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INCIDÊNCIA DE HEMOGLOBINA S EM DOADORES DE SANGUE NA REGIÃO


CENTRAL DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL1

INCIDENCE OF HEMOGLOBIN S IN BLOOD DONORS IN THE CENTRAL REGION OF


THE STATE OF RIO GRANDE DO SUL1

Willian Reges Bosi2, Adílis Rodrigues2 e Guilherme Brum França2


Orientador: Bruno Stefanello Vizzotto3

Universidade Franciscana- Curso de Biomedicina, Área de Ciências da Saúde

RESUMO

As hemoglobinopatias são um grupo de doenças de doenças genéticas monogênicas


recessivas, afetando diretamente a hemoglobina. O diagnóstico precoce é fundamental, pois
permite melhor terapêutica clínica e aconselhamento genético. O diagnóstico laboratorial
confirmatório para pacientes portadores de alguma hemoglobinopatia seja talassemia ou
anemia falciforme é realizado através de testes moleculares, tais como a PCR que por sua
vez amplifica a região mutada do gene que é responsável pela patologia. Atualmente, vários
testes e ensaios vêm sendo otimizados para o diagnóstico das doenças, com uma forte ligação
na biologia molecular, com testes mais sensíveis que resistentes, permitindo um diagnóstico
mais preciso e com poucas desvantagens. Este trabalho avaliou a incidência de portadores
da hemoglobina S em doadores de sangue da região central do estado do Rio Grande do Sul,
através da PCR, onde não obteve-se resultados significativos, porém sempre que haver
suspeita clínica deve-se procurar um profissional da saúde para esclarecer melhor suas
dúvidas e ter um melhor direcionamento.
Palavras-chave: β-globina, PCR, eletroforese, talassemia.

ABSTRACT

Hemoglobinopathies are a group of diseases of monogenic recessive genetic diseases,


directly affecting hemoglobin. Early diagnosis is essential because it allows better clinical
therapy and genetic counseling. The confirmatory laboratory diagnosis for patients with
some hemoglobinopathy is thalassemia or sickle cell anemia is performed through
molecular tests, such as the PCR that in turn amplifies the mutated region of the gene that
is responsible for the pathology. Currently, several tests and trials have been optimized for
the diagnosis of diseases, with a strong connection in molecular biology, with more
sensitive tests than resistant, allowing a more accurate diagnosis and with few
disadvantages. This study evaluated the incidence of hemoglobin S donors in blood donors
from the central region of the State of Rio Grande do Sul, through PCR, where no
significant results were obtained, however, whenever there is clinical suspicion, one should
seek a professional from the health to better clarify your doubts and have a better direction.
Keywords: β-globin, PCR, electrophoresis, thalassemia.
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Estudo sobre incidência de hemoglobina S em doadores de sangue na região central do estado do Rio Grande
do Sul.
2
Acadêmicos do Curso de Biomedicina- Universidade Franciscana (UFN). E-mails: willianbosi@hotmail.com,
adilisrodrigues@hotmail.com, guilherme_bfranca@hotmail.com.
3
Professor, orientador, responsável pela disciplina de Técnicas Laboratoriais de Biologia Molecular.
bvizzotto@yahoo.com.br
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INTRODUÇÃO

As hemoglobinopatias constituem o grupo de doenças genéticas de caráter monogênias


recessivas difundidas em nível mundial. Apresentam origem em mutações que afetam
diretamente os genes associados à síntese das cadeias de globina da hemoglobina, podendo
resultar em alterações da sua síntese, onde inclui-se as síndromes talassêmicas e a anemia
falciforme, ou em mudanças estruturais, como nos casos de drepanocitose. (TRAEGER-
SYNODINOS J; 2014). Estima-se que cerca de 5% da população mundial seja portadora dos
genes responsáveis pelo desenvolvimento de hemoglobinopatias e, anualmente, pode nascer
aproximadamente 300.000 crianças como variantes graves destas patologias (OMS; 2011).

