Cresil Brillante.
3) Mezclar la solución suavemente.
4) Se coloca luego en baño maría (37oC) por 15 minutos.
5) Se realizan frotis sanguíneos.
6) Se lee con objetivo de 100x.
41
Cálculos
Examine por lo menos 100 eritrocitos con el objetivo de inmersión. Cuente

cuidadosamente:
 Cantidad total de glóbulos rojos.
 Número total de reticulocitos que haya entre ellos.
El recuento se ha venido haciendo clásicamente de forma manual mediante la

observación en el microscopio óptico. El resultado se da en porcentaje sobre cada
100 hematíes. Es más útil calcular el número de reticulocitos por mm 3, mediante la
fórmula:
Reticulocitos/mm3 = % reticulocitos x millones eritrocitos
100
Reticulocitos % = # de reticulocitos
10
Nota: Cuando disminuye el número de eritrocitos como suele suceder en la

anemia, el valor porcentual debe corregirse según el hematocrito empleando la
siguiente fórmula:
Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x Hto paciente
Hto normal
Existe una relación inversa, aproximadamente lineal, entre el hematocrito y el

período de maduración periférica de los reticulocitos. De esta forma puede
calcularse otra magnitud de interés clínico denominada índice de producción
reticulocitaria (IPR) aplicando la fórmula siguiente:
42
IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente
Período de maduración en días x Hto normal
Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoyética medular (anemia

regenerativa), mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoyética
(anemia arregenerativa)
Relación entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia:
Hematocrito 45 40 35 30 25 20 15
Niveles de Hemoglobina (g/L) 15 13.3 11.7 11.0 8.3 6.6 5.0
Recuento de reticulocitos (%) 1 2 5 10 15 20 30
Recuento de reticulocitos
1 1,8 4 7 8,3 9 10
corregido (%)
Tiempo de maduración
 1 día  2 días 3 días
estimado
Índice de reticulocitos 1 2 5 5 7,5 10 10
Primeras 24 h de vida: 2,0 - 6,0%
1 día a 2 semanas: 0,3 – 1,5%
2 semanas a adultos: 0,5 - 2,2%
43
Variaciones patológicas
Disminución de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia)
Aplasia medular, anemias carenciales intensas (megaloblástica y ferropénica),

anemias inflamatorias.
Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis)
Período neonatal, anemias hemolíticas, anemias posthemorrágicas, anemias

carenciales en fase de tratamiento, mieloptisis (infiltración neoplásica en la médula
ósea), mielofibrosis idiopática.
2. MÉTODO DE LA GOTA GRUESA PARA EL DIAGNOSTICO DE

MALARIA
La malaria es una infección parasitaria causada por una de las 4 especies del
genero Plasmodium, siendo la más mortal P. falciparum. En el laboratorio puede
ser diagnosticada mediante la identificación de las formas parasitarias en un frotis
sanguíneo.
Toma de muestra
1) Limpiar con un alcohol el dedo medio de la mano o dedo gordo del pie en
lactantes. Nunca debe hacerse en el dedo pulgar ni en los adultos ni en los
niños.
2) Puncionar con lanceta desechable el borde lateral del dedo. Limpiar la
primera gota de sangre con algodón seco.
3) Presionar para obtener una nueva gota de sangre y tomarla en el centro de
un portaobjeto. Presionar nuevamente para obtener más sangre y tomar
dos o tres gotas más grandes sobre el portaobjeto a un cm de distancia de
la gota tomada anteriormente.
44
4) Extensión en capa fina: utilizar otro portaobjeto limpio para hacer la

extensión. Tocar la gota pequeña con el segundo portaobjeto y realizar un
extendido periférico normal con ángulo de 45°.
5) Preparación de gota gruesa: con la esquina del segundo portaobjeto. Unir
en movimientos rápidos las gotas de sangre más grandes y extender en
una capa gruesa y uniforme. La sangre no debe removerse en exceso pero
puede extenderse en círculo o rectángulo con 3-6 movimientos.
6) Dejar secar la preparación de gota gruesa en posición horizontal,
protegiendo el portaobjeto de las moscas, el l polvo y el calor excesivo.
La sangre debe ser colectada antes de empezar cualquier tratamiento.
La sangre capilar es el espécimen de preferencia, porque los

