Você está na página 1de 29

MANUAL DE IDENTIFICAÇÃO DE

BACTERIOPLÂNCTON

Organização:
Raimundo Bemvindo Gomes
André Ferreira Porfírio
Carlos Yuri Vieira de Sousa
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

Clostridium botulinum, bactéria anaeróbia estrita. Produz a toxina botulínica, que


causa paralisia fatal nos seres humanos. Na micrografia eletrônica de varredura acima
(colorida artificialmente), são notáveis os esporos. Cada bactéria possui de 3 a 8 μm de
comprimento.

1
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

Sumário reduzido
PARTE I – OBJETIVOS E FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
1. Objetivos ................................................................................................................................................................... 3
1.1. Objetivo geral ............................................................................................................................................... 3
1.2. Objetivos específicos .................................................................................................................................... 3
2. Fundamentação teórica ........................................................................................................................................... 3
2.1. Coleta ............................................................................................................................................................ 3
2.2. BHM - Bactérias Heterotróficas Mesófilas (Pour-plate) .............................................................................. 3
2.3. Purificação .................................................................................................................................................... 4
2.4. Isolamento..................................................................................................................................................... 4
2.5. Preservação ................................................................................................................................................... 4
2.6. Triagem ......................................................................................................................................................... 5
2.7. Coloração de Gram ....................................................................................................................................... 6
2.8. Testes complementares para os não fermentadores de lactose gram-negativos ........................................... 7
2.9. Teste de oxidase ............................................................................................................................................ 8
2.10. Provas bioquímicas ..................................................................................................................................... 9
PARTE II – PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
3. Preparativos que antecedem a coleta ...................................................................................................................... 12
4. Coleta ......................................................................................................................................................................... 12
5. BHM ........................................................................................................................................................................... 13
6. Purificação ................................................................................................................................................................. 14
7. Isolamento.................................................................................................................................................................. 15
8. Preservação ................................................................................................................................................................ 16
9. Triagem ...................................................................................................................................................................... 16
10. Coloração de Gram ................................................................................................................................................. 18
11. Testes complementares para gram-negativos não fermentadores de lactose .................................................... 19
12. Teste de oxidase ....................................................................................................................................................... 21
13. Provas bioquímicas ................................................................................................................................................. 21
13.1. Introdução .................................................................................................................................................... 21
13.2. Caldo vermelho de fenol .............................................................................................................................. 22
13.3. Meio SIM (Sulfeto, indol e motilidade)....................................................................................................... 23
13.4. Ágar LIA ...................................................................................................................................................... 23
13.5. Ágar TSI ...................................................................................................................................................... 24
13.6. Ágar leite ..................................................................................................................................................... 25
13.7. Ágar citrato de Simmons ............................................................................................................................. 25
13.8. Meio de Clark-Lubs - Prova do Vermelho de Metila (VM) ........................................................................ 26
13.9. Meio de Clark-Lubs - Prova de Voges-Proskauer (VP) .............................................................................. 26
13.10. Gelatina nutritiva ....................................................................................................................................... 27
PARTE III – PROCESSO FINAL DE IDENTIFICAÇÃO, CONSIDERAÇÕES FINAIS E REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
14. Processo final de identificação ............................................................................................................................... 27
15. Considerações finais................................................................................................................................................ 28
Referências bibliográficas ............................................................................................................................................ 28

2
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

1. Objetivos
1.1. Objetivo geral

 Capacitar o analista para realizar o procedimento de identificação de bactérias por meio de análises que
permitam observar características morfológicas e definir um perfil bioquímico.

1.2. Objetivos específicos

 Fornecer conhecimentos acerca da coleta de material para identificação de bacterioplâncton;


 Ensinar as técnicas envolvidas em procedimentos comuns em um laboratório de microbiologia, como
preparo de meios de cultura, técnicas assépticas de inoculação, além de técnicas de isolamento e de
preservação de bactérias;
 Classificar bactérias em gram-negativos e gram-positivos;
 Possibilitar o estabelecimento de um perfil bioquímico para a bactéria em estudo.

2. Fundamentação teórica
2.1. Coleta
Os frascos de vidro devem ser esterilizados a 121 ºC por 15 minutos em autoclave. Para fazer isso, eles
devem ser cobertos com jornal no fundo e papel-alumínio na tampa. Depois de estéreis, deve-se retirar o jornal e
manter o papel-alumínio até o momento da coleta, a fim de evitar a sua contaminação.
A coleta deve ser realizada de modo que o frasco fique completamente cheio, a fim de evitar ao máximo
a contaminação por bactérias do ar. A amostra coletada deve ser processada em até 8 horas, pois esse é o máximo
aceitável para garantir que a amostra representa a realidade do cenário analisado.

2.2. BHM – Bactérias Heterotróficas Mesófilas (Pour-plate)


O pour-plate é um método de contagem de micro-organismos. É preferível ao
spread-plate, já que, no primeiro, há a mistura entre meio de cultura e amostra, o que
permite que os micro-organismos cresçam em qualquer parte do meio de cultura. Isso
permite avaliar, de modo preliminar, o tipo de metabolismo do micro-organismo em
relação à utilização de oxigênio. Esse método é utilizado para a parte que seleciona as
bactérias heterotróficas mesófilas da amostra coletada.
Figura 1 - Pour-plate em ágar O meio de cultura utilizado para isso é o ágar PCA (Plate Count Agar – ágar
PCA após incubação
de contagem em placa). Um litro de ágar PCA possui, tipicamente, 5 g de peptona, 2,5 g
de extrato de levedura, 1 g de glicose e 15 g de ágar.

3
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

2.3. Purificação
As bactérias que vêm do ambiente estão, normalmente, acostumadas com escassez
de nutrientes, devido à competição com outras espécies por alimento, pela própria limitação do
meio onde vivem etc. Ao serem inoculadas no ágar PCA, elas passam a viver em um meio com
mais nutrientes, mas o ágar PCA não é um meio de cultura rico (porque, ressalte-se, é utilizado

Figura 2 - Caldo BHI para contagem, isto é, não ser rico em nutrientes é algo que deve ocorrer para que ele sirva para
seus objetivos).
Para oferecer aos micro-organismos um meio rico em nutrientes, elas são purificadas. A purificação
ocorre em caldo BHI (Brain Heart Infusion), por dois motivos. Primeiramente, o BHI é um meio composto por
cérebro e coração, elementos altamente nutritivos. Além disso, por se apresentar, nesse caso, como um caldo, os
nutrientes ficam mais acessíveis às bactérias do que ficariam em um ágar.

2.4. Isolamento
O processo de isolamento busca, idealmente, uma cultura pura, isto é, busca isolar uma única célula
microbiana para que ele dê origem a uma colônia por meio dos processos de divisão celular. Entretanto, é muito
difícil, por meio da técnica de isolamento que será descrita à frente, isolar uma única célula microbiana. Por isso,
trabalha-se com o conceito de cultura axênica.
Uma cultura axênica é uma cultura próxima de uma cultura pura, ou seja, ela foi
originada por um pequeno grupo de micro-organismos. Também pode ser originada de uma
única célula microbiana, diferenciando-se da cultura pura, porém, por o isolamento de uma
célula não ser garantido.

Figura 3 - Ágar nutritivo O isolamento é realizado para evitar erros nos procedimentos seguintes devido à
presenta de outras espécies de bactérias ou de outras cepas da bactéria em estudo. A técnica
de isolamento por esgotamento em placa de Petri produz resultados compatíveis com o conceito de cultura axênica.
Nesse caso, o isolamento é ocasionado pelo atrito entre o ágar e a amostra inoculada, que acarreta na deposição de
partes cada vez menores da amostra ao longo da estria realizada.

2.5. Preservação
A etapa de preservação da amostra busca manter o isolamento realizado anteriormente. Ela é realizada
utilizando tubos com 3 a 5 mL de ágar inclinado, podendo ser ágar BHI ou ágar nutritivo.
A inoculação em tubo com ágar pode ser feita de três modos. O
primeiro (figura à esquerda) é utilizado, principalmente, em ágar semissólido e
é denominado “picada em camada alta”. É uma
simples penetração no ágar em linha reta até próximo

4
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

do fundo do tubo. É útil para avaliar a motilidade de micro-organismos, que tendem a turvar o meio quando são
móveis ou a crescer somente ao redor da picada quando são imóveis. A figura central representa um dos dois tipos de
inoculação utilizados em tubos com ágar sólido. Ela é chamada de “estria” e é utilizada quando se deseja preservar a
colônia que crescerá após a inoculação. A figura à direita representa a “estria em linha reta”, segunda técnica para ágar
sólido. É empregada quando se deseja avaliar as características culturais do crescimento de bactérias em ágar
inclinado.

