Guía Técnica de Microbiología 2013

Instituto Tecnológico de Culiacán
Departamento de Ingeniería Química- Bioquímica
GUÍA TÉCNICA DE MICROBIOLOGÍA

CENTRADA EN EL APRENDIZAJE POR COMPETENCIAS
BASILIA MARTHA MONTOYA ARAUJO
Culiacán, Sinaloa, diciembre 2013

Guía Técnica de Microbiología centrada en el
Aprendizaje por Competencias Montoya-Araujo,B.M.

Departamento de Ingeniería Química-Bioquímica
Tabla de contenido
Prólogo ......................................................................................................................................... 3
Normas de seguridad en el Laboratorio de Microbiología ..................................................... 4
Cuidados del material y equipo utilizado en el Laboratorio de Microbiología ..................... 5
Práctica 1. Clasificación, preparación y esterilización de material ...................................... 7
Práctica 2. Clasificación, diseño, preparación y esterilización de medios de cultivo ....... 11
Práctica 3. Obtención de cultivos puros a partir de cultivos
mixtos utilizando diversas técnicas de aislamiento ........................................... 18
Práctica 4. Identificación presuntiva de bacterias por su morfología
colonial y características microscópicas ............................................................. 23
Práctica 5. Conservación de cepas ......................................................................................... 29
Práctica 6. Curva de crecimiento poblacional en cultivo sumergido .................................. 32
Práctica 7. Curva de crecimiento en un cultivo sólido .......................................................... 35
Práctica 8. Efecto de las condiciones ambientales sobre el crecimiento microbiano ...... 38
Práctica 9. Cultivo de bacterias anaerobias ........................................................................... 43
Práctica 10. Recuento de bacterias por la técnica de vertido en placa ............................... 47
Práctica 11. Recuento de bacterias en película Petrifilm ...................................................... 52
Práctica 12. Recuento de coliformes y Escherichia coli en
muestras de agua por el método de filtración por membrana ......................... 56
Práctica 13. Determinación de bacterias coliformes totales,
coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica del NMP .......................... 60
Práctica 14. Pruebas bioquímicas y técnicas rápidas para la
caracterización de enterobacterias ..................................................................... 67
Práctica 15. Cultivo e identificación de hongos filamentosos y levaduras ........................ 79
Práctica 16. Identificación de algas y protozoarios ............................................................... 83
Práctica 17. Ecología microbiana ............................................................................................ 86
Práctica 18. Biología Molecular: Extracción, amplificación y observación del DNA ........ 90
Anexos........................................................................................................................................ 96
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Prólogo
El presente manual tiene la finalidad de fomentar el desarrollo de competencias que conlleve al estudiante, al
dominio de las metodologías necesarias para la manipulación de los microorganismos con responsabilidad, en
beneficio del ser humano y su medio ambiente. La naturaleza viviente de los microorganismos con los que se
trabaja en el Laboratorio de Microbiología, le imprime a éste, una característica única; que si bien, el estudiante
está consciente de que el trabajo con microorganismos es arduo pero fascinante, también lo está, de que la
experimentación le brinda la oportunidad de conceptualizar a partir de lo observado, potenciando su capacidad
crítica y responsabilizándose de su propio aprendizaje. Sobre esta base, las actividades prácticas presentadas
son congruentes al conocimiento teórico, sin embargo no constituyen de manera alguna una corroboración de lo
visto previamente en clase.
Las prácticas permiten la comprensión de conceptos complejos además, favorecen el aprendizaje cooperativo, el
trabajo en equipo, las relaciones interpersonales, lo que favorece el establecimiento de un ambiente de confianza
y respeto. A través de la experimentación, el estudiante pone en juego una serie de conocimientos, habilidades,
capacidades, valores y actitudes que propician procesos intelectuales complejos que le permiten resolver las
diferentes problemáticas a las que se enfrenta, valiéndose de la observación sistemática y objetiva de
evidencias. El manual integra una serie de sugerencias de actividades prácticas que demuestran los principios
generales de la Microbiología, propiciando en el estudiante la libertad de elegir, a conveniencia de la
experimentación, los métodos y técnicas apropiadas para el desarrollo de su aprendizaje de manera
independiente, convirtiéndose el profesor en un guía y orientador.
En este contexto resulta necesario llevar a cabo la evaluación de las prácticas de laboratorio con la finalidad de
obtener las evidencias necesarias que permitan garantizar su eficacia en cuanto lo que se pretende lograr con el
desarrollo de las mismas. Considerando que los estudiantes son los actores principales del proceso educativo,
han de involucrarse en dicha evaluación, a partir de sus expectativas y opiniones sobre el éxito o fracaso de las
experiencias en el laboratorio, aspectos cruciales en la mejora continua del proceso educativo.
Cada práctica incluye un breve antecedente teórico sobre el tema a abordar, así como el procedimiento y algunos
cuestionamientos que conllevan al estudiante a generar la reflexión de lo que hace, el por qué y para qué lo
hace. A través de los diferentes apartados incluidos en cada una de las prácticas, el estudiante va desarrollando
diferentes competencias genéricas y específicas del área de Microbiología, que en conjunto, le permitirán lograr
la competencia general del curso de Microbiología, abonando ésta a su vez, al perfil de egreso del Ingeniero
Bioquímico y Ambiental.
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Normas de seguridad en el Laboratorio de Microbiología

1. Asista al laboratorio en los horarios que correspondan y lea el protocolo de la práctica con antelación a su realización, a
fin de adquirir una idea clara de lo que va a hacer, para qué, cómo y con qué lo va a hacer.
2. Deje sus pertenencias personales como bolsos, libros y otros objetos, en el lugar que se les indique.
3. Evite los accesorios que podrían ser fuente de contaminación como joyería y recoja el cabello largo.
4. Ingrese al laboratorio por el área de la exclusa de ingreso, con bata de algodón completamente cerrada, zapato cerrado
y de suela antideslizante, protocolo de la práctica y bitácora de laboratorio.
5. Lave sus manos con agua y jabón de acuerdo al protocolo establecido, antes de realizar las actividades programadas,
antes de salir del laboratorio y ante cualquier sospecha de contaminación durante las actividades prácticas.
6. Prohibido beber, comer, masticar chicle, fumar o ponerse y quitase lentes de contacto, en cualquier área del laboratorio
7. Trabaje en equipo, en silencio, con responsabilidad, respeto y siga las indicaciones del profesor (a) y de la persona
responsable del laboratorio, para realizar la práctica con éxito.
8. Mantenga el área de trabajo ordenada, no coloque objetos personales sobre la superficie de trabajo.
9. Limpie y desinfecte las superficies de trabajo, antes de iniciar y al finalizar la sesión práctica.
10. Emplee técnicas asépticas para el manejo de cultivos de microorganismos.
11. Use guantes y cubreboca estériles siempre que esté trabajando en el laboratorio. En caso de salir del laboratorio, debe
quitarse estos implementos y al regresar, utilizar nuevos guantes y cubreboca estériles.
12. Durante la manipulación de microorganismos, trabaje en el gabinete de bioseguridad o en la proximidad de la llama de un
mechero Fisher a fin de mantener las condiciones de esterilidad.
13. Utilice micropipetas o dispensador para líquidos. NUNCA pipetear con la boca una muestra microbiológica.
14. Coloque los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin.
15. No utilice ningún reactivo que no esté debidamente identificado, verifique las etiquetas de los mismos.
16. Verifique que no haya mecheros encendidos antes de llevar acabo un procedimiento de limpieza utilizando solventes.
17. Utilice los mecheros Fisher con precaución, no deje material inflamable cerca y evite el posible contacto con el cabello y
ropa. Al finalizar la actividad práctica, compruebe que se ha cerrado la llave de gas.
18. Utilice guantes de asbesto para manipular la autoclave y el material recién esterilizado.
19. NUNCA vierta material biológico en los desagües, sanitarios o botes para basura. Esterilice todo los residuos biológicos y
material desechable, antes de desecharlo.
Medidas a seguir en caso de emergencia:
20. En caso de accidentes, avise inmediatamente al profesor y a la persona responsable del laboratorio para que soliciten
atención médica urgente.
21. En caso de salpicaduras con materiales biopeligrosos o corrosiones en los ojos, inmediatamente lave el ojo con agua
durante 20-30 minutos, en el lavaojos y mantenga los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado.
22. En caso de cortadas menores y heridas, lave con agua y jabón por varios minutos y aplique un antiséptico adecuado.
23. En vertidos químicos sobre la piel, lave inmediatamente utilizando la regadera ubicada en el área de emergencia.
24. En caso de un derrame de material biológico sobre el cuerpo, remueva la ropa inmediatamente y colóquela en una
solución desinfectante antes de lavarla y dese un baño con agua y jabón en la regadera de emergencia.
25. Ante un derrame accidental de muestras contaminadas con material biológico, informe inmediatamente al profesor (a) y
la persona responsable del laboratorio. Colóquese guantes, cubra con papel absorbente el área del derrame, vierta un
desinfectante adecuado y deje actuar por el tiempo necesario. Retire el material absorbente junto al material roto y
colóquelo en un recipiente para residuos contaminados o bolsa de desechos, la cual debe esterilizarse junto con los
guantes utilizados. Lave sus manos con abundante agua y jabón.
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Cuidados del material y equipo utilizado en el Laboratorio de Microbiología
1. El trabajo en el laboratorio de Microbiología, requieren técnicas específicas y diferentes a las que se utilizan en otras
áreas, por ejemplo, es imprescindible trabajar en condiciones asépticas.
2. Los instrumentos y materiales como asas de siembra, pipetas, matraces, placas de Petri, entre otros, que van a entrar en
contacto con el medio de cultivo, recipientes o con los microorganismos en estudian, han de ser esterilizados
previamente.
3. El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene, deben esterilizarse por calor húmedo en autoclave a 121ºC durante 20
minutos, antes de utilizarse. Tanto los tubos de cultivo como las placas de Petri y los matraces con medio de cultivo, ya
estériles, deben permanecer tapados para impedir la entrada de microorganismos, hasta su utilización.
4. Antes de utilizar las asas para siembra, es necesario esterilizarlas sometiéndolas a la acción de la llama del mechero
hasta que el filamento quede incandescente (al rojo vivo). Una vez utilizadas las asas, deben flamearse de nuevo con el
objeto de eliminar los microorganismos que quedan en aquellas.
5. Las varillas de vidrio acodadas para distribuir los microorganismos de la muestra sobre la superficie del medio de cultivo
contenido en una placa de Petri, deben utilizarse previamente esterilizadas, impregnándolas en alcohol y pasándolas
posteriormente, ligeramente, por la llama del mechero.
6. El material de vidrio se esteriliza por calor seco a 160ºC durante 2 horas. Las pipetas graduadas de vidrio, deben
empacarse de forma individual, envuelta en papel estraza para mantener su esterilidad. Si no se utiliza el gabinete de
bioseguridad y en cambio se utiliza mechero Fisher, los tubos de cultivo, placas de Petri y pipetas, deben abrirse cerca
de la llama del mechero y flamearse ligeramente antes de ser usadas.
7. Para pipetear suspensiones de microorganismos, debe utilizarse micropipeta con puntilla estéril o bien, el dispensador
de líquidos en el que se coloca la pipeta de vidrio estéril, cerca de la llama del mechero. NUNCA pipetear con la boca una
muestra microbiológica.
8. Para el llenado de las placas de Petri con el medio de cultivo, las placas deben permanecer sobre la superficie del área
de trabajo del gabinete de bioseguridad, y si es con mechero, sobre la mesa de trabajo, en la proximidad de la llama del
mechero. Una vez llenas, se dejan solidificar sobre la misma superficie.
9. Todo el material sucio o contaminado se sumergen en una mezcla sulfocrómica donde se dejan 24 horas al cabo de las
cuales se lavan con agua y se dejan escurrir y secar.
10. El material desechable como las plaxas de Petri, se esterilizan por calor húmedo y posteriormente se desechas en bolsas
rojas para residuos biológicos.
11. Para la descontaminación de instrumentos, equipos y material que sean estables al calor, se utiliza el autoclave,
sometiéndolo a la acción del vapor de agua a una atmósfera de sobrepresión (121º C) en ciclos más prolongados de lo
habitual (1 hora en lugar de 20 minutos), posteriormente se procede a su lavado para eliminar toda materia extraña,
sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o utilizando detergentes o mezcla crómica y se enjuaga con
abundante agua y se deja escurrir y secar a temperatura ambiente.
12. Todo el equipo, especialmente los aparatos delicados, como microscopios, gabinete de bioseguridad, sistema de
filtración, contador de colonias, espectrofotómetros, potenciómetros, centrífugas, balanzas, autoclaves, incubadoras,
hornos, entre otros, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.
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Laboratorio de Microbiología e Investigación Asignatura: Microbiología

Clave: AEM-1050
Práctica 1. Clasificación, preparación y esterilización de material Duración (h): 4
y equipo utilizado en el Laboratorio de Microbiología
Competencia general
Identifica y prepara el material utilizado en el laboratorio de Microbiología, aplicando los procedimientos
adecuados y respetando las normas de bioseguridad.
Competencias específicas
 Organiza el material utilizado en el laboratorio para su fácil manejo e identificación, valorando los beneficios
que de ello derivan.
 Realiza su trabajo en condiciones asépticas y esteriliza material de laboratorio para la manipulación de
microorganismos, mediante la aplicación de calor seco y calor húmedo.
Competencias transversales
 Desarrolla habilidades de búsqueda, procesamiento y análisis de información procedente de fuentes diversas
y la organiza de forma oral y escrita.
 Sigue instrucciones y procedimientos de manera reflexiva, comprendiendo como cada uno de sus
pasos contribuye al alcance de un objetivo.
Actitudes y valores
 Respeta a sus compañeros y las normas del laboratorio.
 Asume una actitud constructiva, dentro del equipo de trabajo, congruente con los conocimientos y
habilidades con los que cuenta.
Antecedentes teóricos
En el laboratorio de Microbiología se utiliza una gran variedad de materiales y equipos tales como pipetas,
matraces, placas de Petri, gabinetes de bioseguridad, autoclaves, microscopios, entre otros, que es necesario
identificar y conocer su funcionamiento, con la finalidad de utilizarlo adecuadamente y lograr el éxito en las
actividades a realizar. La asepsia y esterilización son dos procesos fundamentales, el trabajo de laboratorio ha
de realizarse en condiciones de asepsia, las cuales se consiguen empleando diversas técnicas encaminadas a
impedir el acceso de microorganismos al área de trabajo; en tanto que la esterilización se efectúa mediante
procedimientos físicos y químicos, que se emplean para inactivar o destruir a los microorganismos, incluidas
las esporas. La muerte de los microorganismos sometidos al efecto del calor húmedo, sigue un orden
logarítmico, teóricamente los supervivientes pueden reducirse a un número inferior a la unidad, mientras que
ciertas fracciones resisten durante todo el periodo de exposición térmica, de esto se desprende que aunque en
teoría, la esterilidad total no se alcanzará jamás, los microorganismos sobrevivientes estarán de tal manera
afectados, que para fines prácticos dejarán de existir. Un microorganismo está vivo desde el punto de vista
microbiológico cuando es capaz de multiplicarse, por consiguiente, un microorganismo muere cuando pierde de
forma irreversible la capacidad de reproducirse. La condición fundamental que deben observar los materiales
previos a la esterilización es la limpieza, que consecuentemente producirá la disminución de la carga
microbiana inicial, y un correcto empacado a fin de impedir el ingreso de microorganismos al interior, una vez
esterilizados.
Existen varios métodos para llevar a cabo el proceso de esterilización, se emplean métodos físicos como el uso
de radiación, filtración, calor, entre otros y métodos químicos mediante el uso de agentes químicos como
fenoles, alcoholes, halógenos, detergentes; la elección de un determinado método viene condicionado por el tipo
de material que se quiere esterilizar. El método comúnmente empleado para destruir los microorganismos por
ser económico y fácil de controlar. El calor utilizado con este fin, puede aplicarse en forma de calor seco o de
calor húmedo. Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco en horno Pasteur a 160ºC durante 2
horas. Esta temperatura no puede utilizarse para esterilizar líquidos como las soluciones y medios de cultivo,
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ya que al llegar a los 100ºC comenzarían a hervir y continuarían hirviendo sin elevar su temperatura por
encima del punto de ebullición del agua a presión atmosférica y a esta temperatura las esporas pueden
sobrevivir durante horas, además, de que puede implicar cambios en la concentración de los componentes del
medio, por lo que las soluciones y medios de cultivo se esterilizan, por calor húmedo en autoclave a 121ºC -
15 min.
Materiales Equipo
 Bitácora de laboratorio  Cámara fotográfica
 Mecheros Fisher  Gabinete de bioseguridad
 Cronómetro  Horno Pasteur de aire caliente
 Gradilla para tubos  Incubadora con termómetro
 Piseta  Balanza analítica
 Cajas Petri de vidrio y desechables  Refrigerador
 Tubos de cultivo con tapón de rosca  Baño María
 Espátulas  Autoclave
 Asas de siembra  Planchas agitadoras para placas de Petri
 Varillas de vidrio para siembra  Otros equipos existentes en el laboratorio
 Probeta de 100 ml
 Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml
 Matraz Erlenmeyer de 150 ml
 Dispensadores para pipetas
 Micropipetas
 Puntillas estériles de 0.1 a 5 ml para micropipeta
 Pipetas Pasteur
 Vasos de precipitados de 100, 250 y 500ml
 Gasa
 Hilo grueso
 Parafilm
 Papel estraza y papel metálico
 Papel secante
 Algodón
 Guantes de asbesto
 Guantes de latex estériles
 Cubreboca
 Marcadores indelebles
 Cinta indicadora de esterilidad
 Solución de fenol al 5% o benzal al 10%
 Agua destilada
Procedimiento
El/la profesor (a) muestra a los estudiantes los materiales y equipos existente en el laboratorio y explica los
principios generales del trabajo en el laboratorio de Microbiología, enfatizando los aspectos de
desinfección, preparación y esterilización de materiales necesarios para la manipulación de microorganismos.
1. Normatividad en el laboratorio
 Lea las normas de bioseguridad del laboratorio de Microbiología y discútalas con el grupo.
 Identifique el lugar de ubicación del extinguidor, botiquín, señalamientos colocados en el laboratorio, la
regadera de emergencia y el lavaojos.
2. Reconocimiento de material y equipo
 Identifique los materiales asignados, además de los equipos existentes en el laboratorio.
 Elabore una propuesta sobre el uso y los cuidados de los mismos.
3. Limpieza y empacado de material a esterilizar
 Lave el material de cristalería asignado, utilizando un detergente líquido neutro y suficiente agua.
Enjuague con abundante agua de grifo y posteriormente con agua destilada. Seque el material al aire o
utilizando papel absorbente para acelerar el secado, o bien introdúzcalo por 30 minutos en el horno de aire
caliente.
 Antes de iniciar el empacado del material que se desea esterilizar, limpie con una franela húmeda y
desinfecte el área de trabajo con una solución de fenol al 5% o benzal al 10%.
 Empaque el material correctamente como sigue:
o Placas de Petri: Tome una hoja tamaño oficio de papel estraza, coloque una caja en la parte central
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y envuélvala tomando los extremos del papel y uniéndolos. Haga un nuevo doblez recargando
ligeramente en la caja para marcarlo, doble los extremos y coloquea un trozo pequeño de cinta indicadora
de esterilidad.
o Pipetas: Introduzca una pequeña porción de algodón en el cuello de la pipeta, procurando que
quede lo suficientemente apretada y envuélvala con tiras de papel estraza de 3 cm de ancho,
comenzando por la punta y en forma de espiral girar hacia arriba hasta el final de la pipeta o viceversa
y cierre con un trozo de cinta indicadora de esterilidad.
o Tubos de cultivo: Coloque 9 ml de agua destilada a cada tubo de cultivo, cierre los tubos con sus tapas de
baquelita, colóquelos en un vaso de precipitado, cubra el vaso con papel metálico, rotule el vaso y adhiera
un trozo de cinta indicadora de esterilidad.
o Matraces: coloque 100 ml de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 150 ml. Elabore una muñeca
utilizando una torunda de algodón, cúbrala con gasa y utilice hilo grueso para sujetar la gasa al algodón.
Tape el cuello del matraz con la muñeca que elaboró, lo suficientemente apretado para evitar que se
destape, coloque papel metálico sobre la muñeca y adhiera al matraz, un trozo un trozo de cinta
indicadora de esterilidad.
o Varillas de vidrio para siembra: no es necesario empacarlas para su esterilización, ya que al momento de
utilizarlas se cuenta con un vaso de precipitado con agua destilada para enjuagarlas y otro vaso con alcohol
de 96º para esterilizarlas.
4. Esterilización por calor seco
 Introduzca las pipetas y placas de Petri, que empacó anteriormente, en el horno Pasteur de aire caliente sin
conectar.
 Tenga en cuenta las siguientes recomendaciones: los materiales a esterilizar no deben estar en contacto con
las paredes, piso y techo del horno, la carga del esterilizador será homogénea y no deberá superar el 80% de
la capacidad del horno.
 Encienda el horno y espere hasta que se alcance la temperatura de 160ºC y a partir de ese momento,
comience a contar el tiempo de esterilización que es de 2 horas, utilice un cronómetro.
 Durante el ciclo de esterilización no abra la puerta del horno porque ello implicaría abortar el ciclo, debiendo
en este caso reiniciarlo.
5. Esterilización por calor húmedo
 Coloque el agua de grifo en la autoclave u olla de presión hasta la marca. Introduzca el vaso de
precipitado que contiene los tubos de cultivo con 9 ml de agua destilada y el matraz Erlenmeyer con los 100
ml de agua destilada evitando que toquen las paredes de la olla de presión/ autoclave.
 Cierre la autoclave/olla dejando abierta la válvula de salida de vapor para facilitar la expulsión del aire
desplazado por el vapor que se produce. Elimine completamente el aire de la autoclave, para evitar que el
manómetro aumente a 15 libras y la temperatura no alcance los 12lºC. Una vez que el vapor que sale, sea
continuo, cierre la válvula y vigile el termómetro.
 Cuando la autoclave alcance los 121ºC, inicie a contar el tiempo (15 minutos) para que se efectúe la
esterilización.
 Transcurrido los 15 minutos, retire los mecheros de la olla de presión o apague la autoclave.
 Deje enfriar hasta que el manómetro marque cero y abra la válvula de salida de vapor, para expulsar el
vapor restante. Si abre la válvula entes de que el manómetro marque cero, la rápida pérdida de
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presión hace hervir el material líquido, o bien, propicia la