anticoagulantes pueden alterar la morfología del parasito y las
características de la tinción.
3 4
45
Tinción de extensión de sangre con colorante de Giemsa.
Método rápido de tinción de extensiones en capa gruesa y en capa fina sobre el

mismo portaobjetos.
1) Fijar la extensión fina añadiéndole tres gotas de metanol o sumergiéndola

en un recipiente con metanol durante algunos segundos.
2) Preparar una solución de Giemsa al 10% en agua amortiguada, destilada o
desionizada, de pH 7,2; si se necesita poca cantidad, 3 gotas de colorante
por ml de agua bastara para conseguir la concentración correcta de
solución de Giemsa. Cada portaobjeto necesita unos 3 ml de colorante
preparado.
3) Vertir suavemente el colorante sobre el portaobjeto; para ellos puede
usarse una pipeta. Otra posibilidad es colocar los portaobjetos hacia abajo
en un disco de tinción cóncavo e introducir el colorante por debajo del porta
objeto.
4) Dejar actuar el colorante de 5-10 minutos.
5) Eliminar suavemente el colorante del portaobjeto añadiendo agua limpia
gota a gota; no debe inclinarse el portaobjeto para que caiga el colorante y
lavar a continuación, ya que así quedará un depósito de espuma sobre la
extensión.
6) Colocar el portaobjeto en la gradilla, con la cara de la extensión hacia
abajo, para que escurra y se seque, asegurándose de que la extensión no
toca el soporte.
Para permitir la deshemoglobinización, no debe fijarse la preparación de

gota gruesa; así evite que esta quede expuesta al metanol o a sus vapores.
46
Identificación de Plasmodium spp.
47
Recomendaciones
Si es necesario guardar las preparaciones de gota gruesa realice la precoloración

antes de teñir:
Sumergir durante 1 segundo en azul de metileno fosfatado. Dejar escurrir sobre

una toalla de papel. Después de esto se puede colorear inmediatamente o dejar
secar en posición vertical. Las placas así tratadas se pueden guardar varios días.
Dilución y tiempo de tinción usando tinción de Giemsa comercial

Dilución Tiempo de tinción Como realizarla
2 ml Giemsa +
1:20 20 minutos
38 ml de bH2O
1 ml Giemsa +
1:50 50 minutos
49 ml de bH2O
1 ml Giemsa +
1:100 2 horas
99 ml de bH2O
48
V. OTROS PRUEBAS
1. VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)
Fundamento
Cuando se deja una muestra de sangre anticoagulada en reposo, los hematíes
como tienen mayor densidad que el plasma, tienden a sedimentar, la velocidad de
caída depende de la tendencia que tienen los eritrocitos a formar pilas o “rouleaux”
y esta a su vez depende de la interacción de dos fuerzas opuestas: Una fuerza de
atracción: Las fuerzas de Van der Waals y una fuerza de repulsión: El potencial Z.
El equilibrio entre estas dos fuerzas puede ser alterado por la presencia de ciertas
moléculas asimétricas plasmáticas, especialmente el fibrinógeno (Proteína de fase
aguda) y las gamma globulinas cuando están muy aumentadas, estas proteínas
funcionan como dieléctricos disminuyendo el potencial Z, por lo tanto priman las
fuerzas de atracción y se acelera la velocidad de sedimentación.
Para la prueba, la sangre no debe coagularse, motivo por el cual, la sangre

extraída se le adiciona una sustancia anticoagulante (la más común es citrato
sódico al 3,8 % en proporción exacta de 1 parte de citrato por 3 de sangre, es
decir, al 1/4).
La sedimentación globular se realiza en tres etapas:
 Hemaglutinación: Es la tendencia de los hematíes a formar agregados en

forma de "pilas de moneda". Estos sedimentan de forma muy lenta por lo
que van a determinar la velocidad de todo el proceso.
 Sedimentación: Desplazamiento de los hematíes hacia el fondo de la pipeta
a velocidad constante.
 Acumulo o depósito en el fondo.
El principio físico de esta prueba se basa en la Ley de Stokes considerando los

hematíes como esferas suspendidas en un medio infinito.
49
Materiales:
Tubos Wintrobe.
Pipetas Pasteur.
Soporte de Wintrobe.
Tabla de Wintrobe.
Cronometro.
Procedimiento:
1) Con la ayuda de la pipeta pasteur llenar el tubo Wintrobe hasta la marca de
10 o 1 con sangre previamente homogenizada.
2) Colocar el tubo de Wintrobe en la gradilla de sedimentación cuidando que
esté perfectamente nivelada (vertical, 90º).
3) Dejar reposar durante 1 hora evitando cualquier movimiento.
4) Hacer la lectura de los milímetros (mm) sedimentados en 1 hora.
Este es el resultado sin corregir y se reporta VSG sin corregir en mm/hr.
Corrección de los valores de VSG:

Se debe realizar la corrección de los valores de VSG a pacientes con anemia,
utilizando la tabla de Wintrobe, que relaciona el Macrohematocrito con el valor en
mm de la VSG.
1) Centrifugue por 30 minutos el tubo de Wintrobe y obtenga el valor de

Macrohematocrito.
2) En la tabla de corrección de VSG, ubique en el eje de la Y la VSG mm/hr y
en el eje de la X el valor del macrohematocrito.
3) Luego intercepte los puntos y descienda hasta la línea de la mujer y hasta
la línea del hombre, cuando alcance la línea que corresponda deténgase y
siga recto hasta encontrar el valor de la VSG corregida.
4) La escala de la VSG esta graduada de 2 en 2 y la escala del
macrohematocrito esta graduada de 1 en 1.
50
Factores que afectan a la VSG:
 Factores Plasmáticos. Los más importantes son las proteínas

plasmáticas, especialmente el fibrinógeno y las globulinas (sobre todo alfa-
1-antitripsina, haptoglobina, etc...). La Albúmina posee un escaso efecto
sobre la VSG. Se cree que estas proteínas disminuyen la carga
electrostática de la membrana de los hematíes, disminuyendo la repulsión
entre ellos y favoreciendo su agregación.
 Factores Físicos. Sobre todo la morfología eritrocitaria y el VCM,
observándose que a mayor tamaño de los hematíes, mayor velocidad de
sedimentación.
 Factores Ajenos a la Sangre. Tales como temperatura, hemólisis, tiempo
transcurrido desde la extracción o limpieza de material
 Los valores elevados pueden deberse a:
Causas Fisiológicas: Embarazo, Envejecimiento, Crecimiento normal
Causas Patológicas: Anemias intensas (especialmente microcíticas y

ferropénicas), Procesos Inflamatorios Crónicos, IAM (Infarto Agudo de Miocardio),
Insuficiencia Renal, Neoplasias, tumores y hemopatías, Gammapatías
Monoclonales, Aumento de la fracción de las globulinas.
 Las causas más frecuentes de valores disminuidos:
Policitemias, Alteraciones eritrocitarias, e Hipofibrinogenenemia (disminución

concentración de fibrinógeno plasmático.
Valores Normales
Edad Hombre Mujer

Menor a 50 años < 15mm/hr < 20mm/hr
51
Mayor a 50 años <20 mm/hr <30 mm/hr
2. CÉLULAS L.E.
Fundamento
Se denomina célula LE a una célula fagocítica del sistema inmune que
ha fagocitado el material nuclear desnaturalizado de algún otro tipo de célula. Por
lo general esta célula fagocítica es un macrófago o un neutrófilo. El núcleo
desnaturalizado puede ser observado ocupando la porción central de la célula
fagocítica (esto es conocido como cuerpo LE), mientras que el propio núcleo de la
célula fagocítica por lo general queda extendido en forma de herradura en la
periferia. Las células LE fueron descubiertas en 1984 por Hargraves y
colaboradores.
Materiales
Mortero con pilón.
Pipeta Pasteur.
Colador.
Tubos Wintrobe.
Centrifuga.
Laminas portaobjetos 25.4x76.2mm (1”x3”).
Colorante de Wright.
Aceite de inmersión.
Microscopio óptico.
Incubadora.
52
Procedimiento
1) Extraer 10 ml de sangre y dejar coagular durante 2 horas a 37 ºC.
2) Centrifugar a 3,500 rpm por 10 minutos.
3) Eliminar el suero y depositar el coagulo en el colador, que está sobre el
mortero.
4) Aplastar el coagulo con el pilón y recoger el producto en el mortero.
5) Pasar el líquido obtenido a un tubo Wintrobe con la pipeta Pasteur, y
centrifugar 15 minutos a 2000 rpm.
6) Usando la misma pipeta Pasteur, eliminar primero el suero hemolizado, y
luego tomar la capa de leucocitos y depositar en dos láminas portaobjeto
para realizar el frotis.
7) Aplicar la Tinción Wright a los frotis.
8) Observar e identificar las células LE en las preparaciones usando el
microscopio a un objetivo de 100x.
Resultados
Se reporta “No se Observan Células LE” ó “Se Observan Células LE”
53
VI. PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y COLORANTES
1. SOLUCIÓN DE TURK 2%
Ácido acético glacial…………………………………… 2,0 mL

