INCIDÊNCIA DE HEMOGLOBINA S EM DOADORES DE SANGUE NA REGIÃO
CENTRAL DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL1
INCIDENCE OF HEMOGLOBIN S IN BLOOD DONORS IN THE CENTRAL REGION OF
THE STATE OF RIO GRANDE DO SUL1
Willian Reges Bosi2, Adílis Rodrigues2 e Guilherme Brum França2
Orientador: Bruno Stefanello Vizzotto3
Universidade Franciscana- Curso de Biomedicina, Área de Ciências da Saúde
RESUMO
As hemoglobinopatias são um grupo de doenças de doenças genéticas monogênicas
recessivas, afetando diretamente a hemoglobina. O diagnóstico precoce é fundamental, pois permite melhor terapêutica clínica e aconselhamento genético. O diagnóstico laboratorial confirmatório para pacientes portadores de alguma hemoglobinopatia seja talassemia ou anemia falciforme é realizado através de testes moleculares, tais como a PCR que por sua vez amplifica a região mutada do gene que é responsável pela patologia. Atualmente, vários testes e ensaios vêm sendo otimizados para o diagnóstico das doenças, com uma forte ligação na biologia molecular, com testes mais sensíveis que resistentes, permitindo um diagnóstico mais preciso e com poucas desvantagens. Este trabalho avaliou a incidência de portadores da hemoglobina S em doadores de sangue da região central do estado do Rio Grande do Sul, através da PCR, onde não obteve-se resultados significativos, porém sempre que haver suspeita clínica deve-se procurar um profissional da saúde para esclarecer melhor suas dúvidas e ter um melhor direcionamento. Palavras-chave: β-globina, PCR, eletroforese, talassemia.
ABSTRACT
Hemoglobinopathies are a group of diseases of monogenic recessive genetic diseases,
directly affecting hemoglobin. Early diagnosis is essential because it allows better clinical therapy and genetic counseling. The confirmatory laboratory diagnosis for patients with some hemoglobinopathy is thalassemia or sickle cell anemia is performed through molecular tests, such as the PCR that in turn amplifies the mutated region of the gene that is responsible for the pathology. Currently, several tests and trials have been optimized for the diagnosis of diseases, with a strong connection in molecular biology, with more sensitive tests than resistant, allowing a more accurate diagnosis and with few disadvantages. This study evaluated the incidence of hemoglobin S donors in blood donors from the central region of the State of Rio Grande do Sul, through PCR, where no significant results were obtained, however, whenever there is clinical suspicion, one should seek a professional from the health to better clarify your doubts and have a better direction. Keywords: β-globin, PCR, electrophoresis, thalassemia. 1 Estudo sobre incidência de hemoglobina S em doadores de sangue na região central do estado do Rio Grande do Sul. 2 Acadêmicos do Curso de Biomedicina- Universidade Franciscana (UFN). E-mails: willianbosi@hotmail.com, adilisrodrigues@hotmail.com, guilherme_bfranca@hotmail.com. 3 Professor, orientador, responsável pela disciplina de Técnicas Laboratoriais de Biologia Molecular. bvizzotto@yahoo.com.br 2
INTRODUÇÃO
As hemoglobinopatias constituem o grupo de doenças genéticas de caráter monogênias
recessivas difundidas em nível mundial. Apresentam origem em mutações que afetam diretamente os genes associados à síntese das cadeias de globina da hemoglobina, podendo resultar em alterações da sua síntese, onde inclui-se as síndromes talassêmicas e a anemia falciforme, ou em mudanças estruturais, como nos casos de drepanocitose. (TRAEGER- SYNODINOS J; 2014). Estima-se que cerca de 5% da população mundial seja portadora dos genes responsáveis pelo desenvolvimento de hemoglobinopatias e, anualmente, pode nascer aproximadamente 300.000 crianças como variantes graves destas patologias (OMS; 2011).
