INTRODUCCIÓN

El botánico ruso Mikhail Tswett en 1910 describió por vez primera la

cromatografía, colocó un extracto de pigmentos vegetales en la parte superior de
una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar éter,
observó que la mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que
descendían a través de la columna a diferentes velocidades.

Figura 1: Experimento de Mikhail Tswett Figura Figura 2: Fotografía de Mikhail Tswett.

Tomada de blogspot Cromatografía Líquida de
Alta Eficacia, (2013).

Tras su descubrimiento, la cromatografía quedo prácticamente olvidada hasta

1930 año en que fue redescubierta por Kuhn y Lederer, quienes la aplicaron para
la separación de carotenoides; a partir de este momento, el uso de esta técnica se
fue extendiendo cada vez más, al tiempo que se desarrollaban diferentes
versiones de la misma: cromatografía de reparto (Martin y Synge, 1941), de papel
(Consden, Gordon y Martin, 1944), de capa fina (Stahl, 1958), etc. Un hito
importante en el desarrollo de la cromatografía lo constituyó el desarrollo de la
cromatografía gas-líquido (Martin y James, 1952), técnica que encontró
rápidamente aplicaciones de gran importancia, lo que llevo a su vez al desarrollo
de la teoría de la separación cromatográfica (Van Deemter, 1956; Giddings, 11

1
1965, etc.) así como al desarrollo de una instrumentación que permitía un mayor
control de las condiciones de trabajo.

Hoy en día casi no hay campo de la química, biología, medicina, etc. en el que no
se utilice la cromatografía en alguna de sus formas, tanto en su vertiente
preparativa como en la analítica; por otra parte el desarrollo sobre el uso conjunto
de la cromatografía con otras técnicas analíticas, así como el desarrollo de otros
tipos de cromatografía, como es por ejemplo la de fluidos supercríticos, hace
previsible una extensión aún mayor de su uso.

2
 CROMATOGRAFÍA

Actualmente cromatografía es el nombre que se le da a un grupo de técnicas

utilizadas en la determinación de la identidad de sustancias, en la separación de
componentes de las mezclas y en la purificación de compuestos. Esta técnica es
muy efectiva y por lo tanto se utiliza tanto a nivel de investigación como a nivel
industrial.

Este método puede variar de técnica en técnica, pero siempre se basa en el

mismo principio: Todos los sistemas de cromatografía contienen una fase
estacionaria y una fase móvil.

La cromatografía es esencialmente un método de separación en el que los

componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una inmóvil (fase
estacionaria), y otra móvil (fase móvil) la cual percola a través de la primera.

El proceso cromatográfico se da como resultado de repetidos procesos de sorción

y desorción durante el movimiento de los componentes de la mezcla arrastrados
por la fase móvil a lo largo de la fase estacionaria. (Elución), produciéndose la
separación debido a las diferencias en las constantes de distribución de los
componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la móvil. A la distribución
final de los componentes en función de su posición sobre el lecho estacionario, o
del tiempo en que eluyen se le denomina cromatograma.

3
 FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es un potente método de separación que tiene aplicación en

todas las ramas de la ciencia. La técnica fue inventada y denominada así por el
botánico ruso Mikhail tswett a principios del siglo XX.

Ningún otro método de separación es tan poderoso ni tiene tantas aplicaciones

como la cromatografía.

Es difícil definir con rigor el término “cromatografía” porque el concepto se aplica a

una gran variedad de sistemas y técnicas. Sin embargo, todos estos métodos
tienen en común el empleo de una fase estacionaria y una fase móvil.

 Fase estacionaria: En cromatografía, la fase estacionaria está fija en una

columna o en una superficie plana.
 Fase móvil: En cromatografía, la fase móvil se desplaza sobre o a través de
la fase estacionaria, acarreando una mezcla en la que se encuentra el analíto.
La fase móvil puede ser gas, líquido o fluido supercrítico.

Los componentes de una mezcla se pasan a través de una fase estacionaria

mediante el flujo de una fase móvil y las separaciones están basadas en las
diferencias de la velocidad de migración entre los componentes de la fase móvil.

Los métodos cromatógrafos son de dos tipos fundamentales:

1. Cromatografía en columna: la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto

y la fase móvil se hace pasar por el tubo, con presión o por gravedad.

Figura 3. Cromatografia en columna

2. Cromatografía plana: la fase estacionaria

está sujeta por una placa plana o en los
poros de un papel. En este caso la fase
móvil se mueve a través de la fase
estacionaria por acción capilar o por la
influencia de la gravedad.

4
 Clasificación de la cromatografía dependiendo del estado físico de las fases
envueltas.

Cromatografía de gases (CG)

Cromatografía de líquidos (CL)

Cromatografía de fluidos
supercríticos (CF; fase móvil:
fluido supercrítico)

Cromatografía de gases (GC)

Es una técnica de separación en la que la fase móvil es un gas. La cromatografía

de gases se lleva a cabo siempre en columna.

Cromatografía de líquidos (LC)

Es una técnica de separación en la que la fase móvil es un líquido. La

cromatografía de líquidos se puede realizar tanto en columna como en plano.

 Cromatografía de Reparto (o líquido - líquido), se basa en las

características de solubilidad relativa de los solutos entre la fase móvil y
una fase estacionaria de un líquido no polar. La fase líquida se impregna a
un soporte inerte de sílice o, en el caso de cromatografía de fase invertida,
se une químicamente.
 Cromatografía de Adsorción (líquido - sólido o cromatografía de fases
normales).