A hemoglobina é a proteína presente no interior dos eritrócitos que tem como principal
função o transporte de oxigênio (O2) para todas as células. A sua estrutura é de uma proteína
esferóide, globular, formada por quatro subunidades distintas, compostas de dois pares de
cadeias globínicas, polipeptídicas, sendo um par denominado de cadeias do tipo alfa (alfa-a e
zeta-x) e o outro de cadeias do tipo não-alfa (beta-b, delta-d, gama-g e epsílon-e). Sua
estrutura é quimicamente unida a um núcleo prostético de ferro, a ferroprotoporfirina IX
(heme), que detém a propriedade de receber, ligar e/ou liberar o oxigênio nos tecidos
(DACIE, J.V. et. al., 1984; FAIRBANKS, V.F. et. al., 1987).

A anemia falciforme (HbS) é uma doença hematológica hereditária, descrita pela primeira
vez por Herrick em 1910, está ligada com o gene beta da cadeia globina, onde há substituição
do ácido glutâmico pela valina na posição seis da extremidade N-terminal da cadeia beta da
globina, originando a hemoglobina S causando uma mutação no gene da globina que deforma
o eritrócito, fazendo com que a célula perca seu formato discóide, tornando-se alongada com
filamentos na sua extremidade (NAGEL RL et. al., 1985) conforme mostrado na figura 1.

Figura 1: Representação esquemática da mutação gênica responsável pelo surgimento da HbS.

O diagnóstico precoce é fundamental para o portador, permitindo uma abordagem


adequada e asconselhamento genético têm como objetivo diminuir as complicações
decorrentes da doença e comcomitantemente diminuir o uso racional de medicamentos, uma
vez que as complicações clínicas dos portadores são influenciadas por fatores genéticos e
ambientais. (MELO-REIS, 2006).

Os tratamentos para anemia falciforme são profiláticos com o objetivo de evitar alguns
sintomas, tais como: Desidratação, anoxia, infecções, estase da circulação e resfriamento da
pele, tratamento com imunização, ácido fólico, penicilina. Na terapêutica profilática
encontramos uso de analgésicos, antiinflamatórios não esteroidais (AINES), opiáceos,
hidroxiuréia e transfusão de sangue (BRAGA JAP et. al., 1995; RABB LM et. al., 1983).

Existem vários métodos utilizados para a pesquisa diagnóstica da hemoglobina S. Dentre


os métodos utilizados para triagem de hemoglobinas anormais, destacam-se: Resistência
Osmótica em solução de Cloreto de Sódio a 0,36%; eletroforese em pH alcalino em acetato de
celulose; análise da morfologia eritrocitária. Para diagnóstico confirmatório, utiliza-se:
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Pesquisa de Corpos de Heinz e Agregados de Hemoglobina H; eletroforese em pH ácido;


dosagem de hemoglobina A2; dosagem de hemoglobina Fetal. A eletroforese em pH ácido foi
realizada também com o gel de Agar para hemoglobina ácida da CELM, com excelentes
resultados, os exames de imagem tem papel complementar, mostrando características
peculiares da doença, tais como o crânio com estriações perpendiculares, a HbS também pode
ser confirmada por procedimentos eletroforéticos em pH ácido, em que as hemoglobinas que
apresentam migração semelhante em pH alcalino podem ser diferenciadas (BETKE, K et. al.,
1959; MARENGO-ROWUE, A.J. 1965; PAPAVANNOPOULOS et. al., 1974;
SILVESTRONI, E et. al., 1975; VELLA, F. 1968).

OBJETIVOS

Objetivo Geral
Avaliar a incidência de portadores da hemoglobina S em doadores de sangue na região
central do estado do Rio Grande do Sul.

Objetivo Específico
Em pesquisa da β-globina, expostas em pacientes portadores de anemia falciforme, foi
avaliada a incidência de portadores da hemoglobina S em doadores de sangue na região
central do estado do Rio Grande do Sul, através do teste de PCR, onde foi otimizado com o
kit Maxiprep (HOLLAND NT., et. al; 2003).

METODOLOGIA

AMOSTRAS

O anticoagulante utilizado foi o CPDA-1, onde foram utilizados para a otimização da


abordagem maxiprep (CHOMCZYNSKI P, SACCHI N; 1987).