A hemoglobina é a proteína presente no interior dos eritrócitos que tem como principal função o transporte de oxigênio (O2) para todas as células. A sua estrutura é de uma proteína esferóide, globular, formada por quatro subunidades distintas, compostas de dois pares de cadeias globínicas, polipeptídicas, sendo um par denominado de cadeias do tipo alfa (alfa-a e zeta-x) e o outro de cadeias do tipo não-alfa (beta-b, delta-d, gama-g e epsílon-e). Sua estrutura é quimicamente unida a um núcleo prostético de ferro, a ferroprotoporfirina IX (heme), que detém a propriedade de receber, ligar e/ou liberar o oxigênio nos tecidos (DACIE, J.V. et. al., 1984; FAIRBANKS, V.F. et. al., 1987).
A anemia falciforme (HbS) é uma doença hematológica hereditária, descrita pela primeira vez por Herrick em 1910, está ligada com o gene beta da cadeia globina, onde há substituição do ácido glutâmico pela valina na posição seis da extremidade N-terminal da cadeia beta da globina, originando a hemoglobina S causando uma mutação no gene da globina que deforma o eritrócito, fazendo com que a célula perca seu formato discóide, tornando-se alongada com filamentos na sua extremidade (NAGEL RL et. al., 1985) conforme mostrado na figura 1.
Figura 1: Representação esquemática da mutação gênica responsável pelo surgimento da HbS.
O diagnóstico precoce é fundamental para o portador, permitindo uma abordagem
adequada e asconselhamento genético têm como objetivo diminuir as complicações decorrentes da doença e comcomitantemente diminuir o uso racional de medicamentos, uma vez que as complicações clínicas dos portadores são influenciadas por fatores genéticos e ambientais. (MELO-REIS, 2006).
Os tratamentos para anemia falciforme são profiláticos com o objetivo de evitar alguns sintomas, tais como: Desidratação, anoxia, infecções, estase da circulação e resfriamento da pele, tratamento com imunização, ácido fólico, penicilina. Na terapêutica profilática encontramos uso de analgésicos, antiinflamatórios não esteroidais (AINES), opiáceos, hidroxiuréia e transfusão de sangue (BRAGA JAP et. al., 1995; RABB LM et. al., 1983).
Existem vários métodos utilizados para a pesquisa diagnóstica da hemoglobina S. Dentre
os métodos utilizados para triagem de hemoglobinas anormais, destacam-se: Resistência Osmótica em solução de Cloreto de Sódio a 0,36%; eletroforese em pH alcalino em acetato de celulose; análise da morfologia eritrocitária. Para diagnóstico confirmatório, utiliza-se: 3
Pesquisa de Corpos de Heinz e Agregados de Hemoglobina H; eletroforese em pH ácido;
dosagem de hemoglobina A2; dosagem de hemoglobina Fetal. A eletroforese em pH ácido foi realizada também com o gel de Agar para hemoglobina ácida da CELM, com excelentes resultados, os exames de imagem tem papel complementar, mostrando características peculiares da doença, tais como o crânio com estriações perpendiculares, a HbS também pode ser confirmada por procedimentos eletroforéticos em pH ácido, em que as hemoglobinas que apresentam migração semelhante em pH alcalino podem ser diferenciadas (BETKE, K et. al., 1959; MARENGO-ROWUE, A.J. 1965; PAPAVANNOPOULOS et. al., 1974; SILVESTRONI, E et. al., 1975; VELLA, F. 1968).
OBJETIVOS
Objetivo Geral Avaliar a incidência de portadores da hemoglobina S em doadores de sangue na região central do estado do Rio Grande do Sul.
Objetivo Específico Em pesquisa da β-globina, expostas em pacientes portadores de anemia falciforme, foi avaliada a incidência de portadores da hemoglobina S em doadores de sangue na região central do estado do Rio Grande do Sul, através do teste de PCR, onde foi otimizado com o kit Maxiprep (HOLLAND NT., et. al; 2003).