expulsión de tapones de los matraces.
 Abra la autoclave y retire el material estéril utilizando
guantes de asbesto.
 Una vez frío el material, proceda a colocarlo en el
refrigerador a una temperatura de 2-8ºC hasta su utilización.
Observaciones y resultados
Conclusiones
Seguridad e higiene
 Se siguen los procedimientos de bioseguridad e higiene indicados en el reglamento interno del Laboratorio.
 Al finalizar el experimento, se realiza un proceso de limpieza de material y equipo utilizado, siguiendo las
recomendaciones generales para tal fin.
 Tanto los residuos como los desechos biológicos reciben el tratamiento adecuado para evitar contaminación.
Evaluación
 La evaluación es sistemática con una planeación flexible y criterios definidos. Continua a través de la
observación de los desempeños en los aspectos puntuales relacionados con el trabajo de laboratorio;
formativa y sumativa, considerando que los desempeños logrados abonan a la competencia general del
curso.
 Se centra en recabar evidencias (de conocimiento, producto, desempeño y actitud), de los aprendizajes de
los alumnos, para lograr el desarrollo de las competencias propuestas para esta actividad.
 Se evalúa el reporte que elabora el alumno, considerando los criterios establecidos en la rúbrica diseñada
para tal fin, además de las respuestas del siguiente cuestionario:
1. ¿Qué beneficios representa para usted, cumplir con las normas de seguridad en el laboratorio?
2. ¿Cuál es la diferencia entre asepsia y esterilización?
3. ¿Por qué antes de una esterilización es necesario lavar y desinfectar el material?
4. ¿Qué finalidad tiene el empacado y los algodones que se colocan en los matraces y puntas de las pipetas,
antes de la esterilización?
5. ¿Qué material se esteriliza por calor seco y cuál no?. ¿Por qué?
6. ¿A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen las esporas?
7. ¿Qué consideraciones tendría en cuenta para cargar la autoclave con material a esterilizar? ¿Qué sucede
si cierra la válvula de la autoclave antes de que sea eliminado totalmente el aire?
8. Discuta, en primera instancia, con su equipo de trabajo y posteriormente con el resto del grupo, los
resultados obtenidos y determine si tanto la manipulación de materiales como los procesos de
esterilización por calor seco y calor húmedo, fueron adecuados.
Bibliografía
Harvey, R. A., Champe P.C. y Fischer, B.D. 2008. Microbiología. Primera Edición. Editorial Lippincott Williams
& Wilkins. USA.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P. V. y Clark, D.P. 2009. Brock Biología de los microorganismos.
12ª edición. Editorial Pearson.
Organización Mundial de la Salud. 2005. Manual de Bioseguridad en Laboratorio. Tercera Edición. Ginebra.
Tortora, Gerard J. Funke, B. y Case, C. 2007. Introducción a la Microbiología, 9ª Ed. Editorial Panamericana
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Clave: AEM-1050
Práctica 2. Clasificación, diseño, preparación y esterilización de Duración (h): 4
medios de cultivo
Competencia general
Diseña medios de cultivo considerando los requerimientos metabólicos y de crecimiento de los microorganismos
y valora las ventajas de su utilización en el cultivo de microorganismos.
 Identifica los componentes de los medios de cultivo y sus funciones.
 Diseña medios de cultivo seleccionando los componentes adecuados con base a los requerimientos
nutricionales de los microorganismos.
 Inocula en medios de cultivo y obtiene cultivos mixtos.
 Investiga, organiza y transmite información, utilizando las tecnologías de la información y comunicación.
 Formular explicaciones y conclusiones de los resultados obtenidos a partir del trabajo experimental.
Actitudes y valores
 Respeta el trabajo de los otros y las normas de bioseguridad del laboratorio
 Se responsabiliza de su trabajo y su propio aprendizaje.
Para el cultivo de microorganismos en el laboratorio, es necesario disponer de un medio artificial que les brinde
todos los requerimientos nutricionales para desarrollarse, este ambiente artificial se denomina medio de cultivo,
que consiste en un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, que suministran los
componentes necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Los microorganismos presentan un gran
potencial en su capacidad de utilizar distintas fuentes de energía y de carbono para su crecimiento, desde
sustancias inorgánicas hasta compuestos orgánicas complejas. Estos nutrientes son requeridos por los
microorganismos para los dos objetivos que comprende el metabolismo: para fines energéticos y para fines
biosintéticos. Los microorganismos, sobre todo las bacterias, exhiben una gran diversidad metabólica, Desde el
punto de vista de requerimientos de energía, las bacterias pueden ser fototrofas las que utilizan como fuente de
energía, la energía luminosa, quimiolitotrofas o litotrofas aquellas que sólo requieren sustancias inorgánicas
-
sencillas (SH2, S, NH3, NO2 , Fe…) y quimioorganotrofas u organotrofas las que requieren compuestos orgánicos
(carbohidratos, hidrocarburos, ácidos grasos, aminoácidos, entre otros). Desde el punto de vista biosintético, se
pueden ser autótrofas, utilizan una fuente inorgánica de carbono, como el CO 2; y los heterótrofos, cuya fuente de
carbono es orgánica. Entre los heterótrofos, una de las fuentes más típicas de carbono es la glucosa.
La diversidad metabólica de los microorganismos genera la necesidad de una gran variedad de medios de
cultivo, algunos microorganismos pueden crecer en cualquier medio de cultivo, mientras que otros, requieren
medios especiales, por lo que no existe un medio de cultivo universal para el crecimiento de todos. Los distintos
tipos de medios de cultivo varían según las necesidades de los microorganismos, pero todos han de contener
los nutrientes necesarios para el crecimiento y han de mantenerse estériles hasta su uso. Cuando se diseña la
fórmula del medio de cultivo, es necesario conocer en qué categoría está incluido el microorganismo a cultivar
para elegir adecuadamente los componentes del medio: generalmente compuestos inorgánicos para
microorganismos fototrofos y litotrofos, y orgánicos para organotrofos. Los medios pueden prepararse a partir
de cada uno de sus constituyentes o de medios deshidratados comerciales. En éstos últimos los nutrientes se
encuentran mezclados en las proporciones adecuadas, requiriendo sólo la adición de agua destilada para
disolverlos, además de simplificar el trabajo, se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. Al
momento de preparar un medio de cultivo, es necesario considerar tanto las características metabólicas como de
crecimiento de los microorganismos. Los componentes comunes de los medios de cultivo incluyen: Fuente de
carbono: CO2 ó compuestos carbonados orgánicos. Los carbohidratos son fuente de carbono y energía por
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excelencia en los quimioorganotrofos. Los más comunes son: hexosas, pentosas, disacáridos; polisacáridos,
alcoholes y glucósidos. Fuente de nitrógeno: los autotrofos pueden crecer utilizando moléculas sencillas como
-
NO3 , NH3 ó N2. El nitrógeno es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de pared.
Otros microorganismos pueden incorporar nitrógeno en forma de aminoácidos, bases púricas o pirimídicas. En
ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el aporte de nitrógeno son las peptonas. Fuente de fósforo:
se suelen agregar fosfatos de sodio o potasio y yema de huevo. El fósforo se incorpora a ácidos nucleicos,
=
fosfolípidos, polímeros de membrana, ATP, y sustancias de reserva. Fuente de azufre: se adiciona como SO4 ,
cisteina o metionina. En la célula se incorpora a aminoácidos y coenzimas. Fuente de calcio, magnesio y potasio:
+
se adicionan como sales inorgánicas, cationes que estabilizan macromoléculas aniónicas. K actúa como
2+ 2+
coenzima y estabilizador de RNA, el Mg se integra a la clorofila en organismos fotosintéticos y el Ca abunda
en esporas como dipicolinato de calcio. Fuente de sodio: se suministra como NaCl y contribuye a equilibrar la
presión osmótica del medio extracelular. Catión requerido por bacterias halofílicas. Microelementos o elementos
trazas: Mn estimula el crecimiento y favorece la esporulación; Fe cofactor de enzimas para la función respiratoria
en citocromos, catalasa; Co interviene en la síntesis de vitamina B12; Cu presente en oxidasa terminal de la
cadena respiratoria. Otros son inhibidores del crecimiento como Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a
-4
concentración mayor a 10 M puede resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos. En algunos
medios de cultivo para quimioorganotrofos, los factores de crecimiento pueden ser aportados por: Extracto de
carne, aporta sustancias nitrogenadas como aminoácidos, bases púricas y pirimídicas, ácidos orgánicos y
sustancias no nitrogenadas como glucógeno, fosfatos de hexosas, ácido láctico, sales inorgánicas. Extracto de
levadura aporta mezclas de aminoácidos y péptidos, y carbohidratos. Extracto de malta, sustituto del extracto de
levadura . Agentes solidificantes; el agar es un polisacárido ácido derivado de algas marinas, formado
principalmente por galactosa; contiene sustancias nutritivas en pequeñas concentraciones, y por esto no puede
ser utilizado en medios para autotrofos, pero si en medios de cultivo complejos para quimioorganotrofos. Se
agrega al 5% en medios de consistencia muy firme para detener el crecimiento de gérmenes muy móviles. Otro
solidificantes son la agarosa, silicagel, gelatina y albumina de huevo. Agua: los medios se preparan en el
2+ 2+
laboratorio con agua destilada lo que estandariza su composición y asegura la ausencia de iones Ca y Mg
que pueden precipitar con fosfatos.
Los medios de cultivo, de acuerdo a su composición pueden ser complejos o naturales: se desconoce su
composición química exacta, se preparan a partir de sustancias naturales como leche, extractos de carne… y
son aptos para el cultivo de quimioorganotrofos. Definidos o sintéticos: composición química definida cualitativa
y cuantitativamente. Se usan para para cultivar fototrofos y quimiolitotrofos. Según su función o finalidad, se
clasifican en: medios comunes (permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos, como el agar
carne). Medios enriquecidos (se obtienen agregando, a un medio común, nutrientes como sangre o yema de
huevo y se utilizan para el cultivo de microorganismos exigentes, por ejemplo el agar chocolate). Medios de
enriquecimiento (medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo, permiten
aumentar el número de microorganismos de ese tipo pero sin inhibir al resto de flora acompañante, como el
caldo lactosado). Medios selectivos (medios sólidos modificados para que, en una flora mixta, permitan el
desarrollo de determinadas especies e inhiban la proliferación de las otras. La selectividad se logra alterando las
condiciones físicas del medio de cultivo o agregando compuestos químicos inhibidores. Ej: 1) cambiando pH:
para favorecer el desarrollo de microorganismos acidófilos como el Lactobacillus, se puede agregar ácido
tartárico o acético a los medios de cultivo para obtener un pH final de 5.4, totalmente inadecuado para muchas
bacterias acompañantes. 2) Altas concentraciones osmóticas: en agar manitol con una concentración de NaCl de
7.5% muy pocas bacterias pueden crecer, salvo las que presenten una elevada tolerancia a NaCl, como S.
aureus. 3) Agregando antisépticos: colorantes como verde brillante, cristal violeta y eosina, se utilizan para inhibir
gérmenes Gram positivos mientras los Gram negativos desarrollan sin dificultad. Medios diferenciales que
permiten el desarrollo de especies que coexisten en un cultivo mixto (aquellos cultivos en los cuales la población
está constituida por más de una especie de microorganismo, de los cuales es posible aislar una sola especie
para obtener un cultivo puro) y que se desean aislar. Contienen indicadores que permiten demostrar
características metabólicas de un determinado grupo de microorganismos. Un ejemplo es el agar eosina azul de
metileno que diferencia Escherichia coli de Enterobacter aerogenes sobre la base de la diferencia de color de
sus colonias. Por su consistencia, los medios de cultivo pueden ser líquidos (contienen disueltos en agua, los
nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos y no contienen agar en su formulación); sólidos
(contienen nutrientes disueltos en agua pero se les añade agar al 1.5-2%) y semisólidos (0,5-0,7% de agar). Aún
cuando las condiciones químicas del medio de cultivo estén cubiertas, el crecimiento y desarrollo de los
microorganismos no tendrá lugar si se desconocen las condiciones físicas de temperatura, pH, actividad de agua,
presión osmótica, requerimientos de luz, y oxígeno, factores ambientales que se abordarán más adelante.
Materiales Equipo
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 Cronómetro  Autoclave u olla de presión
 Espátulas  Horno Pasteur de aire caliente
 Placas de Petri estériles  Incubadora con termómetro
 Asas de siembra  Refrigerador
 Pipetas estériles graduadas de 1,0 ml  Balanza analítica
 Dispensadores para pipetas  Baño María
 Micropipetas
 Puntillas estériles de 0.1 a 5 ml para micropipetas
 Matraces Erlenmeyer de 250 y 500 ml
 Gradilla para tubos
 Soporte con anillo y malla
 Tubos de cultivo
 Piseta
 Algodón
 Gasa
 Parafilm
 Papel estraza
 Papel metálico
 Papel secante
 Cinta indicadora de esterilidad
 Cubreboca
 Bolsas de plástico
 Ácido tartárico o acético
 Agua destilada
 Medios de cultivo: caldo nutritivo, agar
bacteriológico y agar nutritivo.
 Material biológico: Lactobacillus
Fundamento
La preparación adecuada de un medio de cultivo permite disponer de los nutrientes requeridos para favorecer el
crecimiento de los microorganismos en el laboratorio.
Procedimiento
1. Preparación de medios de cultivo líquidos
 Desinfecte el área de trabajo con fenol al 5% o benzal al 10%.
 Lea y siga cuidadosamente las instrucciones del fabricante, realice cálculos para preparar 3 tubos con caldo
nutritivo, pese la cantidad exacta del medio deshidratado considerando un volumen de 5 ml por tubo.
 Cierre inmediatamente el envase del medio.
 Utilice una probeta de 100 ml y mida el volumen de agua destilada requerida para la preparación del medio y
viértala en un matraz Erlenmeyer de capacidad mayor al volumen de medio a preparar y disuelva la porción
pesada.
 El medio líquido no requiere de calentamiento para disolver sus componentes.
 Distribuya 5 ml del medio de cultivo en cada uno de los 5 tubos de cultivo y coloque los tapones de
baquelita, sin apretar demasiado.
 Identifique el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre y fecha de preparación.
 Coloque los tubos en un vaso de precipitado, cubra con papel metálico y esterilice por calor húmedo en
autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
 Una vez esterilizados, retire los tubos de la autoclave y colóquelos en la gradilla.
2. Preparación de medios de cultivo semisólido
 Diseñe un medio de cultivo complejo semisólido que incluya una fuente de C, una fuente de energía, una
fuente de N y proporcione los factores físicos y/o químicos que favorezcan sólo el desarrollo de un grupo de
microorganismos quimioorganotrofos y acidófilos.
 Esterilice e inocule el medio de cultivo.
 Incube el cultivo a la temperatura adecuada y tiempo necesario para su desarrollo.
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3. Preparación de medios de cultivo sólidos en tubo inclinado

 Lea y siga cuidadosamente las instrucciones del fabricante, realice cálculos para preparar 5 tubos con agar
nutritivo, pese la cantidad exacta del medio deshidratado considerando un volumen de 5 ml por tubo.
 Cierre inmediatamente el envase del medio.
viértala en un matraz Erlenmeyer y disuelva la porción pesada.
 Coloque en el cuello del matraz, una muñeca ajustada y cubra con papel metálico.
 Caliente el medio de cultivo hasta ebullición, utilizando un soporte y mechero. Tenga cuidado de no
sobrecalentar ya que el medio puede derramarse, por lo que es recomendable que utilice un matraz de una
capacidad mayor al volumen de medio a preparar.
 Inmediatamente después de la ebullición, distribuya 5 ml de agar en cada tubo. Tape sin apretar demasiado.
 Coloque los tubos en un vaso de precipitado, cubra con papel metálico y rotule el lote de medio de cultivo
preparado indicando su nombre y fecha de preparación.
 Esterilice por calor húmedo en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
 Luego del ciclo de esterilización, retire de la autoclave utilizando guantes de asbesto y coloque los tubos aún
calientes, sobre una varilla y deje gelificar en posición inclinada hasta formar el pico de flauta.
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4. Preparación de medios de cultivo sólidos en placa de Petri

 Lea y siga cuidadosamente las instrucciones del fabricante, realice cálculos para preparar 5 placas de Petri
con agar nutritivo. Pese la cantidad exacta del medio deshidratado considerando un volumen de 15 ml por
placa. Cierre inmediatamente el envase del medio para evitar la hidratación del mismo.
viértala en un matraz Erlenmeyer de capacidad mayor al volumen de medio y disuelva la porción pesada.
 Coloque en el cuello del matraz, una muñeca ajustada y cubra con papel metálico.
 Caliente el medio hasta ebullición, utilizando un soporte y mechero. Tenga cuidado de no sobrecalentar ya
que el medio puede derramarse, por lo que es recomendable que utilice un matraz de una capacidad mayor
al volumen de medio a preparar.
 Esterilice por calor húmedo en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
 Una vez esterilizado, deje atemperar el medio de cultivo a 42ºC y vierta 15 ml en cada placa de Petri estéril
en ambiente aséptico, utilizando la llama del mechero o el gabinete de bioseguridad.
 Deje gelificar el medio y selle cada placa con cinta parafilm, para evitar contaminación y deshidratación.
5. Prueba de esterilidad de medios de cultivo

 Una vez esterilizados los medios, tome un tubo y una placa de Petri de cada uno de los medios preparados y
esterilizados, etiquete como “control de esterilidad” y la fecha. Incube a 35ºC durante 24 horas.
 Tome un tubo y una placa de Petri más, de cada uno de los medios preparados y abra el tubo y la placa
durante 1 minuto, tape el tubo y selle nuevamente la placa con cinta parafilm y etiquete como “muestra de
aire” y la fecha. Incube a 35ºC por 24 h.
 Repita el mismo procedimiento y abra otro tubos y otra placa durante 30 segundos en la proximidad del
mechero Fisher o en el gabinete de bioseguridad y etiquete como “muestra en área aséptica” y la fecha.
Incube a 35ºC durante 24 horas.
 Repita el procedimiento anterior, inoculando 2 tubos con medio líquido, 2 tubos con agar inclinado y 2
placas, con un microorganismo proporcionado, incube a 35ºC durante 24 horas.
 Transcurrido el lapso, revise los tubos y las placas para detectar la presencia de contaminantes, comparando
con los “controles de esterilidad”. En los medios líquidos, el crecimiento microbiano se detecta a través de la
presencia de película, turbidez o sedimento; en los medios semisólidos y sólidos, mediante la presencia de
15
masa microbiana en forma de colonias.