Na imagem ao lado é possível ver a diferença após o preparo de ágar em camada alta e
de ágar inclinado.
Após a inoculação da bactéria e o aparecimento da colônia de 24 a 48 horas depois,
podem ser usadas duas técnicas de preservação. A primeira consiste apenas em manter o micro-
organismo em geladeira (por volta de 4 ºC), a fim de retardar o seu metabolismo. Uma cepa
preservada desta maneira deve ser repicada, isto é, transferida para um novo meio a cada 20 dias, a
fim de a cultura não ficar muito velha. A segunda técnica possui uma duração maior:

Figura 4 - Ágar BHI aproximadamente 5 anos. É empregado óleo mineral estéril, que deve ser posto no tubo com a
inclinado
colônia até 1 cm acima do fim do bisel. Depois disso, o tubo também deve ser armazenado em
geladeira.
Observação: O óleo mineral é inflamável. Por isso, ao manusear uma cultura preservada com óleo
mineral, deve-se ter cuidado, pois a agulha utilizada nas inoculações fica com resíduos do óleo. Isso é perigoso tanto
na hora de aquecê-la ao rubro, pois é comum que haja produção de faíscas, que podem ferir o analista, quanto na hora
de introduzir a agulha no tubo, pois, se ela estiver quente, é possível que o óleo mineral se inflame.

2.6. Triagem
Na etapa de triagem são realizados os primeiros testes de metabolismo. Após sua conclusão, é possível
presumir duas coisas: (1) se a bactéria é gram-negativa ou gram-positiva (fato que será confirmado no procedimento
seguinte) e (2) em alguns casos identificar, o gênero e a espécie.
São utilizados dois meios de cultura: ágar EMB (Eosin Methylene
Blue – eosina azul de metileno) e ágar MacConkey. Ambos são seletivos e
diferenciais. O primeiro possui, entre outros componentes, lactose e os dois
corantes que lhe dão nome. A fermentação da lactose é um diferencial pois
separa as bactérias em dois grandes grupos. Dentre aqueles que fermentam, há a
bactéria E. coli, que gera coloração verde-metálico no meio devido à intensa

Figura 5 - Ágar EMB. A colônia adquiriu fermentação de lactose. Os dois corantes presentes (a eosina possui coloração
essa coloração porque fermentou a lactose
amarelada) inibem o crescimento da maioria das bactérias gram-positivas.

5
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

Observação: Depois de esterilizado, o azul de metileno presente no ágar EMB se transforma em um


composto transparente devido à falta de oxigênio no meio que decorre da alta temperatura, tornando o meio
amarelado. Assim, ele deve ser passado em um agitador do tipo vórtex até que chegue adquira sua coloração violeta
característica. Isso deve ser realizado logo após o meio sair da autoclave, pois ele deve voltar à cor original antes de
solidificar, ou seja, esse processo não pode ser realizado após a solidificação do meio,
ainda que ele seja fundido.

O ágar MacConkey também é utilizado para detectar a fermentação da


lactose, servindo como confirmação ao resultado obtido com o ágar EMB. Além da
lactose, possui sais biliares e cristal violeta (dentre outros componentes), substâncias
que inibem o crescimento da maioria das bactérias gram-positivas. Sua coloração
característica é um tom de rosa translúcido.
Figura 6 - Ágar MacConkey
A fermentação de lactose produz ácido láctico. Isso resulta na diminuição
do pH. Os corantes utilizados são sensíveis a essas mudanças, propiciando que o meio e/ou as bactérias adquiram uma
coloração específica, diferenciando os fermentadores dos não fermentadores de lactose (NFL). Além disso, o ágar
BEM, diferencia os fermentadores de lactose em fermentadores lentos (FLL) e fermentadores intensos (FIL). 3

2.7. Coloração de Gram


Esse passo é uma das técnicas mais importantes em bacteriologia. O método foi desenvolvido em Berlim
pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram (1853 – 1938) há mais de 120 anos, em 1894, sendo
modificado por microbiologistas com o decorrer do tempo. As modificações que correram desde o fim do século XIX
estão indicadas na tabela abaixo.

Método original Método atual Motivo

Utilizava violeta-de-genciana Utiliza violeta-de-metila O violeta-de-metila já contém um


fixador químico em sua composição,
facilitando o procedimento.

Utilizava uma mistura de solventes Utiliza etanol em concentração A mistura de solventes (etanol e
como solução descorante acima de 96 ºGL propanona) pode causar uma
hiperdescoloração, interferindo nos
resultados.

Utilizava fucsina fenicada. Utiliza safranina A safranina é utilizada porque, no


espectro da cor, diferencia-se mais
nitidamente do violeta utilizado
como primeiro corante.

Tabela 1 - Modificações na coloração de Gram

6
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

As bactérias são separadas em gram-negativas ou gram-


positivas conforme suas características culturais. As gram-positivas
possuem membrana plasmática e parede celular (mais espessa do que a
parede celular das bactérias gram-negativas), enquanto as gram-negativas
possuem membrana plasmática, parede celular, periplasma ou espaço
periplasmático e membrana externa.

A membrana externa das bactérias gram-negativas serve


como barreira ao primeiro corante utilizado. Ela é removida da célula
quando em contato com o etanol e, assim, a célula perde a cor (sendo
contracorada pelo segundo corante. Nas bactérias gram-positivas, o
primeiro corante penetra na parede celular e adere às estruturas internas da
célula. Depois de aderido, o corante não é removido pelo etanol.

Figura 7 - Diferenças estruturais entre bactérias Há de se falar, como um complemento, das bactérias álcool-
gram-positivas e gram-negativas
ácido-resistentes. Esse grupo de bactérias normalmente é pouco corada ou
não é corada pelo método desenvolvido por Gram. Classe representada principalmente pelo gênero Mycobacterium, é
composta por bactérias que possuem resistência à coloração e à descoloração, isto é, é difícil tanto corá-las como
descorá-las. Isso se deve à presença de ácidos micólicos na célula bacteriana. São coradas por meio do método de
Ziehl-Neelsen, técnica que não será abordada neste manual.
Observação: Como já dito, bactérias gram-positivas são, em sua grande maioria, inibidas pelos meios de
cultura utilizados na triagem. Por isso, caso uma bactéria que cresceu nos meios do tópico anterior seja classificada
como gram-positiva na coloração de Gram ou caso uma bactéria que não cresceu nos meios do tópico anterior seja
classificada como gram-negativa na coloração de Gram, as duas etapas devem ser repetidas para que se obtenha uma
confirmação dos resultados. Além disso, caso a coloração de Gram revele, microscopia, bactérias coradas como gram-
positivas e como gram-negativas, é provável que o isolamento não tenha sido eficiente e/ou a amostra esteja
contaminada. Nesse caso, deve ser repetido o procedimento de isolamento, de triagem (pois a contaminação pode ter
interferido nos resultados relativos à fermentação da lactose) e da coloração de Gram.

2.8. Testes complementares para os não fermentadores de lactose gram-negativos


Essa classe de bactérias possui muitos meios de cultura destinados exclusivamente à sua identificação.
Isso ocorre porque ela inclui classes de gêneros importantes, como o gênero Salmonella. Dentre os meios de cultura
disponíveis, utilizamos: Ágar SS (Salmonella Shigella), Ágar XLD (Xilose, Lisina e Desoxicolato) e Ágar HE
(Hektoen Enteric). Ambos são meios de cultura seletivos e diferenciais.
O ágar SS é utilizado, principalmente, para identificação de bactérias dos
gêneros que dão nome ao meio de cultura. Seus componentes, dentre outros, são lactose,
sais biliares nº 3, citrato de sódio, tiossulfato de sódio, citrato de amônio e ferro e os

7
Figura 8 - Ágar SS
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

corantes vermelho neutro e verde brilhante. O corante verde brilhante e os sais biliares são as substâncias que dão ao
meio a capacidade de inibir o crescimento de micro-organismos gram-positivos. Já o corante vermelho neutro o torna
diferencial, pois, como será visto mais à frente, ele muda a coloração da colônia e/ou do meio de acordo com o gênero
da bactéria, se essa for uma enterobactéria. Observe a coloração alaranjada na figura ao lado.
O ágar XLD possui um espectro um pouco mais amplo de utilização do que o
ágar SS. Dentre os seus componentes, L-Lisina, xilose, lactose, desoxicolato de sódio,
citrato de amônio e ferro, tiossulfato de sódio e vermelho de fenol. A seletividade do ágar
XLD ocorre devido ao desoxicolato de sódio, que impede o crescimento de bactérias
gram-positivas. O vermelho de fenol, por sua vez, causa a diferenciabilidade do meio,
diferenciando alguns gêneros de enterobactérias. Na figura à esquerda, pode-se ver a

Figura 9 - Ágar XLD coloração avermelhada.