5
En la siguiente tabla se observan diferentes fases móviles y fases
estacionarias en diferentes técnicas de cromatografía:

Tabla 1: diferentes fases móviles y fases estacionarias.

6
 CROMATOGRAFÍA DE GASES

Principios Básicos

En la cromatografía de gases los componentes de una muestra evaporizada se

separan como consecuencia de que se reparten entre una fase gaseosa y una
fase estacionaria contenida en una columna. A diferencia de la mayoría de los
otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas del
analito; su única función es transportar este último a través de la columna.

Existen dos tipos de cromatografía de gases:

 Cromatografía Gas-Liquido (CGL): tiene gran aplicación en todos los

campos de la ciencia. En esta cromatografía, el analito se divide entre una
ase gaseosa y una fase liquida inmovilizada sobre la superficie del relleno
solido inerte o en las paredes de un tubo capilar.

 Cromatografía Gas-Solido (CGS): se basa en una fase estacionaria sólida

en la que la retención de los analitos ocurre porque hay adsorción. Su
aplicación es limitada debido a la retención semipermanente de las
moléculas activas o polares y a la obtención de picos de elución con colas
muy notables.

7
Instrumentación

Sistema de gas portador

En la cromatografía de gases la fase móvil se llama gas portador y debe ser

químicamente inerte. El helio es el gas para la fase móvil más común, pero
también se usa Argón, Nitrógeno e Hidrógeno.

Requieren reguladores de presión, manómetros y medidores de flujo para

controlar la corriente de gas.

El sistema de gas portador contiene a menudo un tamiz molecular para eliminar el

agua y otras impurezas.

Los flujos se controlan mediante un regulador de presión.

8
Sistema de inyección

Permiten que la muestra sea del tamaño adecuado para obtener una alta
eficiencia de la columna.

Columna cromatografía

Tubo estrecho generalmente de metal o sílice fundida, con diámetro interno y

longitud variables, en cuyo interior se encuentra la fase estacionaria. Es, por tanto,
en su interior donde los componentes de la muestra se separan. La columna
puede unirse directamente al inyector y al detector (cromatografía de gases, GC) o
bienestar conectada a otras partes del equipo mediante tubos conectores.

Generalmente se utilizan dos tipos de columnas: empacadas y tubulares.

Sistema de detección

Que es la parte del instrumento que mide de manera continua una propiedad física
o química del fluido que sale de la columna (aluato) y la transforma en una señal
eléctrica.

Sistema de amplificación

Un sistema de amplificación y tratamiento de la señal eléctrica generada por el

detector, de manera que se obtenga una señal que pueda ser entendida por el
analista (por ejemplo, la aparición del cromatograma en la pantalla del ordenador.

Características de un detector ideal

1. Sensibilidad adecuada.
2. Buena estabilidad y reproductibilidad
3. Respuesta lineal para lo solutos que se extiendan a varios ordenes de magnitud.
4. Intervalo de temperatura desde la temperatura ambiente hasta al menos 400ºC
5. Tiempo de respuesta corto independiente de la tasa de flujo
6. Alta confiabilidad y manejo sencillo
7. Respuesta semejante a todos los solutos o una respuesta selectiva y altamente
predecible para uno o más tipos de solutos.
8. No debe destruir la muestra

9
Columnas

Al igual que sucede en todas las técnicas cromatografías, la columna es el

corazón del cromatógrafo de gases. La columna es el auténtico elemento de
separación de los componentes de la muestra.

Una columna para cromatografía de gases, está formada por:

 Un tubo, que puede ser de diversos materiales (preferiblemente inertes),

dentro del cual se encuentra la fase estacionaria. Esta puede ser un sólido
activo (cromatografía gas sólido), o con mayor frecuencia un líquido
depositado sobre las partículas de un sólido portador (columnas
empaquetadas o de relleno) o sobre las propias paredes del tubo
(columnas tubulares abiertas).

Figura 7. Tubos.

Columnas Empaquetadas

Las columnas empaquetadas consisten, en un tubo (normalmente de vidrio o

acero inoxidable) con un diámetro interno que varía entre 2 y 5 mm y de una
longitud que oscila entre 1 y 15 m, arrollado de una forma adecuada para poderse
introducir en el interior del horno del cromatógrafos.

En el interior del tubo, se dispone la fase estacionaria bajo la forma de un líquido

soportado sobre un material adecuado finamente pulverizado; el diámetro de las

10
partículas del relleno debe ser, al menos, 10 veces inferior al diámetro del tubo,
con el fin de conseguir una buena uniformidad en su distribución. El relleno, se
encuentra confinado en el interior del tubo por medio de tapones del algún material
poroso (generalmente lana de vidrio o lana de cuarzo) situados en los extremos.

La longitud, y consecuentemente la eficacia, de las columnas empaquetadas se

encuentra limitada fundamentalmente por la caída de presión del gas portador
entre cabeza y salida de columna.

Figura 8. Tipos de columnas.

Figura 9. Interior de columna empaquetada.

11
Columnas tubulares abiertas

Las columnas tubulares abiertas (conocidas normalmente como columnas

capilares) fueron descritas inicialmente por Golay en 1957, y se encuentran entre
las más ampliamente utilizadas debido a la gran eficacia de separación que
proporcionan.