 Guarde los cultivos obtenidos entre 2-8ºC, ya que los utilizará en las siguientes prácticas.
6. Recomendaciones generales
 En caso de que prepare más placas con medio de cultivo, éstas serán almacenadas a una temperatura entre
2-8ºC invertidas, con el objeto de evitar que el agua condensada en la tapa, se derrame sobre el medio.
 En caso de incorporar al medio compuestos termolábiles, como vitaminas o antibióticos, esterilice éstos
por filtración y añádalos al medio de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una vez que éste se
haya atemperado.
 En caso de que se le presenta algún inconveniente, antes de su esterilización, el medio de cultivo puede
almacenarlo por un periodo máximo de 12 horas entre 2-8ºC.
 Después de observar las características de desarrollo microbiano, esterilice los cultivos en autoclave.
 Antes de esterilizar los tubos de ensayo retire las etiquetas (plumón, etiqueta o maskin-tape). Después de
esterilizados, vierta el agar fundido en una bolsa de plástico y deposiítela en el contenedor correspondiente.
Conclusiones
Seguridad e higiene
Evaluación
formativa y sumativa, considerando que los desempeños logrados abonan a la competencia general.
 Se evalúa el reporte de la práctica realizada, trabajo en equipo, valores y actitudes, así como la presentación,
análisis y discusión de resultados, considerando los criterios establecidos en las rúbricas diseñadas.
1. ¿Cuándo se dice que un microorganismo requiere de un medio selectivo?
2. ¿Cuáles serían las implicaciones al verter el medio de cultivo muy caliente en las placas de Petri?
3. ¿Cuál es la utilidad de preparar medios de cultivo en forma de pico de flauta?
4. La composición del caldo nutritivo es extracto de carne y peptona en agua a pH 7; la composición del
caldo Mc Conkey es peptona, lactosa, sales biliares, púrpura de bromocresol, cloruro de sodio en agua a
pH 7. ¿Cuál es la función de cada uno de los componentes en cada medio?
5. Para un microroganismo quimioorganotrofo qué componentes tendría en cuenta para diseñar un medio de
cultivo complejo o químicamente indefinido que incluye:
fuente de carbono:
fuente de nitrógeno:
fuente de energía:
6. Para un microorganismo fotoautotrofo mencione qué componentes tendría en cuenta para diseñar un
medio de cultivo químicamente definido o sintético que incluye:
fuente de carbono:
fuente de energía:
fuente de nitrógeno:
7. Agar nutritivo:
Extracto de carne………. 0.3 g
Peptona de carne ……….0.5 g
NaCl ………………………0.5 g
Agar ………….…………...1.5 g
Agua destilada……………100 ml
pH:………………………… 7
b.1. ¿Qué aporte realiza cada componente?
b.2. ¿Qué componente aporta los factores de crecimiento?
¿Cuál es la fuente de energía en el medio de cultivo?
Clasifique este medio por su consistencia, origen y composición.
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¿Qué clase de microorganismos –según fuente de C y energía- crecerían en

8. Caracterice uno de los medios de cultivo que preparó, considerando los siguientes aspectos:
Medio de cultivo utilizado:
Cantidad preparada:
Cantidad pesada:
Cálculos:
pH inicial y pH final:
Consistencia:
Tipo de medio de cultivo según la naturaleza de sus componentes:
Tipo de medio de cultivo según el propósito de su uso:
Distribución:
Condiciones de esterilidad:
Condiciones de almacenamiento:
Bibliografía
Difco y BBL. 2012. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos. 11ª. Edición.
Forbes, B.A., Sahm, D.F., and A.S. Weissfeld. 2002. Bailey & Scott´s Diagnostic Microbiology. 11th
ed. Mosby. USA.
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Clave: AEM-1050
Práctica 3. Obtención de cultivos puros a partir de cultivos Duración (h): 4
mixtos utilizando diversas técnicas de aislamiento
Competencia general
Obtiene cultivos puros a partir de poblaciones mixtas, utilizando técnicas adecuadas de aislamiento y
transferencia.
 Prepara el área de trabajo y evita contaminación, mediante la aplicación de la técnica adecuada.
 Selecciona las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar un objetivo específico.
 Obtiene cultivos puros transfiriendo colonias aisladas por estría cruzada y diseminación con varilla acodada.
 Organiza el material para su fácil identificación y manejo.
 Genera informes de experimentos realizados a partir de la búsqueda, procesamiento y análisis de información
procedente de diversas fuentes.
Actitudes y valores
 Sustenta una postura personal sobre el tema, considerando otros puntos de vista de manera crítica y
reflexiva.
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionar a éstos, las condiciones físicas, químicas y nutricionales
adecuadas para su multiplicación de manera controlada. El cultivo se inicia con la siembra o inoculación del
microorganismo (inóculo) en un medio de cultivo adecuado e incubado a una temperatura adecuada para el
crecimiento de los microorganismos. La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando
punta, asa, hisopo o pipeta estéril. En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones
mixtas, en las que unos individuos interaccionan con otros estableciendo complejas relaciones. En estas
condiciones, el grado de dificultad que implica el estudio de los microorganismos en poblaciones mixtas, es muy
alto. El aislamiento de individuos a partir de poblaciones mixtas y la obtención de cultivos puros formados por
microorganismos de un solo tipo, constituyó un avance trascendental en la Microbiología, posibilitando su estudio.
El cultivo axénico o puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo y que proviene de una sola
célula, el crecimiento de ésta, origina en medio sólido, una masa celular visible que recibe el nombre de colonia.
Cada colonia representa una población de microorganismos procedentes de una sola célula, a partir de la
cual se tiene la seguridad de obtener el cultivo puro de un solo tipo de microorganismo.
La obtención de un cultivo puro a partir de una población mixta, se efectúa mediante el aislamiento y la
transferencia. El aislamiento se realiza mediante técnicas como la estría cruzada y la diseminación en superficie
con varilla acodada, entre otras, basadas en diluir la muestra inicial para obtener colonias aisladas. La
transferencia consiste en transferir las colonias aisladas a tubos con medio de cultivo sólido inclinado, para
obtener un cultivo puro. El medio de cultivo utilizado en el proceso de aislamiento dependerá, entre otros
parámetros, de los requerimientos nutricionales de los microorganismos que se desee aislar y de la presencia de
microorganismos que, por sus características y por la cantidad en que se encuentren en la muestra, dificulten la
obtención del microorganismo objeto del aislamiento. En este último caso, es necesario utilizar medios de
enriquecimiento y medios selectivos que inhiban el desarrollo de microorganismos contaminantes. Una vez que
se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien
congelando las células en glicerol (10-30%) a -70° C, en Nitrógeno líquido a -173° C, o mediante liofilización.
Los cultivos puros son esenciales para el estudio y caracterización de los microorganismos.
Materiales Equipo
 Cronómetro  Gabinete de bioseguridad
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 Mecheros Fisher  Microscopio óptico

 Varillas acodadas de vidrio  Incubadora con termómetro
 Varillas acodadas de poliestireno estériles  Baño María
 Asas de siembra  Horno Pasteur
 Matraces Erlenmeyer de 100, 250 y 500 ml  Balanza analítica
 Probetas de 100  Planchas agitadoras para placas de
 Placas de Petri estériles Petri
 Pipetas graduadas de 1 ml
 Micropipetas de 0.1 – 5.0 ml
 Puntillas estériles para micropipetas 0.1 – 5.0 ml
 Pipetas Pasteur
 Vaso de precipitado de 100, 250 y 500 ml
 Piseta
 Algodón
 Gasa
 Parafilm
 Papel estraza
 Papel metálico
 Papel secante
 Guantes de latex y cubreboca estériles
 Cinta masking con indicador de esterilidad
 Solución de cristal violeta
 Solución de lugol
 Solución alcohol-acetona (3:1)
 Solución safranina al 0,5%
 Alcohol de 96º
 Agua destilada
 Agar nutritivo
 Agar eosina azul de metileno
 Material biológico: cultivos mixtos
Fundamento
Mediante el aislamiento se logra la separación de los microorganismos que se encuentran en un cultivo mixto, y
las colonias aisladas es posible transferirlas a un medio sólido para obtener un cultivo axénico o puro.
Procedimiento
1. Aislamiento de microorganismos por estría cruzada o estría múltiple
 Desinfecte el área de trabajo con una solución de fenol al 5% o de benzal al 10%.
 Prepare una placa de agar eosina azul de metileno estéril por cada integrante del equipo de trabajo, y una
placa más que se usará como control. Siga el mismo procedimiento para la preparación y esterilización de
medios de cultivo, que realizó en la práctica no. 2.
 En caso de no utilizar el gabinete de bioseguridad, encienda los mecheros y coloque junto a los mecheros,
todo el material necesario de modo tal, que trabaje sin dificultad a una distancia no mayor a 15 cm de la llama
de los mecheros.
 Esterilice el asa de siembra de manera directa en el mechero hasta que alcance el rojo incandescente
y enfríe 10 segundos en la proximidad de la llama del mechero. En caso de trabajar en el gabinete de
bioseguridad, utilice asa desechable, o bien, utilice mecheros Fisher para esterilizar el asa.
 Utilice los cultivos mixtos que obtuvo en la práctica anterior. Si el microorganismo a aislar se encuentra en
medio de cultivo líquido, abra el tubo del cultivo sosteniendo la tapa del tubo con el dedo meñique de la
misma mano con la que sostiene el asa, NUNCA deposite la tapa sobre la mesa o gradilla, pues está cargada
de microorganismos. Flamee la boca del tubo y tome el inóculo agitando suavemente el asa dentro del mismo,
quedando la muestra adherida por tensión superficial en el extremo del asa de siembra. Flamee nuevamente
la boca del tubo antes de cerrar, para fijar al vidrio los microorganismos que pudieran estar presentes en ésta.
19
1) Esterilice el asa y deje enfriar. 2) Destape y lame la boca del tubo. 3) tome el inóculo, vuelva a flamear y tape
el tubo. Precauciones: El asa de siembra se maneja como si se tratase de un lápiz. La boca del tubo de cultivo se
flamea después de abrir y antes de cerrar el tubo. El tapón del tubo se mantiene en el dedo meñique de la misma
mano con la que sostiene el asa. Absolutamente todo el procedimiento es realizado cerca del mechero o bien, en
el gabinete de bioseguridad.
 Si el microorganismo a aislar se encuentra en medio de cultivo sólido, coloque la placa en forma invertida
sobre la mesa de trabajo junto al mechero.
 Esterilice el asa en el mechero. Levante la parte que contiene el medio de cultivo con los microorganismos,
llévela a la proximidad de la llama del mechero (si es que no trabaja en gabinete de bioseguridad) enfríe el asa
en la orilla del medio de cultivo, donde no se ve masa microbiana y tome una pequeña porción de una
colonia aislada mediante un ligero roce con el asa de siembra.
 Una vez que ya tiene el asa cargada con microorganismos procedentes de un cultivo en medio líquido o
sólido, tome una placa de Petri con agar nutritivo estéril y extienda sobre un área pequeña de la superficie
del medio de cultivo, en forma de estrías muy juntas (carga), pero sin hacer presión para no dañar el agar.
 Flamee y enfríe el asa y después roce la siembra realizada previamente, extienda de nuevo por otra zona de
la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameado y enfriando el asa al
comienzo de las sucesivas siembras en estría.
 Deje una placa sin inóculo como control de esterilidad del medio.
 Incube las placas a 35ºC durante 24 horas, en posición invertida (las inoculadas y el control.
2. Aislamiento de microorganismos por diseminación en superficie con varilla acodada o asa Digralsky
 Prepare 5 tubos de cultivo con 9 ml de agua destilada estéril y 11 placas de Petri con agar nutritivo estériles.
Siga el mismo procedimiento para la preparación y esterilización de soluciones y medios de cultivo, que
realizó en la práctica no. 2.
 Coloque en una gradilla los 5 tubos de cultivo con 9 ml de agua destilada estéril. Con mictropipeta y puntilla
estéril, tome1 ml del cultivo mixto en medio líquido que obtuvo en la práctica anterior, y deposítelo en el primer
-1
tubo, homogeneice y rotule como 10 . De este tubo tome 1 ml y deposítelo en el segundo tubo,
-2 -5.
homogeneice y rotule como 10 , siga el mismo procedimiento hasta llegar a la dilución 10 Utilice una
puntilla estéril diferente para cada dilución. No deseche los tubos de dilución, ya que se requerirán para
realizar el método de vertido en placa.
 Si utiliza varilla de vidrio, introduzca el brazo más corto de la varilla acodada, en alcohol al 70%. Si utiliza
varilla acodada de poliestireno, esta puede esterilizarla por radiación.
-1
 Use una micropipeta y deposite 0,1 ml de de la dilución 10 en una placa con agar nutritivo estéril (por
20
duplicado). Tome la varilla acodada, expóngala a la llama del mechero durante unos segundos, enfríe unos
segundos, y luego utilice el brazo más corto de la varilla para dispersar el inóculo, de manera uniforme sobre
la superficie completa del agar, hasta que se absorba, como se muestra en la figura de la parte inferior. Siga
el mismo procedimiento para cada una de las diluciones. Considere que las placas han de hacerse por
duplicado.
 Deje una placa más, sin inóculo como control de esterilidad del medio.
 Incube las placas a 35ºC durante 24 horas, en posición invertida (las inoculadas y el control)
4. Transferencia de colonias aisladas para obtener cultivos puros

La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de recipiente que los
contiene. Se pueden presentar los siguientes casos:
 Siembra de un medio líquido a medio líquido: el procedimiento se puede realizar con asa, aguja o pipeta y en
tubos de cultivo, matraces o frascos de dilución.
 Siembra de medio sólido a medio líquido: el procedimiento se realiza con asa o aguja y en tubo de cultivo,
matraces o frascos de dilución.
 Siembra de medio sólido a medio sólido: el procedimiento se puede realizar con asa o aguja y en tubo de
cultivo, ya sea en superficie en placa de Petri por estría o en profundidad en tubo de cultivo.
 Siembra de medio líquido a medio sólido: El procedimiento se realiza con asa, aguja o pipeta Pasteur y en
tubo de cultivo inclinado o en placa de Petri por estría.
 Tras la incubación de las placas inoculadas por estría cruzada y las inoculadas con varilla acodada, realice
frotis del crecimiento bacteriano a partir de ambas placas y tíñalos con la tinción de Gram, si todas las células
observadas coinciden morfológicamente, proceda a transferir la colonia a tubo con agar inclinado para obtener
21
un cultivo puro.
 Usando el asa de siembra estéril, transfiera a un tubo con agar nutritivo estéril e inclinado, una pequeña
porción de una colonia completamente aislada, de cualquiera de las placas de Petri utilizadas para el
aislamiento en superficie con varilla acodada o estría cruzada.
 Introduzca el asa en el tubo de agar inclinado hasta el fondo, diluyendo el inóculo en el agua de condensación
que se acumula en esa parte, luego mueva el asa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento
de zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.
 Deje un tubo de cultivo con agar inclinado, sin inocular, como control. Incube los tubos, incluyendo el control,
a una temperatura de 35ºC durante 24 horas.
 Después de la incubación, observe en los tubos de cultivo, la aparición de crecimiento bacteriano sobre la
superficie del agar.
 Mantenga los cultivos puros, previamente rotulados, entre 2-8ºC para formar un cepario.
Conclusiones
Seguridad e higiene
Evaluación
formativa y sumativa, los desempeños logrados abonan a la competencia general del curso.
1. ¿Qué entiende por cultivo mixto y qué por cultivo puro?
2. ¿En qué consiste el aislamiento por estría cruzada?
3. ¿Por qué se recomienda enfriar el asa en el medio de cultivo antes de realizar las estrías cruzadas?
4. ¿Cuáles fueron las ventajas y desventajas que presentaron los métodos utilizados?
5. ¿En qué ocasiones o circunstancias se debe emplear cada unote los métodos anteriores?
Bibliografía
Bibek, R. 2009. Fundamental Food Microbiology. First Edition. Wiley-Blackwell Ed.
Tortora, Gerard J.Funke, Berdell y Case, C. 2007. Introducción a la Microbiología. 9ª.edición. Ed. Panamericana
Winn, W. et al. 2008. Koneman. Diagnóstico microbiológico. Texto y Atlas en color. 6a. ed. Ed. Panamericana.
22


Clave: AEM-1050
Práctica 4. Identificación presuntiva de bacterias por su morfología Duración (h): 4
colonial y características microscópicas
Competencia general
Realiza adecuadamente la identificación presuntiva de algunas bacterias mediante criterios morfológicos
macroscópicos y microscópicos.
 Identifica y describe correctamente las características morfológicas de las colonias bacterianas, con base a
criterios establecidos.
 Elabora preparaciones en fresco y permanentes utilizando técnicas de tinción simple, diferencial, selectiva y
negativa.
 Distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, así como distintas estructuras bacterianas
manipulando adecuadamente el microscopio óptico.
y la organiza de forma oral y escrita.
Actitudes y valores
 Asume compromisos con responsabilidad al colaborar en equipo de aprendizaje para la consecución de
objetivos comunes.
 Respeta el trabajo de los demás y las normas de bioseguridad del laboratorio.
Cuando se cultivan las bacterias sobre medios de cultivo sólidos, las células aisladas se multiplican
sucesivamente hasta dar un crecimiento visible conocido con el nombre de colonias, las características de estas,
tales como el tamaño, pigmentación, forma, borde, elevación, superficie, apariencia general, se usan en la
identificación de las especies. Una de las características más importante de las bacterias, es su morfología,
definida por el su arreglo y estructura. Existen bacterias en forma redondeada (cocos), en forma cilíndrica
(bacilos) y en forma de espirales (espirilos) y a su vez, cada categoría se clasifica con base a diferentes
arreglos. Las principales dificultades en la observación y estudio de los microorganismos, son su reducido
tamaño y su transparencia a la luz visible, por tanto, la observación y estudio de su morfología y algunas de sus
estructuras, requiere, además del microscopio, llevar a cabo preparaciones las cuales pueden realizarse en
fresco, o bien fijas y teñidas. La preparación fresca solo se usa durante la observación y se desecha; en tanto
que una preparación permanente dura por largos periodos de tiempo, gracias a que se utiliza, para su montaje,
un agente como el bálsamo de Canadá, que permite que el cubreobjetos permanezca adherido al portaobjetos.
La forma más sencilla de preparar un microorganismo para su examen microscópico, es hacer una preparación
en fresco, la cual puede realizarse mediante una preparación en fresco simple o mediante una preparación en
gota pendiente. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos en su estado
natural; el inconveniente es que no permite aumentar el contraste, por la escasa diferencia entre los índices de
refracción del medio y de los microorganismos. Para aumentar el contraste de las células sin afectar su
viabilidad, en las preparaciones en fresco, suele agregárseles colorantes muy diluidos como el cristal violeta.
Otra forma de examinar un microorganismo al microscópico, es mediante una preparación fija y teñida, que
consiste en extender la muestra sobre un portaobjetos, en una capa muy delgada que permita el paso de la luz.
Este extendido llamado “frotis” puede hacerse suspendiendo el desarrollo microbiano en una pequeña gota de
agua mediante el asa y distribuyéndolo en el portaobjetos; colocando en el portaobjetos una gota de crecimiento
microbiano; utilizando hisopo o cinta adhesiva; o bien por impronta, presionando el portaobjetos sobre la
23
muestra. Una vez realizado el frotis, sigue el proceso de fijación, que tiene por objeto adherir la muestra al
portaobjetos y coagular el protoplasma antes de teñir la célula, desnaturalizando las proteínas para facilitar la
acción del colorante. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más usual, aunque también puede fijarse con
sustancias químicas como formaldehido, ácidos, alcoholes o sales metálicas. Después de la fijación le sigue el
proceso de tinción que puede ser positiva (cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las
estructuras en estudio; utilizan colorantes) o negativa (cuando se oscurece el fondo de la preparación y se
observa sólo la silueta incolora de los microorganismos). La fijación produce el encogimiento de las células; la
tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores de lo que son realmente. Algunas tinciones
requieren la utilización de sustancias químicas denominadas mordientes, como el ácido fénico, ácido tánico y
lugol., que actúan como sustancia puente entre el colorante y la estructura a teñir, permitiendo su
coloración; en otros casos, altera su estructura celular, permitiendo su tinción.
Los colorantes aumentan el contraste y se clasifican como naturales o sintéticos, estos últimos son más
utilizados y tienen afinidad específica por los materiales celulares. Algunos colorantes son cationes (por
ejemplo, azul de metileno, cristal violeta y safranina) que se combinan con los constituyentes celulares cargados
negativamente, como los ácidos nucleicos. Otros colorantes son aniones (por ejemplo, eosina, fucsina ácida y l
rojo Congo) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente como muchas proteínas.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles como el negro Sudán, que se combinan con los materiales
lipídicos de la célula. Las tinciones pueden clasificarse en simples, diferenciales y selectivas. La tinción simple
es aquella en la que sólo se utiliza un colorante de tipo básico como la safranina, cristal violeta o azul de
metileno para incrementar el contraste. La tinción diferencial es la que emplea secuencialmente dos o más
colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en función de diferencias en su estructura y
composición química, por ejemplo la tinción de Gram basada en las propiedades de la pared celular bacteriana.
La tinción selectiva se utiliza para identificar determinadas estructuras, en estas tinciones se colorea
únicamente una parte de la célula. Entre las más usadas están la tinción de esporas de Wirtz-Conklin, la de
flagelos de Leifson, la tinción negativa para cápsulas bacterianas y la tinción de núcleo de Feulgen.
Materiales Equipo
 Cronómetro  Microscopio óptico
 Gradilla para tubos  Refrigerador
 Portaobjetos y cubreobjetos  Balanza analítica
 Asa de siembra  Autoclave
 Varilla para coloración
 Pinzas portaobjetos
 Pipetas graduadas de 1 ml
 Espátulas
 Piseta
 Frascos goteros
 Aplicadores de madera
 Marcador indeleble
 Cubreboca y guantes de latex estériles
 Algodón
 Parafilm
 Papel seda
 Papel secante
 Papel metálico
 Aceite de inmersión
 Bálsamo de Canadá
 Alcohol etílico absoluto y de 96º
 Solución de fenol al 5% o de benzal al 10%
 Solución de cristal violeta
 Solución alcohol-acetona (3:1)
 Solución ácido-alcohol (3% HCl en alcohol 96º)
 Solución safranina al 0,5%
 Solución fuscina fenicada
24
 Solución nigrosina al 10% o tinta china

