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El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molécula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la
unión de secuencias de ADN proveniente de dos organismos de especies diferentes que normalmente no se encuentran
juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo se produce una modificación genética que permite la
adición de un nuevo ADN al organismo conllevando a la modificación de rasgos existentes o la expresión de nuevos rasgos.
La producción de una proteína no presente en un organismo determinado y producidas a partir de ADN recombinante se
llaman proteínas recombinantes.

 
   

  

     
 

  
    
 
   




 
 
  
 
El cultivo celular debe de estar a una densidad óptica de 0.6 a 0.8, ya que de acuerdo a la escala de crecimiento bacteriano
se encuentra en la mitad de la fase log, lo cuál nos indica una gran proliferación de las células bacterianas, las cuales están
maduras por tanto beneficia el proceso de expresión de proteínas recombinantes.

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c$%
El IPTG es un análogo sintético de gran estabilidad de la lactosa. El IPTG se utiliza para inducir la expresión de genes
clonados que están bajo control del operónlac. Se utiliza en relación con el X-Gal para determinar el fenotipo lac en azul /
blanco de detección de colonias.
Induce la transcripción del gen que codifica para la beta-galactosidasa, una enzima hidrolasa que cataliza la hidrólisis de ɴ-
galactósidos en monosacáridos. Una ventaja de IPTG para los estudios in vivo es que, como no puede ser metabolizado por
E. coli su concentración se mantiene constante y la tasa de expresión de estos factores lac / genes controlados o-, no es una
variable en el experimento. La ingesta de IPTG depende de la acción de la lactosa permeasa.

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Utilizar otra cepa bacteriana que tenga mejores condiciones para producir la proteína se interés, además se podrían
considerar también el utilizar otro vector (Plásmido) el cual pueda ser de alta copia, lo cual se obtendría más expresión de la
proteína tanto por el plásmido como por el crecimiento bacteriano, caso contrario lo que sucede con los plásmidos pET, ya
que son de baja copia y la expresión de la proteína depende solo del crecimiento bacteriano y del inductor, en este caso en
particular, se obtenía mayor cantidad de proteína debido a que en cada tiempo de muestra se tenían más bacterias, lo cual
se debió de corregir para tener un resultado más de acuerdo con el procedimiento, para realizar dicha corrección debió
haberse medido la densidad óptica inicial para el tiempo cero y así para los demás tiempos y con esta relación ir
disminuyendo los mililitros a utilizar y así ver realmente cuanta proteína se expreso.


 

  

La agregación es un fenómeno que aparece cuando las bacterias se enfrentan a un estrés celular, tal como el que se da
cuando nosotros las forzamos a producir la proteína que nos interesa en concentraciones elevadas. Como consecuencia de
la situación de estrés, las proteínas que se van produciendo se acumulan en forma de unos agregados insolubles que
denominamos cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión han sido descritos como agregados proteicos densos,
refráctiles, altamente hidratados, resistentes a algunos detergentes, cilíndricos y de medida variable. En general, se ha
creído también que estos agregados estaban formados por proteína inactiva, lo que ha restringido de manera notable el
espectro de proteínas que han sido finalmente comercializadas por la industria biotecnológica, ya que la forma inactiva no
es útil.

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Se sometería a un estrés celular a las bacterias

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El vector que se utiliza contiene secuencias de ADN que al ser replicadas confieren resistencia a antibióticos específicos.
Esta técnica ha sido ampliamente utilizada en el campo de la medicina y ha permitido el desarrollo de importantes avances
terapéuticos como por ejemplo la producción de insulina recombinante.

Permite además la posibilidad de utilizar plantas y alimentos transgénicos, así como microorganismos modificados
genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la
insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales. El
uso de ADN recombinantes puede también tener un impacto perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser
humano y en el propio planeta.

Con el uso de ADN recombinante se ha logrado obtener plantas transgénicas resistentes a insectos, hongos, bacterias y
herbicidas, con mejores características de calidad durante postcosecha y con alto contenido nutricional. También ha
permitido la clonación, expresión y producción mediante esta técnica de diversos antígenos, por ejemplo, la vacuna contra
la hepatitis B y la vacuna contra el virus del papiloma humano.