Básicamente, una columna tubular está formada por un tubo (normalmente de

vidrio o sílice fundida) de un diámetro comprendido entre 0,2 y 0,8 mm, en cuya
pared interna se dispone la fase estacionaria.

Según sea la forma en que se dispone la fase estacionaria sobre la pared del tubo,
se distinguen básicamente dos tipos de columnas:

Columnas PLOT (Porous Layer Open Columnas WCOT (Wall Coated Open
Tubular) Tubular)

 Columnas WCOT (Wall Coated Open Tubular). En este tipo

de columnas (que son las de uso más frecuente), la fase estacionaria se
encuentra depositada formando una película líquida directamente sobre las
paredes del tubo.

Figura 11. Interior de columna Wcot.

12
  Columnas PLOT (Porous Layer Open Tubular). En estas columnas la
pared interna del tubo está recubierta por una capa de un soporte
adsorbente; si a su vez el soporte está impregnado con una fase
estacionaria líquida, las columnas son denominadas SCOT (Support
Coated Open Tubular.

Figura 12.

El enorme uso que se hace de este tipo de columnas es debido fundamentalmente

a que la elevada eficacia que ofrecen permite la separación de mezclas muy
complejas con relativa facilidad.

La gran eficacia de este tipo de columnas permite conseguir buenas resoluciones

sin recurrir a fases estacionarias de gran selectividad, lo que simplifica mucho el
problema de la elección de la fase estacionaria.

El principal inconveniente de este tipo de columnas es su pequeña capacidad de

carga, lo que obliga a utilizar sistemas de inyección especiales para introducir
pequeñas cantidades de muestra y detectores de muy alta sensibilidad.

Soporte solido: La misión de los soportes sólidos utilizados en algunos tipos

de columnas es la de proporcionar una superficie sobre la que se deposita la
fase estacionaria líquida en forma de película uniforme.

Los soportes utilizados en cromatografía de gases deben reunir una serie de

cualidades, como son:

1. Deben presentar una superficie específica relativamente elevada.

2. Deben ser porosos.

13
 3. Deben ser relativamente duros para que sus partículas no se rompan
durante los procesos de impregnación y llenado de las columnas.
4. Deben ser térmicamente estables.
5. La superficie de los soportes debe ser químicamente inerte y no debe
provocar fenómenos de adsorción que puedan influir en la separación
cromatografías.

La fase estacionaria

La fase estacionaria tiene en cromatografía de gases un papel fundamental, ya

que la fase móvil es cromatográficamente inerte y las separaciones son debidas
exclusivamente a las interacciones específicas que se dan entre los componentes
de la muestra y la fase estacionaria.

Las propiedades que debería cumplir una fase estacionaria son:

1. Debería tener un rango de temperaturas de utilización lo más amplio

posible (idealmente entre -60 y 400 EC).
2. Debe tener una presión de vapor lo más baja posible.
3. Debe ser térmicamente estable.
4. Debe ser químicamente inerte.
5. Debe tener baja viscosidad en las condiciones de trabajo.
6. Debe mojar bien el soporte, presentando además una adherencia suficiente
como para que no sea arrastrada por la fase móvil.

Además de cumplir estos requisitos generales, la fase estacionaria debe ser

selectiva frente a los compuestos a separar.

14
A nivel molecular, la retención de un soluto por parte de la fase estacionaria
puede ser debida a cualquier tipo de fuerzas intermoleculares:

Fuerza de
dispersión

Fuerza de
orientación
Fuerzas
intermoleculares
Fuerzas
donador-aceptor

Fuerzas de
inducción
Figura 13. Tabla clasificación de fuerzas intermoleculares.

Detectores

Los detectores usados en cromatografía de gases, pueden dividirse de forma

genérica en detectores universales y detectores específicos.

los primeros ofrecen la ventaja de responder prácticamente ante cualquier

compuesto que pueda eluir de la columna, no obstante, esta misma propiedad
puede convertirse en un serio inconveniente cuando se procede al análisis de
mezclas muy complejas.

Los detectores usados en cromatografía de gases, pueden dividirse de forma

genérica en detectores universales y detectores específicos.

15
La utilización de detectores específicos resulta muy ventajosa ya que, al responder
únicamente frente a un grupo limitado de compuestos, los cronogramas que
ofrecen resultan muy simplificados.

Tipo de Detector de conductividad termica

detectores
Detector de ionización en llama

Detector de captura electronica

Detector Nitrogeno-Fosforo

Detector fotometrico de llama

Detector de fotoionización

Detector de conductividad electronica

Figura 18. Tipos de detectores.

Detector de conductividad térmica

Uno de los primeros detectores utilizados para el trabajo de rutina en

cromatografía de gases, ha sido el detector de conductividad térmica o detector de
hilo caliente.

Este tipo de detector responde a la diferencia de conductividad térmica existente

entre el gas portador puro y el gas portador mezclado con alguna otra substancia;
la magnitud de la respuesta dependerá de la diferencia de conductividad térmica
entre el compuesto que eluye de la columna y el gas portador.

16
Figura 19. Detector imagen interna.

En un detector de conductividad, el gas procedente de la columna pasa a través

de una cavidad termostatizada que contiene el elemento sensor, un hilo de metal
calentado o un termistor.