 Solución verde de malaquita al 5%
 Solución de azul de metileno de Loeffler
 Solución de extrán al 5%
 Xilol
 Agua destilada
 Material biológico: cultivos en medio líquido y sólido
de E. coli, Sacharomyces cerevisiae, Bacillus
subtilis, B. thuringiensis y Klebsiella sp.
Procedimiento
Fundamento
Las características macroscópicas de las colonias bacterianas, pueden ser diferentes si los microorganismos
crecen en diferentes medios de cultivo.
1. Observación macroscópica del desarrollo bacteriano en un medio de cultivo agarizado
 Inicie desinfectando el área de trabajo con una solución de fenol al 5% o de benzal al 10%.
 A partir del cultivo bacteriano en placa de Petri, obtenido en la práctica anterior, observe y describa las
colonias.
 Utilizando algunos criterios morfológicos como tales como el tamaño (grande 5 mm, mediana 2-3 mm o
pequeña 1-2 mm); aspecto (mucosa, seca, opaca, brillante o transparente) y el color de la colonia en un
medio específico.
 Utilice también los criterios que se marcan en el dibujo que se muestra a continuación.
2. Observación macroscópica del crecimiento

bacteriano en cultivos líquidos
 A partir del cultivo en medio líquido obtenido en la
práctica anterior, observe y describa el desarrollo
bacteriano utilizando los siguientes criterios:
 Turbidez uniforme
 Formación de película
 Sedimento
3. Observación de características microscópicas
Preparación en fresco
 Anote en un extremo del portaobjetos, el contenido de la
preparación, la fecha y su nombre.
 Tome una asada del cultivo líquido de microorganismos obtenido en la práctica anterior y deposítela
directamente sobre la superficie de un portaobjetos. Deposite suavemente un cubreobjetos sobre la superficie
de la muestra. Observe con el objetivo de menor aumento (10X) y luego con el de mayor (40X) aumento.
 Elabore esquemas de lo observado.
Preparación de frotis
 Rotule el portaobjetos que utilice para hacer el frotis como en el caso anterior. Coloque una pequeña gota de
agua destilada en el centro de un portaobjetos limpio. Flamee el asa de siembra hasta el rojo vivo, deje enfriar
el asa y tome en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido, que le
fue asignado y transfiéralo a la gota de agua que se encuentra en el portaobjetos. Remueva la mezcla con el
asa hasta formar una suspensión homogénea que quede extendida en una capa muy delgada.
25
 Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que
basta con colocar y extender una gota de la suspensión de microorganismos, directamente sobre el
portaobjetos.
Fijación de muestras
 Una vez preparado el frotis, pase el portaobjetos de 3-5 vedes por la periferia de la llama dejando enfriar el
portaobjetos entre cada pase.
 En caso de utilizar metanol (para bacterias
procedentes de medio líquido), añada unas gotas de
metanol sobre la extensión completamente seca.
Golpee el portaobjetos por su canto con cuidado
contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el
exceso de metanol. Espere a que el metanol se
evapore completamente.
 Una vez realizado el frotis y haber realizado la
fijación, continúe con el proceso de tinción.
3.4. Tinción de los frotis o preparaciones
 Realice las diferentes tinciones siguiendo el
procedimiento general para tinciones que se muestra
a continuación:
Tinción simple
Fundamento
La tinción simple se basa en la utilización de un sólo colorante tal como el azul de metileno, para la observación
al microscopio.
Procedimiento
 Una vez que haya preparado y fijado el frotis, colóquelo sobre la varilla de coloración y cubra la preparación
con azul de metileno durante 1 - 2 minutos. Lave la preparación con agua de grifo para eliminar el colorante,
inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el
frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Elimine
26
la máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de
la mesa de trabajo.
 Seque al aire y coloque la preparación al microscopio añadiendo sobre la misma, una gota de aceite de
inmersión. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión (100X).
Tinción diferencial de Gram
Fundamento
El cristal violeta penetra la pared celular tanto de bacterias Grampositivas como Gramnegativas; el lugol actúa
como mordiente formando un complejo con el cristal violeta. Al decolorar con una mezcla de alcohol y acetona, la
pared de las Grampositivas, formada por una gruesa capa de peptidoglucano, impide la salida del complejo
cristal violeta-lugol, manteniéndose la coloración violeta. En las Gramnegativos por el contrario, el complejo
cristal violeta-lugol sale por los poros que ha generado el alcohol-acetona en la membrana externa de la pared
celular. La bacteria por lo tanto se decolora y al agregar la safranina se tiñe de rojo.
Procedimiento
 Una vez que haya preparado y fijado el frotis, colóquelo sobre la varilla de coloración y cúbralo con cristal
violeta durante 2 minutos. Retire el cristal violeta NO LAVE CON AGUA.
 Añada inmediatamente lugol durante 1 minuto.
 Decolore con alcohol-acetona 20 segundos.
 Escurra y tiña con safranina durante 30 segundos.
 Lave con bastante agua el exceso de colorante.
 Seque la preparación al aire y observe al microscopio con el objetivo de inmersión.
 En el apartado de observaciones, de esta práctica,
haga esquemas de lo observado y concluya sobre lo
mismo.
Tinción selectiva para esporas (Wirtz-Conklin)
Fundamento
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas
que las hacen resistentes a los factores ambientales
adversos, estas cubiertas hacen que las esporas
aparezcan en el microscopio óptico como estructuras
refringentes. Las esporas no pierden el colorante verde
de malaquita en el lavado, en tanto que las formas
vegetativas si, quedando teñidas con el colorante de
contraste.
Procedimiento
 Prepare un frotis a partir de Bacillus subtilis y otro de
Bacillus thuringiensis y colóquelos sobre una varilla
de coloración.
 Cubra la preparación con verde de malaquita y caliente a emisión de vapores durante 1 minuto, utilizando
unas pinzas y algodón humedecido con alcohol. EVITE que el colorante hierva y que la muestra se seque,
añada más colorante si este se evapora.
 Lave con abundante agua el exceso de colorante. Agregue safranina como colorante de contraste, durante 1
minuto y después de este tiempo, lave con abundante agua el exceso de colorante.
 Seque la preparación al aire y observe al microscopio con el objetivo de inmersión.
 Anote la morfología y disposición de las endosporas de las dos especies de Bacillus.
 En el apartado de observaciones, de esta práctica, haga esquemas de lo observado y concluya sobre lo
mismo. La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carácter
taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género.
Tinción negativa para observación de cápsulas
Fundamento
Las partículas del colorante no pueden penetrar a la cápsula, que se observa como una zona clara y
transparente, alrededor de la célula, que aparece refráctil sobre un fondo oscuro.
Procedimiento
 Coloque una asada de nigrosina al 10% o tinta china en un portaobjetos y mezcle con una asada del cultivo
líquido de Klebsiella sp o de Sacharomyces cerevisiae
 Tome un portaobjetos y con éste, distribuya suavemente la mezcla sobre toda la superficie del portaobjetos,
un hasta obtener una capa fina del material que se va a observar.
 Haga la observación de la muestra con objetivo de 40X o con objetivo de inmersión, utilizando en este caso,
27
una gota de aceite de inmersión.

 En el apartado de observaciones, de esta práctica, haga esquemas de lo observado y concluya sobre lo
mismo.
4. Preparación de muestras permanentes
 Anote en un extremo del portaobjetos, el contenido de la preparación, la fecha y su nombre.
 Realice un frotis de la muestra.
 Proceda a realizar la deshidratación de la muestra utilizando una serie de concentraciones de etanol hasta
llegar al absoluto (80%, 90%, 95%, 100%). Preparare cuatro placas de Petri con su correspondiente
concentración de etanol y vaya sumergiendo la muestra entre 10 y 15 minutos en cada una de las
concentraciones, con el objetivo de que la preparación quede totalmente deshidratada.
 Seque el portaobjetos al aire y monte la preparación empleando un agente montante como bálsamo de
Canadá, medio de montaje hidrofóbico constituido por sustancias no miscibles en el agua.
 Una vez montada la muestra, coloque un cubreobjetos y observe al microscopio.
5. Recomendaciones generales
 Después de observar las preparaciones, es necesario sumergir los portaobjetos en una solución sanitizante
durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y conservarlos en un frasco con alcohol al 95%.
Conclusiones
Seguridad e higiene
Evaluación
curso.
 Se evalúa el reporte de la práctica realizada, trabajo en equipo, valores y actitudes, considerando los criterios
establecidos en las rúbricas diseñadas para cada actividad.
1. ¿Qué características debe tener un colorante para ser empleado en una tinción negativa?
2. ¿En qué consiste una tinción diferencial y para qué se emplea?
3. ¿Qué sucede si a un cultivo envejecido de Bacillus sp. se le realiza una tinción de Gram?
4. ¿Podría utilizar un colorante básico como primer colorante en la tinción de esporas?
5. ¿Cómo se observarán las bacterias después de la tinción de Gram, si se olvida realizar el paso de
decoloración?
6. ¿Qué sucederá si no se calienta el colorante en la tinción de esporas?
7. ¿La disposición de las endosporas en las dos especies de Bacillus, es la misma?
8. ¿Qué importancia tiene la presencia de la cápsula en las bacterias?
Bibliografía
Harvey R. A.; Champe, Pamela C. y Fischer, Bruce D. 2008. Microbiología. Liippincott Williams & Wilkins Wolters
Kluwer Health. Agapea.
Tortora, Gerard J. Funke, Berdell y Case, C.L. 2007.Introducción a la Microbiología. 9ª ed.Editorial Panamericana
28


Clave: AEM-1050
Práctica 5. Conservación de cepas Duración (h): 4
Competencia general
Realiza la preservación de cepas microbianas utilizando técnicas a corto plazo y desarrolla una colección de
cepas en el laboratorio.
 Conserva cepas puras utilizando las técnicas de desecación, aceite mineral y suspensión en agua estéril.
 Argumenta, con base a la experimentación, las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas utilizadas
en la conservación de cepas.
 Construye nuevas conceptualizaciones a partir de evidencias científicas.
 Argumenta ideas de forma oral y escrita.
Actitudes y valores
 Asume una actitud constructiva, congruente con los conocimientos y habilidades con los que cuenta.
 Aporta puntos de vista con apertura y considera los de otras personas de manera reflexiva.
En Microbiología, el concepto de cepa se refiere al conjunto de microorganismos, como bacterias, hongos… que
comparten el mismo acervo genético. Una cepa se deriva de un único microorganismo aislado en cultivo, y la
cepa de referencia de una especie, representa un ejemplo invariable de la especie en cuestión y es parte de una
colección de cultivos (por ejemplo ATCC). En el laboratorio de Microbiología es fundamental el mantenimiento y
conservación de cepas microbianas, puesto que constituyen el objeto material de trabajo. Por tan, un buen
método de conservación ha de garantizar la pureza, supervivencia de al menos el 70 % de las células y su
estabilidad genética. Existen varios métodos para la conservación de microorganismos, agrupados en 3
categorías de acuerdo al tiempo de su viabilidad: métodos de conservación a largo, mediano y corto plazo. Sin
embargo, la Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC, siglas en inglés), establece que por
seguridad, cada cepa debe ser mantenida por al menos 2 procedimientos diferentes.
La congelación (a –70 °C y –196 °C) y la liofilización son técnicas de conservación a largo plazo, minimizan al
máximo el riesgo de cambio genético en las células y las mantienen viables hasta por 25 años. Durante la
congelación, al bajar la temperatura se reduce el metabolismo drásticamente, hasta el caso de anularlo con
nitrógeno líquido (-196°C). La liofilización es el método más utilizado por las colecciones internacionales de
cultivos tipo, y consiste en congelar una suspensión de microorganismos y eliminar el agua como vapor de agua
directamente del hielo, sin pasar por el estado líquido, combinando técnicas de congelación y deshidratación. A
mediano plazo, es el término que agrupa las técnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los cultivos
entre 2 y 5 años. Se destaca en este grupo la desecación en diferentes soportes (papel filtro, arena, suelo…),
esterilizados por calor seco. La desecación se basa en la paralización del crecimiento por eliminación del agua
disponible para las células, lo que reduce drásticamente el metabolismo. El subcultivo seriado es una técnica
que permite la supervivencia de los cultivos en cortos períodos de tiempo (semana - 15 días), lo que incrementa
el riesgo de contaminación y de cambios genéticos. Consiste en resembrar el microorganismo en un medio
adecuado; se utiliza agar inclinado para evitar la desecación rápida del medio, además, en medio sólido se
detectan mejor los contaminantes, que en medio líquido.
Una técnica de preservación resulta más efectiva para un grupo microbiano que para otro, no existe una técnica
universal para conservar adecuadamente todos los microorganismos. Así, los hongos pueden conservarse por
desecación en suelo; las bacterias se conservan mejor por liofilización, pero se pueden utilizar prácticamente
todos los métodos; los virus con nitrógeno líquido; las algas y cianobacterias en subcultivo seriado. En el caso de
bacterias y hongos filamentosos de espora pequeña, la temperatura de almacenamiento recomendada es de
18°C; las levaduras y hongos filamentosos de espora grande, se almacenan a 5°C en un cepario, lugar aséptico
y específico, donde se almacena todo tipo de cepas puras con fines de investigación y enseñanza. Para ello,
pueden ser utilizados refrigeradores mecánicos (-60ºC), refrigeradores de nitrógeno líquido (-196ºC) y cuartos
29
fríos (5ºC). Existen las colecciones de cultivos tipo, dedicadas a almacenar, mantener y comercializar cepas a
nivel mundial como la ATCC (USA), Kral (Praga), Lobaina (Belgica)…
Materiales Equipo
 Cronómetro  Refrigerador
 Asa de siembra  Incubadora con termómetro
 Placas de Petri estériles  Baño María
 Tubos de cultivo  Autoclave
 Gradilla para tubos  Balanza analítica
 Matraz Erlenmeyer de 100, 250l y de 500 ml
 Pipetas graduadas de 1,0 ml
 Micropipetas de 0.1 – 5.0 ml
 Puntillas estériles para micropipetas 0.1 – 5.0 ml
 Vasos de precipitado de 100, 250 y 500 ml
 Piseta
 Cubreboca
 Algodón
 Gasa
 Papel filtro
 Papel metálico
 Papel secante
 Parafilm
 Carbonato de calcio
 Arena tamizada
 Tierra tamizada
 Vaselina líquida estéril
 Agua destilada
 Cultivos puros en tubo inclinado.
Procedimiento
1. Preservación por desecación
 Limpie la zona de trabajo con una solución de fenol al 5% o de benzal al 10%.
 Tome un tubo de cultivo y agregue 0,1 g de arena tamizada, 0,1 g de tierra tamizada y 0,1 g de carbonato de
calcio, coloque la tapa al tubo sin apretar mucho. Coloque el tubo en un vaso de precipitado, cubra con papel
metálico y esterilice en autoclave. Saque el material utilizando guantes de asbesto y deje enfriar.
 Trabajando al mechero o en gabinete de bioseguridad, haga una suspensión de microorganismos de la
siguiente manera: agregue agua destilada estéril a un tubo inclinado conteniendo un cultivo puro (de los que
se obtuvieron en la práctica anterior) y agite para obtener la suspensión.
 Agregue 0,1 ml de la suspensión al tubo que contiene la arena, tierra y carbonato estéril.
 Rotule con el nombre del microorganismo, la fecha y medio en el que fue preservado.
 Guarde el cultivo entre 2ºC – 8ºC, con la finalidad de iniciar la colección de cepas en el laboratorio (cepario).
2. Preservación en aceite mineral
 En condiciones asépticas tome el tubo que contiene el cultivo puro y agregue la vaselina líquida estéril, hasta
el pico del tubo.
 Rotule el tubo con el nombre de microorganismo, la fecha y el medio en el que fue preservado.
 Guarde el cultivo en refrigeración entre 2ºC – 8ºC y sume el cultivo a la colección.
30
3. Preservación en agua destilada

 En condiciones asépticas, haga una suspensión de
microorganismos siguiendo las instrucciones
anteriormente descritas en el punto no. 1.
 Deposite 0,1 ml de la suspensión en un tubo de cultivo
estéril.
 Rotule el tubo con el nombre de microorganismo, la fecha
y el medio en el que fue preservado.
 Guarde el cultivo en refrigeración entre 2ºC – 8ºC y sume
el cultivo a la colección.
Conclusiones
Seguridad e higiene
Evaluación
 Se evalúa el reporte del experimento, valores y actitudes, considerando los criterios establecidos en las
rúbricas diseñadas para cada actividad. Además del siguiente cuestionario:
1. ¿Qué tipo de métodos se utilizaron en esta práctica para la conservación de cepas?
2. ¿Por cuánto tiempo considera que se podrán conservarse las cepas que ha preservado?
3. ¿Cuáles son las características de debe reunir una cepa preservada?
4. ¿Qué porcentaje de supervivencia de microorganismos debe garantizar cualquier método de
preservación?
5. Mencione las ventajas y desventajas de los métodos utilizados para la conservación de cepas.
Bibliografía
Hatt, H. (ed.) 1980. American Type Culture Collection Methods. I. Laboratory Manual on Preservation, Freezing
and Freeze-Drying". American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD.
Willey, J. M., Sherwood, L. M., y Woolverton, Ch. J.2009. Microbiología de Pescott, Harley y Klein. 7ª.edición. Editorial
McGraw-Hill Interamericana.
31


Clave: AEM-1050
Práctica 6. Curva de crecimiento poblacional en cultivo sumergido Duración (h): 4
Competencia general
Calcula los parámetros característicos de la cinética del crecimiento poblacional en un cultivo sumergido.
 Determina el crecimiento de una población microbiana mediante la medición de su densidad óptica en función
del tiempo.
 Construye una curva de crecimiento a partir de los resultados obtenidos.
 Maneja las TICs para la organización e interpretación gráfica de datos.
 Formula explicaciones y conclusiones de los resultados obtenidos a partir del trabajo experimental.
Actitudes y valores
 Respeta las normas del laboratorio.
 Asume una actitud flexible y de colaboración, asumiendo responsabilidades en el desarrollo de las tareas en
equipo.
El crecimiento e cualquier sistema biológico suele definirse como el incremento ordenado de todos los elementos
componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la
multiplicación celular. En organismos multicelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño
del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, lo que ocurre es un aumento
de la población. Así, el crecimiento bacteriano es posible estudiarlo desde el punto de vista individual y
poblacional. El crecimiento individual es el incremento en el tamaño y peso; los eventos de crecimiento individual
hacen referencia al ciclo celular. El crecimiento poblacional es el incremento en el número de células como una
consecuencia del crecimiento y división celular, e incluye la cinética de crecimiento, los factores que afectan al
tiempo de generación y factores ambientales que limitan el crecimiento. El crecimiento de una población resulta
de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha población. Algunos conceptos involucrados en
el crecimiento poblacional es la tasa de crecimiento (cambio del número de células o masa por unidad de
tiempo), generación (intervalo para la formación de dos células provenientes de una) y el tiempo de generación
(tiempo que tarda una población en duplicarse o el tiempo requerido para completar un ciclo de división). El
tiempo de generación es diferente para cada especie microbiana, y puede ir desde algunos minutos hasta
algunos días. El crecimiento de un microorganismo depende del microorganismo en sí; de la composición del
medio de cultivo; de las condiciones de incubación, temperatura, concentración de CO 2; y de la procedencia y
características del inóculo. Así, en condiciones óptimas E.coli tiene un ciclo de vida de 15-20 minutos, mientras
que Mycobacterium tuberculosis lo tiene de 18 horas. Las células crecen más rápidamente en un medio
enriquecido que en un medio mínimo. La curva de crecimiento varía dependiendo de que se parta de un cultivo
estacionario o de uno en crecimiento exponencial.
El crecimiento de las poblaciones bacterianas en un sistema de cultivo cerrado, está limitado por el agotamiento
de los nutrientes o bien, por la acumulación de productos tóxicos del metabolismo. En estos sistemas la fase
exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones, debido al
agotamiento de nutrientes y/o a la acumulación de desechos. Cuando las bacterias se cultivan en medios sólidos
o líquidos, las condiciones se asemejan a las de un sistema cerrado, sin un aporte continuo de nutrientes., ni
drenaje de células ni de sustancias de desecho. Si luego de inoculado el medio líquido, se toman muestras a
intervalos regulares, la representación gráfica de los datos (conteo de células viables contra tiempo), dará la
curva de crecimiento característica que consta de la fases lag, exponencial, estacionaria y fase de muerte. La
fase lag es una fase de preparación y adaptación al medio, su duración depende del medio de cultivo y el estado
fisiológico de las células vivas. La fase exponencial es una consecuencia del hecho de que cada célula se divide
para formar dos células (fisión binaria); los microorganismos unicelulares crecen exponencialmente y la velocidad
de crecimiento exponencial varía mucho de uno a otro. Las condiciones ambientales, como la temperatura y la
32
composición del medio de cultivo, afectan a la velocidad de crecimiento exponencial, así como las características
del microorganismo. En la fase estacionaria, el crecimiento exponencial se detiene, los nutrientes indispensables
se agotan, no hay incremento o decremento en el número de células o masa, hay limitación de nutrientes y
acumulación de sustancias tóxicas. Los microorganismos son fisiológicamente activos y viables. En un sistema
cerrado no se puede llevar a cabo indefinidamente el crecimiento exponencial. Si la incubación continúa después
que una población alcanza la fase estacionaria, las células pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero
lo más probable es que mueran; si sucede esto último, la población se encuentra en la fase de muerte.
Materiales Equipo
 Cronómetro  Autoclave
 Gradilla para tubos  Horno Pasteur de aire caliente
 Celdas para espectrofotómetro  Incubadora con termómetro
 Espátulas  Balanza analítica
 Probeta de 100 ml  Refrigerador
 Frascos de dilución de 125 ml con tapa de baquelita  Baño María
 Micropipetas  Microscopio óptico
 Puntillas estériles de 0.1 a 5 ml para micropipetas  Vórtex
 Vasos de precipitados de 100  Espectrofotómetro
 Piseta
 Papel seda
 Cubreboca
 Caldo extracto de levadura y glucosa (YED)
 Agua destilada
 Inóculo: Saccharomyces cerevisiae 1 ml (DO: 1,25)
Fundamento
Cuando se sigue el crecimiento de una población microbiana, midiendo su densidad óptica (DO) en función del
tiempo, se obtiene su curva de crecimiento.
Procedimiento
 En condiciones asépticas, inocule 1 ml de Saccharomyces cerevisiae en el frasco de dilución que contiene 25
ml de medio YED (extracto de levadura y glucosa) estéril y agite en vórtex. Rotule el frasco de dilución e
incube a 37ºC durante 24 horas.
 Mida la densidad óptica del cultivo (DO) utilizando el espectrofotómetro a 600 nm y compruebe que esta DO
inicial (to) es aproximadamente de 0.05. Siga la evolución del crecimiento, evidenciado por la turbidez, y mida
nuevamente la DO durante las 24 horas de incubación del cultivo, a intervalos de 2 horas.
 Represente en una gráfica los valores de DO obtenidos para obtener la curva de crecimiento del cultivo.
TIEMPO DE MUESTREO (H) TURBIDEZ (DO)
Conclusiones
33
Seguridad e higiene
Evaluación
1. ¿Cómo se define el crecimiento microbiano?
2. ¿Cómo se define el crecimiento individual y el crecimiento poblacional?
3. ¿Cuáles son los eventos a nivel celular que ocurren en cada una de las etapas del crecimiento?
4. ¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causarán un incremento de la fase lag en la curva de
crecimiento y que condiciones la disminuiría?
5. ¿Cómo se define el tiempo de generación o tiempo de duplicación y cómo se relaciona con la tasa de
crecimiento específica (µ)?
Bibliografía
McLandsborough, L. 2009. Food Microbiology Laboratory. First Edition. Editorial Wiley-Blackwell.
Willey, J. M., Sherwood, L. M., y Woolverton, Ch. J. 2009. Microbiología de Pescott, Harley y Klein. 7ª.
edición. Editorial McGraw-Hill Interamericana.
34