O ágar HE é, dentre os três apresentados, o mais
seletivo de todos, utilizado com o mesmo fim dos dois anteriores. Seus componentes são sais
biliares nº 3, lactose, salicilina, tiossulfato de sódio, citrato de amônio e ferro, azul de
bromotimol e ácido fucsínico, dentre outros. As substâncias causadoras da seletividade são os
sais biliares nº 3, o ácido fucsínico e o azul de bromotimol, sendo este último o responsável
pelas alterações de cor do meio. Observe, na figura à direita, a coloração verde do ágar HE.
Figura 10 - Ágar HE
As alterações de cor ocorrem devido à produção ou à não-produção de ácido a
partir da lactose. Esse é o motivo para a substância utilizada para provocar mudança de cor no meio ser um indicador
de pH (vermelho neutro, vermelho de fenol e azul de bromotimol).
Devido à seletividade e à facilidade de caramelização de alguns carboidratos presentes, esses meios de
cultura não precisam e não devem ser esterilizados. Não precisam devido à alta seletividade impede os micro-
organismos que normalmente contaminam os meios de cultura de crescer. Além disso, devido à provável
caramelização, sua esterilização não é só desnecessária, mas proibida.

2.9. Teste de oxidase


O teste da oxidase é importante para detectar a produção da enzima citocromo-oxidase, importante
catalisador que está presente em bactérias como Pseudomonas spp., Neisseria spp. e Pleosiomonas spp. e ausente em
bactérias como Staphylococcus spp., bactérias entéricas e também em outros grupos.
A detecção se baseia no contato de uma cepa com tiras impregnadas com p-fenilenodiamina. O contato
da cepa com essa substância resulta na produção de indofenol, composto que muda rapidamente a coloração da tira.
As tiras devem ser guardadas em um recipiente exclusivo em geladeira, a fim de aumentar seu tempo de
uso. Antes da utilização, é necessário que o frasco fique fechado até atingir a temperatura ambiente. Depois disso, a
tira deve ser retira e o frasco fechado rapidamente e logo levado de volta à geladeira. A tira também deve ser usada
imediatamente após ser retirada do frasco.

8
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

Observação: Devido à presença de metais oxidáveis nas alças e agulhas de inoculação comuns, é
recomendada a utilização de palitos de madeira ou plástico estéreis (tais como alças de inoculação de plástico
descartáveis), ou, alternativamente, alças de platina. Além disso, uma mudança de cor que ocorre em 2 ou mais
minutos após o contato pode ser um falso positivo, dado que o reagente é altamente sensível a luz.

2.10. Provas bioquímicas


As provas bioquímicas buscam evidenciar as diferenças metabólicas que existem entre os micro-
organismos. Todos as provas bioquímicas (ou testes bioquímicos) são baseados na inoculação de um micro-organismo
isolado em um meio de cultura que contém: (1) um substrato específico, o qual se deseja analisar e (2) um tipo de
indicador que permita identificar a ocorrência ou não da reação entre o micro-organismo e um substrato.
Embora testes anteriores (como os que detectam a fermentação de lactose, fazendo uso de ágar EMB e
ágar MacConkey) também envolvam principalmente o metabolismo do micro-organismo estudado, essa etapa é
especificamente denominada provas bioquímicas porque reúne um conjunto relativamente grande de meios de cultura,
cada um com diferentes objetivos, o que permite construir um amplo perfil bioquímico da cepa em estudo,
diferentemente do caso citado, onde é detectado apenas uma característica (fermentação de lactose).
É importante atentar para as especificidades que alguns meios possuem, tais como características de
preparo, esterilização, inoculação, cultivo e/ou interpretação, já que pequenos erros nessa etapa podem afetar mais
intensamente todo o processo de identificação, pois um falso-negativo ou falso-positivo resultará na identificação
equivocada do micro-organismo em estudo.
Nesse tópico, cada teste bioquímico será abordado individualmente.
- Caldo vermelho de fenol
Uma importante diferença no metabolismo dos micro-organismos é a sua capacidade para fermentar
determinados açúcares. Contendo extrato de carne, peptona, cloreto de sódio, vermelho de fenol e um carboidrato,
esse meio de cultura é utilizado para evidenciar a capacidade de um micro-organismo fermentar o carboidrato
escolhido.
O processo se baseia na presença de vermelho de fenol, indicador de pH que assume as cores vermelha
em pH básico e amarela em pH ácido. Antes de inoculado, o meio é básico. A fermentação de um carboidrato resulta
na produção de ácido (s), o que leva à mudança de cor do meio.
Além disso, também é utilizado um tubo de Durhan que fica invertido. Esse tubo serve para aprisionar
gases que possam ser produzidos durante a fermentação, pois a produção de gases nesse processo é, também, uma
característica para diferenciar micro-organismos.
- Meio SIM (Sulfeto, indol e motilidade)
Esse meio de cultura semissólido tem mais de um objetivo. O “S” de sulfeto indica que o meio pode
detectar a produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) pelo micro-organismo em estudo. Caso esse gás seja produzido, ele

9
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

reagirá com o sulfato de amônio ferroso presente no meio, gerando um precipitado característico. Também há a
possibilidade de esse gás causar rachaduras e/ou bolhas no meio de cultura, embora esse não seja o meio mais usual
para identificar sua produção.
O “I” significa indol. Alguns micro-organismos possuem a enzima triptofanase, capaz de degradar o
aminoácido triptofano (muito comum nas proteínas), produzindo o indol. Após a incubação, é adicionado ao
crescimento bacteriano o Reativo de Kovacs. Se houver presença de indol, haverá uma reação que produzirá uma
mudança de coloração na superfície do meio.
O “M” significa motilidade. Ela pode ser detectada neste teste porque o meio SIM é um meio
semissólido. Com isso, caso o micro-organismo inoculado seja móvel, haverá um crescimento difuso no meio, isto é,
ele não se restringirá apenas à parte do meio que foi inoculada.
- Ágar LIA (Lysine and Iron Agar – ágar lisina e ferro)
Alguns dos componentes desse meio de cultura são L-Lisina, citrato férrico de amônio,
tiossulfato de sódio e púrpura de bromocresol. Ele permite evidenciar a presença de enzimas capazes
de descarboxilar e/ou desaminar o aminoácido lisina, pois os produtos resultantes dessas reações
geram diferentes alterações de cor no meio de cultura.
Além disso, também é possível, assim como no meio SIM, detectar a produção de sulfeto
de hidrogênio, pois o citrato férrico de amônio reage com o H2S produzido, formando o mesmo

precipitado característico que pode ser visto no meio SIM. Figura 11 - Ágar LIA

É importante dizer que o ágar LIA é muito sensível à temperatura e, por isso, não deve
ser aquecido por mais do que 20 segundos durante o preparo (que será descrito nos tópicos posteriores).
- Ágar TSI (Triple Sugar Iron – tríplice açúcar e ferro)
Os três açúcares aos quais o nome se referem são glicose, lactose e sacarose, principais componentes
desse meio de cultura ao lado do sulfato de amônio e ferro, do tiossulfato de sódio e do vermelho de fenol.
O vermelho de fenol indica se o micro-organismo em análise é capaz de fermentar algum dos açúcares
presentes no meio. Além disso, assim como no meio SIM e no ágar LIA, é possível detectar a produção de sulfeto de
hidrogênio (H2S) por meio da formação do precipitado característico, resultado da reação desse composto com o
sulfato de amônio e ferro presente no meio.
- Ágar leite
O ágar leite é composto por ATGE (Ágar Triptona, Glicose e Extrato de levedura) e leite (estéril). Seu
preparo é, como se verá adiante, um tanto mais complicado, pois envolve a esterilização do leite separado do ATGE
para, depois de estéreis, serem misturados. Isso ocorre porque o leite é esterilizado a uma temperatura mais baixa, a
fim de evitar sua degradação.