El detector de conductividad térmica es universal y no es destructivo; por lo

general se utiliza para el análisis de gases permanentes, hidrocarburos ligeros y
otros tipos de compuestos que ofrecen una respuesta pobre en otros tipos de
detectores.

Detector de ionización en llama.

El detector de ionización de llama, es tal vez el más ampliamente utilizado en

cromatografía de gases. Este tipo de detector es en la práctica de respuesta
universal, ya que es selectivo hacia los compuestos que presenten enlaces C-H,
por lo que son muy pocos los compuestos que no dan señal en él.

En un detector de ionización de llama, el gas procedente de la columna se mezcla

con hidrógeno y esta mezcla se quema en una cámara con exceso de aire.

Los detectores de ionización de llama ofrecen una elevada sensibilidad, gran

estabilidad y un rango dinámico lineal excepcionalmente elevado; todo ello, junto
con una gran sencillez de utilización ha hecho que este tipo de detectores, sean
con mucho los de mayor utilización.

17
Figura 20. Detector de ionización de llama.

Detector de captura electrónica

El detector de captura electrónica ocupa probablemente el segundo lugar entre los

detectores de más alta utilización, debiéndose este hecho a su excepcional
sensibilidad.

En un detector de captura electrónica, se utiliza una fuente de radiación β para

bombardear el gas portador que pasa a través de una cámara de ionización,
generándose de esta forma un plasma de iones positivos, radicales libre y
electrones térmicos.

Las fuentes de partículas β utilizadas en este tipo de detectores son emisores

débiles, 3H, 63Ni, 55Fe, o electrones emitidos por efecto termoeléctrico, aunque
en la práctica solamente son asequibles detectores basados en fuentes de 63Ni y
en algunos casos de tritio.

18
Detector de nitrógeno-fosforo

El detector de nitrógeno-fósforo (también conocido como detector termoiónico o

detector de llama alcalina), está basado en el hecho de que la adición de una sal
de metales alcalinos a la llama de un detector de ionización aumente la respuesta
de éste hacia determinados elementos (fósforo, nitrógeno, azufre, etc.).

La selectividad de este tipo de detectores es muy dependiente de parámetros tales

como la temperatura, la forma y el tamaño de la llama, la composición de la sal
alcalina, geometría del detector, etc.; debido a esta dependencia de muchos
parámetros experimentales, el manejo de este tipo de detector es difícil.

El principal problema que presenta este detector es la inestabilidad de su

respuesta, debida fundamentalmente a contaminación o pérdida de actividad de la
perla alcalina, por lo que es necesario realizar calibraciones con relativa
frecuencia.

Detector fotométrico de llama

El detector fotométrico de llama (FPD), utiliza una llama de hidrógeno para excitar
a un estado electrónico elevado fragmentos de moléculas que contengan átomos
de azufre o fósforo.

Estos dos elementos son excitados de forma óptima por la llama de hidrógeno, y
cuando retornan a su estado fundamental emiten las líneas características de sus
espectros; las líneas analíticas de interés son seleccionadas por medio de un filtro
y la intensidad de la radiación emitida es medida por medio de un
fotomultiplicador.

En este tipo de detector, el gas portador procedente de la columna es mezclado

con aire y quemado en una atmósfera de hidrógeno; la emisión de los átomos de
azufre o fósforo se da fundamentalmente en la zona superior, rica en hidrógeno de
la llama, por lo que en ocasiones se utiliza un diseño de doble quemador con una
segunda llama para producir la excitación.

19
Detectores de fotoionización

Los detectores de fotoionización están basados en la utilización de los fotones

generados en una lámpara de descarga para ionizar los compuestos orgánicos
que emergen, junto con el gas portador, de una columna cromatografía.

Este tipo de detectores, utilizan para generar la radiación un tubo de descarga que
contiene una mezcla de gases a baja presión; éstos son excitados por medio de
una diferencia de potencial elevada que se mantiene entre dos electrodos.

En este detector el gas portador pasa a través de una cámara de ionización,

separada físicamente del tubo de descarga por medio de una ventana
transparente a la radiación.

Los compuestos que eluyen de la columna son ionizados por los Detalle de un
doble quemador fotones de alta energía procedentes de la lámpara y los iones
generados son recogidos por medio de un electrodo polarizado adecuadamente.

Prácticamente la totalidad de los compuestos orgánicos dan algún tipo de

respuesta con estos detectores. La sensibilidad del detector de fotoionización es
dependiente del potencial de ionización del compuesto de que se trate; la
respuesta del detector frente a los compuestos orgánicos sigue el orden general:

Compuestos aromáticos > alquenos > alcanos > alcoholes > ésteres > aldehídos >
cetonas

Detector de conductividad electrolítica

El detector de conductividad electrolítica más ampliamente utilizado es el de Hall;

la célula de medida de este detector, mide la conductividad del líquido en su
primera parte, y la conductividad del líquido más la de los productos de la pirolisis
en la segunda, sumándose después de forma diferencial las señales de las dos
medidas, con lo que se minimizan las fluctuaciones de respuesta debido a factores
que puedan afectar a la medida (conductividad de base del líquido, variaciones de
temperatura, etc.).