*Solución acuosa de violeta de genciana al 1%........ 1,0 mL
Agua destilada…….……………………………………. 100 mL
*puede ser sustituido por 1 gota de cristal violeta.
Procedimiento
Se mezclan todos los reactivos y se guarda en frasco de vidrio en lugar fresco a
temperatura ambiente.
2. SOLUCIÓN DE HAYEN
Bicloruro de mercurio………………………………… 0,5 g

Sulfato de sodio ……………………………………… 5,0 g
Cloruro de sodio ……………………………………… 1,0 g
Agua destilada ………………………………………… 200 mL
Procedimiento
3. SOLUCIÓN OXALATO DE AMONIO 1%
Oxalato de amonio……………………………………… 1,0 g
54
Agua destilada c.s.p. …………………………………… 100 mL
Procedimiento
4. EDTA
EDTA en polvo………………………………………….. 8 g.
Agua destilada………………………………………….. 100ml
Procedimiento
Se mezcla el EDTA en el agua destilada.
5. CITRATO DE SODIO AL 3.8%
Citrato de sodio…………………………………………… 3,8 g

Agua destilada……………………………………………. 100 mL
Procedimiento
Se mezcla el citrato de sodio en el agua destilada.
6. COLORANTE DE GIEMSA
Colorante Giemsa en polvo …………………………….. 1,0 g

Metanol (CH3 OH) ……………………………………….. 66,0 mL
Glycerol ……………………………………………………. 66,0 mL
Procedimiento
1) Disolver el colorante con el glicerol.
2) Adicionar el metanol, mezclar bien y dejar a temperatura ambiente de 7 a
14 días (maduración).
55
3) Filtrar antes de su empleo. Guardar en frasco color oscuro.
7. COLORANTE DE WRIGHT
Colorante de Wright ………………………………………… 0,3 g

Metanol (CH3 OH) ………………………………………….. 97,0 mL
Glycerol ………………………………………………………. 3,0 mL
Procedimiento
Disolver en un mortero el colorante con el glicerol. Una vez disuelto se adiciona el
metanol trasvasándolo a un frasco oscuro (color caramelo), luego agite. Filtrar
antes de usar.
8. SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA AL 0,9%
Cloruro de sodio …………………………………………………… 0,9 g

Agua destilada c.s.p. ……………………………………………… 100 mL
Procedimiento
9. SOLUCION AZUL CRESIL BRILLANTE
Azul cresil brillante……………………………………………….. 1 g.

Citrato trisodico…………………………………………………… 0.4 g.
Solución de NaCl al 0.85%....................................................... 100ml
56
Procedimiento
10. SOLUCIÓN DE AZUL DE METILENO FOSFATADO.
Azul de metileno en polvo………………………………………… 1g

Fosfato disódico (NaHPO4)……………………………………….. 3g
Fosfato monopotásico (KH2PO4)………………………………… 1g
Agua destilada…………………………………………………….. 300 ml
Procedimiento
Mezclar en mortero seco y disolver 1 g de la mezcla en 300 ml de agua destilada,
filtrar si es necesario.
11. SOLUCIÓN ALCOHÓLICA DE GIEMSA
Giemsa en polvo………………………………………………….. 0.75g

Alcohol metílico……………………………………………………. 65.0 ml
Glicerina pura……………………………………………………… 35.0 ml
Procedimiento
Preparar en botella con perlas de vidrio, la cual se mantiene bien tapada y agitar 6
a 10 veces diarias. Después de 3 días se puede usar, si los ensayos demuestran
que el colorante es satisfactorio; filtrar si es necesario.
57
VII. BIBLIOGRAFÍA
 Rodak F. Bernadette. Hematología: Fundamentos y Aplicaciones Clínicas.