METODOLOGIA
AMOSTRAS
O anticoagulante utilizado foi o CPDA-1, onde foram utilizados para a otimização da
Pipetou-se 100ul de cada amostra em tubo falcon de 50ml, e adicionou-se 15mL de sangue total + 25 ml de Tampão de LISE, logo após leva-se ao vórtex, centrifugar 6.000xg por 5 min; descarta-se o sobrenadante e adiciona-se 30ml de Tampão de lise. Logo após, centrifugar a 6.000g por 5 min, vortear, adicionar 2 ml NaCl 5M e centrifugar a 7000g or 15 min. Descartar o sobrenadante e adicionar 3 ml TRIS-Hcl 10Mm PH 8.0 (ressuspender o pellet); adicionar 3 ml detergente SDS 20mg/ml e vortexar. Feito isso, adicionar 2 ml NaCl 5M e centrifugar 7.000g por 15 min; transferir o sobrenadante para o tubo falcon (novo) de 50 ml, e descartar o pellet e adicionar 30 ml de etanol absoluto gelado ao sobrenadante coletado; depois disso, deve-se incubar no freezer a -20c° por 20 min; e centrifugar a 7.000g por 5 min, descartar o sobrenadante e ficar com o pellet e adicionar 5 ml de etanol 70%, e misturar; centrifugar 7.000g por 5 min e descartar o sobrenadante. Adicionar 5 ml de etanol 70%, e misturar; centrifugar 7.000xg por 5 min e descartar o sobrenadante. Secar o pellet a temperatura ambiente por 10 min e adicionar 7 ml de T.E. 10:1 PH 8.0 e depois incubar a 70°C por 30 4
min. O armazenamento deve ser feito em freezer à -20°C (CHOMCZYNSKI P, SACCHI N;
1987).
PCR
Para cada amostra de DNA, foi colocado em dois tubos, um marcado como normal (N) e outro como mutante (M). Em cada um dos tubos, foi adicionado um iniciador direto comum, que mistura Taq polimerase. O iniciador normal da foice foi adicionado no tubo rotulado como N e o iniciador específico da foice mutante foi adicionado no tubo rotulado como M. Para verificar se o sistema de PCR funcionava adequadamente e para evitar resultados negativos falsos, um par de iniciadores de controle interno foi adicionado a cada tubo. Cada um desses primers foi testado com amostras de DNA de controle positivo e negativo sendo conhecidas sob condições de PCR rigorosas e uniformes (LITTLE S., 1998; MOHANTY D. et. al., 2008). Todos os reagentes foram fornecidos pela Chromus Biotech Pvt. Ltd.
A interpretação dos resultados da PCR, foramseparados em primers normais e mutantes de
células falciformes, primeiramente foram executados lado a lado na eletroforese de gel submarino horizontal. Foi preparado 2% de gel de agarose contendo 0,5 ug / ml do itercalante (brometo de etídio) e as amostras foram executadas a 100 V durante 45-60 minutos. Após a eletroforese, as bandas foram visualizadas sob luz ultravioleta (UV) no sistema de documentação Gel (sistema de imagem Gel Logic 200, imagem molecular Kodak) que funciona emitindo fluorescência. O brometo de etidio, um corante intercalante liga-se especificamente ao ácido nucleico, onde é excitado pela irradiação ultravioleta emitindo fluorescência. Após a reação da PCR, a presença ou a ausência de uma banda de 207 pares de bases com o iniciador específico da falcão mutante sob luz UV é diagnóstico para a presença ou ausência do alelo falciforme (LITTLE S; 1998).
ELETROFORESE
Os primers utilizados para a técnica da PCR foram:
Primer Forward: 5’GAA GAG CCA AGG AGA GGT AC 3’ Primer Reverse: 5’CAA TTC ATC CAC GTT CAC C 3’
O tamanho do fragmento do produto de PCR com iniciador normal e mutante com base na foice é de 268 pares de bases e com controle interno Inc1 e Inc2 é de 860 pares de bases (LITTLE S., 1998; MOHANTY D. et. al., 2008).