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012$c/345c/

67      

La regulación genética implica todos aquellos procesos que afectan o intervienen en la acción de los genes a nivel de los
procesos de traducción o trascripción, regulando los productos funcionales de un gen y actividad.

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 . 
*    

Los genes que codifican para enzimas necesarias en el metabolismo básico celular se expresan de manera continua, es
decir, de forma constitutiva. Por tal motivo, a este tipo de genes se les denomina, ͞genes constitutivosXo estos están
sometidos a un tipo de regulación diferente que hace que se estén expresando siempre.

La expresión génica inducible es cuando el sustrato sobre el que va actuar la enzima provoca la síntesis de la misma. Al
efecto del sustrato se le denomina inducción positiva. A este tipo de expresión corresponden los procesos catabólicos de
degradación, por ejemplo, el operón lactosa, el operón arabinosa, el operón maltosa.

La expresión génica represible es cuando el producto final de la reacción que cataliza el enzima impide la síntesis de la
misma. Este fenómeno recibe el nombre de inducción negativa. Al compuesto que impide la síntesis del enzima se le
denomina correpresor. A este tipo de expresión corresponden procesos anabólicos, por ejemplo el operón triptófano y el
operónhistina.

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 (    

Se dice que un sistema está bajo control positivo cuando el producto del gen regulador activa la expresión de los genes,
actúa como un activador. El control positivo es ejecutado por una proteínaactivadora por catabolitos (CAP)también llamada
proteína activadora del AMP cíclico (CRP).
Cuando i
crece en un medio con lactosa los niveles de AMPc son altos, el AMPc se une a la CRPactivándola y la
proteína activada CRP-AMPca su vez estimula la transcripción de los genes estructurales del operón lactosa y de otros
operones de azúcares. La CAP es un dímero que al unirse al AMPc se activa y estimula la transcripción de los genes del
operón lactosa, de manera que la proteína activadora CAP-AMPc es necesaria para la unión de la ARN-polimerasa al
promotor de los genes del operón lactosa. La proteína activadora CAP-AMPc se une a la región promotora cerca del
nucleótido que ocupa la posición -60 (60 nucleótidos antes del comienzo del gen z).

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 (    

Se dice que un sistema está bajo control negativo cuando el producto del gen regulador reprime o impide la expresión de
los genes, actúa como un represor. En un sistema de regulación negativa existe un inhibidor o represor celular que evita la
transcripción y para iniciar la transcripción se necesita un antagonista del inhibidor que generalmente se llama inductor.
Dentro de este control podemos distinguir, a su vez:
a)p Control negativo con efectos inductores: el represor, per se es activo, pero se inactiva en presencia del inductor.
Ejemplo Operón lactosa:
ïp Mientras en el medio no exista lactosa, el tetrámero del represor presenta una alta afinidad de unión hacia las
secuencias del operador, y así impide que la ARN polimerasa reconozca y se una al promotoro por lo tanto, no
existe apenas transcripción del operón de la lactosa. La actividad de unión al operador reside en el extremo N-
terminal, que presenta un diseño característico en hélice-bucle-hélice. El operador al que se une presenta una
secuencia palindrómica imperfecta.
ïp Si en el medio existe lactosa (u otro azúcar de tipo ß-galactósido) como única fuente de carbono, dicho azúcar
actúa como inductor del operón: se une a una zona de las subunidades del tetrámero del represor (codificado por
lacI), con lo que se produce un cambio conformacional alostérico del represoro con ello disminuye la afinidad del
tetrámero hacia la secuencia del operador, por lo que ahora la RNA polimerasa puede iniciar la transcripción.

b)p Control negativo con efectos represores: el represor, per se es inactivo (aporrepresor), pero en presencia del
correpresor se activa (adquiere su capacidad funcional), y es entonces cuando reprime al operón estructural. Ejemplo
Operón triptófano:
ïp En un medio pobre en aminoácido triptófano: el gen trpR se expresa: se sintetiza el aporrepresor inactivo, por lo
que la ARN polimerasa puede transcribir el operón de genes estructurales (trpEDCBA). Hay síntesis de las enzimas
del operón a sus niveles desreprimidos.
ïp En un medio rico en triptófano: el gen trpR se expresa igualmente, es decir, se sintetiza aporrepresor inactivo, pero
al unirse a dos moléculas de triptófano que la bacteria ha captado del medio se produce un cambio de
conformación que genera el represor activo (aporrepresor + correpresor): ahora reconoce y se une a la secuencia
del ͞operador͟ (que está solapado con el promotor). Así se impide la transcripción del operón, aunque no
totalmente. Esto da lugar al nivel de expresión basal o reprimido (que en el caso de este operón representa 1/60
del nivel desreprimido).