20
Figura 25. Sistema de inyección de la muestra

Sistema de inyección de la muestra

Los dispositivos de inyección de muestras para cromatografía de gases tienen la

misión de vaporizar la muestra a analizar e incorporarla a la corriente de gas
portador que se dirige hacia la columna.

La vaporización e introducción de las muestras en el sistema, debe realizarse

cumpliendo una serie de requisitos:

1. La vaporización de la muestra debe ser lo más rápida posible.

2. La vaporización debe realizarse sin discriminar ningún componente de la
muestra.
3. La muestra debe llegar a la columna como una banda lo más fina posible.

21
Inyectores para columnas empaquetadas

La inyección de muestras en columnas empaquetadas no presenta problemas

particulares; este tipo de columnas admiten cantidades de muestra relativamente
elevadas, y la inyección de unos cuantos microlitros de muestra no conduce a una
merma apreciable de la eficacia de la columna.

Figura 26.Interior de Inyectores.

Inyectores para columnas capilares

Los sistemas de introducción de muestras utilizados para trabajar con columnas

capilares, están basados sobre los mismos principios de los inyectores utilizados
para columnas empaquetadas Las columnas capilares son muy afectadas por los
disolventes, de forma que los volúmenes que se pueden inyectar en ellas son
extremadamente bajos.

22
Inyección con división de muestra

Este tipo de inyección (más conocida como inyección “split”), es el más sencillo de
los que se utilizan en cromatografía capilar. El inyector de “split”, consta
básicamente de los mismos elementos que un inyector normal, con la única
adición de un sistema de división de flujo a la salida de la cámara de mezcla.

Los inyectores de este tipo presentan dos inconvenientes:

La división de la muestra da lugar a que las cantidades de analito que son

separadas y llegan al detector sean muy pequeñas, por lo que los límites de
detección aumentan bastante, lo que es un gran inconveniente a la hora de
realizar análisis de trazas.

Los inyectores de “Split” pueden en algunos casos dar lugar a discriminación entre
los componentes de la muestra.

Inyección Splitless

En la técnica de inyección “splitless”, la totalidad de la muestra inyectada es

dirigida hacia la columna, que se mantiene durante la inyección a una temperatura
inferior al punto de ebullición del componente más volátil de la muestra.

La utilización de la técnica de “splitless” supone dos importantes ventajas. En

primer lugar, dado que no existe división de muestra, permite un aumento notable
de la sensibilidad, por lo que es muy adecuada para el análisis de trazas. Por otra
parte, la reconcentración de la muestra en la cabeza de la columna origina que las
pérdidas de eficacia debidas a una inyección inadecuada sean de mucha menor
importancia que en otras técnicas de inyección.

23
Inyección en columna

Los sistemas de inyección en columna (normalmente conocidos por su nombre

inglés de “on-column”), han sido diseñados para posibilitar la introducción de
muestras directamente en el interior de columnas capilares.

La gran ventaja que ofrece el sistema de inyección “on-column”, es que reduce la

discriminación entre los componentes de la muestra prácticamente a cero,
obviándose además todos los problemas que presentan las restantes técnicas de
inyección.

Otros sistemas de inyección

Válvulas de inyección de gases.

Desorción Térmica
Inyectores de espacio de cabeza

24
Aplicaciones cualitativas y cuantitativas

Las técnicas cromatografías están ampliamente extendidas y su enorme aplicación

se debe a su elevada sencillez, bajo costo y gran eficacia de separación.

A menudo la cromatografía de gases

se emplea para confirmar la presencia
o ausencia de un compuesto en una
muestra determinada.

Aplicaciones cualitativas
Las aplicaciones cualitativas de la CGL son más limitadas. Se utilizan
frecuentemente para determinar la pureza de compuestos orgánicos, pues la
aparición de picos adicionales revela la presencia de contaminantes y la medida
de las áreas bajo estos picos proporcionan un cálculo aproximado del grado de
contaminación.

Es también un método excelente para confirmar la presencia o ausencia de un

supuesto componente de una mezcla, siempre que se disponga de un patrón.

La identificación de un determinado compuesto A puede realizarse a través del

factor de selectividad, tomando un cierto compuesto B como patrón.

Otra forma de llevar a cabo la identificación de un determinado compuesto en una

mezcla es haciendo uso del denominado índice de retención o de Kovats (I). Para
un alcano normal es igual a 100 veces el número de carbonos del compuesto, sin
considerar el relleno de la columna, la temperatura u otras condiciones
cromatográficas. Según esto, es posible definir una escala de índices de retención
tomando como referencia los alcanos normales. Por lo que el índice de retención
de un compuesto desconocido se puede establecer a partir de dos alcanos
normales, de los cuales uno eluye antes y otro después que el compuesto, como
en el ejercicio 2 de este tema.

25
Aplicaciones cuantitativas

La altura del pico o el área bajo el pico de un producto de elución en una columna
cromatografía se utilizan ampliamente en los análisis cuantitativos o
semicuantitativos. En condiciones muy bien controladas se puede alcanzar una
exactitud (relativa) de 1% con el método del patrón externo o interno. Como con la
mayoría de las técnicas analíticas, la confiabilidad se relaciona directamente con
el control de las variables; la exactitud también depende en parte de la naturaleza
de la muestra.