RESULTADOS
As técnicas testadas foram realizadas em amostras de isolados clínicos de portadores de
HbS, provenientes da região central do estado de Santa Maria- RS. Para as técnicas trabalhadas, sendo estas, PCR otimizada com kit Maxiprep, com o objetivo de analisar a incidência de hemoglobina S em doadores de sangue, não foram obtidos resultados significativos., conforme mostra a figura 2. 5
Figura 2: Eletroforese em gel de agarose: Foram utilizados dois marcadores negativos (CN), um marcador endógeno (END) e as amostras (A1, A2 e A0), sendo que A0 corresponde ao branco da reação. Foi pipetado 8µl de cada amostra mais 2µl do intercalante, e para o marcador foi utilizado 3 µl do intercalante mais 7 µl do marcador.
DISCUSSÕES
O Brasil é um país diversificado em mistura racial, com forte influência na dispersão de
genes anormais, contudo em hemoglobinopatias (falcemias e talassemias). A distribuição das hemoglobinas normais está ligada com os grupos raciais que participaram na formação da população de cada região (LEONELI GG., et. al; 2000).
Assim sendo, a heterogeneidade étnica-racial da população brasileira dificulta a
comparação dos resultados, uma vez que existe uma grande mistura na diversidade racial. (LISOT CLA., et. al; 2004).
Num estudo feito por Melo et al (2000), mostrou que 23.981 doadores de sangue de Uberlândia, Minas Gerais, e cidades subjacentes, destes doadores, os autores encontraram 820 (3,42%) portadores de hemoglobinopatias, onde a Hb AS foi encontrada em maior prevalência (2,48%) quando comparadas com as outras hemoglobinopatias; o mesmo fato foi encontrado na análise feita por Tavares e Bernardes, onde uma população de 483 doadores de sangue do Centro de Hematologia de Sobradinho (Distrito Federal), onde a frequência de Hb AS foi a predominante (2,96%), e no Hemonúcleo da Universidade São Francisco, na cidade de Bragança Paulista, São Paulo, realizou-se um estudo com uma população de 1.846 doadores; sendo que, desses 1,13% foi Hb AS, demonstrando predominância de doadores AS em bancos de sangue do Brasil (ACEDO MJ., et. al; 2002).
Outro estudo realizado no Sul e Sudeste, mostrou que 1,9% de hemoglobinopatias, com predomínio de talassemias em São Paulo e 11,7% e no Rio Grande do Sul, sendo 9,8% sugestivos de talassemia. A baixa prevalência de talassemias no presente estudo (0,1%) se 6
justifica devido a seleção prévia de doadores exclui indivíduos anêmicos, além da presumida composição étnica da população (LISOT CLA., et.al., 2004; ORLANDO GM., et.al., 2000).
CONCLUSÃO
As hemoglobinopatias são um problema de saúde pública a nível mundial, de caráter
genético, monogênias recessivas sem cura, mas com um tratamento correto e, quando diagnosticadas cedo, diminuem alguns ricos, tais como o uso racional de medicamentos, uma vez que possuem vários efeitos indesejados ao paciente. A triagem e o aconselhamento genético são de extrema importância, pois esclarecem dúvidas obre estas doenças e procuram um melhor direcionamento ao paciente portador. O diagnóstico laboratorial e o aconselhamento genético são de fundamental importância para o conhecimento das hemoglobinas anormais na população brasileira, uma vez que existe uma grade mistura de raça na população brasileira.
A população deve ter acesso a mais informação sobre esta temática de modo a desenvolver um conhecimento dos riscos e consequências que estas doenças acarretam. Segundo alguns dados dos níveis de migrações dos últimos anos, são necessários novos estudos, mais precisos, sobre a frequência e distribuição atual destas doenças, para que haja um melhor planeamento, ao nível da medicina familiar e o alargamento dos rastreios a nível nacional e não apenas a nível regional. A identificação de portadores deveria ser incluída nos exames de rastreio desde o primeiro trimestre de gestação, para caso ocorra suspeita e/ou identificação de casais de risco a nível nacional, possa ser tomada uma melhor conduta.
Atualmente, graças a muitos avanços tecnológicos e científicos, vários testes moleculares
vêm sendo estudados e otimizados para diversas doenças com a finalidade de dar um resultado mais exato e preciso ao paciente com poucas desvantagens, garantindo uma maior sensibilidade.
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