Clave: AEM-1050
Práctica 7. Curva de crecimiento en un cultivo sólido Duración (h): 4
Competencia general
Calcula los parámetros cinéticos característicos de las bacterias, mediante una curva de crecimiento en cultivo
sólido.
 Cuantifica el número de UFC/ml de E.coli por unidad de tiempo y a partir de los datos obtenidos, construye
una gráfica de la cinética de crecimiento.
 Determina el tiempo de generación de E. coli a partir del valor de la tasa de crecimiento específica.
 Conocer las fases de una curva de crecimiento en un cultivo de Escherichia coli y calcular los parámetros
cinéticos (µ, td) característicos de las bacterias.
Actitudes y valores
 Asume una actitud flexible y de colaboración, adjudicándose responsabilidades en el desarrollo de las
actividades en equipo.
El crecimiento de cualquier sistema biológico suele definirse como el incremento ordenado de todos los
elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente
conduce a la multiplicación celular. En organismos multicelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento
del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, lo que ocurre es
un aumento de la población. Así, el crecimiento bacteriano es posible estudiarlo desde el punto de vista individual
y poblacional. El crecimiento individual es el incremento en el tamaño y peso; los eventos de crecimiento
individual hacen referencia al ciclo celular. El crecimiento poblacional es el incremento en el número de células
como una consecuencia del crecimiento y división celular, e incluye la cinética de crecimiento, los factores que
afectan al tiempo de generación y factores ambientales que limitan el crecimiento. El crecimiento de una
población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha población.
En los cultivos en sistemas cerrados sólidos, también se presentan las fases, los parámetros y la cinética de
crecimiento al igual que en los cultivos sumergidos. Para estudiar la cinética de crecimiento en los cultivos
sólidos, se requiere dar seguimiento a la evolución del número de células viables por unidad de superficie o por
unidad de masa. El crecimiento de una célula aislada e inmóvil, en un sustrato o medio de cultivo sólido, al
transcurrir el tiempo origina una masa celular visible que recibe el nombre de colonia, por consiguiente, se
denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada, que en un breve lapso de
tiempo, da lugar a la formación de una colonia, siempre y cuando se encuentre en condiciones favorables
respecto a nutrientes y factores ambientales. En el cultivo sólido, la densidad de cada colonia es muy alta (del
7
orden de 10 células para una colonia de unos 5 mm), esto se debe a que en el medio sólido, a diferencia del
líquido, las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este medio sólido permite un aporte
continuo de nutrientes (por difusión desde el entorno de la colonia, hacia ella), y eliminación continua de
productos de desecho (por difusión desde la colonia hacia fuera). Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo,
excepto que no hay drenaje de células. Cuando se realizan los cultivos en placas de Petri y el número inicial de
bacterias por unidad de superficie es muy alto, da lugar a lo que se denomina un césped, ocasionado por la
confluencia de las colonias. En el caso de los microorganismos móviles o bien, de los hongos filamentosos que
muestran un crecimiento trófico, no se producen colonias aisladas, sino formaciones más difusas o miceliares.
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Materiales Equipo
 Placas de Petri estériles  Horno Pasteur de aire caliente
 Probeta de 100 ml  Incubadora con termómetro
 Pipetas graduadas de 1,0 ml  Balanza analítica
 Dispensadores para pipetas  Refrigerador
 Micropipetas de 1,0 ml y puntillas estériles  Baño María
 Gradilla para tubos  Cronómetro
 Matraz Erlenmeyer de 250 ml  Planchas agitadoras para placas de Petri
 Guantes de asbesto  Contador de colonias
 Cubreboca
 Algodón
 Parafilm
 Hilo grueso
 Gasa
 Papel metálico
 Papel estraza
 Piseta
 Agua destilada
 Solución de fenol al 5% o de benzal al 10% l
 Agar nutritivo
 1 frasco de dilución con tapón de baquelita con 90 ml
de solución salina isotónica estéril.
 6 tubos de cultivo con 9 ml de solución salina
isotónica estéril.
 Cultivo bacteriano de 24 horas en caldo de infusión
de cerebro y corazón (BHI)
Fundamento
Al inocular una bacteria en un medio sólido, experimentará un periodo de adaptación al medio y a las
condiciones de cultivo, para dividirse posteriormente en forma exponencial, originando una curva de crecimiento
poblacional.
Procedimiento
 Con una micropipeta coloque 1 ml del cultivo de 24 horas de E. coli en BHI, en un frasco de dilución, con 99
ml de solución salina isotónica estéril (1:100). Transfiera 0,1 ml de esta dilución a un tubo de dilución con 9,9
ml de solución salina isotónica estéril (1:10,000). Repita el procedimiento transfiriendo 0,1 ml de esta nueva
dilución a otro tubo de dilución con 9,9 ml de la solución salina estéril (1:1000000). Para cada dilución utilice
una puntilla estéril diferente. Tanto el frasco como los tubos de dilución, han de estar previamente rotulados
con el número de dilución y el tiempo 0. Las muestras han de homogeneizarse cada vez que se haga una
nueva dilución (repita este paso para los tiempos: 1, 2, 3, 4 y 5 horas)
 Inocule por duplicado 0,1 ml de las últimas tres diluciones en cajas de Petri con agar nutritivo previamente
36
rotuladas con el número de dilución y el tiempo 0, distribuya el inóculo utilizando la varilla acodada (repita
este paso para los tiempos: 1, 2, 3,4 y 5 horas)
 Deje que se absorba el inóculo e incube en forma invertida durante 24-48 horas a 35ºC (repita este paso para
los tiempos: 1, 2, 3, 4 y 5 horas)
 Cuantifique el número de UFC / ml de E. coli utilizando el cuenta colonias.
 Reporte en forma gráfica la relación entre dos variables, la variable independiente es el tiempo y se colocará
en el eje X, y el logaritmo de UFC/ml de microorganismos, en el eje Y.
 Determine la tasa de crecimiento promedio (k) utilizando la fórmula k = (log N – log N0) / log 2 (t), donde N0 =
al número de UFC al tiempo 0 (h) y N = al número de UFC al tiempo 5 (h)
 Calcule la tasa de crecimiento específica (µ) utilizando la fórmula µ = ln2(k), con este valor determine el
tiempo de generación de Escherichia coli con la relación td = ln2 / µ.
TIEMPO DE UFC/ML
MUESTREO
(H)
Conclusiones
Seguridad e higiene
Evaluación
8
1. ¿Si dispone de 6 ml de un cultivo bacteriano con 8,4 x 10 UFC/ml ¿Qué diluciones debería realizar para
contar aproximadamente 40 colonias por placa, si se siembra 0,1 ml de dicha dilución?
5
2. ¿Qué dilución debería realizar para obtener 2 ml de una suspensión de bacterias que contenga 2 x 10
UFC totales, si parte de un cultivo que contiene 2 x 109 UFC/ml?
Bibliografía
37


Clave: AEM-1050
Práctica 8. Efecto de las condiciones ambientales sobre el Duración (h): 4
crecimiento microbiano
Competencia general
Evalúa el efecto de factores ambientales sobre el crecimiento microbiano.
 Determina el efecto de la temperatura, pH y actividad de agua en el crecimiento microbiano.
 Argumenta la relación que existe entre las condiciones del hábitat natural de las poblaciones microbianas y
las condiciones óptimas de crecimiento en el laboratorio.
y la organiza de forma oral y escrita, utilizando las tecnologías de información y comunicación.
 Formula explicaciones y conclusiones de los resultados obtenidos a partir de experimentos realizados.
Actitudes y valores
 Participa en la planificación y realización de actividades en equipo, valorando las aportaciones propias y
ajenas, en función de los objetivos establecidos.
Los factores ambientales modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que pueden llegar a
ocasionar la muerte de los microorganismos; además, condicionan la distribución de los microorganismos en sus
ecosistemas y hábitats naturales y, permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano. Los factores
ambientales que se controlan frecuentemente a nivel laboratorio, además de los nutrientes, es la temperatura,
pH, actividad de agua, la luz, oxígeno y presión hidrostática, entre otros. Aunque determinadas condiciones
pueden ser nocivas para una especie, para otras, pueden ser neutras o beneficiosas. La temperatura es uno de
los parámetros ambientales más importantes que condicionan el crecimiento y la supervivencia de los
microorganismos. La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento y, por lo tanto al tiempo de generación (g).
Cada microorganismo tiene sus temperaturas cardinales que son la temperatura mínima, por debajo de
crecimiento debido a una gelificación de la membrana y por detenerse el transporte de nutrientes. La temperatura
máxima por encima de la cual no existe crecimiento por desnaturalización proteica y por rotura de membrana o
lisis celular. La temperatura óptima, a la que se da el crecimiento óptimo debido a que las reacciones enzimáticas
alcanzan su máxima velocidad.
En función de la temperatura de crecimiento los microorganismos pueden ser: 1) Psicrófilos que a su vez se
subdividen en psicrófilos estrictos aquellos microorganismos que pueden crecer a 0 ºC pero cuya temperatura
óptima es de 15 ºC; y los llamados psicrófilos facultativos o psicrótrofos, como Pseudomonas, que constituyen
aquellos microorganismos que pueden proliferar a 0 ºC pero que tienen temperaturas óptimas más elevadas 20 -
30 ºC. Los psicrófilos presentan adaptaciones bioquímicas a medios fríos, como sistemas de transporte
adaptados a bajas temperaturas y un aumento en la proporción de ácidos grasos insaturados en la membrana. 2)
Mesófilos cuya temperatura mínima de crecimiento se encuentra entre 5 a 15ºC, máxima 35-47ºC y óptima
entre 30-45ºC), la mayor parte de los microorganismos pertenecen a esta categoría. 3) Termófilos,
microorganismos cuya temperaturas óptima es de 50 - 60 ºC, hay algunos con temperaturas óptimas aún más
altas 80 - 121 ºC, a estos se les denomina hipertermófilos o termófilos extremos como Thermus aquaticus y que
taxonómicamente estos últimos pertenecen al dominio de las Archaea. La existencia de enzimas termoestables,
ribosomas resistentes, membranas ricas en ácidos grasos saturados, son algunas de las principales
adaptaciones bioquímicas a altas temperaturas en células vegetativas. En condiciones de refrigeración los
mesófilos y termófilos detienen su crecimiento (µ=0) y se mantienen durante largo tiempo sin morir. Los
psicrófilos pueden crecer en estas condiciones y llegar a producir poblaciones importantes.
38
La mayoría de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio, ateniendo al mismo tiempo
su pH interno óptimo prácticamente constante. Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH
8, pero su pH interno es siempre 7.6 o muy cercano a ese valor. Respecto del margen normal de pH a los que
crecen las bacterias, éstas se pueden clasificar en neutrófilas, crecen entre pH 5,5 y 8; acidófilas, crecen entre
pH 0 y 5 y alcalófilas, crecen entre pH 8,5 y 11,5. Los cambios bruscos del pH causan alteraciones en la
estabilidad de la membrana plasmática, en el intercambio de hidrogeniones, causa desnaturalización en las
proteínas con actividad enzimática y en las proteínas de transporte. En general los hongos toleran pH más
ácidos que las bacterias.
Como los microorganismos dependen del agua para la síntesis de sus componentes celulares, es necesario que
ésta se encuentre disponible en el medio de cultivo para que los microorganismos la puedan utilizar para su
crecimiento, el agua disponible con la que cuentan para su crecimiento, se expresa como actividad de agua (Aw),
para el agua pura la Aw es igual a 1.0. La adición de sales o de azúcar produce una contracción celular que
evita el crecimiento. El valor de la Aw) indica la cantidad de agua disponible para ser utilizada por los
microorganismos. La cantidad disponible de agua para los microorganismos en un medio de cultivo, no depende
sólo de la cantidad que se ha añadido, ya que en estos medios se pueden encontrar sustancias sólidas disueltas
que disminuyen su disponibilidad, por tanto, la Aw disminuye en la medida que aumenta la concentración del
soluto. Para la mayoría de las bacterias el valor medio es de 0.90-0.98, a valores menores, baja la tasa de
crecimiento. Existen las bacterias halotolerantes, como Staphylococcus aureus, que soportan una reducción muy
leve del valor de Aw (0.9); sin embargo, las bacterias holófilas cuyo hábitat son ambientes salinos, toleran muy
bien la disminución de la Aw. Los halófilos requieren bajas (1-6%) o moderadas (6-15%) concentraciones de
sales para crecer y los halófilos extremos como las arqueas, crecen en ambientes muy salinos (15-30%). Los
hongos xerófilos crecen en valores de Aw muy bajos (0.65-0.75); en tanto que las levaduras osmófilas, crecen a
elevada concentración de azúcares (Aw de 0.60-0.65)
Materiales Equipo
 Espátulas  Refrigerador
 Placas de Petri estériles  Balanza analítica
 Probeta de 100 ml  Baño María
 Pipetas graduadas de 1,0 ml  Potenciómetro
 Micropipetas  Autoclave u olla de presión
 Puntillas estériles de 0.1 a 5 ml para micropipetas
 Tapas de Brewer
 Matraz Erlenmeyer de 100 y 250 ml
 Piseta
 Cubreboca
 Algodón
 Gasa
 Papel metálico
 Parafilm
 Solución de NaOH 1M
 Solución de HCL 1 M
 Caldo nutritivo
 Agar papa dextrosa (PDA)
 Agar nutritivo
 Agua destilada
 Cultivo de Escherichia coli en medio líquido
 Suspensión de esporas de Aspergillius niger
39
Fundamento
Los microorganismos crecerán en condiciones óptimas si se les proporciona las condiciones ambientales
adecuadas.
Procedimiento
1. Efecto de la temperatura
 Prepare 6 placas de Petri con medio de cultivo PDA, siembre 3 placas con 0,1 ml de suspensión de esporas
de hongos y distribuya con varilla acodada. Las otras 3 placas serán los controles, por lo que no han de ser
inoculados.
 Incube una placa sembrada y un control a 15ºC, otra sembrada y un control a 30ºC y por último, una placa y
un control a 45ºC en forma invertida durante 72 horas.
 Transcurrido el tiempo de la incubación, realice las observaciones macroscópicas en las placas.
 Prepare 8 tubos de cultivo con agar nutritivo inclinado. Inocule 4 tubos con asa de siembra con el cultivo de
Escherichia coli. Los 4 tubos restantes no han de ser inoculados, pues serán los controles.
 Incube un tubo y un control a 4ºC, otro tubo y un control a 28ºC, un tercero y un control a 35ºC y el último tubo
inoculado y un control a 55ºC, durante 24-48 horas.
 Una vez transcurrido el tiempo de incubación, observe el crecimiento en cada uno de los tubos.
 Anote sus observaciones.
2. Efecto del pH
 Prepare 4 placas de Petri con medio de cultivo PDA, ajustado a cuatro valores de pH diferentes cada placa
(3,5,7 y 9), con soluciones de NaOH 1M o HCL 1 M.
 Inocule las 4 placas con 0,1 ml de suspensión de esporas de hongos y distribuya con varilla de vidrio.
 Prepare una placa más como control. No la inocule.
 Incube las 5 placas a 30ºC en forma invertida durante 72 - 96 horas.
 Una vez transcurrido el tiempo de incubación, realice las observaciones macroscópicas de las colonias.
 Prepare 4 tubos de cultivo con caldo nutritivo ajustado a cuatro valores de pH diferentes cada tubo (3,5,7 y 9),
con soluciones de NaOH 1M o HCL 1 M.
 Inocule los 4 tubos con 0,1 ml del cultivo de Escherichia coli.
 Prepare un tubo de cultivo más, con caldo nutritivo normal, sin inocular (control)
 Incube todos los tubos, incluyendo el control, a 35ºC, durante 24-48 horas.
 Observe el crecimiento en cada uno de los tubos y anote dichas observaciones.
3. Efecto de la Aw por concentración de solutos
 Prepare 5 tubos de cultivo con caldo nutritivo con concentraciones de NaCl al 1%, 3%, 5%, 9% y 12%
respectivamente.
 Inocule los 5 tubos con 0.1 ml de cultivo de Escherichia coli
 Prepare un tubo de cultivo más, con caldo nutritivo, pero no lo inocule (control)
 Incube todos los tubos incluyendo el control, a 35ºC durante 24-48 horas.
 Observe el crecimiento en los tubos y anote sus observaciones.
Efecto de la temperatura: Anote el crecimiento de acuerdo a la temperatura a la que fueron incubados los
microorganismos, colocando un signo negativo (-) para la ausencia de crecimiento y la presencia de crecimiento
con un signo positivo (+): crecimiento mínimo (+),moderado (++) y crecimiento abundante (+++). Compare sus
resultados con los reportados para Aspergillius niger y Escherichia coli.
CRECIMIENTO 4ºC 25ºC 35ºC 55ºC
Aspergillius niger
Escherichia coli
Efecto del pH: En los tubos, anote la presencia de turbidez en el medio, como crecimiento positivo (+) y la
ausencia como crecimiento negativo (-). En las placas de Petri, observe microscópicamente el crecimiento en
forma de colonias.
40
MEDIO DE CULTIVO CRECIMIENTO

Caldo nutritivo pH 3
Papa dextrosa agar pH 3

Efecto de la Aw por concentración de solutos: Anote el crecimiento colocando un signo negativo (-) para la
ausencia de crecimiento y la presencia de crecimiento indíquela con un signo positivo (+): crecimiento mínimo
(+),moderado (++) y crecimiento abundante (+++). Compare sus resultados con los reportados para la cepa en
estudio.
MEDIO DE CULTIVO CRECIMIENTO

Caldo nutritivo con NaCl al 1%

Incluya fotografías o esquemas de lo observado.

Conclusiones
Seguridad e higiene
Evaluación
rúbricas diseñadas para cada actividad. Además de la evaluación del siguiente cuestionario:
1. ¿Qué relación existe entre las condiciones del hábitat natural de las poblaciones microbianas y las
condiciones óptimas de crecimiento en el laboratorio?
2. ¿Cómo se clasifican los microorganismos de acuerdo a la temperatura óptima de crecimiento?
3. ¿Cómo influye el pH en el crecimiento de bacterias y hongos?
4. ¿Cómo afecta la concentración de sales la presión osmótica?
5. ¿Qué nombre reciben los microorganismos que soportan elevadas presiones osmóticas?
6. ¿Cuáles son los mecanismos celulares que han desarrollado los microorganismos termófilos extremos y
psicrófilos, para adaptarse a condiciones extremas de temperatura y pH?
Bibliografía
41

42


Clave: AEM-1050
Práctica 9. Cultivo de bacterias anaerobias Duración (h): 4
Competencia general
Realiza el cultivo de bacterias anaerobias mediante siembra en profundidad y en superficie.
 Desarrolla el crecimiento de microorganismos anaerobios, mediante la aplicación adecuada de sistemas de
incubación para atmósfera enriquecida en CO2.
 Distingue los distintos tipos de bacterias anaerobias con base a su crecimiento en las distintas zonas del
medio de cultivo.
 Formula hipótesis sobre la experimentación a desarrollar.
 Busca, procesa y analiza información procedente de fuentes diversas y la organiza de forma oral y escrita.
Actitudes y valores
 Colabora en equipo de aprendizaje para la consecución de objetivos comunes, asumiendo los copromisos con
responsabilidad.
 Respeta a sus compañeros y las normas del laboratorio. Respeta a sus compañeros y las normas del
laboratorio.
Los microorganismos anaerobios poseen un metabolismo de tipo fermentativo en el cual sustancias orgánicas
son los aceptores finales de electrones. Las formas vegetativas mueren cuando son expuestos al O 2 molecular
libre en la atmósfera, aunque el grado de resistencia bajo estas condiciones es variable (aerotolerancia). Las
esporas bacterianas no son afectadas por tratarse de formas biológicas metabólicamente inertes y con muy
escasa proporción de agua en su composición.
Existen métodos para proporcionar una mayor o menor oxigenación en función del tipo de microorganismos que
se desee cultivar. Los medios líquidos permiten una mayor difusión del oxígeno hacia las capas inferiores que los
medios sólidos. Los niveles de difusión de oxígeno en las distintas capas condicionará el crecimiento de distintos
tipos de microorganismos. En el mundo microbiano existen especies capaces de alternar con sistemas
metabólicos diferentes para crecer y multiplicarse en muy diferentes condiciones de aerobiosis, total, reducida o
ausente, los llamados anaerobios facultativos como E. coli. Otros como los microaerófilos, solamente subsisten
en rangos estrictos de gases tales como el O 2 y el CO2. Los aerobios estrictos, en cuanto a sus exigencias de
medio ambiente, son microorganismos poseedores de sistemas enzimáticos que solamente funcionan en
ausencia de O2, por ejemplo, especies del género Clostridium.
Las bacterias anaeróbicas no crecen en medios de cultivo normales debido a que tienen exigencias nutritivas
mayores al ser el metabolismo anerobio menos eficaz que el aeróbico. En general precisan medios con una
elevada proporción de peptonas y carbohidratos y un bajo potencial redox. Los medios de cultivo llevan
incorporado un compuesto reductor, como tioglicolato, ácido ascórbico, cisteína, entre otros. La protección de los
cultivos anaerobios del oxígeno libre se puede conseguir por diferentes métodos tales como la siembra en
profundidad, siembra en tubo con medio sólido, siembran en tubo con medio líquido, utilización de jarras de
anaeobios (Jarras GasPack) siendo este último el más utilizado. Estas jarras constan de un soporte para placas
incluido en una cubeta transparente con tapa hermética y un sobre comercial para crear la atmósfera anaerobia,
que contiene una tableta de borohidrato sódico, otra de bicarbonato sódico y ácido cítrico y un catalizador de
paladio.
Materiales Equipo
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 Placas de Petri estériles  Balanza analítica
 Tapas de Brwer estériles  Baño María
 Probeta de 100 ml  Potenciómetro
 Pipetas graduadas de 1,0 ml  Autoclave u olla de presión
 Micropipetas con puntillas estériles de 1,0 ml  Jarra de anaerobiosis Gas-Pak
 Matraz Erlenmeyer de 100 y 250 ml
 Piseta
 Cubreboca
 Algodón
 Gasa
 Papel metálico
 Parafilm
 Sobres generadores de CO2
 Azul de metileno
 Caldo nutritivo
 Caldo de tioglicolato
 Agar Esosina azul de metileno (EMB)
 Agar nutritivo
 Agar para anaerobiosis
 Agua destilada
 Cultivo de Escherichia coli en medio líquido
 Suspensión de esporas de Aspergillius niger
Procedimiento
1. Siembra en profundidad
Fundamento
Se basa en el empleo de medios especiales cuya finalidad es la de crear una atmósfera de anaerobiosis, el
oxigeno es eliminado por la acción reductora del medio.
En medio líquido
 Prepare 2 tubos de cultivo con un medio reducido de tioglicolato estériles.
 Hierva los tubos con medio en un baño María durante 15 ó 20 minutos, antes de ser inoculados, para eliminar
el oxígeno disuelto.
 Inocule un tubo, una vez atemperado a 42-45ºC y con el asa de siembra, realizando un movimiento en espiral
de arriba a abajo y de abajo a arriba, para distribuir la muestra homogéneamente, sin agitar el tubo durante la
siembra para evitar la entrada de aire. El otro tubo va a ser utilizado como control.
 Solidifique rápidamente los tubos sumergiéndolos en agua fría. Agregue una capa de parafina estéril para
impedir la difusión del O2 al medio.
 Incube los 2 tubos durante 24-48 horas a 35ºC.
 Observe los resultados. Los microorganismos pueden crecer en la parte superior del medio si son
aerobios estrictos, en la zona inferior del medio si son anaerobios estrictos, a lo largo de todo el medio,
en el caso de anaerobios facultativos y anaerobios aerotolerantes y, por último, si se trata de
microorganismos microarófilos aparecerá crecimiento en una pequeña zona intermedia próxima a la
superficie.
44
En placa de Petri
 Transfiera 1 ml del inóculo a una placa de Petri estéril y añade el agar para anaerobiosis fundido y
atemperado a 42-45ºC, homogeneizando mediante giros repetidos de la placa, hasta que el inóculo se haya
distribuido uniformemente.
 Una vez solidificado el agar, añada una segunda capa de medio de cultivo.
 Incube las placas a 35ºC durante 24-48 horas. Al término de la incubación, observe el crecimiento y
morfología de las colonias.
 Siembra en superficie
Utilizando la Jarra Gas-Pak
Fundamento
El sobre GasPak se activa al añadir agua, que pasa por una serie de canales a una mecha de papel de filtro. La
mecha suministra el agua a las tabletas generadoras de gas en la cámara de tabletas. El hidrógeno, generado a
partir de una tableta de borohidruro sódico después de añadir agua, se combina con el oxígeno de la jarra en
presencia del catalizador de paladio para formar agua. Después de la activación, se genera el CO2 a partir de
tableta de bicarbonato de sodio y ácido cítrico. La mecha de filtro de papel en el sobre, demora la introducción
de agua en la cámara de tabletas, lo que permite colocar la tapa en la jarra antes de que se libere un volumen
significativo de gases.
Procedimiento
 Transfiera 1 ml del inóculo a una placas de Petri estéril y añada el
agar para anaerobiosis o agar EMB (eosina azul de metileno)
fundido y atemperado a 42-45ºC, homogeneizando mediante giros
repetidos de la placa, hasta que el inóculo se haya distribuido
uniformemente.
 Coloque el sobre generador de hidrógeno y bióxido de carbono, en
la jarra, para eliminar el O2.
 Verifique el ambiente es anaeróbico, colocando dentro de la jarra,
una tira de papel filtro impregnada del indicador azul de metileno,
que vira de color en presencia de CO2. El indicador es de color azul
cuando se expone al aire y se vuelve incoloro cuando está
totalmente reducido.
 Incube la placa en la jarra de anaerobiosis durante 48 horas y
observe el crecimiento y morfología de las colonias al término de la
incubación.
Utilizando las tapas de Brewer