La altura del pico o el área bajo el pico de un producto de elución en una columna
cromatografía se utilizan ampliamente en los análisis cuantitativos o
semicuantitativos. En condiciones muy bien controladas se puede alcanzar una
exactitud (relativa) de 1% con el método del patrón externo o interno. Como con la
mayoría de las técnicas analíticas, la confiabilidad se relaciona directamente con
el control de las variables; la exactitud también depende en parte de la naturaleza
de la muestra.

26
 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

Fundamento y principios básicos

La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los

componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar
(columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílice que se ha tratado con
RMe2SiCl. La fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución
es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran de
acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna.
Estas interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la
muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza de
los compuestos a determinar.

El proceso cromatográfico puede ser considerado como: un conjunto de fuerzas

que compiten de manera selectiva por un compuesto (analito o soluto) para, por
una parte, fijarlo al relleno de la columna o fase estacionaria, o llevarlo disuelto en
los líquidos que fluyen a través de la columna o fase móvil. Los distintos tipos de
fuerzas entre fase estacionaria y solutos definen los distintos tipos de
cromatografía.

Descripción general de la técnica HPLC

En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una

columna que contiene a la fase fija. La separación cromatografía en HPLC es el
resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en
ambas fases, móvil y estacionaria

A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto

rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada
por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.

La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos

naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos poli
funcionales de alto peso molecular.

27
Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible
para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.

La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una
mayor gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la
separación.

HPLC preparativa

Es la técnica escogida para aislamiento y purificación de productos de valor en las

industrias químicas y farmacéuticas así como en la biotecnología y la
bioquímica. La cromatografía preparativa comprende un amplio rango de
aplicaciones, desde el aislamiento de 1µg de muestra para identificación
espectroscópica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100
g.

Tipos de HPLC

Cromatografía de fase normal: La cromatografía de fase normal o normal

phase HPLC (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el
campo de la química, y se caracteriza por separar los compuestos sobre la
base de su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una
fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante
polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria.
La fuerza de adsorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del
compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria
polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención
La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del
compuesto de interés, sino también en factores estéricos de forma que los
isómeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La
utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo
de retención de los compuestos mientras que los disolventes más
hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención.

28
La NP-HPLC cayó en desuso a los años 1970 con el desarrollo del HPLC
de fase reversa o reversed-phase HPLC debido a la falta de
reproductibilidad de los tiempos de retención puesto que los disolventes
próticos cambiaban el estado de hidratación de la sílice o alúmina de la
cromatografía.

Cromatografía de fase inversa: La HPLC de fase inversa (RP-HPLC)

consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad
moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de
cromatografía es la sílice tratada con RMe2SiCl, donde la R es una cadena
alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retención es mayor para las
moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter
polar eluyen más rápidamente.
El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase
móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. La
cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo
denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía de
fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que
resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar,
un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La
fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la
disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente.
Este efecto hidrofóbico está dominado por el aumento de la entropía, y la
consecuente disminución de la energía libre, asociada con la minimización
de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofóbico disminuye
con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el
coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la
columna y eluye.
Las características del compuesto de interés juegan un papel muy
importante en la retención.

29
En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un
tiempo de retención mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la
molécula. Aun así, las moléculas muy grandes pueden ver reducida la
interacción entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El
tiempo de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que
suele ser inversamente proporcional al tamaño del compuesto. Los
compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros
lineales puesto que la superficie total se ve reducida.
Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmóvil, otras modificaciones de la
fase móvil pueden afectar la retención del compuesto; por ejemplo, la
adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión
superficial, y como la entropía de la interface compuesto-disolvente está
controlada precisamente por la tensión superficial, la adición de sales tiende
a aumentar el tiempo de retención.
Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la
hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayoría de métodos
utilizan un tampón como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH.
Estos tampones controlan el pH, pero también neutralizan la carga o
cualquiera resto de sílice de la fase estacionaria que haya quedado
expuesta y actúan como contra iones que neutralizan la carga del
compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar,
pero en general mejoran la separación cromatografía.
Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que
las columnas de sílice normales. Aun así, muchas columnas de fase
reversa están formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se
deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que éstas podrían
dañar el esqueleto de sílice subyacente. Las columnas se pueden utilizar en
ácidos en medio acuoso pero no deberían estar expuestas demasiado
tiempo al ácido porque puede corroer las partes metálicas del aparato de
HPLC.

30
Cromatografía de exclusión molecular: La cromatografía de exclusión
molecular, también conocida como cromatografía por filtración en gel,
separa las partículas de la muestra en función de su tamaño. Generalmente
se trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se suele
utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. También es muy útil
para la determinación de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria
de las proteínas purificadas.
La cromatografía de filtración molecular es un método de cromatografía en
columna por el cual las moléculas se separan en solución según su peso
molecular, o más precisamente, según su radio de Stokes.
En esta cromatografía, la fase estacionaria consiste en largos polímeros
entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los fines
prácticos, la columnas se empaquetan con pequeñas partículas
esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados. En consecuencia,
estas partículas son porosas, y el tamaño de los poros es tal que algunas
moléculas (las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros, en
tanto que otras (las suficientemente pequeñas) podrán pasar libremente.
Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina
una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al
interior de esta.