10
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

O leite é uma suspensão cuja principal proteína é a caseína. Algumas bactérias possuem enzimas capazes
de hidrolisar a caseína, gerando produtos solúveis em água. Essa reação gera uma mudança no aspecto do meio de
cultura por si só (não há uso de indicadores de pH, como na maioria dos outros meios de cultura), permitindo a
identificação dessa característica metabólica.
- Ágar citrato de Simmons
Esse ágar tem como componentes principais citrato de sódio, fosfato diácido de
amônio e azul de bromotimol. É um meio de cultura diferencial que evidencia a capacidade de
um micro-organismo utilizar citrato de sódio e fosfato diácido de amônio como fontes,
respectivamente, de carbono e nitrogênio, já que são as únicas fontes presentes. Caso o micro-
organismo utilize essas substâncias, haverá crescimento microbiano e os metabólitos produzidos
causarão, em contato com o azul de bromotimol, uma mudança de cor característica no meio.
- Meio de Clark-Lubs (Prova do vermelho de metila e prova de Voges-Proskauer)
O meio de Clark-Lubs é simples: composto por peptona, fosfato monoácido de
potássio e glicose. Permite verificar se o micro-organismo é capaz de fermentar a glicose pela
via ácido-mista e se é capaz de fermentar a glicose pela via butileno-glicólica. Para isso, são

preparados dois tubos com o mesmo meio para cada teste. Figura 12 - Ágar
Certos micro-organismos possuem a capacidade de fermentar o ácido pirúvico citrato de Simmons

(produto da glicólise) formando etanol e alguns ácidos orgânicos, como o ácido láctico, ácido metanoico (fórmico) e
ácido etanoico (acético). O indicador de pH vermelho de metila é adicionado ao meio após o crescimento bacteriano.
Sua cor é definida de acordo com a presença ou a ausência dos ácidos mencionados.

A prova de Voges-Proskauer identifica micro-organismos que produzem acetoína após a fermentação do


ácido pirúvico. Depois de hidrogenada, a acetoína forma o butano-2,3-diol (butileno-glicol). A detecção desses
metabólitos é feita com a adição, após o crescimento e nessa ordem, de solução de hidróxido de potássio 40 % e
solução de alfa-naftol 5 %. A primeira solução provoca uma reação entre o hidróxido de potássio e o butileno-glicol,
com a formação de butano-2,3-diona. Como essa reação não provoca mudança perceptível no meio, é utilizada a
solução de alfa-naftol, que, além de catalisar a reação supracitada, provoca, em alguns minutos, a mudança de
coloração característica do teste positivo.
- Gelatina nutritiva
É também um meio simples, composto de extrato de carne, peptona e gelatina. Nos primórdios da
microbiologia, Roberto Koch (1843 – 1910) utilizava gelatina como agente solidificante de meios de cultura.
Entretanto, muitas bactérias faziam o meio de cultura se tornar líquido após seu crescimento. Depois deu m tempo, ele
passou a utilizar ágar, proveniente de extratos de algas vermelhas, devido à sugestão de uma amiga.

11
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

O que ocorria é que algumas bactérias possuem enzimas proteolíticas que provocam a hidrólise da
gelatina. Hidrolisada, a gelatina perde a estrutura que lhe dá consistência e se transforma em líquido. Para se ter
certeza de que a gelatina está realmente hidrolisada e não apenas fundida devido à temperatura, ela é resfriada, após o
crescimento, a 20 ºC, que é quando é feita a leitura do teste.

3. Preparativos que antecedem a coleta


Ao chegar ao laboratório, a coleta deve ser processada preferencialmente de imediato. Para que isso
ocorra, os preparativos necessários devem ser realizados antes do dia da coleta.
Deve-se preparar água de diluição, ágar PCA, pipetas estéreis e placas estéreis. A água de diluição deve
ser feita de modo que cada garrafa possua 90 mL (pois cada garrafa receberá 10 mL de amostra ou de uma diluição
anterior). O ágar PCA deve ser preparo em tubos duplos, sendo que cada tubo deve conter 15 mL de meio. As pipetas
e placas devem ser embaladas para posterior esterilização.
Todos os materiais devem ser autoclavados a 121 ºC por 15 minutos e armazenados em local adequado.
As placas e pipetas devem permanecer na estufa de secagem a 60 ºC por algumas horas após a esterilização para que a
água residual evapore.

4. Coleta
4.1. Material utilizado
- Um frasco de boca larga para cada ponto de coleta (levar mais um ou dois como reserva)
- Papel alumínio; - Isopor;
- Jornal; - Gelo.
- Ligas;

4.2. Procedimento experimental


O frasco de vidro deve ser embalado com jornal embaixo e papel alumínio na tampa. O jornal deve ser
preso com uma liga e deve ser retirado após a esterilização em autoclave, que deve durar 15 minutos a 121 ºC.
Os fracos devem ser transportados em um isopor com gelo até o local da coleta. O papel alumínio deve
ser retirado logo antes da coleta. Deve-se posicionar o frasco na horizontal e a tampa deve ser aberta somente quando
estiver muito próxima da linha da água. O frasco deve ser imerso na horizontal ao início da coleta e deve ser posto na
vertical conforme o necessário para que fique completamente preenchido.
Após cheio, o frasco deve ser posto no mesmo isopor. Depois da coleta, a amostra deve ser processada
em, no máximo, 8 horas.

12
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

5. BHM
Observações:
1. Todo o material que for entrar em contato com a amostra (placas de Petri e meios de cultura, por
exemplo) devem ser esterilizados em autoclave a 121 ºC por 15 minutos (exceto quando outras condições de
temperatura e pressão forem explicitadas), tanto nesta como em todas as etapas que ocorrerão, motivo pelo qual a
esterilização não será mencionada na metodologia e seus materiais não serão citados no material utilizado.

2. Também não será informado nos tópicos seguintes a necessidade do uso de bico de gás, pois
sempre que se trabalhar com algum micro-organismo, ele é imprescindível. O mesmo vale para agulhas e alças de
inoculação.
3. Outras normas) tais como flambagem de tubos, aquecimento de agulhas e afins) não serão
mencionadas no procedimento, pois se pressupõe que o analista possui os conhecimentos fundamentais inerentes à boa
realização destes procedimentos.

5.1. Material utilizado


- Pipetas estéreis;
- Água de diluição estéril;
- Ágar PCA estéril em tubos;
- Placas de Petri estéreis.

5.2. Procedimento experimental


Primeiramente, as garrafas de água de diluição e as placas de Petri devem ser previamente identificadas
com a respectiva diluição, a fim de evitar erros no processo.
A amostra deve ser agitada suficientemente e, com uma pipeta estéril, devem ser coletados 10 mL da
amostra e despejados na garrafa identificada como 101. Depois de agitar essa garrafa, 10 mL devem ser coletados com
uma pipeta estéril e despejados na garrafa identificada como 100. Esse procedimento deve ser repetido até a última
diluição.
Depois de terminadas as diluições, procede-se ao pour plate. As diluições selecionadas devem ser
separadas das demais, o ágar PCA dos tubos deve ser fundido em micro-ondas e as placas estéreis devem ser
preparadas para uso. 1 mL da diluição da amostra deve ser despejado na placa estéril vazia. O ágar PCA fundido deve
ser despejado sobre a amostra na placa quando estiver com uma temperatura próxima de 45 ºC. Depois disso, a placa
deve ser deslizada sobre a mesa, fazendo movimentos na forma de 8, para que haja homogeneização do material. Esse
procedimento é repetido para todas as diluições.

13
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

5.3. Cultivo
As placas devem ser cultivadas a 35 ºC em estufa por até 72 horas. Um crescimento satisfatório ocorre,
geralmente, de 36 a 48 horas após a inoculação.

5.4. Resultados
Após o tempo necessário ao crescimento, as placas devem apresentar crescimento moderado de colônias
bacterianas. O ideal é que haja entre 30 e 300 colônias.

5.5. Discussões
Um crescimento de muitas colônias indica que o ecossistema analisado possui uma quantidade elevada de
bactérias heterotróficas mesófilas. O aparecimento de fungos é normal nessa fase do processo e suas colônias devem
ser desconsideradas, pois são analisadas com outros métodos.
Caso não haja crescimento ou ele seja escasso, é provável que tenha ocorrido erro no procedimento
experimental de inoculação, mas também é possível que o ambiente possua poucas bactérias do tipo BHM, caso sua
temperatura situe-se na faixa de 20~25 ºC.

5.6. Seleção de colônias


As colônias devem ser selecionadas com base na diversidade. Deve ser escolhida uma placa que
apresente entre 30 e 300 colônias de bactérias. As colônias mais diferentes entre si e se assemelhem a colônias de
bactérias devem ser selecionadas para a próxima etapa. A diferenciação de colônias é realizada principalmente com
base na cor e na forma.

6. Purificação
6.1. Material utilizado
- Caldo BHI em tubos (5 mL/tubo);

6.2. Procedimento experimental


O procedimento de inoculação é simples. Deve-se tocar a colônia selecionada com uma agulha de
inoculação e, em seguida, chacoalhar a agulha dentro do caldo BHI até que se tenha certeza que a parte da colônia que
estava na agulha foi transferida, pelo menos em parte, para o caldo.
Isso deve ser repetido para todas as colônias selecionadas.

6.3. Cultivo
Os tubos com caldo BHI devem ser cultivados em estufa a 35 ºC por até 48 horas. Normalmente, um
crescimento satisfatório ocorre de 18 a 24 horas após a inoculação.