EXTRAÇÃO

Pipetou-se 100ul de cada amostra em tubo falcon de 50ml, e adicionou-se 15mL de sangue
total + 25 ml de Tampão de LISE, logo após leva-se ao vórtex, centrifugar 6.000xg por 5 min;
descarta-se o sobrenadante e adiciona-se 30ml de Tampão de lise. Logo após, centrifugar a
6.000g por 5 min, vortear, adicionar 2 ml NaCl 5M e centrifugar a 7000g or 15 min. Descartar
o sobrenadante e adicionar 3 ml TRIS-Hcl 10Mm PH 8.0 (ressuspender o pellet); adicionar 3
ml detergente SDS 20mg/ml e vortexar. Feito isso, adicionar 2 ml NaCl 5M e centrifugar
7.000g por 15 min; transferir o sobrenadante para o tubo falcon (novo) de 50 ml, e descartar o
pellet e adicionar 30 ml de etanol absoluto gelado ao sobrenadante coletado; depois disso,
deve-se incubar no freezer a -20c° por 20 min; e centrifugar a 7.000g por 5 min, descartar o
sobrenadante e ficar com o pellet e adicionar 5 ml de etanol 70%, e misturar; centrifugar
7.000g por 5 min e descartar o sobrenadante. Adicionar 5 ml de etanol 70%, e misturar;
centrifugar 7.000xg por 5 min e descartar o sobrenadante. Secar o pellet a temperatura
ambiente por 10 min e adicionar 7 ml de T.E. 10:1 PH 8.0 e depois incubar a 70°C por 30
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min. O armazenamento deve ser feito em freezer à -20°C (CHOMCZYNSKI P, SACCHI N;


1987).

PCR

Para cada amostra de DNA, foi colocado em dois tubos, um marcado como normal (N) e
outro como mutante (M). Em cada um dos tubos, foi adicionado um iniciador direto comum,
que mistura Taq polimerase. O iniciador normal da foice foi adicionado no tubo rotulado
como N e o iniciador específico da foice mutante foi adicionado no tubo rotulado como M.
Para verificar se o sistema de PCR funcionava adequadamente e para evitar resultados
negativos falsos, um par de iniciadores de controle interno foi adicionado a cada tubo. Cada
um desses primers foi testado com amostras de DNA de controle positivo e negativo sendo
conhecidas sob condições de PCR rigorosas e uniformes (LITTLE S., 1998; MOHANTY D.
et. al., 2008).
Todos os reagentes foram fornecidos pela Chromus Biotech Pvt. Ltd.

A interpretação dos resultados da PCR, foramseparados em primers normais e mutantes de


células falciformes, primeiramente foram executados lado a lado na eletroforese de gel
submarino horizontal. Foi preparado 2% de gel de agarose contendo 0,5 ug / ml do itercalante
(brometo de etídio) e as amostras foram executadas a 100 V durante 45-60 minutos. Após a
eletroforese, as bandas foram visualizadas sob luz ultravioleta (UV) no sistema de
documentação Gel (sistema de imagem Gel Logic 200, imagem molecular Kodak) que
funciona emitindo fluorescência. O brometo de etidio, um corante intercalante liga-se
especificamente ao ácido nucleico, onde é excitado pela irradiação ultravioleta emitindo
fluorescência. Após a reação da PCR, a presença ou a ausência de uma banda de 207 pares de
bases com o iniciador específico da falcão mutante sob luz UV é diagnóstico para a presença
ou ausência do alelo falciforme (LITTLE S; 1998).

ELETROFORESE

Os primers utilizados para a técnica da PCR foram:


Primer Forward: 5’GAA GAG CCA AGG AGA GGT AC 3’
Primer Reverse: 5’CAA TTC ATC CAC GTT CAC C 3’

O tamanho do fragmento do produto de PCR com iniciador normal e mutante com base na
foice é de 268 pares de bases e com controle interno Inc1 e Inc2 é de 860 pares de bases
(LITTLE S., 1998; MOHANTY D. et. al., 2008).