Fundamento
Se basa en el empleo de medios especiales cuya finalidad es la de
crear una atmósfera de anaerobiosis, el oxigeno es eliminado por la
acción reductora del medio.
Procedimiento
 Inocule una placa de Petri con medio estéril de agar para
anaerobiosis con el microorganismo en estudio.
 Sustituya la tapa de la placa de Petri, por la tapa de Brewer
previamente esterilizada.
 Incube las placas a 35ºC durante 24-48 horas.
 Observe el crecimiento y morfología de las colonias.
45
Conclusiones
Seguridad e higiene
Evaluación
rúbricas diseñadas para cada actividad. Además de la evaluación del siguiente cuestionario:
1. ¿Cómo se clasifican los microorganismos anaerobios con base a sus requerimientos de CO2?
2. ¿Qué tipo de medios de cultivo se requiere para el crecimiento de microorganismos anaerobios?
3. ¿Cómo sustituirías una jarra anaeróbica Jas-Pak en el laboratorio?
4. ¿para qué se utiliza la tira de papel filtro impregnada del colorante azul de metileno?
Bibliografía
Cortes, J. A. 2005. Ensayos Microbiológicos: Manual de Laboratorio. Volumen I y II.2ª. edición. Editorial Reverté.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V. y Clark, D.P.2009. Brock Biología de los microorganismos. 12ª
edición. Editorial Pearson.
46


Clave: AEM-1050
Práctica 10. Recuento de bacterias por la técnica de vertido en placa Duración (h): 4
Competencia general
Determina la cantidad de microorganismos viables presentes en una muestra por la técnica de vertido en placa.
 Cuantifica el número de UFC de bacterias viables mesofílicas utilizando la técnica de vertido en placa.
 Interpreta adecuadamente los resultados de la cuenta en placa.
 Investiga, organiza y transmite información, utilizando las tecnologías de la información y comunicación.
 Manipula adecuadamente los equipos utilizados.
Actitudes y valores
 Respeta el trabajo de los otros y las normas de bioseguridad del laboratorio.
 Se responsabiliza de su trabajo y su propio aprendizaje.
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en una muestra, la cuenta en placa es la
técnica idónea. La técnica consiste en verter el agar sobre la muestra que luego se mezcla en el medio
mediante una agitación suave de la placa. Tras la incubación, algunas colonias quedarán embebidas en el agar y
otras crecerán en la superficie. Esta técnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el
medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno, permiten seleccionar grupos de
bacterias cuya presencia es importante en diferentes muestras. Si se trata de una muestra de alimento, las
bacterias mesofílicas aerobias, son un indicador general de la población que puede estar presente en dicha
muestra, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manipulado el alimento. Este grupo en particular, se
determina en la mayor parte de los alimentos, sin embargo, para algunos alimentos en especial, se requiere
determinar la presencia de bacterias psicrotróficas, psicrofílicas y termofílicas, para predecir la estabilidad del
producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La técnica básica es la misma, pero cambian las
condiciones de incubación, medios de cultivo. Por ejemplo, la temperatura y tiempo de incubación para bacterias
psicrotróficas (20 ± 2ºC, de 3-5 días); psicrofílicas (5 ± 2ºC, de 7-10 días) ; mesófilas (35 ± 2ºC, durante 48 ± 2
h) y termofílicas (55 ± 2ºC, durante 48 ± 2 h).
47
Materiales Equipo
 Asa de siembra  Horno Pasteur de aire caliente
 Placas de Petri estériles  Incubadora con termómetro
M
 Películas Petrifilm 3 para mesófilos aerobios  Balanza analítica
 Difusor o dispersor para las placas Petrifilm  Refrigerador
 Pipetas graduadas de 1,0 ml  Cronómetro
 Dispensadores para pipetas  Planchas agitadoras para placas de Petri
 Micropipetas de 1,0 ml y puntillas estériles  Contador de colonias
 Cubreboca
 Algodón
 Parafilm
 Hilo grueso
 Gasa
 Papel metálico
 Papel estraza
 Piseta
 Agua destilada
 Agar para métodos estándar o Plate count agar
(PCA)
 1 frasco de dilución con tapón de baquelita con 90 ml
de agua peptonada al 1% estéril
 6 tubos de cultivo con 9 ml de agua peptona al
1%estéril.
 Cultivo de bacterias en caldo de infusión de cerebro
y corazón (BHI) de 24 horas
Fundamento
La técnica se basa en contar las unidades formadoras de colonias (UFC) presentes en un g o ml de muestra que
se desarrollan en el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo
que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio, el recuento de las colonias permitirá
conocer el número de células existentes en el cultivo inicial.
Procedimiento
 Realice diluciones de la muestra proporcionada (cultivo directo o primario), utilizando como diluyente agua
peptonada estéril al 1%, como se muestra en la figura que se encuentra en la parte inferior. Tome 1 ml de la
solución problema (cultivo de E. coli) y páselo a un tubo conteniendo 9 ml de agua peptonada estéril. La
-1
dilución obtenida será 1:10 (10 ) respecto del original.
 Homogeneice bien y con otra puntilla estéril, pase 1 ml de este tubo al siguiente. De este modo la dilución
-2
será 1:100 (10 ).
-6
 Repita el mismo procedimiento hasta obtener con el último tubo la dilución 10 .
 Distribuya las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación, la adición de medio de
cultivo y homogenización, se puedan realizar libremente. Marque las cajas en sus tapas con los datos
pertinentes previamente a su inoculación.
 Coloque en cajas Petri por duplicado, 1,0 ml de la primera dilución utilizando para tal propósito una
micropipeta con puntilla estéril. Repita el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera
sembrar, utilizando una puntilla estéril diferente para cada dilución.
 Después de inocular las placas, agregue a éstas de 12 a 15 ml del medio preparado (Plate count agar),
fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C en baño de agua.
48
 Mezcle cuidadosamente mediante seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las
manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrás hacia adelante, sobre una superficie lisa y
nivelada hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la
cubierta de las cajas. O bien, como se muestra en la fotografía de la parte superior, coloque las cajas de Petri
sobre la plancha rotatoria para su homogeneización automática. Deje solidificar.
 Incluya una caja sin inóculo como testigo de esterilidad.
 Incube las cajas en posición invertida a 35 ± 2ºC durante 24-48 ± 2 h.
 Después de la incubación, cuente las placas que se encuentren en el

intervalo de 25 a 250 colonias, usando el contador de colonias.
 Las placas de al menos una de tres diluciones deben estar en el

intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en el intervalo
apropiado, calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha
dilución y reportar.
 Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la
cuenta promedio dada por cada dilución antes de promediar la cuenta de
las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro.
Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en
ensayos donde las placas presenten situaciones no contempladas en los
ejemplos anteriores, se procede a realizar lo siguiente:
o Placas con menos de 25 colonias. Cuando las placas corridas para la menor dilución muestran cuentas
49
de menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes en dicha dilución, promediar el

número de colonias y multiplicar por el factor inverso de dilución, para obtener el valor estimado de
cuenta en placa. Aclarar en su informe esta situación agregando la leyenda “valor estimado”.
o Placas con más de 250 colonias. Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las
colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias.
Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4
ó 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una
caja Petri de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Aclarar en el
informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado".
o Colonias extendidas. Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes formas: 1) Cadenas
de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la desintegración de un
cúmulo de bacterias. Contar cada cadena como colonia individual. 2) Colonias que se desarrollan en
película entre el agar y el fondo de la caja. 3) Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la
caja sobre la superficie del agar. 4) Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones
acompañadas de inhibición del crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represión del
crecimiento que por sí mismo excede el 25% de la superficie de la caja. En caso de que una dilución se
encuentre dentro del rango y otra dilución presente colonias de crecimiento extendido, reportar la
dilución en la que se pueden contar las colonias.
o Placas sin colonias. Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la cuenta
en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja usada.
o Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con más de 250
colonias. Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado más de 250 colonias, contar
ambas placas incluyendo la que está fuera del intervalo para determinar la cuenta en placa.
o Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilución dentro del intervalo de 25 a 250 colonias.
Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el número de colonias especificadas en el
intervalo, contar el número de colonias de las cuatro placas para calcular la cuenta en placa.
 Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por 1/d (inversa de la dilución
utilizada) para obtener el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por ml o g de la muestra.
Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que sólo aparezcan 2 dígitos significativos al inicio de
esta cifra. Cuando el tercer dígito del promedio es 4 o menor, se deja el número de 2 dígitos. Por ejemplo,
-1
si la cuenta en una placa es de 243, se reporta como 24 X 10 ; en caso de que el tercer dígito sea 5 o
superior, el segundo dígito se redondea al siguiente, por ejemplo si la cuenta es de 248, se reporta como
-1 -2
25 x 10 . En caso de que el promedio sea por ejemplo de 179.5 en la dilución 10 , se reporta como 18 x
-3
10 UFC.
 El tamaño de la población se calcula utilizando la siguiente fórmula:
UFC/ ml = N / volumen de inóculo x factor de dilución*. Donde N es el número promedio de colonias
obtenidas para una dilución dada y * inversa de la dilución
Ejemplo:
No. De colonias = 250
-3
Dilución: 10
Volumen de inóculo: 1 ml
UFC/ml = 250x1000/1
UFC/ml = 250,000
 El resultado de la prueba se reporta como: UFC/g o ml de bacterias aerobias en placa, en plate count
agar o agar para cuenta estándar, incubadas a 35 ± 2ºC durante 48 ± 2 h para muestras de alimento;
durante 24 ± 2 h en caso de tratarse de agua o durante 72 ± 2 h en caso de alimentos deshidratados, a la
misma temperatura para todos los casos.
Conclusiones
Seguridad e higiene
50
Evaluación
1. ¿Qué diferencia existe entre los métodos de medición directos y los métodos de medición indirectos?
2. Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, ¿Por qué se reporta la cuenta en placa
como menor que el valor de la dilución más baja usada?
8
3. ¿Si dispone de 6 ml de un cultivo bacteriano con 8,4 x 10 UFC/ml ¿Qué diluciones debería realizar para
contar aproximadamente 40 colonias por placa, si se siembra 0,1 ml de dicha dilución?
5
4. ¿Qué dilución debería realizar para obtener 2 ml de una suspensión de bacterias que contenga 2 x 10 UFC
9
totales, si parte de un cultivo que contiene 2 x 10 UFC/ml?
5. ¿Cuáles ventajas y desventajas presenta el método de vertido en placa?
Bibliografía
Bartha, R. y Atlas, R, 2000. Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental, 1ª. Ed.,Editorial Person.
Fernández-Escartín, Microbiología Sanitaria Agua y Alimentos. Volumen I, 1981, Universidad de Guadalajara.
51


Clave: AEM-1050
Práctica 11. Recuento de bacterias en película Petrifilm Duración (h): 4
Competencia general
Determina la cantidad de bacterias viables presentes en una muestra de alimento por la cuenta de unidades
formadoras de colonias en película Petrifilm.
 Cuantifica el número de UFC de bacterias mesofílicas viables utilizando la técnica alternativa de película
Petrifilm.
 Compara la técnica de vertido en placa y la de la película Petrifilm describiendo sus ventajas y desventajas
para el recuento de bacterias mesofílicas.
Actitudes y valores
 Asume una actitud flexible y de colaboración, adjudicándose responsabilidades en el desarrollo de las
actividades en equipo.
Las pruebas microbiológicas rápidas actualmente desarrolladas ofrecen detección, identificación o enumeración
de microorganismos en tiempos más cortos y llevando a cabo metodologías mucho más sencillas, comparadas
con las tradicionalmente utilizadas. Con este tipo de tecnologías es posible optimizar los recursos disponibles ya
que estas requieren mucho menos material de laboratorio y menos número de personal técnico, lo que da como
resultado mayor productividad.
Algunas pruebas rápidas para indicadores incorporan medios selectivos y agentes diferenciales que permiten
una rápida identificación de los microorganismos . Uno de los métodos rápidos convenientes es el uso de
películas Petrifilm, que consiste en un sistema de doble película con medio de cultivo listo para utilizarse, un
3M
agente gelificante soluble en frío y un indicado. Las películas Petrifilm para recuento de aerobios totales son
un medio de cultivo listo para ser empleado, que contiene nutrientes del agar métodos estándar, un agente
gelificante soluble en agua fría y un tinte indicador (cloruro de trifenil tetrazolio-TTC) que facilita la enumeración
de las colonias.
52
Materiales Equipo
M
 Películas Petrifilm 3 para mesófilos aerobios  Autoclave
 Difusor o dispersor para las películas Petrifilm  Horno Pasteur de aire caliente
 Micropipetas y puntillas de 1,0 ml estériles  Balanza analítica
 5 tubos de cultivo con 9 ml de agua peptona estéril al  Refrigerador
1%.  Contador de colonias
 Cubreboca
 Piseta
 Cultivo de bacterias en caldo de infusión de cerebro
y corazón (BHI) de 24 horas.
Fundamento
La enzima deshidrogenasa que se encuentra en la membrana de las bacterias, se asocia al cloruro de trifenil
tetrazolio y los iones H se liberan reduciendo al TTC a formazan coloreando la colonia en rojo.
Procedimiento
 Seguir las reglas de asepsia y seguridad establecidas para el trabajo de laboratorio.
-1
 A partir de un cultivo de bacterias en caldo de infusión de cerebro corazón (BHI), realice diluciones desde 10
-5
hasta 10 en tubos de cultivo con 9 ml de agua peptona estéril al 1%.
 Rotule las películas Petrifilm con la identificación de la muestra y la dilución correspondiente.
 Coloque la película Petrifilm para el recuento de microorganismos aerobios mesófilos en una superficie plana.
 Levante la lámina supertransparente superior y con la micropipeta con una puntilla estéril, perpendicular a la
placa Petrifilm, coloque 1 ml de la dilución decimal apropiada en el centro de la película cuadriculada interior.
 Libere cuidadosamente la película superior dejando que caiga sobre la dilución, evitando la formación de
burbujas de aire. No la deslice hacia abajo.
 Coloque el dispersor o esparcidor sobre la película de arriba con la cara lisa hacia arriba, en el centro de la
placa, cubriendo totalmente la muestra.
 Presione suavemente en el centro del dispersor para distribuir la muestra uniformemente en el área circular.
No gire ni deslice el dispersor. Distribuir la muestra o inóculo por toda el área de crecimiento del Petrifilm,
antes de que se forme el gel.
 Levante el dispersor y espere al menos 1 minuto para permitir que solidifique el gel.
53
 Inocule una o dos placas por cada dilución existente.

 Incube las placas en posición horizontal, cara arriba, en grupos o pilas de no más de 20, a una temperatura
de 35ºC por 48 horas. Puede ser necesario humectar el ambiente de la incubadora con un pequeño recipiente
con agua estéril, para minimizar la pérdida de humedad.
 Seleccione las placas que presenten un rango de conteo entre 30 – 300 colonias.
 Contabilice todas las colonias rojas de borde regular, independientemente del tamaño o intensidad en el
color. Las Placas Petrifilm pueden ser contadas en un contador de colonias estándar.
2
 El área de crecimiento circular del Petrifilm es aproximadamente de 20cm . Pueden realizarse estimaciones
en placas que contengan más de 300 colonias contando el número de colonias en uno más cuadros
representativos y obteniendo el promedio. Multiplicar el número de colonias obtenido por 20 para obtener el
recuento total por placa.
 Altas concentraciones de colonias en las placas, ocasionará que toda el área de crecimiento se vuelva roja o
rosada. Ocasionalmente, en placas demasiado cargadas, el centro de la placa puede carecer de colonias
visibles, pero pueden apreciarse muchas colonias pequeñas en los bordes. Cuando esto ocurre, diluir más la
muestra para obtener un recuento más preciso.
 Algunos organismos pueden licuar el gel, pudiéndose producir una difusión que oculte la presencia de otras
colonias. Si la licuación del gel interfiere con el recuento, debe realizarse un recuento estimado contando las
áreas no afectadas. la licuefacción generalmente se presenta de manera tardía.
 Tras la incubación, las placas pueden conservarse para recuentos posteriores, en congelación a
temperaturas bajo o igual a los -15ºC por un máximo de una semana, para efectuar el conteo. Esto es sólo
para casos de emergencia, no se debe establecer como procedimiento rutinario.
 En caso de realizar diluciones en duplicado, se deben promediar el número de colonias encontradas en
ambas placas de la misma dilución y multiplicar por el inverso de la dilución. En caso de realizar sólo una
placa en diluciones consecutivas, registrar el número de colonias de cada dilución, multiplicar por el inverso
de la dilución y luego determinar el promedio del recuento bacteriano entre ambas diluciones.
 Los recuentos se informarán con 2 dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una unidad al segundo dígito
si éste es impar y mantener el segundo dígito si éste es par. Usar ceros para los demás dígitos hacia la
derecha. Se informará como UFC/g.
 En el caso de valores obtenidos sobre o bajo el rango deben ser informados como “Recuento estimado en
placa”. En caso de recuentos incontables se informará como “Muy numeroso para contar” y en caso de no
obtener desarrollo en las placas se debe informar de acuerdo al límite de detección de la técnica: <10 UFC/g
-1
o ml en muestras en dilución 10 .
54
Conclusiones
Seguridad e higiene
 Tanto los residuos como los desechos biológicos reciben el tratamiento adecuado para evitar contaminación. y
equipo utilizado.
Evaluación
1. Compare y describa ¿Cuáles ventajas y desventajas presenta el método de vertido en placa y el método
de las placas Petrifilm para el recuento de bacterias mesofílicas?
Bibliografía
Bartha, R. y Atlas, R, 2000. Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental, 1ª. Ed.,Editorial Person.
Fernández-Escartín, Microbiología Sanitaria Agua y Alimentos. Volumen I, 1981, Universidad de Guadalajara.
55