6.4. Resultados
Não aplicáveis.

14
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

6.5. Discussões
Não aplicáveis.

7. Isolamento
7.1. Material utilizado
- Ágar nutritivo em placas.

7.2. Procedimento experimental


Existem dois tipos de estria em placa. O tipo I é chamado estria
em quadrante e o tipo II é chamado estria em placa toda. O tipo I é mais
recomendado nesta etapa por propiciar um isolamento melhor do que o tipo
II.
É recomendado que essa etapa seja realizada de duas a três
Figura 13 - Tipos de estria em placa vezes para que o isolamento seja garantido. Caso, ainda assim, não ocorra
isolamento, podem ser feitas diluições decimais. Essas diluições seriam
inoculadas a fim de obter uma colônia isolada.

7.3. Cultivo
As placas devem ser cultivadas em estufa a 35 ºC por até 48 horas. Normalmente, um crescimento
satisfatório ocorre de 24 a 36 horas após a inoculação.

7.4. Resultados
As bactérias devem ser isoladas para que se trabalhe
com uma colônia do tipo axênica.
À direita e à esquerda, dois exemplos de colônias
bacterianas isoladas.

Figura 14 - Exemplo Figura 15 - Exemplo de


de colônia bacteriana colônia bacteriana
isolada isolada

7.5. Discussões
O tamanho da bactéria e sua velocidade de duplicação são fatores que influenciam diretamente na
probabilidade de isolamento. Colônias de bactérias que são relativamente grandes e/ou que se duplicam rapidamente
tendem a se aglomerar mais facilmente do que aquelas que são pequenas e/ou tem um tempo de duplicação
relativamente longo. Desse modo, é importante atentar, quando não ocorrer o isolamento, para isso, pois é possível
que permitir um cultivo que dure menos tempo propicie o isolamento correto.

15
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

A quantidade de nutritivos do meio também influencia no isolamento. Caso seja necessário, pode ser
utilizado um meio menos nutritivo.

8. Preservação
8.1. Material utilizado
- Ágar BHI inclinado ou ágar nutritivo inclinado em tubos (de 3 a 4 mL/tubo)

8.2. Procedimento experimental


Depois de isoladas, as bactérias devem ser inoculadas em ágar inclinado por meio de estria em bisel.

8.3. Cultivo
Os tubos inoculados devem ser cultivados a 35 ºC por até 48 horas. Normalmente, um crescimento
satisfatório ocorre em torno de 24 horas no caso do ágar BHI e de 24 a 36 horas no caso do ágar nutritivo.
Após o crescimento, os tubos devem ser resfriados a, aproximadamente, 4 ºC, com ou sem óleo mineral
(segundo a técnica escolhida). É importante atentar para o tempo de repique, principalmente quando não se usa óleo
mineral.

8.4. Resultados
Não aplicáveis.

8.5. Discussões
Não aplicáveis.

9. Triagem
9.1. Material utilizado
- Ágar EMB em placas;
- Ágar MacConkey em placas;
- Colônia bacteriana jovem (inoculada a menos de 72 horas, preferencialmente a menos de 36 horas).

9.2. Procedimento experimental


Cada colônia bacteriana deve ser inoculada em uma placa de ágar EMB e em uma placa de ágar
MacConkey. A inoculação pode ser feita tanto por estria em quadrante como por estria em placa toda.

9.3. Cultivo
As placas devem ser cultivadas em estufa a 35 ºC por até 48 horas. Normalmente, ocorre um crescimento
satisfatório de 24 a 36 horas após a inoculação. Ainda assim, é necessário verificar o crescimento após 24 horas e
também após 48 horas.

16
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

9.4. Resultados
Há quatro resultados possíveis no ágar EMB:
1. Não ocorrer crescimento
2. Ocorrer crescimento de colônias incolores ou com sua coloração típica;
3. Ocorrer crescimento de colônias róseas, vermelhas ou roxas;
4. Ocorrer crescimento de colônias verde-metálicas.

No ágar MacConkey, existem três resultados possíveis:


1. Não ocorrer crescimento;
2. Ocorrer crescimento de colônias que tornam o meio ao seu redor amarelo;
3. Ocorrer crescimento de colônias que tornam o meio ao seu redor vermelho.

9.5. Discussões
Para cada um dos resultados acima, há uma
interpretação. No caso do ágar EMB, não ocorrer crescimento
indica que a bactéria é gram-positiva, tendo em vista que esse meio

Figura 16 - Possibilidades de crescimento no inibe o crescimento da maioria das gram-positivas. Ocorrendo


ágar EMB

crescimento, admite-se que a bactéria é gram-negativa. Colônias incolores ou com sua


coloração típica são classificadas como não fermentadoras de lactose, já que os corantes do
meio não mudaram sua cor original. Colônias róseas, vermelhas ou roxas indicam fermentação
lenta de lactose, pois esse tipo de processo fermentativo gera mudança na cor das colônias. O
crescimento de colônias com coloração verde-metálica indica fermentação intensa da lactose, tendo em vista que os
corantes só se combinam (amarelo da eosina e azul do azul de metileno) de modo a propiciar a cor verde quando
ocorre uma fermentação rápida.
No caso do ágar MacConkey, o não crescimento da bactéria também indica Figura 17 - Possibilidades
que ela é gram-positiva, pelo mesmo motivo do ágar EMB. Bactérias gram-negativas de crescimento no ágar
MacConkey
crescem tornando o meio amarelo caso não fermentem a lactose, e bactérias gram-
negativas fermentadoras de lactose (tanto as lentas quanto as intensas) tornam o meio vermelho.

17
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

Desse modo, podem-se montar as seguintes tabelas expostas abaixo.

Gram-negativa não Gram-negativa Gram-negativa


Ágar\Bactéria Gram-positiva fermentadora de fermentadora lenta de fermentadora intensa
lactose lactose de lactose

Ocorre crescimento de
Ocorre crescimento de Ocorre crescimento de
Não ocorre colônias incolores ou
Ágar EMB colônias róseas, roxas ou colônias de cor verde-
crescimento com suas colorações
vermelhas metálica
típicas

Ágar Não ocorre Ocorre crescimento que Ocorre crescimento que Ocorre crescimento que
MacConkey crescimento torna o meio amarelo torna o meio vermelho torna o meio vermelho

Tabela 2 - Interpretação do crescimento em ágar EMB e ágar MacConkey

10. Coloração de Gram


10.1. Material utilizado
- Descartador ou suporte para realização dos procedimentos com corante;
- Colônia bacteriana jovem (inoculada a menos de 72 horas, preferencialmente a menos de 36 horas);
- Lâmina de vidro;
- Microscópio óptico;
- Óleo de imersão;
- Solução de cristal violeta a 1 %;
- Solução de lugol fraco;
- Etanol 96 ºGL, no mínimo;
- Solução de safranina a 0,25 %;
- Água destilada.
10.2. Procedimento experimental
O procedimento é divido em duas partes: (1) preparar e fixar o esfregaço; (2) corar o esfregaço.
Para preparar o esfregaço, deve-se colocar na lâmina uma gota de água (não necessariamente destilada)
ou de solução de cloreto de sódio a 0,9 %. A agulha de inoculação contendo a colônia deve ser tocada na gota, que
deve, então, ser espalha numa área de, aproximadamente, 1 cm². A lâmina deve permanecer na bancada e próxima ao
bico de gás até que seque (isso deve ocorrer a temperatura ambiente, ou seja, a lâmina não pode ser aquecida). Depois
de seca, a lâmina deve ser passada na chama três vezes (uma vez consiste em uma ida e uma volta), a fim de fixar o
esfregaço à lâmina.
A lâmina deve ser colocada no suporte ou descartador para que se proceda à coloração. Uma quantidade
de solução a 1 % de cristal violeta suficiente para cobrir todo o esfregaço deve ser adicionada e permanecer por 60