2a ed. Buenos Aires: Media Panamericana; 2004.
 Ruiz Arguelles, G. Fundamentos de Hematología. 4a ed. México: Editorial
Panamericana; 2009.
 Vives Corrons, J. Aguilar Bascompte, J. Manual de Técnicas de Laboratorio
en Hematología. 3a ed. España: ELSEVIER; 2006.
 Barbara H. Estridge Anna P. Reynolds. Basic Clinical Laboratory
Techniques. 6th ed. USA: DELMAR CENGAGE Learning; 2012
 Carr, Jacqueline H. Atlas de Hematología Clínica. 3a ed. Buenos Aires:
Médica Panamericana; 2010.
58
59

Protocolo Hemato 2013

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Manual de Hematología. Dpto. Microbiología y parasitología. UNAN-León.

6. COLORANTE DE GIEMSA .............................................................................................. 55

1. ANTICOAGULANTES USADOS EN HEMATOLOGÍA.

Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible, incluso

EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica, dipotásica o tripotásica del ácido

especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por

Citrato trisódico, C6H5O7Na3.

Heparina sódica. Heparina de litio.

2. CÓDIGO DE COLOR DE TAPONES.

El método mas común y rápido para la obtención de muestras sanguíneas es la

Materiales y equipos requeridos

Tubos con anticoagulante EDTA.

3) Limpiar la zona con alcohol al 70% o alcohol yodado, en un área de 2

4) El paciente deberá abrir y cerrar la mano durante unos segundos y después

5) Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de tal manera

6) Se fija la vena y se coloca la aguja en dirección paralela a esta, se perfora

7) Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido.

9) Retirar la aguja de la jeringa. Verter la muestra lentamente por las paredes

Ventajas de una extracción de sangre venosa

Desventajas de una extracción de sangre venosa

inadecuado para el análisis de gases, recuentos celulares, determinación

La sangre capilar es la obtenida por punción cutánea. Es una mezcla de sangre

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequeña o cuando por

2) Desinfectar la zona con alcohol al 70%, secar con algodón estéril.

II. BIOMETRÍA HEMÁTICA COMPLETA

El hematocrito se basa en la separación de los elementos celulares del plasma

Se determina midiendo la fracción que comprende a los glóbulos rojos (masa

Capilares con heparina

Capilares sin heparina.

Mechero con metanol.

2) Debe llenarse aproximadamente 3/4 del capilar. El Llenado se efectúa por

 Se debe homogenizar las muestras para asegurar la calidad del ensayo.

2. RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS

La sangre se diluye en un líquido que nos permite observar claramente los

Procedimiento (dilución 1/200):

Eritrocitos contados en 5 cuadrantes (R. Thomas) Dónde:

Superficie contada x Profundidad x Dilución *Superficie contada= 0.2 mm2

Eritrocitos contados en 5 cuadrantes (R. Thomas)

1/5 x 1/10 x 1/200

Simplificando, obtenemos el factor de multiplicación:

# de Eritrocitos /mm3 = Eritrocitos contados x 10,000

3. RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS

La sangre anticoagulada se deposita en un líquido que permite evidenciar los

Procedimiento (dilución 1/20):

leucocitos contados en 4 cuadrantes Dónde:

Simplificando, obtenemos el factor de multiplicación:

# de leucocitos/mm3 = leucocitos contados x 50

Corrección de valores para restar eritrocitos nucleados:

La concentración del número de Normoblastos (por mm3) es:

Normoblastos/mm3 = # de normoblastos contados x Leucocitos/mm 3

Leucocitos/mm3 Corregidos = Leucocitos/mm3 – Normoblastos/mm3

Procedimiento (dilución 1/100):

Plaquetas contadas en 5 cuadrantes (R. Thomas) Dónde:

1/5 x 1/10 x 1/100

Simplificando, obtenemos el factor de multiplicación:

# de Plaquetas /mm3 = Plaquetas contadas x 5,000

Causas de aumento (trombocitosis):

Causas de disminución (Trombopenia):

La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y

1) Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera BLANCO (BL), y

2.5 ml de H2O destilada 2.5 ml de H2O destilada

3) Mezclar e incubar 3 minutos a Temperatura ambiente.