Clave: AEM-1050
Práctica 12. Recuento de coliformes y Escherichia coli en Duración (h): 4
muestras de agua por el método de filtración por membrana
Competencia general
Evalúa la calidad microbiológica de muestras de agua mediante la búsqueda de coliformes y E. coli utilizando el
método de filtración por membrana.
 Realiza el recuento de unidades formadoras de colonias de organismos coliformes y E. coli y los distingue
 Organiza los datos obtenidos e interpreta los resultados.
 Determina si el agua analizada reúne y cumple con lo establecido en la normatividad vigente.
Actitudes y valores
 Es perseverante en el logro de los resultados deseados y objetivo con los obtenidos.
Las Guías para la calidad del agua potable de la Organización Mundial de la Salud, indican que no es práctico
monitorear los agentes patógenos presentes en el agua y que lo mejor es detectar organismos indicadores, que
alerten del riesgo de contaminación fecal. Un buen indicador debe ser capaz de evaluar la probabilidad de que
existan patógenos en el agua. La OMS establece dos tipos de indicadores microbiológicos: 1) el grupo coliforme,
conformado por coliformes termotolerantes (coliformes fecales) y Escherichia coli, y los coliformes totales y 2) el
recuento total de bacterias heterotróficas en placa.
De igual manera, la normatividad nacional para la calidad microbiológica del agua para uso y consumo humano,
representada por la NOM-127-SSA1-1994. Salud ambiental, agua para uso y consumo humano. Límites
permisibles de la calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización; así como por
la NOM-201-SSA1-2002, Productos y servicios. Agua y hielo para consumo humano, envasados y a granel.
Especificaciones sanitarias, determinan que para evaluar la calidad microbiológica del agua, es necesario la
determinación de coliformes como microorganismos indicadores de la calidad del agua.
Materiales Equipo
 Membranas de filtración 0.45 µm de Ǿ de poro  Autoclave
 Placas de Petri de 60 mm para Millipore estériles  Incubadora con termómetro
 Probeta de 100 ml  Balanza analítica
 Frascos de dilución de 150 ml  Refrigerador
 Mcropipetas con puntillas estériles de 10 y 1ml  Baño María
 Pipetas graduadas de 1,0 ml  Equipo Millipore para filtración completo (estéril)
 Matraz Erlenmeyer de 250 ml  Cronómetro
 Cubreboca
 Algodón
56
 Gasa
 Papel metálico
 Piseta con agua destilada
 Etanol de 96º
 Solución de fenol al 5%, o benzal al 10%
 100 ml de solución salina isotónica estéril
 Chromagar ECC
 Muestras de agua
Fundamento
El método se basa en la filtración de una muestra para concentrar células viables sobre la superficie de una
membrana microporosa, en cuya superficie quedan retenidas las células y transferirlas a un medio de cultivo
apropiado para posteriormente contar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) desarrolladas
después de la incubación.
Procedimiento
 Siga los procedimientos de asepsia y seguridad definidos en prácticas anteriores.
 Consulte y siga el procedimiento establecido en la NOM-110-SSA1-1994. Preparación y dilución de muestras
para su análisis microbiológico.
Filtración de la muestra
 En condiciones de asepsia, monte el equipo Millipore y conectarlo al sistema de vacío.
 Utilizando las pinzas Millipore previamente flameadas con alcohol y enfriadas, coloque la membrana Millipore
(cuadriculado hacia arriba) sobre el portafiltro poroso. Cuidadosamente coloque el embudo sobre el
receptáculo y asegúrelo en su lugar con la pinza adaptadora. Mantenga el vacío cerrado.
 Agite suavemente el frasco que contiene los 100 ml de la muestra de agua en el embudo del equipo Millipore,
bajo vacío parcial, con el filtro aún en su lugar, enjuague el embudo mediante la filtración de tres porciones de
20 a 30 mL de solución buffer estéril. Una vez complementado el enjuague final y que el proceso de filtración
haya concluido, cierre el vacío.
 Retire el embudo e inmediatamente después retire la membrana tomándola con las pinzas Millipore,
previamente flameadas con alcohol y enfriadas y colóquela sobre el medio selectivo cromogénico
(CHROMagar™ ECC) con un movimiento circular a fin de evitar la entrada de aire, asegurando el contacto de
la membrana con el medio y sin dejar burbujas de aire.
57
 Incube durante 24 ± 2 horas a 35 ± 0,5ºC.

 Recomendaciones
 Incluya un control de 100 mL de solución buffer estéril cada 10 muestras para estudiar una posible
contaminación cruzada o buffer contaminado. Incube el control bajo las mismas condiciones de la muestra.
 Use unidades de filtración estériles al principio de cada serie de filtraciones, como precaución mínima para
prevenir contaminación accidental. Una serie de filtraciones se considera cuando hay un intervalo de
interrupción de 30 minutos o más entre cada filtración de muestras. Después de tales interrupciones, trate
cualquier muestra como una serie de filtración y esterilice toda la unidad de filtración en uso. Descontamine
este equipo entre filtraciones sucesivas, ya sea por medio de luz ultravioleta (UV) o esterilizando
apropiadamente en autoclave de acuerdo con las características del equipo.
Conteo
 Para determinar la cuenta de colonias sobre el filtro de membrana, use el contador de colonias.
 Las colonias típicas de coliformes totales presentan un color rojo en tanto que E. coli un color azul.
Cálculos
Calcule el número de UFC /100 mL de muestra usando filtros de membrana con 20 a 80 colonias de coliformes y
no más de 200 colonias para cualquier tipo de colonia según la siguiente ecuación:
Consulte Modificación a la Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994 y la NOM-201-SSA1-2002, que

señalan los límites permitidos de bacterias coliformes y confirmar si el agua analizada cumple con los límites
permisibles establecidos.
Conclusiones
Seguridad e higiene
58
Evaluación
curso.
para tal fin, además de la respuesta y justificación a la siguiente pregunta: del siguiente cuestionario:
¿Qué ventajas y desventajas encuentras al utilizar esta técnica respecto a otras técnicas? Fundamenta tu
respuesta.
Bibliografía
Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) “Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as Quality and
Safety Indicators”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed.
Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington.
Secretaria de Salud. NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994. Preparación y dilución de muestras para
su análisis microbiológico.
Secretaria de Salud. NORMA Oficial Mexicana NOM-244-SSA1-2008. Equipo y sustancias germicidas para
Tratamiento doméstico de agua. Requisitos sanitarios. Apéndice Informativo B. Determinación de bacterias
coliformes totales y coliformes fecales-método de filtración por membrana.
Secretaria de Salud. NORMA Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002, Productos y servicios. Agua y hielo para
consumo humano, envasados y a granel. Especificaciones sanitarias.
Secretaria de Salud. Modificación a la NORMA Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994. Salud ambiental,
agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe
someterse el agua para su potabilización.
59


Clave: AEM-1050
Práctica 13. Determinación de bacterias coliformes totales, Duración (h): 4
coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica del NMP
Competencia general
Investiga la presencia de bacterias del grupo coliforme en muestras de agua y alimento utilizando la técnica del
NMP.
 Investiga la presencia de bacterias coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli en agua de
consumo humano y alimentos, mediante la técnica del Número Más Probable (NMP).
 Diferencia los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales, mediante la
realización de las pruebas presuntivas y confirmativas.
 Organiza los datos obtenidos e interpreta los resultados.
Actitudes y valores
 Es perseverante en el logro de los resultados deseados y objetivo con los obtenidos.
Dentro del llamado "grupo coliforme" se incluyen bacilos gramnegativos, aerobios o anaerobios facultativos, no
esporulados, capaces de fermentar la lactosa con producción de gas y ácido en 48 horas a 35ºC, en medios de
cultivo sólidos o líquidos y producen colonias negras con brillo metálico en agar Endo. El grupo coliforme para su
estudio, se subdivide en dos grupos: el grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende a todos los
bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con
producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros
principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, está
constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h de
incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo una de las especias
más importante es Escherichia coli,
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia
Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), E. coli reacciona negativamente a la tinción de Gram, es anaerobio
facultativo, móvil por flagelos peritricos), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su
prueba de IMVIC es ++--. E. coli es huésped normal del trato intestinal del ser humano y los animales de sangre
caliente, por lo cual se encuentra en grandes cantidades en las heces y el estiércol. Sin embargo, existen
algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas y se clasifican con base en las
características que presentan sus factores de virulencia únicos, cada grupo provoca enfermedad mediante un
mecanismo diferente. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli
enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Las 4
primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados.
Una técnica muy utilizada para el recuento de coliformes en agua y alimentos es el Número Más Probable
(NMP), el cual se basa en primera instancia, en una selección de los microorganismos que producen ácido y gas
en lactosa a 35ºC. Por ello, el primer paso es la siembra en tubos de algún caldo lactosado, con o sin inhibidores,
con tubo de fermentación, seguido por una confirmación en un medio líquido selectivo y una determinación de los
coliformes fecales cuya diferenciación se realiza en base al hecho de que puedan fermentar la lactosa a 44,5ºC
60
con producción de gas. La técnica del número más probable (NMP), es un método estadístico basado en la
teoría de las probabilidades de Poissson; proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana
presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor
el volumen de muestra inoculado. El método del NMP es una estrategia eficiente de estimación de densidades
poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. Este
método es utilizado en forma rutinaria para la determinación de bacterias coliformes en agua y alimentos,
utilizando tablas estadísticas que permiten estimar la población bacteriana. La determinación por el NMP
considera únicamente microorganismos viables y es particularmente útil para bajas concentraciones de
microorganismos (<10 /g o ml), especialmente en leche y agua, y preferentemente para las muestras en las que
existen dificultades en el conteo de colonias en placa.
Materiales Equipo
 Asa de siembra  Cámara fotográfica
 Bolsas estériles para Stomacher  Gabinete de bioseguridad
 Placas de Petri estériles  Horno Pasteur de aire caliente
 Mcropipetas con puntillas estériles de 10 y 1ml  Balanza analítica
 Pipetas graduadas de 1,0 ml  Refrigerador
 Frascos de dilución de 150 ml  Baño María
 Tubos de cultivo  Stomacher (homogeneizador peristáltico)
 Tubos de Durham  Cronómetro
 Cubreboca
 Algodón
 Gasa
 Papel metálico
 Solución de fenol al 5%, o benzal al 10%
 Reactivos para la tinción de Gram
 Reactivo de Kovac
 Caldo lactosado de concentración sencilla
 Caldo lactosado de concentración doble
 Caldo lactosa verde brillante bilis
 Caldo lauril sulfato triptosa
 Caldo de Mackenzie
 Caldo EC (Eijkman)
 Muestras de agua y alimentos
Fundamento
La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (positivo o negativo) en replicas de diluciones
consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en la muestra, las bacterias coliformes
totales fermentan la lactosa con producción de ácido y gas, incubadas a 35  0.5C durante 24 a 48 horas, y las
bacterias coliformes fecales y E. coli fermentan la lactosa con producción de ácido y gas incubadas a 44.5ºC 
2C durante 24 h. La producción de gas se manifiesta en las campanas de fermentación de Durham.
Procedimiento
 Siga los procedimientos de asepsia y seguridad definidos en prácticas anteriores.
1. Determinación de coliformes totales
a) Muestras de agua y hielo
 Para el análisis de agua se emplea la serie de 5 tubos inoculados (5 tubos con 10 ml, 5 tubos con 1 ml y 5
tubos con 0,1 ml)
 Prueba presuntiva: Agite la muestra de agua y transfiera micropipeta y puntilla estéril, volúmenes de 10 ml de
61
muestra a cada uno de los 5 tubos con 20 ml de caldo lactosado de mayor concentración y provistos con
tubos de Durham invertidos, y 1,0 ml y 0,1 ml de muestra cada uno de los tubos de las series de 5
respectivamente con 10 ml de caldo lactosado de concentración sencilla. En el caso del análisis de agua
potable, agua purificada y hielo, puede utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa con púrpura de
bromocresol (concentración 0,01 g/l de medio), como alternativa al uso de campanas de fermentación.
 Incube los tubos a 35  2C. Examine a las 24  2h la formación de gas, si no se observa la formación de gas,
incube hasta las 48  2h.
 Observe los resultados. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo, en caso
de que haya utilizado el caldo lauril sulfato y si utilizó el caldo lactosado, los tubos positivos presentan
fermentación evidenciada por la formación de gas.
 Prueba confirmativa: De cada tubo que muestre formación de gas, tome una asada y siembre en un número
igual de tubos provistos con tubos de Durham invertidos, con medio de confirmación, caldo lactosa lauril bilis
verde brillante.
 Incube los tubos a 35  2C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este tiempo, incube
hasta las 48 ± 2 horas y observe si hay turbidez y formación de gas. La presencia de gas, en cualquier
cantidad, dentro del tiempo de incubación requerido, hace positiva la prueba.
 Consulte la tabla del NMP para conocer el NMP de coliformes totales/100 ml de muestra.
Tabla no. 1. Índices de NMP y límites de confianza de 95 % para variar combinaciones de resultados positivos y negativos, cuando se utilizan
5 tubos con 10 ml de muestra
Nº de tubos positivos Índice NMP/100ml Límite de confianza de 95 %
Inferior Superior
0  2,2 0 6
1 2,2 0,1 12,6
2 5,1 0,5 19,2
3 9,2 1,6 29,4
4 16 3,3 52,9
5  16 8 infinito
62
b) Muestras de alimentos
 Para el análisis de alimentos se considera una combinación de tres tubos por cada dilución.
 Prueba presuntiva: tome 90 ml de agua peptonada estéril y deposítelos en una bolsa estéril para Stomacker,
agregue 10 g de la muestra de alimento y homogenice en el Stomacker.
 Tome 3 tubos de cultivo provistos con tubos de Durham invertidos, con 10 ml de caldo lauril sulfato triptosa.
Use una micropipeta con puntilla estéril para transferir 1,0 ml de muestra a cada uno de estos tubos y mezcle
suavemente el inóculo con el medio. Para las diluciones subsecuentes, realice el mismo procedimiento,
utilizando una puntilla estéril diferente para cada dilución.
 Incube los tubos a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas y observe si hay formación de gas, en caso contrario,
prolongue la incubación hasta las 48 ± 2 horas. La presencia de gas, en cualquier cantidad, dentro del tiempo
de incubación hace positiva la prueba.
 Prueba confirmativa: Agite suavemente los tubos de caldo lauril sulfato triptosa que resultaron positivos en la
prueba presuntiva. Transfiera de 2 a 3 asadas de cada tubo a un número igual de tubos con caldo lactosa
verde brillante bilis provistos con tubos de Durham invertidos. Al efectuar la reinoculación, sostenga el tubo
primario (lauril sulfato triptosa) en ángulo tal que se pueda tomar la asada evitando la película que existiera en
el medio. Saque el asa del líquido en sentido perpendicular a su superficie de manera que se forme un
menisco bien definido.
 Incube los tubos con caldo lactosa verde brillante bilis a 35  1,0C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas
no se observa en este tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas y observar si hay formación de gas.
La presencia de gas, en cualquier cantidad, dentro del tiempo de incubación requerido, hace positiva la
prueba de coliformes totales.
 Consulte la tabla del NMP para conocer el NMP de coliformes totales /g o ml de muestra.
Cálculos
 Tome la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de incubación
requerido y buscar el NMP en la tabla correspondiente.
 Cuando sólo una dilución muestra tres tubos positivos, elija ésta y las diluciones mayores posteriores.
Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de tres, elija esta última y las
dos diluciones anteriores más bajas. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y éstos se
encuentran en más de tres diluciones, seleccione las dos diluciones mayores positivas y la siguiente. Cuando
los tubos positivos sólo se encuentran en la muestra sin diluir (10,0 ml o 1,0 g) y en la primera dilución (1,0 ml
o 10-1 g), seleccione las tres primeras diluciones para el cálculo del número más probable.
 En cada caso se obtiene un número de tres cifras, según corresponda. En la columna de la tabla del NMP que
indica el número de tubos positivos se busca el índice del NMP. Para calcular el NMP de organismos
coliformes/100 ml de muestra se utiliza la siguiente fórmula: NMP/ml = NMP de la tabla x factor de dilución
intermedia/100.
63
Tabla 2. Índices de NMP y límites de confianza de 95 % para variar combinaciones de resultados positivos y negativos, cuando se utilizan 3
tubos con 10 ml, 3 con 1,0 ml y 3 con 0,1 ml de la muestra
NO. DE TUBOS POSITIVOS LÍMITES DE CONFIANZA (95%)

3 3 3 NMP/100 ML
(10ml) (1 ml) (0,1 ml) Mínimo Máximo
0 0 1 3 0.5 9
0 1 0 3 0.5 13
1 0 0 4 0.5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 3 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
2. Determinación de coliformes fecales
 Utilice los tubos, gas positivos del caldo lactosa verde brillante bilis procedentes del recuento de bacterias
coliformes totales.
 Transfiera de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo, a un número igual de tubos con caldo EC (Eijkman)
provistos de tubos de Durham invertidos. Alternativamente trasfiera de 2 a 3 asadas a tubos con caldo lactosa
verde brillante bilis y agua peptonada (Mackenzie).
 Incube los tubos a 44,5 ºC ± 0,2 ºC en baño de agua por 24 2 horas y observe la formación de gas. Si la
formación de gas no se observa en este tiempo, prolongue la incubación hasta las 48 ± 2 horas. Los tubos
que presenten gas son positivos ya que a esta temperatura solo el bacilo coli fecal produce ácido y gas.
 Adicione a los tubos con agua peptonada, de 0,2 – 0,3 ml del reactivo de Kovac, agite los tubos y déjelos en
reposo durante10 minutos. La prueba positiva de producción de indol se manifiesta por una coloración rojo
oscura, en la prueba negativa se conserva el color original del reactivo. Los cultivos gas positivos en caldo EC
a 44,5 ºC ± 0,5 ºC, y que produzcan indol en caldo peptona, pueden considerarse como positivos de
coliformes fecales.
 Consulte la tabla del NMP para conocer el NMP de coliformes de coliformes fecales /100 ml en caso de
muestras de agua, o bien, el NMP de coliformes fecales /g o ml de muestra en caso de muestras de
alimentos, confirmados a partir del número de tubos positivos en caldo EC.
 Realice el control de calidad para coliformes fecales, inoculando en tubos de caldo EC una cepa de E. coli
como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar junto con las
muestras.
64
3. Prueba confirmativa para Escherichia coli

 Tome una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y siembre por estría cruzada en agar
eosina azul de metileno para su aislamiento.
 Incube las placas invertidas a 35°C por 18-24 h.
 Seleccione 2 colonias de cada placa, que presenten centro negro, planas con o sin brillo metálico.
 Si no hay colonias con morfología típica, pruebe una o más colonias lo más parecido a E. coli, de cada placa
y siembre en agar cuenta estándar para realizar las pruebas de morfología microscópica y pruebas
bioquímicas.
 Incube las placas a 35°C por 18-24 h.
 Haga un frotis y realice la tinción de Gram. Observe al microscopio la presencia de bacilos cortos o
cocobacilos Gram-negativos.
Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC).

 A partir de las cajas de agar cuenta estándar, seleccione una colonia, resuspenda ésta en 2 ml de solución
salina isotonica estéril para realizar las siguientes pruebas bioquimicas:
o Producción de indol: Tome una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo con caldo tristona
o un tubo con medio SIM (inocular por picadura en forma recta) incube a 35°C por 24 ± 2 h. Finalizada
la incubación, adicione entre 0.2 y 0.3 ml de reactivo de Kovacs, la presencia de una
coloración roja en la superficie del tubo se considera como prueba positiva para la presencia de
indol.
o Producción de ácidos mixtos (prueba de rojo de metilo): Tome una asada de la suspensión
bacteriana e inocule un tubo que contenga caldo RM-VP, incube a 35°C por 48 ± 2 h. Adicione 5
gotas de solución de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un
color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa.
o Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer): Tome una asada de la suspensión
bacteriana e inocule un tubo que contenga caldo RM-VP, incube a 35°C por 48 ± 2 h. Adicione 0.6
ml de solución KOH 40% , agite y 0.2 ml de solución alfa- naftol y agite. Deje reposar el tubo
destapado durante 10 minutos; se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color
rosa en la superficie.
o Utilización del citrato: Tome una asada de la suspensión bacteriana e inocule un tubo que contenga
caldo citrato de Koser o agar citrato de Simmons. Incube a 35°C por 96 h. El desarrollo del cultivo que
se observa con la turbiedad en el caldo citrato de Koser o el vire de color verde a azul en el citrato de
Simmons, se considera una prueba positiva.
Conclusiones
65
Seguridad e higiene
Evaluación
curso.
1. ¿Cómo define al grupo de los coliformes?
2. ¿Qué diferencia existe entre los coliformes totales y los coliformes fecales?
3. ¿Cuáles son los puntos críticos para realizar las técnicas del NMP?
4. ¿Cuáles fueron las dificultades al realizar la lectura mediante esta técnica?
5. ¿Qué ventajas y desventajas presenta la técnica del NMP?
Bibliografía
Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) “Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as Quality and
Safety Indicators”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed.
Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington.
Secretaria de Salud. NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinación de
bacterias coliformes. Técnica del número más probable.
Secretaria de Salud. NORMA Oficial Mexicana NOM-145-SSA1-1995. Productos cárnicos troceados y curados.
Productos cárnicos curados y madurados. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Apéndice normativo B.
De la estimación de la densidad microbiana por la técnica de número más probable.
66