Cromatografía liquida de alta eficiencia en condiciones

desnaturalizantes: Se trata de un método que se emplea para el rastreo
de mutaciones (ya casi totalmente en desuso debido al auge de la
secuenciación), que permite detectar la presencia de variaciones en el ADN
aunque no se determinan específicamente cuáles. En este caso, se utiliza
la técnica cromatográfica para la detección de heterodúplex de ADN, en
lugar de utilizar un gel para correr las moléculas de ácidos nucleicos.
El procedimiento consiste en desnaturalizar (aumentando la temperatura
normalmente) una muestra que contenga tanto el ADN problema como un
ADN control, que no es más que el mismo ADN problema pero en su

31
versión silvestre o normal (sin mutaciones). Luego se procede a
renaturalizar (disminuyendo la temperatura), de manera que aquellas
cadenas de ADN que vuelvan a unirse con sus respectivas
complementarias (cadena "a" silvestre con cadena "b" silvestre; o bien
cadena "a" mutante con cadena "b" mutante) no presentarán diferencia con
el estado original; sin embargo, si por ejemplo una cadena "a" silvestre
híbrida con una cadena "b" mutante, aquella región (más o menos amplia)
en la que exista mutación no complementará, formándose un bucle u
horquilla, es decir, una región en la que las bases nitrogenadas no son
complementarias y no establecen las uniones características por puentes
de hidrógeno en la doble hélice de ADN. Dichas estructuras son los
denominados heterodúplex (dúplex de ADN híbridos). Estos heterodúplex
migran de forma diferente a los homodúplex en la columna de
cromatografía de fase reversa(al igual que lo hacen en un gel de agarosa o
acrilamida). La separación se realiza en condiciones desnaturalizantes
variables, detectándose las moléculas de ADN midiendo la absorbancia a
260 nm. Esto origina un pico de elución a un tiempo característico. A
medida que se incrementan las condiciones desnaturalizantes los
heterodúplex migran por delante de los homodúplex, apareciendo los picos
correspondientes a heterodúplex antes en el gráfico resultante, el
cromatograma. De esta manera, como los heterodúplex se desnaturalizan a
temperaturas distintas a los homodúplex, ambas moléculas dan lugar a
picos de elución distintos.

32
Factores a considerar en la cromatografía HPLC durante el proceso de
separación del analito

1. Factor de retención: valora si es posible la elución de los componentes en

un tiempo óptimo para las condiciones dadas.
2. Factor de selectividad: valora la posibilidad de separar los componentes sin
solaparse.
3. La resolución: evalúa la calidad de separación entre dos componentes.
4. La evaluación de la eficacia de la columna para realizar una separación: se
realiza mediante el número de patos teóricos o altura de plato teórico.

Instrumentación

Los componentes básicos de un sistema para HPLC son:

A) Depósitos para la fase móvil (disolventes): El depósito que mantiene la

fase móvil a menudo no es más que una botella de vidrio.
B) Sistema de bombeo para proporcionar presión a la fase móvil: La
mayoría de las bombas de HPLC comerciales se basan en un diseño de
pistones alternativos, como se muestra aquí.
C) Sistema de inyección de muestras: La válvula de inyección fija o variable
a través de bucle es una forma común de introducir la muestra.
D) Columna cromatográfica: Es el corazón del sistema cromatográfico, en
ella se produce la retención de los diferentes compuestos que permite su
separación.

33
 Inyectores de jeringa

En este tipo de inyectores, la introducción de la muestra en la columna se realiza

por medio de una jeringa cuya aguja entra en el sistema cromatógrafico a través
de una membrana lo que permite depositar la muestra en la cabeza de la columna.

Las ventajas de este tipo de

inyector, radican en su facilidad
de construcción y en que
permiten sacar todo el partido de
eficacia ofrecida por la columna;
por el contrario, son inyectores
que presentan una gran falta de
reproducibilidad, tienen una
presión de trabajo limitada y son
de gran dificultad de manejo.

34
Inyectores de válvula

Este sistema de inyección consiste en una válvula de seis vías, dos de las cuales
están conectadas entre sí por medio de una espira. Esta espira es un tubo de
volumen conocido, cuya misión es la de contener la muestra antes de efectuarse
la inyección.

La introducción de la muestra en la columna se lleva a cabo en dos etapas; la

primera se realiza a presión atmosférica, y consiste en cargar la muestra en la
espira con ayuda de una jeringa; en la segunda, mediante un giro de válvula, se
hace pasar el eluyente a través de la espira hacia la columna.

La inyección mediante válvulas en con mucho la más utilizada, ya que reúne

prácticamente todas las características exigibles a un inyector.

En la actualidad los inyectores son válvulas de 6 vías que dirigen el caudal hacia
la columna, pasando según su posición, a través de un loop en el cual se
introduce la solución a inyectar. Las válvulas se pueden manipular de modo
manual o automáticamente. El loop es intercambiable, lo que permite introducir
una serie de medidas estándar que generalmente van desde 50 hasta 200 µL.

Los inyectores, ya sean, de tipo manual o automático tienen una posición de carga
y otra de inyección.

1. Posición de carga (Figura 8 a): se llena el loop y lo que sobra va a los

desechos. La fase móvil se dirige desde la bomba hacia la columna.

En un inyector manual el rotor se encuentra en la posición de carga (load) es aquí

cuando se inserta la jeringa en el orificio y se inyecta el contenido en el inyector,
en este caso se debe inyectar un volumen de muestra igual o mayor a 5 veces la
capacidad del loop para purgarlo y asegurar que quede limpio, la muestra que
sobra va a los desechos.