18
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

segundos sobre a amostra. Depois disso, a amostra deve ser lavada com água destilada. Adiciona-se, então, lugol fraco
em quantidade suficiente para cobrir todo o esfregaço, permanecendo sobre esse também por 60 segundos. Depois, a
lâmina deve ser lavada com etanol 96 ºGL e, após, com água destilada. Por fim, deve-se adicionar solução de
safranina a 0,25 % em quantidade suficiente para cobrir todo o esfregaço. A safranina permanece por 30 segundos
sobre o esfregaço. Então, a lâmina deve ser lavada com água destilada. Deve-se esperar que a lâmina seque a
temperatura ambiente para visualizá-la ao microscópio. Pode-se usar papel higiênico para secar a lâmina, com o
cuidado de não tocar no esfregaço.
As lavagens, tanto com água como com etanol, não devem ser realizadas diretamente sobre o esfregaço,
mas sim acima deste, na parte superior da lâmina quando ela é inclinada.
A microscopia deve ser feita de modo que a observação definitiva deve ser realizada em objetivas de 40x
e 100x, sendo que na objetiva de 100x deve-se utilizar óleo de imersão. A visualização na objetiva de 100x deve ser
realizada por último, pois, após adicionar o óleo de imersão sobre o esfregaço, não é possível removê-lo e, portanto,
não é possível voltar à visualização na lente de 40x.
10.3. Resultados
As bactérias da amostra podem adquirir as cores azul/roxo ou vermelha/rosa.
10.4. Discussões
Bactérias visualizadas com a cor azul/roxo
são classificadas como gram-positivas, enquanto aquelas
visualizadas com cor vermelho/rosa são classificadas
como gram-negativas. Caso se visualize bactérias
azuis/roxas e bactérias vermelhas/róseas no mesmo
esfregaço, é provável que haja contaminação da cultura.
Nesse caso, deve-se refazer o processo d e isolamento
Figura 19 - Microscopia de (ver tópico 7). Figura 18 - Microscopia de
bactérias gram-negativas bactérias gram-positivas após a
após a coloração de Gram Bactérias que não se coram ou que ficam coloração de Gram
com coloração fraca podem ser bactérias álcool-ácido-
resistentes (BAAR). Nesse caso, é interessante realizar a coloração de Ziehl-Neelsen para verificar essa possibilidade.
11. Testes complementares para gram-negativos não fermentadores de lactose
11.1. Material utilizado
- Ágar SS em placas;
- Ágar XLD em placas;
- Ágar HE em placas;
- Colônia bacteriana jovem (inoculada a menos de 72 horas, preferencialmente a menos de 36 horas).
11.2. Procedimento experimental
Cada bactéria que se enquadre na classificação dada por esse tópico deve ser inoculada em uma placa de
ágar SS, uma placa de ágar XLD e uma placa de ágar HE.

19
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

11.3. Cultivo
As placas devem ser cultivadas a 35 ºC por até 48 horas. Normalmente, um crescimento satisfatório
ocorre em torno de 24 horas após a inoculação. Ainda assim, é necessário verificar o crescimento após 24 horas de
inoculação e também após 48 horas de inoculação.
11.4. Resultados
Para o ágar SS, os resultados possíveis são:
1. Não ocorrer crescimento;
2. Ocorrer crescimento de colônias claras ou incolores sem centros negros;
3. Ocorrer crescimento de colônias claras ou incolores com centros negros;
4. Ocorrer crescimento de colônias róseas/vermelhas.
Para o ágar XLD, os resultados possíveis são:
1. Não ocorrer crescimento;
2. Ocorrer crescimento de colônias vermelhas sem centros negros
3. Ocorrer crescimento de colônias vermelhas com centros negros;
4. Ocorrer crescimento de colônias róseas com centros negros;
5. Ocorrer crescimento de colônias amarelas.
Para o ágar HE, os resultados possíveis são:
1. Não ocorrer crescimento;
2. Ocorrer crescimento de colônias verde-claras;
3. Ocorrer crescimento de colônias verdes ou verde-azulada com centros negros;
4. Colônias amarelas ou alaranjadas (podendo haver precipitados biliares ao redor das colônias e
halos cor de salmão ou laranja).
11.5. Discussões
Os gram-negativos inibidos nos três meios de cultura são alguns coliformes, como Escherichia coli ou
Enterococcus faecalis. Entretanto, como a inibição não é tão alta, esses micro-organismos ainda podem crescer.
No ágar SS, Shigella spp. cresce formando colônias claras ou incolores, assim como bactérias
formadoras de sulfeto de hidrogênio (principalmente, Salmonella spp. e Proteus spp.), que se diferenciam das
primeiras por possuírem centros negros em suas colônias. Os coliformes que são parcialmente inibidos crescem
formando colônias pequenas que podem ser róseas ou vermelhas.
No ágar XLD, Shigella spp. cresce formando colônias vermelhas, assim como Salmonella spp., que se
diferencia da primeira, assim no ágar SS, pela presença do centro negro na colônia. Proteus spp. cresce formando
colônias róseas com centros negros. Escherichia coli é parcialmente inibida e forma colônias amareladas.
No ágar HE, Shigella spp. cresce formando colônias verde-claras. Salmonella spp. cresce formando
colônias verdes ou verde-azulada com centros negros. Os coliformes que são parcialmente inibidos formam colônias
amarelas ou alaranjadas que podem possuir precipitados biliares ao redor das colônias e também halos cor de salmão
ou laranja.

20
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

Com esses dados, podem ser montadas as tabelas que são expostas a seguir.

Meio\Bactéria Shigella spp. Salmonella spp. Proteus spp. Coliformes*


Ágar SS Colônias Colônias Colônias Colônias pequenas
claras/incolores claras/incolores com claras/incolores com róseas ou vermelhas
centros negros centros negros
Ágar XLD Colônias vermelhas Colônias vermelhas Colônias róseas com Colônias amareladas
com centros negros centros negros (E. coli)
Ágar HE Colônias verde- Colônias verdes ou - Colônias amarelas ou
claras verde-azulada com alaranjadas com sais
centros negros biliares e halos cor
de salmão/laranja
*Apenas algumas espécies

12. Teste de oxidase


12.1. Material utilizado
- Tiras de oxidase impregnadas com p-fenilenodiamina;
- Colônia bacteriana jovem (inoculada a menos de 72 horas, preferencialmente a menos de 36 horas);
- Agulha/Alça de platina ou palito de madeira estéril.
12.2. Procedimento experimental
Com a agulha/alça ou palito de madeira estéril, deve-se tocar a colônia de bactéria e transferir uma
amostra para as tiras de oxidase.
12.3. Resultados
O resultado ocorre entre 0 e 120 segundos após o depósito da amostra na tira de oxidase e é perceptível
devido à mudança de cor da tira.
Caso a tira adquira cor rosa forte em menos de 20 segundos, o teste é positivo. Se a mudança de cor
ocorrer de 21 a 120 segundos após o depósito, o teste é fracamente positivo. Em não ocorrendo mudança de cor ou
ocorrendo mudança após 120 segundos, o teste é negativo.
12.4. Discussões
A mudança de cor só é caracterizada como evidência da presença da enzima citocromo-oxidase quando
ocorrer em menos de 120 segundos, tendo em vista que pode haver interferência no resultado devido à exposição à luz
durante o teste.
13. Provas bioquímicas
13.1. Introdução
Ainda que algumas bactérias (bactérias dos gêneros Salmonella e Shigella, por exemplo) possam ser
identificadas antes das provas bioquímicas, essa etapa é essencial, pois permite uma caracterização detalhada do
metabolismo do micro-organismo estudado. Desse modo, pode-se identificar a espécie de uma bactéria cujo gênero já
foi identificado.

21
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

Por exemplo, S. typhi e S. enterica são duas espécies do gênero Salmonella e, portanto, crescem do
mesmo modo no ágar SS, no ágar XLD e no ágar HE, ou seja, não é possível diferenciá-las por esses testes. Durante
as provas bioquímicas, essa diferenciação é possível, pois S. typhi gera resultado negativo no teste do ágar citrato de
Simmons, enquanto S. enterica gera um resultado positivo.
Existem muitos testes bioquímicos disponíveis. Existem testes que são realizados de acordo com as
características do micro-organismo já observadas durante o processo. Por exemplo, caso se saiba que o micro-
organismo é um coco que se organiza em cadeias, possivelmente está se trabalhando com uma bactéria do gênero
Streptococcus. Nesse caso, é interessante utilizar ágar sangue para verificar se o micro-organismo é alfa, beta ou
gama-hemolítico.
Desse modo, os testes bioquímicos a serem realizados dependem dos resultados que foram obtidos no
decorrer do processo. É importante ressaltar que são utilizados vários meios de cultura especiais, que possuem
características específicas no preparo, na esterilização, na inoculação, no cultivo e/ou na interpretação dos resultados.
Por isso, deve-se ter bastante atenção a cada processo, a fim de evitar erros, que podem culminar numa identificação
incorreta do micro-organismo.
Para todas as provas bioquímicas, é necessário ter uma colônia bacteriana jovem (inoculada a menos de
72 horas, preferencialmente a menos de 36 horas).
13.2. Caldo vermelho de fenol
13.2.1. Material utilizado
- Caldo vermelho de fenol com pH devidamente ajustado (cor vermelho cereja) em tubos estéreis com tubo
de Durhan adicionado de um carboidrato.
13.2.2. Procedimento experimental
Deve-se tocar a colônia e transferi-la para o tubo com o caldo vermelho de fenol, chacoalhando a
agulha/alça de inoculação contra as paredes do tubo até que a amostra que estava na agulha seja transferida, pelo
menos em parte, para o líquido.
13.2.3. Cultivo
Os tubos devem ser incubados em estufa a 35 ºC por até 48 horas. Normalmente, um crescimento
satisfatório ocorre entre 18 e 24 horas após a inoculação.
13.2.4. Resultados
Os resultados possíveis são:
1. Não ocorrer crescimento
2. Ocorrer crescimento sem produção de gás
3. Ocorrer crescimento com produção de gás
13.2.5. Discussões
O indicador de pH presente, vermelho de fenol, indica a presença de produtos ácidos mudando a cor do
meio de vermelho para amarelo. Essa mudança ocorre quando o micro-organismo fermenta o carboidrato presente,
gerando produtos ácidos. A presença de gás é evidenciada por bolhas no tubo de Durhan, indicando se a fermentação
do micro-organismo gera ou não produtos gasosos (normalmente, CO2)
Caso não ocorra crescimento, o meio permanece vermelho e o tubo de Durhan continua sem gás. Nesse
caso, diz-se que o micro-organismo não fermenta o carboidrato em questão.