Control negativo con inducción: Control negativo con represión:

)7
  

* 



En el control positivo los genes estructurales no se transcriben (o en todo caso lo hacen a un nivel basal bajo) a no ser que
exista una proteína reguladora activa llamada apoinductor o activador, la cual estimula la transcripción de los genes.
Algunos operones bacterianos poseen promotores tales que no pueden ser usados eficientemente por la RNA polimerasa
de forma directa para el inicio de la transcripción, sino que además, requieren proteínas auxiliares activadoras. Es decir, la
transcripción de estos operones no ocurre, a no ser que la proteína activadora se una a zonas del DNA cercanas al promotor
(normalmente al lado 5' respecto del promotor).
Un inductor es un sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresión de los genes. El inductor suele ser el sustrato de
una ruta catabólica, o una molécula muy semejante al sustrato natural.
7
   
* 
7  


Un represor se encarga de la regulación de la expresión de los genes, se encarga de inhibir la activación. El gen regulador
codifica para una proteína específica, un producto denominado REPRESOR. Cuando el represor se sintetiza es inactivo el
gen. El co-receptor permite la activación del gen cuando se une al represor.

+7 




Se trata de un elemento de control que es una región del ADN con una secuencia que es reconocida por la proteína
reguladora. El operador se sitúa entre la región promotora y los genes estructurales. Abreviadamente se le designa por la
letra O.

7"   




 
  i coli

1 


:

>pPromotor: región del DNA, precedente a los genes estructurales, que reconoce la RNA polimerasa para llevar a cabo la
transcripción.
>pOperador: región del DNA localizada entre el promotor y el comienzo de los genes estructurales, que es reconocida por
la proteína represora Lac I.
%   

>p° 
: codifica la enzima ɴ-galactosidasa, que cataliza la reacción de hidrólisis de la lactosa en glucosa más galactosa
>p° 
: codifica la proteínagalactósidopermeasa, cuya función es facilitar el transporte de ɴ-galactósidos al interior de la
bacteria.
>p° 
: codifica la enzima tiogalactósidotransferasa, que cataliza la transferencia del grupo acetil del acetil Coenzima A al
6-OH de un aceptor tiogalactósido. Este gen no está relacionado con el metabolismo de la lactosa.
%  

89

Codifica para proteína reguladora

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# 

      *   
 
 

En presencia de lactosa, el medio está desprovisto de glucosa, pero contiene lactosa. La bacteria, si desea sobrevivir, deberá
utilizar la lactosa. Sintetizar las enzimas que puedan hidrolizar la lactosa en glucosa + galactosa se convierte en una
necesidad vital.

En presencia de lactosa (es decir, del inductor), la represión se elimina, los genes pueden entonces expresarse: se dice que
se han desreprimido.

El represor sintetizado por el gen regulador es reconocido por el inductor (es decir, por la lactosa) y ambos se asocian. En
ese estado, el represor es incapaz de reconocer al operador y de unirse. Si el represor ya está unido al operador será
desenganchado por acción del inductor.

Ahora, la RNA polimerasa puede unirse al promotor. Ya no existe impedimento estérico. La transcripción se inicia. Se forma
un mRNA, y será posible sintetizar las 3 enzimas de utilización de la lactosa, dichas enzimas son codificadas por tres genes
bajo control de un único promotor. La lactosa al suprimir el bloqueo causado por el represor, ha permitido la síntesis de las
tres enzimas que son necesarias para su utilización por la célula.