35
El automuestreador permite inyectar la cantidad que se necesite en el análisis,
esta puede ser menor que la capacidad del loop, pues al ser automático va a
evitar imprecisiones en los resultados por error del analista, en este sistema
también se hace la purga del loop antes de la inyección.

2. Posición de inyección de la muestra (figura 8 b): La fase móvil que viene de

la bomba pasa por el loop y empuja la muestra hacia la columna

Para la inyección manual el rotor se mueve a la posición de inyección (inject) sin

quitar la jeringa del orificio después de esto se puede retirar la jeringa y se
devuelve el rotor a la posición de carga

Aplicaciones cualitativas y cuantitativas

La HPLC se puede utilizar como técnica preparativa o como técnica analítica,

permitiendo la purificación, identificación y cuantificación del analito deseado. La
elección de la fase estacionaria y la fase móvil, del flujo al que se va a impulsar la
fase móvil a través de la fase estacionaria e incluso de la temperatura a la que se
va a realizar la cromatografía, permitirán una correcta separación del analito de
otros compuestos. Cada componente de una solución tiene unas características
determinadas bajo ciertas condiciones cromatografías, y debe conseguirse que la
migración del componente y de los contaminantes a través de la columna sea lo
suficientemente distinta para que dicho compuesto sea separado de los demás del
extracto, para permitir su posterior identificación y cuantificación. La cromatografía
líquida de alta presión a pesar de ser una técnica relativamente nueva, se cuenta
que describe numerosas aplicaciones en la literatura química. En la mayoría de los
casos, éstas consisten en determinaciones de sustancias cuyo análisis por otra
técnica cromatografía resulta muy difícil.

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 CAMPO DE APLICACIÓN

Campos de Aplicación de HPLC

 Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
 Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
 Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
 Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos,
propulsores, colorantes
 Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
 Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
 Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,
estrógenos.
Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa
 Separación y purificación de metabolitos
 Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de
muestras de orina
 Purificación y separación de enantiómeros
 Purificación de compuestos naturales
 Purificación y caracterización de enzimas y proteínas

37
 Diferencias fundamentales entre la cromatografía de Gas y HPLC.
HPLC Cromatografía de Gases
Fase móvil: liquida Fase móvil: Gas

Capacidad de separar compuestos Capacidad de separar compuestos

termolábiles volátiles, semi-volátiles y
térmicamente estables a temperaturas
de hasta 350-400º.
Puede ser realizado en una hoja o Puede ser realizado solamente en una
en una columna. columna.
Picos angostos (alta eficiencia)
No existe detector universal Dispone de detectores mucho más
universales.
Más rápido y mayor sensibilidad Es más simple, y sensible.
Instrumentación costosa Instrumentación sencilla y económica

Diferencias entre HPLC y UPLC

HPLC ULPC
Presión de entrada 5000psi Presión de entrada más de 5000 psi
Baja precisión comparativa en la Presión superior en la introducción de
introducción de muestras muestras
Detector que utiliza grandes caudales Detector que utiliza caudales
y celdas de detección más grandes pequeños y límites de detector bajos
Algunos están equipados con La mayoría de ellos están equipados
dispositivos de muestreo con dispositivos de muestreo
automatizados automatizados
Más lentos con menor resolución Rápido con mayor resolución

38
 HPLC UPLC
Tamaño de partícula 3-10 um 1-2 um
Presión 4000-6000 psi 15000-100000 psi
Rango de flujo 100 ul/min 300-800 ul/min
Tiempo de separación Alto Bajo
Sensibilidad Bajo Más alto que el otro
Resolución Menor Alto
Costo del método de Alto Menor
desarrollo

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 CONCLUSIÓN

La cromatografía es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención

selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

La columna de separación es el corazón del cromatógrafo. Proporciona

versatilidad en los tipos de análisis que pueden realizarse. Esta característica,
debida a la amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y
estacionaria, permite separar moléculas que difieren muy poco en sus
propiedades físicas y químicas. En un sentido amplio, la distribución de un soluto
entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las moléculas del
soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la atracción o repulsión relativas que
presentan las moléculas o iones de las fases competidoras por el soluto y entre sí.
Estas fuerzas pueden ser de naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares
permanentes o inducidos, o pueden deberse a fuerzas de dispersión del tipo
London. En cromatografía de intercambio iónico, las fuerzas en las moléculas del
soluto son sustancialmente de naturaleza iónica; pero incluyen también fuerzas
polares y no polares.

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 BIBLIOGRAFÍA

 https://repositorio.sena.edu.co/bitstream/11404/4694/1/guia_cromatografia.
pdf
 http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/
cromatografia/principios_de_cromatografia.pdf
 http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-qumicos/cromatografa-
de-lquidos-hplc
 https://biotaetscientia.com/2016/04/14/principios-de-cromatografia/
 http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia
/cromatografia_liquida_de_alta_eficacia.pdf
 http://blog.utp.edu.co/docenciaedwin/files/2014/09/TIPOS-
CROMATOGRAFÍA.pdf
 https://www.monografias.com/trabajos107/cromatografia-liquida-alta-
performance/cromatografia-liquida-alta-performance.shtml#ventajasya
 https://es.scribd.com/document/259450699/Introduccion-a-La-
Cromatografia

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