RESULTADOS

As técnicas testadas foram realizadas em amostras de isolados clínicos de portadores de


HbS, provenientes da região central do estado de Santa Maria- RS. Para as técnicas
trabalhadas, sendo estas, PCR otimizada com kit Maxiprep, com o objetivo de analisar a
incidência de hemoglobina S em doadores de sangue, não foram obtidos resultados
significativos., conforme mostra a figura 2.
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Figura 2: Eletroforese em gel de agarose: Foram utilizados dois marcadores negativos (CN), um marcador
endógeno (END) e as amostras (A1, A2 e A0), sendo que A0 corresponde ao branco da reação.
Foi pipetado 8µl de cada amostra mais 2µl do intercalante, e para o marcador foi utilizado 3 µl do
intercalante mais 7 µl do marcador.

DISCUSSÕES

O Brasil é um país diversificado em mistura racial, com forte influência na dispersão de


genes anormais, contudo em hemoglobinopatias (falcemias e talassemias). A distribuição das
hemoglobinas normais está ligada com os grupos raciais que participaram na formação da
população de cada região (LEONELI GG., et. al; 2000).

Assim sendo, a heterogeneidade étnica-racial da população brasileira dificulta a


comparação dos resultados, uma vez que existe uma grande mistura na diversidade racial.
(LISOT CLA., et. al; 2004).

Num estudo feito por Melo et al (2000), mostrou que 23.981 doadores de sangue de
Uberlândia, Minas Gerais, e cidades subjacentes, destes doadores, os autores encontraram 820
(3,42%) portadores de hemoglobinopatias, onde a Hb AS foi encontrada em maior
prevalência (2,48%) quando comparadas com as outras hemoglobinopatias; o mesmo fato foi
encontrado na análise feita por Tavares e Bernardes, onde uma população de 483 doadores de
sangue do Centro de Hematologia de Sobradinho (Distrito Federal), onde a frequência de Hb
AS foi a predominante (2,96%), e no Hemonúcleo da Universidade São Francisco, na cidade
de Bragança Paulista, São Paulo, realizou-se um estudo com uma população de 1.846
doadores; sendo que, desses 1,13% foi Hb AS, demonstrando predominância de doadores AS
em bancos de sangue do Brasil (ACEDO MJ., et. al; 2002).

Outro estudo realizado no Sul e Sudeste, mostrou que 1,9% de hemoglobinopatias, com
predomínio de talassemias em São Paulo e 11,7% e no Rio Grande do Sul, sendo 9,8%
sugestivos de talassemia. A baixa prevalência de talassemias no presente estudo (0,1%) se
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justifica devido a seleção prévia de doadores exclui indivíduos anêmicos, além da presumida
composição étnica da população (LISOT CLA., et.al., 2004; ORLANDO GM., et.al., 2000).

CONCLUSÃO

As hemoglobinopatias são um problema de saúde pública a nível mundial, de caráter


genético, monogênias recessivas sem cura, mas com um tratamento correto e, quando
diagnosticadas cedo, diminuem alguns ricos, tais como o uso racional de medicamentos, uma
vez que possuem vários efeitos indesejados ao paciente. A triagem e o aconselhamento
genético são de extrema importância, pois esclarecem dúvidas obre estas doenças e procuram
um melhor direcionamento ao paciente portador. O diagnóstico laboratorial e o
aconselhamento genético são de fundamental importância para o conhecimento das
hemoglobinas anormais na população brasileira, uma vez que existe uma grade mistura de
raça na população brasileira.

A população deve ter acesso a mais informação sobre esta temática de modo a desenvolver
um conhecimento dos riscos e consequências que estas doenças acarretam. Segundo alguns
dados dos níveis de migrações dos últimos anos, são necessários novos estudos, mais
precisos, sobre a frequência e distribuição atual destas doenças, para que haja um melhor
planeamento, ao nível da medicina familiar e o alargamento dos rastreios a nível nacional e
não apenas a nível regional. A identificação de portadores deveria ser incluída nos exames de
rastreio desde o primeiro trimestre de gestação, para caso ocorra suspeita e/ou identificação de
casais de risco a nível nacional, possa ser tomada uma melhor conduta.

Atualmente, graças a muitos avanços tecnológicos e científicos, vários testes moleculares


vêm sendo estudados e otimizados para diversas doenças com a finalidade de dar um
resultado mais exato e preciso ao paciente com poucas desvantagens, garantindo uma maior
sensibilidade.

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