 
Sin embargo cuando no hay lactosa en el medio la proteína represora se encuentra unida al operador impidiendo la
transcripción de los genes para las enzimas que metabolizan la lactosa

67       *


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Cuando el sustrato sobre el que va actuar la enzima provoca la síntesis del enzima. En el operonlac cuando las
concentraciones de lactosa aumentan, el represor tiene mayor afinidad por la lactosa, se une a el y empieza la trascripción
del operon.

667
    
   " #
    

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El medio M9-glicerol es un medio mínimo cuya fuente de carbono será el glicerol. Este medio es utilizado para que las
bacterias produzcan -galactosidasa, la cual cataliza la transformación de la lactosa en alolactosa, el verdadero inductor del
sistema.
67  
  
   " 
Vp Na2CO3 detiene la reacción de la hidrólisis del ONPG.
Vp El ONPG es el que ayudara a detectar la presencia de ɴ-galactosidasa por medio de una reacción de hidrólisis que
generara un producto colorido.
 Vp Glucosa al 2% sirve de fuente de carbono a las bacterias y generan la inhibición del operon°  

Vp Lactosa al 2% sirve de fuente de carbono a las bacterias y generan la activación del operon°  






   





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471   " 

En el tubo A, solo hay presencia de glucosa en el medio, por lo que la bacteria producirá enzimas de utilización de la
lactosa, por lo que los genes que va a codificar para las 3 enzimas (ɴ-galactosidasa, permeasa y transacetilasa) no van a ser
expresados.

En el tubo B, sólo hay presencia de lactosa, ésta actua como inductor para la expresión de la ɴ-galactosidasa, que al estar en
contacto con el ONPG lo hidroliza, produciendo el reactivo de color o-nitrofenol.

En el tubo C, hay glucosa y lactosa, al terminarse la glucosa, la lactosa nuevamente será el inductor para la expresión de la
ɴ-galactosidasa, que hidrolizará el ONPG.

En el tubo D, hay glucosa, a los 7.5 min. se agregó lactosa, el tiempo de incubación después de agrgar la lactosa no es
suficiente para que se hidrolice todo el ONPG, sin embargo si se expresa la ɴ-galactosidasa.

En el tubo E, donde hay presencia de glucosa y lactosa, no existe la producción de las enzimas ya que no hay medio de
cultivo con de E.coli por consiguiente no obtendremos una coloración amarilla en el medio.

6&7    

 


  

 

 



La hidrólisis de ONPG, ya que es un sustrato de la ɴ-galactosidasa que, al ser hidrolizado, produce un compuesto
(ortonitrofenol) que presenta un intenso color amarillo.

6)7
    

;*   4$

El tubo B contiene lactosa y el tubo C glucosa y lactosa.

La adenilatociclasa es una enzima que transforma el ATP en AMPc. El AMPc es necesario para la transcripción de todos los
operones que son inhibidos por el catabolismo de la glucosa. Es decir, para que se transcriban los genes del operón lactosa
se necesitan niveles elevados de AMPc. Cuando el medio tiene glucosa, los niveles de AMPc son muy bajos y como
consecuencia no se transcriben los operones de otros azúcares. Cuando el medio no tiene glucosa pero sí lactosa los niveles
de AMPc son altos, el AMPc se une a la proteína receptora de AMPc (CRP) activándola y la proteína activada CRP-AMPc a
su vez estimula la transcripción de los genes estructurales del operón lactosa y de otros operones de azúcares. La proteína
activadora por catabolitos (CAP) es un dímero que al unirse al AMPc se activa y estimula la transcripción de los genes del
operón lactosa, de manera que la proteína activadora CAP-AMPc es necesaria para la unión de la ARN-polimerasa al
promotor de los genes del operón lactosa.
En ambos tubos la presencia de ATP incrementará los niveles del AMPc, lo cual favorecerá la transcripción de los genes
estructurales del operón lactosa.

6" "#

    *    
 
 




 

 

  lac: i-, is, z-, y-, a-, p-, y oc1(


<  i-: es lactosa positiva, ya que la mutación constitutiva de  
 altera la estructura de la proteína represora de manera
que ya no es capaz de unirse a la región operadora. Por tanto, al no poder unirse la proteína represora al operador, la
región promotora queda asequible para la ARN polimerasa y se produce la transcripción de los genes estructurales en
ausencia lactosa.