22
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

13.3. Meio SIM (Sulfeto, indol e motilidade)


13.3.1. Material utilizado
- Meio SIM em tubos (em camada alta);
- Reativo de Kovacs.
13.3.2. Procedimento experimental
Esse procedimento só pode ser feito com agulha de inoculação, portanto é recomendado que se utilize
uma cultura em meio sólido. Com a agulha, deve-se tocar a colônia bacteriana e inoculá-la no meio em picada, sendo
que a agulha deve ir até, pelo menos, ¾ da profundidade total do meio de cultura. Não se deve encostar o parafuso da
agulha na parte superior do meio.
13.3.3. Cultivo
Os tubos devem ser incubados em estufa a 35 ºC por até 48 horas. Normalmente, um crescimento
satisfatório ocorre em 24 horas
13.3.4. Resultados
Os resultados que podem ocorrer após o cultivo são relativos à produção de sulfeto de hidrogênio, à
produção de indol, à motilidade e ao tipo de metabolismo do micro-organismo em relação ao oxigênio. A produção de
sulfeto é evidenciada pela presença de precipitado negro no meio; a produção de indol é evidenciada após a adição de
algumas gotas do reativo de Kovacs após o crescimento; a motilidade é detectada pela turvação do meio; e o tipo de
metabolismo é detectado pela parte do meio onde ocorre o crescimento.
13.3.5. Discussões
A produção de sulfeto de hidrogênio é evidenciada pelo sulfato de amônio e ferro II, que é o indicador do
meio para H2S. A produção de H2S pode ocorrer devido à hidrogenação do enxofre presente em aminoácidos (como a
cisteína), devido à redução de compostos inorgânicos (como tiossulfatos, sulfitos e sulfatos), ou devido a processos
envolvendo outros substratos. Quando presente, o sulfeto de hidrogênio reage com o sulfato de amônio e ferro II,
formando sulfeto de ferro II, que é o precipitado negro visualizado.
Como o meio SIM é semissólido, ele permite que a bactéria em questão se movimente. Com isso, se
houver crescimento restrito ao local da inoculação (picada), diz-se que o micro-organismo é imóvel; se o crescimento
se espalhar pelo meio, o micro-organismo é classificado como móvel.
A produção de indol pelo micro-organismo ocorre a partir de processos que envolvem o triptofano
(aminoácido). O reativo de Kovacs (composto por álcool isoamílico, ácido clorídrico concentrado e para-
dimetilaminobenzaldeído) fornece n-dimetilaminobenzaldeído ao meio, composto que reage com o indol e forma um
complexo que se apresenta como um anel avermelhado acima do meio entre 10 e 15 minutos após a adição.
Por fim, se o micro-organismo crescer somente na parte superior do meio, diz-se que ele é aeróbio estrito.
Em ocorrendo crescimento em todo o meio de modo uniforme, o micro-organismo é classificado como anaeróbio
facultativo. Se o crescimento ocorrer mais na parte inferior do que na parte superior, o micro-organismo é dito
anaeróbio aerotolerante. Anaeróbios estritos crescem somente na parte inferior do meio.
13.4. Ágar LIA (Lysine and Iron Agar)
13.4.1. Material utilizado

23
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

- Ágar LIA em tubos.


13.4.2. Procedimento experimental
Esse procedimento só pode ser feito com agulha de inoculação, portanto é recomendado que se utilize uma
cultura em meio sólido. Com a agulha, deve-se tocar a colônia bacteriana e inoculá-la no meio de modo que seja feita
picada (até aproximadamente ¾ da profundidade) e estria no bisel. Não se deve encostar o parafuso da agulha na parte
superior do meio.
13.4.3. Resultados
O ágar LIA permite verificar a descarboxilação e a desaminação da lisina, bem como a produção de sulfeto
de hidrogênio. Os testes são negativos se o meio permanecer púrpura na parte superior e tornar-se amarelo na parte
inferior. A descarboxilação da lisina é evidenciada quando a parte inferior do ágar permanece púrpura, e sua
desaminação é detectada quando a superfície do ágar adquire coloração vermelha. O sulfeto de hidrogênio é
detectável, assim como nos meios anteriores, pela formação de um precipitado negro.
O ágar LIA deve ser utilizado somente para fermentadores de glicose, pois não é possível avaliar
corretamente a descarboxilação e a desaminação da lisina para micro-organismos não fermentadores.
13.4.4. Discussões
O ágar LIA contém púrpura de bromocresol como indicador de pH, substância que promove a cor amarela
em pH menor do que ou igual a 5,2 e a cor púrpura em pH maior do que ou igual a 6,8. Quando fermentada, a
dextrose, fonte de carboidratos do meio, altera o pH no fundo do tubo de básico para ácido, gerando a mudança de cor
de púrpura para amarelo.
A descarboxilação e a desaminação da lisina dependem de enzimas que funcionam apenas em pH menor do
que 5,5 e tem a atividade aumentada em anaerobiose. Com isso, é necessário que o micro-organismo fermente a
dextrose, já que essa fermentação gera produtos ácidos. Para que se
chegue a uma concentração baixa de oxigênio no fundo do meio (o
que é próximo da anaerobiose), o ágar LIA deve ser preparado de
modo que a parte abaixo do bisel tenha uma altura considerável, o Figura 20 - Descarboxilação da lisina (à
que diminui a entrada de oxigênio no meio. esquerda) gerando cadaverina (à direita) e CO2.
Com o pH em meio ácido, a enzima, se presente, descarboxilar a lisina, gerando a amina cadaverina. Essa
descarboxilação gera produtos básicos, que aumentam o pH do meio e voltam a torná-lo completamente púrpura.
Portanto, caso não haja descarboxilação da lisina e haja fermentação da glicose, o fundo do meio adquirirá coloração
amarela.
O sulfeto de hidrogênio é detectável de mesmo modo e pelos mesmos princípios dos meios de cultura
abordados anteriormente. Entretanto, caso se esteja trabalhando com micro-organismos que não são capazes de
descarboxilar a lisina, o pH ácido no fundo do tubo pode suprimir a formação de sulfeto de hidrogênio. Isso acontece,
por exemplo, com espécies do gênero Proteus, que, apesar de produzirem sulfeto de hidrogênio, não escurecem esse
meio porque não são capazes de descarboxilar a lisina e tornar o pH básico novamente. A detecção desses micro-
organismos se dá pela desaminação da lisina, que gera uma coloração marrom-avermelhada no bisel.
13.5. Ágar TSI (Triple Sugar Iron)
13.5.1. Material utilizado
- Ágar TSI em tubos.
13.5.2. Procedimento experimental

24
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

Esse procedimento só pode ser feito com agulha de inoculação, portanto é recomendado que se utilize uma
cultura em meio sólido. Com a agulha, deve-se tocar a colônia bacteriana e inoculá-la no meio de modo que seja feita
picada (até aproximadamente ¾ da profundidade) e estria no bisel. Não se deve encostar o parafuso da agulha na parte
superior do meio.
13.5.3. Resultados
O ágar TSI permite verificar a fermentação de glicose, lactose e sacarose, além da produção de sulfeto de
hidrogênio. A fermentação da glicose é observada no bisel do meio de cultura. Ela é positiva quando o meio se torna
amarelo e negativa quando ele permanece vermelho. A fermentação de lactose e sacarose é observada na parte inferior
do meio, seguindo o mesmo padrão de cores.
13.5.4. Discussões
Para cada litro de ágar TSI, há 1,0 g de glicose, 10,0 g de lactose e 10,0 g de sacarose. Como já dito, a
fermentação de carboidratos gera produtos ácidos. O indicador do meio é o vermelho de fenol, que gera coloração
amarela em pH menor do que 6,6 e coloração vermelha em pH maior do que 8,0.
Por ser mais fácil de metabolizar, a glicose é fermentada primeiro e, por isso, é observada no bisel, enquanto
lactose e sacarose tem sua fermentação analisada no fundo do tubo. A produção de sulfeto de hidrogênio é evidenciada
do mesmo modo e pelos mesmos princípios abordados anteriormente.
13.6. Ágar leite
13.6.1. Material utilizado
- Ágar leite em placas.
13.6.2. Procedimento experimental
Com uma agulha ou alça de inoculação, deve-se tocar a colônia ou suspensão da bactéria analisada e estriá-la
na placa de Petri utilizando a técnica de estria em quadrantes.
13.6.3. Resultados
O ágar leite permite detectar a hidrólise da caseína por meio da formação de um halo transparente ao redor
do crescimento da colônia.