°ac is: es lactosa negativo, porque se afecta al gen estructural de la proteína represora modificando la parte central de la
proteína encargada de unirse al inductor (al IPTG). La proteína represora mutante se une al operador pero no es capaz de
reconocer al inductor y no se suelta a pesar de añadir el inductor. Por lo tanto siempre está reprimido y no se expresan los
genes del operón lactosa.

°ac oc:es lactosa positiva, dado que la mutación constitutiva en el operador (OC), consiste en una alteración en la secuencia
de bases nitrogenadas de la región del Operador que tienen como consecuencia que la proteína reguladora producto del
gen i ya no sea capaz de unirse al operador. Al no poder unirse la proteína represora al operador, la región promotora
queda asequible para la ARN polimerasa y se produce la transcripción de los genes estructurales en ausencia de de la
lactosa.

°ac Z-,°ac Y7*°ac A-: Son lactosas negativas, ya que las mutaciones LacZ- eliminan la actividad enzimática, impidiendo la
-
metabolización de la lactosa. Las mutaciones lacY no pueden incorporar la lactosa del medio.

< 7: son lactosa negativa, ya que estos mutantes presentan una alteración en la secuencia de bases nitrogenadas de la
región promotora, como consecuencia la ARN-polimerasa no reconoce la secuencia promotora y, por consiguiente, no se
produce la transcripción de los genes estructurales.

6+7
#   (      
    


 
 

 
  
 *  
 

 
  
 
#


En el caso del triptofano el producto del gen regulador reprime o impide la expresión de los genes que codifican para la
producción de aminoácidos para generar triptofáno, actúa como un mm
m y en el caso del operon lactosa el producto del
gen regulador activa la expresión de los genes para la producción de -galactosidasa para realizar la utilización de la lactosa
que se encuentra presente y que genera la activación, actúa como un   m.

67
       
 (     
 


Las bacterias regulan la expresión genética para adaptarse a las necesidades ambientales, regulan funciones metabólicas en
el organismo que son necesarias para su supervivencia y evitan un gasto de energía innecesario en la producción
simultánea de todos los enzimas necesarios para metabolizar los diferentes azúcares ya que las bacterias pueden emplear
como distintas fuentes de carbono la glucosa, lactosa, galactosa, maltosa, ramosa y xilosa.

6,"
    
#            
 
* 
 En procariontes, el
control de le expresión de los genes permite a la célula ajustar sus procesos sintéticos en función de las necesidades
nutricionales, frente a un medio ambiente cambiante, de modo que se asegure el crecimiento y la división celular.

En las eucariontes la mayor parte de las células están protegidas de las variaciones nutricionales, pues el ambiente
inmediato en el que se encuentran se mantiene relativamente constante. Pero dentro de muchos órganos las hormonas
desempeñan un papel muy importante, modulando la activación o síntesis de ciertas enzimas, es el caso, por ejemplo, del
hígado, que está sometido a bruscos cambios nutricionales.
Una de las diferencias entre la expresión génica en procariontes y eucariontes, es la transcripción monocistónica en la
mayoría de los genes eucariontes

En ciertas células eucariotas (algas) pueden tener la capacidad de adquirir plásmidos. La facilidad de manejar las vías
metabólicas depende del grado de especialización, por lo que en una célula eucariota ciertos procesos serán "repartidos"
en función por los organelos, bajo un central control desde el núcleo. Los operones bacterianos, son necesarios para los
procesos de regulación. En cambio las células eucariotas tienden a ser "reemplazados" por la acción de enzimas más
complejas, hasta llegar a la regulación endocrina (en animales principalmente).

  
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 " 

La regulación genética es un concepto que no solo se aplica a bacterias, sino a cualquier organismo vivo. El caso del
operonlac es un ejemplo muy demostrativo de cómo las bacterias son capaces de sensar el medio ambiente que las rodea y
adaptarse a esas condiciones. En el caso de los eucariontes, serán las células de cada tejido las encargadas de sintetizar las
proteínas necesarias, dependiendo de las condiciones en las que se encuentren.

En cuanto a la práctica profesional el operonlac ha sido utilizado en la construcción de vectores de clonación, ya que se
incorpora el sitio de unión al represor lacI, para así controlar la expresión de los genes introducidos.