13.6.4. Discussões
O ágar leite não contém indicadores. É composto por ATGE e leite estéril. A caseína encontra-se suspensa
no leite. Alguns micro-organismos são capazes de provocar sua hidrólise. Quando isso ocorre, há a formação de
produtos solúveis em água, transformando, portanto, a suspensão em uma solução. Desse modo, a área ao redor do
crescimento perde a coloração esbranquiçada característica e se torna transparente.
13.7. Ágar citrato de Simmons
13.7.1. Material utilizado
- Ágar citrato de Simmons em tubos.
13.7.2. Procedimento experimental

25
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

Com uma agulha ou alça de inoculação, deve-se transferir parte da colônia para o meio, inoculando-a por
meio de estria em bisel.
13.7.3. Resultados
O ágar citrato de Simmons permite identificar micro-organismos capazes de utilizar o íon citrato como fonte
de carbono.
13.7.4. Discussões
A única fonte de carbono presente no ágar citrato de Simmons é o citrato de sódio. O meio contém azul de
bromotimol como indicador de pH e é neutro, por isso possui coloração verde-escuro. Há crescimento de micro-
organismos se, e somente se, esse for capaz de metabolizar o íon citrato. Esse processo gera produtos alcalinos, que
elevam o pH do meio e provocam a mudança de cor do verde para azul.
13.8. Meio de Clark-Lubs – Prova do Vermelho de Metila (VM)
13.8.1. Material utilizado
- Meio de Clark-Lubs em tubos;
- Solução indicadora de vermelho de metila.
13.8.2. Procedimento experimental
Com uma agulha ou alça de inoculação, deve-se transferir parte da colônia em estudo para o meio,
chacoalhando a agulha/alça contra as paredes de tubo de modo a se certificar que o micro-organismo foi transferido
em quantidade apreciável.
Após o crescimento, devem ser adicionadas algumas gotas de solução indicadora de vermelho de metila.
13.8.3. Resultados
Neste teste, o meio de Clark-Lubs permite identificar micro-organismos capazes de fermentar o ácido
pirúvico (piruvato), produto da glicólise. A adição de vermelho de metila provoca uma coloração vermelha se o teste
for positivo e amarela se o teste for negativo.
13.8.4. Discussões
A quebra de uma molécula de glicose em duas moléculas de ácido pirúvico é o que se chama de glicólise.
Alguns micro-organismos são capazes de fermentar esse ácido, gerando produtos também ácidos, como ácido
metanoico (fórmico) e etanoico (acético). Após a adição do vermelho de metila, é possível verificar se tais produtos
ácidos foram produzidos por meio da cor do indicador.
13.9. Meio de Clark-Lubs – Prova de Voges-Proskauer (VP)
13.9.1. Material utilizado
- Meio de Clark-Lubs em tubos;
- Solução de hidróxido de potássio 40 %;
- Solução de alfa-naftol 5%.

26
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

13.9.2. Procedimento experimental


Com uma agulha ou alça de inoculação, deve-se transferir parte da colônia em estudo para o meio,
chacoalhando a agulha/alça contra as paredes de tubo de modo a se certificar que o micro-organismo foi transferido
em quantidade apreciável.
Após o crescimento, devem-se adicionar, nessa ordem e para cada 1,0 mL de meio de cultura, 0,2 mL de
solução de hidróxido de potássio 40 % e 0,6 mL de solução de alfa-naftol 5 %.
13.9.3. Resultados
A produção de acetoína e, portanto, a utilização da via butileno-glicólica para fermentar a glicose é
evidenciada, aproximadamente, 15 minutos após a adição das soluções e é indicada pelo surgimento de um anel
vermelho/fúcsia na parte superior do meio de cultura.
13.9.4. Discussões
A acetoína é uma substância produzida por micro-organismos que fermentam a glicose pela via butileno-
glicólica. Depois de hidrogenada, ela se transforma em butano-2,3-diol, chamado de butileno-glicol. Quando essa
substância, também chamada butileno-glicol, entra em contato com o hidróxido de potássio, inicia uma lenta reação
que forma butano-2,3-diona. Além disso, não há mudança de coloração nessa reação.
Por isso, adiciona-se a solução de alfa-naftol 5 %. Além de catalisar a reação, o alfa-naftol forma um
complexo de cor vermelha/fúcsia que permite verificar se o teste é positivo ou negativo.
13.10. Gelatina nutritiva
13.10.1. Material utilizado
- Gelatina nutritiva em tubos.
13.10.2. Procedimento experimental
Com uma agulha ou alça de inoculação, deve-se transferir parte da colônia para o meio, inoculando-a por
picada.
13.10.3. Resultados
Este teste permite avaliar a hidrólise da gelatina. Após o crescimento, deve-se levar a gelatina a um ambiente
com temperatura de 20 ºC. Após o tempo necessário para o meio atingir essa temperatura, deve-se verificar se ele está
líquido (positivo) ou sólido (negativo).

13.10.4. Discussões
A gelatina nutritiva permite identificar micro-organismos proteolíticos, isto é, aqueles que conseguem
quebrar proteínas. Quando isso ocorre, a gelatina é hidrolisada e não consegue se solidificar a 20 ºC (o que ocorreria
antes do crescimento).
14. Processo final de identificação
Após todas essas etapas, deve-se fazer uma tabela que apresente todos os resultados observados:
características morfológicas das bactérias, coloração de Gram e testes bioquímicos. Depois disso, essa tabela deve ser

27
Instituto Federal do Ceará – campus Fortaleza
Pró-reitoria de Ensino
Diretoria de Ensino
Departamento da Área de Química e Meio Ambiente
Laboratório de Limnologia e Microbiologia Ambiental

Professor: Bemvindo Gomes


Colaborador: Carlos Vieira

comparada com as inúmeras tabelas existentes nos diversos livros de microbiologia. Dependendo das comparações
realizadas, podem ser necessários mais testes, para que se confirme a identificação.
Um bom livro para ser usado como referência é o Diagnóstico Microbiológico – Texto e Atlas Colorido,
de Elmer Koneman (Editora Koogan Guanabara, 6ª edição).

15. Considerações finais


O processo de identificação de bactérias é longo e trabalhoso. Devido a isso, torna-se fácil a ocorrência
de erros por falta de atenção. Buscando evitá-los, o analista deve realizar todas as etapas com a máxima concentração
possível e seguindo as instruções contidas neste material e aquelas dadas pelo orientador.
É importante, também, ressaltar que o analista não deve fazer um procedimento para o qual não esteja
seguro. Dúvidas são importantes e devem ser esclarecidas antes da realização da respectiva etapa, pois alguns erros
têm sérias consequências, como prejuízos ao processo de identificação, risco à saúde do analista, entre outros. Assim,
deve-se buscar a solução delas com o orientador, por meio de pesquisas neste material, em livros e na internet.
Os resultados obtidos devem ser apresentados ao orientador para que este avalie a possibilidade de
estarem corretos. Ainda, deve-se fazer uma busca em livros e na internet, a fim de que tais resultados sejam
comparados a outros, presentes em artigos, livros online etc.

Referências bibliográficas
FILHO, Lauro Santos. Manual de microbiologia clínica. João Pessoa: Editora Universitária/UFPB, 1996. 195 p.
KONEMAN, Elmer et al. Koneman, diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. 6º ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2008.
MARTINS, C. R. F. et al. Técnica de Coloração de Gram. Brasília: Ministério da Saúde, Programa Nacional de
Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS, 1997. 63 p.
MARTINS, Andreza Francisco et al. Bacteriologia clínica: manual de aulas práticas. Porto Alegre: Editora Sulina;
Editora Universitária Metodista IPA, 2010. 101 p.
SILVA, Neusely; JUNQUEIRA, Valéria Cristina Amstalden; SILVEIRA, Neiliane Ferraz de Arruda. Manual de
métodos de análise microbiológica de alimentos. São Paulo: Livraria Varela, 1997. 317 p.

28

Você também pode gostar