Clave: AEM-1050
Práctica 14. Pruebas bioquímicas y técnicas rápidas para la Duración (h): 4
caracterización de enterobacterias
Competencia general
Caracteriza una enterobacteria mediante el uso de técnicas convencionales y técnicas rápidas.
 Investiga actividades metabólicas de las enterobacterias, mediante el uso de medios de cultivo con sustratos
específicos.
 Relaciona los productos del metabolismo con las diferentes especies enterobacterianas.
 Contrasta las ventajas y desventajas del empleo de las pruebas bioquímicas convencionales con el sistema
API 20E para determinar la fisiología bacteriana.
y la organiza de forma oral y escrita utilizando las tecnologías de información y comunicación.
 Identifica, planea y resuelve problemas.
Actitudes y valores
La sencilla estructura bacteriana no permite realizar identificaciones basándose solo en caracteres fenotípicos
fácilmente observables, sino que tiene que basarse en atributos funcionales. La mayoría de las bacterias
solo se pueden identificar mediante sus actividades metabólicas y no sólo por el aspecto morfológico, lo que
conlleva a recurrir a la inoculación de la bacteria a identificar, en diferentes medios de cultivo con el propósito de
evidenciar algunas características metabólicas. La familia Enterobacteriaceae está representada por bacterias
mesófilas, Gramnegativas, no esporuladas, con forma de cocos o bacilos, incluidas en 34 géneros y más de 100
especies. Son citocromo oxidasa negativos (excepto el género Plesiomonas); reducen los nitratos a nitritos,
algunos son móviles mediante flagelos perítricos. Anaerobios facultativos que fermentan la glucosa y lactosa en
condiciones anaeróbicas, con o sin producción de gas, y oxidan una gran variedad de sustratos en condiciones
aeróbicas. Son quimioheterótrofos, requieren compuestos simples de carbono y nitrógeno para su crecimiento,
algunas especies requieren de aminoácidos y vitaminas. Algunas enterobacterias residen en el tracto intestinal de
animales y humanos, como los coliformes, mientras que otras viven en la tierra y en el agua. Algunos de los
géneros más representativos se encuentra: Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Klebsiella, Serratia,
Proteus, Erwinia, Edwardsiella, Citrobacter, Enterobacter, Morganella, Providencia, Hafnia, entre otros. Las
bacterias de la familia Enterobacteriaceae no puede clasificarse sobre la base de la tinción de Gram, puesto que
todas presentan las mismas formas y afinidad tintoreal. Las pruebas bioquímicas se emplean para identificar de
forma clara y precisa, la presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas o de una vía metabólica
completa (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y
que la bacteria al crecer transforma o no.
Existen también, algunas técnicas rápidas que utilizan modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales,
ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos
con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación
de resultados. Uno de los sistemas comerciales más comúnmente usados es la galerìa API 20E, sistema
estandarizado que permite la identificación de bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otros bacilos
Gramnegativos no exigentes. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos
deshidratados, cada tubo es una prueba bioquímica distinta. Los microtubos se inoculas con una suspensión de
microorganismos en agua o solución salina para rehidratar los medios. Las tiras se incuban a 37ºC durante 18-24
horas y por efecto del metabolismo bacteriano se van a producir cambios de colores espontáneos o bien, al
67
añadir reactivos. La lectura de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura y en base
a ello se identifica la bacteria en cuestión..
Materiales Equipo
 Cronómetro  Gabinete de boseguridad
 Mecheros Fisher  Refrigerador
 Asa de siembra  Vortex
 Tubos de cultivo  Horno Pasteur o estufa de aire caliente
 Gradilla para tubos  Incubadora con termómetro
 Espátulas  Baño María
 Probeta de 100 ml  Autoclave
 Piseta con agua destilada  Planchas agitadoras para placas de Petri
 Cubreboca  Microscopio óptico
 Guantes de asbesto  Balanza analítica
 Algodón
 Papel filtro
 Reactivos para la tinción de Gram
 Caldo triptona
 Caldo Rojo de metilo-Voges Proskauer (RM-VP)
 Caldo urea
 Agar citrato de Simmons
 Agar SIM
 Agar Kligler
 Agar leche descremada
 Solución de azul de metileno
 Solución de rojo de metilo
 Solución de NaCl al 0,5%
 Solución de alfa-naftol al 5%
 Solución de KOH al 40%
 Peróxido de hidrógeno al 3%
 Reactivo de Kovacs
 100 ml de aceite mineral estéril
 Sistema API 20E para enterobacterias
 Material biológico: cultivos bacterianos puros en
solución salina isotónica estéril.
Procedimiento
1. Pruebas bioquímicas IMViC (Indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer y citrato)
1.1. Investigación de la producción de indol
Mediante esta prueba se detecta la capacidad del microorganismo de producir indol a partir de la degradación del
aminoácido triptófano mediante la enzima triptofanasa. Sirve para diferenciar distintas especies del género
Edwarsiella y Escherichia y de especies de los géneros Salmonella, Klebsiella y Enterobacter.
Fundamento
Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de
indol, ácido pirúvico y amoníaco al agregar el reactivo de Kovacs. La prueba de indol está basada en la
formación de un anillo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del para-dimetilaminobenzaldehído
que es el principio activo del reactivo de Kovacs.
Procedimiento
 Con el cultivo de 24 horas de la bacteria problema, proceda a inocular un tubo con solución salina isotónica
estéril (SSIE), hasta obtener una suspensión de bacterias ligeramente turbia, a partir de la cual realizará las
inoculaciones de todos los medios de cultivo.
68
 Prepare dos tubos con caldo triptona con NaCl al 0,5%. Inocule
mediante asada, un tubo con caldo triptona con NaCl al 0,5%
(la triptona presenta abundante triptófano). Utilice el otro tubo
como control para comparar coloración (no se inocula)
 Incube los dos tubos a 35ºC durante 24 horas
 Al finalizar la incubación, añada, por la pared del tubo inoculado,
5 gotas del reactivo de Kovacs.
 Observe los cambios. Si la bacteria posee la enzima
triptofanasa, se producirá un anillo de color rojo fucsia en la
interfase del reactivo y el caldo segundos después de añadir el
reactivo de Kovacs, indicando una prueba positiva. Si el anillo es
amarillo, la prueba es negativa (ausencia de indol en medio de
cultivo).
1.2. Investigación de la producción de acetil metil carbinol (Voges-Proskauer) y ácidos (rojo de metilo)
Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de
enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por
la fermentación de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentación ácido-mixta y la
fermentación del 2,3 butanodiol. Con estas dos pruebas se estudia qué tipo de fermentación (butilenglicólica o
ácido mixta) realiza el microorganismo en estudio. En la fermentación ácido-mixta se forman fundamentalmente
láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2; mientras que en la vía del butanodiol se forman
cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y
CO2. La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad de algunos organismos de producir un
producto final neutro, el acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la fermentación (butilenglicólica) de la
glucosa. Esta prueba permite diferenciar Klebsiella pneumoniae y Enterobacter (+) de Escherichia coli y otras
especies de Klebsiella (-). La prueba del rojo de metilo sirve para comprobar la capacidad de un organismo de
producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación (ácido- mixta) de la glucosa.
Esta prueba permite diferenciar Escherichia coli (+) de distintas especies pertenecientes a los géneros
Enterobacter y Klebsiella (-).La acetoína es un metabolito intermediario para llegar hasta 2,3-butilenglicol. Es
decir que se espera que las bacterias que son MR (+) sean VP (-) y viceversa.
Fundamento
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que pone de
manifiesto la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido-mixta. El acetil-metil-carbinol (acetoína) es un
producto intermediario en la producción de butanodiol, en medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína
es oxidada a diacetilo, éste se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo- fucsia.
Procedimiento
 Prepare dos tubos con caldo RM-VP
 Inocule mediante asada, un tubo con caldo RM-VP. Utilice el otro tubo como control (no se inocula)
 Incube los dos tubos a 37°C durante 24-48 horas.
 Finalizado el tiempo de incubación, transfiera 1 ml del caldo a un tubo limpio para realizar la prueba de
Voges-Proskauer (VP)
 En el caldo restante revele rojo de metilo (RM), agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo.
 Para revelar Voges-Proskauer (VP) agregue 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agite
cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y déjelo reposar durante 10 a 15 minutos.
 Observe los cambios en ambos tubos de cultivo.
 Voges-Proskauer
o Prueba positiva: color rojo-fucsia a rosado en la superficie del medio, indica la presencia de
diacetilo, producto de oxidación de la acetoína.
o Prueba negativa: sin cambio de color (color amarillo en la superficie del medio
 Rojo de metilo
o Prueba positiva: el cultivo es lo suficientemente ácido como para permitir que el reactivo
rojo de metilo un color ojo definido (pH=4,4) en la superficie del medio, lo que indica que la
bacteria fermentó la glucosa por la vía ácido-mixta.
o Prueba negativa: color marillo (pH=6) en la superficie del medio.
69
1.3. Utilización del citrato

Esta prueba se usa para determinar la capacidad del microorganismo para
utilizar citrato como única fuente de carbono. Permite diferenciar especies de
Salmonella, Klebsiella y Enterobacter (+) de Escherichia coli y especies de
Edwarsiella, Yersinia, Actinobacillus (-).
Fundamento
Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este
medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato
(ácido), generará una fuerte alcalinización del medio que será aparente por un
cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.
Procedimiento
 Prepare dos tubos inclinados de agar citrato de Simons (contiene citrato de
sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno
respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH)
 Inocule la superficie del agar citrato de Simons con una sola estría en el pico. Utilice el otro tubo como control
para comparar coloración (no se inocula)
 Incube los dos tubos a 37°C durante 24 horas. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo
de la estría, acompañado de un viraje del indicador al azul. Escherichia coli (-)
2. Otras pruebas bioquímicas

2.1. SIM (sulfuro- indol- motilidad)
Este medio de cultivo semisólido permite analizar la capacidad de algunas bacterias de producir sulfuro de
hierro, de hidrolizar el triptófano con producción de indol y la capacidad de movimiento del microorganismo en
estudio. En general, las bacterias móviles son bacilos flagelados (especies de Bacillus, Enterobacter y Vibrio), sin
embargo, algunas formas de cocos son también móviles.
Fundamento
El tiosulfato que contiene el medio como fuente de azufre, es reducido por algunas bacterias a ácido sulfhídrico el
cual reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de hierro de color negro. Las bacterias que contienen la
enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar el triptófano que contiene el medio, con la producción de indol,
ácido pirúvico y amoniaco. La prueba de indol está basada en la formación de un anillo rojo cuando el indol
reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído del Kovacs por la presencia de diacetilo,
producto de oxidación de la acetoína. La producción de H2S mediante un precipitado negro se debe a los
aminoácidos azufrados. Las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la
distribución aleatoria de los microorganismos, por el contrario, las bacterias inmóviles permanecerán en la misma
línea de la picadura en que se sembraron.
Procedimiento
 Prepare dos tubo con medio SIM
 Inocule por picadura, uno de los tubos. Utilice el otro tubo como control
para comparar coloración (no se inocula)
 Incube los dos tubos a 37ºC durante 18-24 horas
 Observe la zona de crecimiento del microorganismo y otros cambios.
 Agregue 0,1 ml del reactivo de Kovacs al tubo inoculad, observar los
cambios en la coloración
 Producción de H2S
o Prueba positiva: formación de un precipitado negro en el
fondo del tubo
o Prueba negativa: sin formación de precipitado negro.
 Motilidad
o Prueba positiva: las bacterias móviles migran de la línea de
siembra y difunden en el medio provocando turbiedad.
o Prueba negativa: crecimiento bacteriano en la línea de siembra, el medio circundante se
mantiene claro.
 Producción de indol
o Prueba positiva: anillo color rojo-fucsia a rosado al agregar 0,1 ml de reactivo de Kovacs
o Prueba negativa: anillo color amarillo al agregar el reactivo de Kovacs.
70
2.2. Agar hierro de Kligler: Fermentación de glucosa y lactosa, producción de gas y H2S
Esta prueba permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un carbohidrato específico
incorporado a un medio de crecimiento básico así como la de producir gas y ácido sulfhídrico. Se utiliza para
identificar diferentes especies bacterianas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. El medio de cultivo
contiene una pequeña cantidad de glucosa y una gran cantidad de lactosa, los microorganismos capaces de
fermentar cualquiera de estos compuestos darán lugar a la formación de ácidos que bajan el pH del medio, como
consecuencia el rojo fenol vira a amarillo. El microorganismo utiliza la fuente de carbono más asequible e el
medio, la glucosa; pero como se encuentra en el medio en muy baja concentración, se agota rápidamente. Los
productos de su degradación acidifican el medio que cambia de rojo a amarillo. Al agotarse la glucosa empieza a
utilizar las peptonas, pero solamente en aerobiosis (se corresponde a la zona superior del tubo). Este consumo
da lugar a residuos amoniacales produciendo una gasificación del medio. El indicador vira a rojo en esa parte del
tubo de cultivo. Posteriormente procede al consumo de lactosa, en el caso de que sea capaz de utilizar este
disacárido, esto da lugar a un descenso de pH, por lo que cambiará el medio de rojo a amarillo. La lactosa es
utilizada después debido al tipo de regulación de la β-galactosidasa, que es la enzima que hidroliza ese
disacárido para dar los correspondientes monosacáridos.
Fundamento
La concentración de glucosa es baja en el medio y se consume rápido por la bacteria generando ácidos, si posee
las enzimas empezará a degradar la lactosa, si no es así, degradará peptonas que alcalizan el medio. El gas se
origina mediante la reacción catalizada por la formiato liasa a partir del ácido fórmico, por lo tanto son gas (+)
aquellos microorganismos que poseen esta enzima. El ácido sulfhídrico se detecta porque reacciona con las
2+
sales de metales pesados (Fe ) presentes en el medio, esta reacción es catalizada por la tiosulfato reductasa
dando lugar a la formación de sulfuro de hierro (color negro) que se deposita en gran parte del tubo, sobre todo
en el fondo.
Procedimiento
 Prepare dos tubos inclinados con medio KIA (agar hierro de Kligler)
 Inocule uno de los tubos, mediante estría en la superficie y la parte interna del medio por picadura. Utilice el
otro tubo como control para comparar coloración (no se inocula)
 Incube los dos tubos de 18-24 horas a 37ºC. Observe e interpretar los cambios producidos en el medio.
 Utilización de carbohidratos
o Si el microorganismo en estudio sólo fermenta la glucosa: a) en superficie: reacción alcalina,
color rojo. b) en profundidad: reacción ácida, color amarillo.
o Si el microorganismo en estudio es capaz de fermentar tanto la glucosa como la lactosa: a) en
superficie: reacción ácida, color amarillo. b) en profundidad: reacción ácida, color amarillo.
o Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa ni la lactosa: a) en
superficie: reacción alcalina, color rojo. b) en profundidad: si el microorganismo es aerobio no se
observa crecimiento ni cambio de color; si el microorganismo es facultativo, reacción alcalina,
color rojo.
o Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa pero si de oxidarla: a) en
superficie: reacción ácida a tiempos cortos y luego
alcalina, color rojo. b) en profundidad: no se observa
crecimiento ni cambio de color.
 Producción de gas
o Si el microorganismo en estudio es aerogénico, la
producción de H2 y CO2 se manifiesta mediante la
formación de una o varias burbujas o el desprendimiento
del medio del fondo del tubo dejando un área clara.
o Si el microorganismo en estudio es anaerogénico, no hay
producción de gases.
 Producción de ácido sulfhídrico (SH2)
o Si el microorganismo en estudio produce este ácido, se
manifestará por la presencia de un precipitado negro de
sulfuro de hierro en la parte profunda del tubo.
o Si el microorganismo en estudio no produce este ácido, se
manifestará por la ausencia de dicho precipitado.
71
2.3. Prueba de la oxidasa

Fundamento
La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de una enzima citocromo-oxidasa que activa la oxidación del
citocromo de la cadena de transporte de electrones, el cual es reducido por el oxígeno molecular que produce
agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de
electrones en la cadena transportadora de electrones. El citocromo se detecta utilizando el tetra para
fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo- oxidasa.
En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura por la oxidación de dicho compuesto a azul
de indofenol.
Procedimiento
 Tome con el asa de siembra, una colonia del microorganismo problema previamente cultivado.
 Coloque la colonia sobre la tira de papel filtro, embebida con el reactivo de Kovacs, asegurándose de
extender cuidadosamente con el asa de siembra.
 Espere de 5-10 segundos y observe si existe algún cambio en la coloración. Si la tira toma una coloración
azul púrpura a morado, el microorganismo es oxidasa (+), si .el color de la tira de papel de filtro embebida en
reactivo de Kovacs no se modifica, es oxidasa (-).
2.4. Prueba de la catalasa

Fundamento
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es
positiva.
Procedimiento
 Sobre el crecimiento obtenido en las placas de agar leche descremada, agregue unas gotas de peróxido de
hidrógeno (3%).
 La prueba positiva se manifiesta por la formación de burbujas debido a la descomposición del H 2O2.
2.5. Hidrólisis del almidón
Fundamento
El yodo que contiene el lugol se incorpora a la fracción helicoidal del almidón dando un color azul y a medida que
la hidrólisis progresa, el color azul va desapareciendo y cambia a rojizo o café claro.
Procedimiento
 Prepare 2 cajas de Petri con agar almidón estéril.
 Inocule por estría con la suspensión del microorganismo problema, una de las cajas, la otra no la inocule
puesto que será el control.
 Incube las 2 cajas a 35ºC durante 24 horas.
 Después del periodo de incubación, agregue lugol alrededor de la estría de desarrollo; la aparición de color
azul revela la presencia de almidón, en tanto que una coloración rojiza o parda indica la degradación del
almidón y se considera la prueba positiva.
2.6. Hidrólisis de la caseína
Fundamento
La caseína es una proteína que se encuentra en la leche, cuando la leche es mezclada con un medio de cultivo,
el medio pierde su transparencia y se vuelve turbio debido a que la caseína reacciona con los iones calcio y
forma complejos coloidales insolubles de caseinato de calcio. Cuando la enzima caseinasa cataliza la hidrólisis
de la caseína, los aminoácidos resultantes se disuelven en el medio acuoso, el medio se torna transparente
alrededor de la colonia del microorganismo, lo que permite detectar la degradación de la proteína.
Procedimiento
 Prepare 2 cajas de Petri con agar leche descremada estéril.
 Inocule por estría una de las cajas con la suspensión del microorganismo problema. La otra caja será el
control, por lo que no la inocule.
 Incube las 2 cajas a 35ºC durante 24 horas.
72
 Después del periodo de incubación, observe si alrededor de las colonias hay un halo transparente. La
desaparición del color blanco de la leche indica que la prueba es positiva.
Nota: Vea el anexo 4. Características de algunas pruebas bioquímicas, a fin de contrastar los resultados
obtenidos.
3. Sistema API 20E para la caracterización de enterobacterias

Procedimiento
 Tome con el asa de siembra una colonia de la cepa a analizar y resuspéndala en 5 ml de solución salina
fisiológica estéril. Homogeneice la suspensión agitando con vortex.
 Etiquete las galerías API en la lengüeta lateral pestaña de la cámara de incubación.
 Llene con agua destilada o desmineralizada, los alveolos del fondo de la cámara de incubación.
 Coloque la galería API dentro de la cámara de incubación.
 A partir del tubo de suspensión (la bacteria problema suspendida en solución salina isotónica estéril), proceda
a inocular las galerías de izquierda a derecha. Introduzca el inóculo en los pozos de la galería con ayuda de
una pipeta Pasteur estéril (para evitar la formación de burbujas en el fondo de los pozos, coloque la punta de
la pipeta sobre la pared de la cúpula, inclinando ligeramente la cámara de incubación hacia delante). Tenga
cuidado de no mezclar el contenido de cada pozo una vez hidratado el medio de cultivo.
 Los microtubos correspondientes a las pruebas CIT, VP y GEL se llenan completamente (tubo + cúpula)..
Para las otras pruebas, llene únicamente los pozos (no las cúpulas). Para las pruebas ADH, LDC, ODC, H 2S
y URE cree una atmósfera anaerobia llenando la cúpula con aceite mineral estéril.
 Inocule dos galerías por equipo, una con el tubo de la suspensión de la bacteria problema y la otra con la
cepa de referencia.
 Cierre la cámara de incubación e incube a 35°C, durante 18 a 24 horas y realice la lectura.
 Luego de la incubación, anote los resultados obtenidos en todas las pruebas que no requieran el agregado de
reactivos.
 Si el microtubo de glucosa es negativo (azul o verde), cuente el total de ensayos positivos. Pueden entonces
presentarse las siguientes alternativas:
o Si dicho número es menor o igual a 2, vuelva a incubar durante 18-24 h a 35 ºC.
o Si el número es mayor que 2, agregue los reactivos a las pruebas que correspondan, realice la
prueba de oxidasa (ver más adelante) y anote todos los resultados obtenidos. Si el ensayo de
glucosa es positivo (amarillo) al cabo de las primeras 18-24 h de incubación, proceda de la
misma forma que en el caso de la alternativa 2) del párrafo anterior.
 Identifique la bacteria por comparación de los resultados obtenidos con la tabla.
 Registre los resultados en las papeletas API correspondientes en el siguiente orden: Anotar primero todas las
reacciones espontáneas y después revelar los ensayos que necesiten la adición de reactivos (TDA, reactivo
TDA, tomar lectura de inmediato; IND, reactivo de Erlich, tomar lectura de inmediato; VP, reactivo α–Naftol +
KOH 40%, tomar lectura después de 10 min). La prueba IND debe ser realizada en último lugar, pues esta
reacción libera gases que pueden alterar la interpretación de las otras pruebas.
 Si el número de pruebas positivas antes de añadir los reactivos (incluyendo el ensayo GLU) es inferior a 3,
reincubar la galería 24 h más, sin volver a añadir los reactivos.
 Obtener el perfil numérico de cada bacteria en la papeleta de resultados. Las pruebas están separados en
grupos de tres y se indica para cada uno un valor de 1, 2 o 4. Como la galería se conforma de 20 ensayos,
sumando al interior de cada grupo los valores que corresponden a reacciones positivas, se obtiene un perfil
numérico de 7 cifras. A la reacción de la oxidasa, con constituye la prueba n°. 21 se le asigna el valor 4,
cuando resulte positiva).
 Identifique la identidad bacteriana mediante el Catálogo Analítico o con ayuda del Software.
Características de las pruebas e interpretación de resultados
73
ONPG: determina la actividad de la enzima b-galactosidasa.

b-galactosidasa
ONPG---------------------------------------------ortonitrofenol
(Orto-nitrofenil- (amarillo)
b-D-galactopiranósido)
Reacción positiva: amarillo
Reacción negativa: incoloro
ADH: determina actividad de la enzima arginina dehidrolasa.
ADH
arginina---------------------------ornitina + NH4 + CO2
El amonio produce un cambio en el pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo.
Reacción positiva: rojo
Reacción negativa: amarillo
LDC: determina actividad de la enzima lisina decarboxilasa.
LDC
lisina------------------------------cadaverina (amina)
La amina produce un cambio de pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo.
ODC: determina actividad de la enzima ornitina decarboxilasa.
ODC
ornitina---------------------------putrescina (amina)
La amina produce un cambio de pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo.
CIT: determina la capacidad de la bacteria de usar el citrato como única fuente de carbono.
El consumo del citrato produce un aumento de pH y un viraje del indicador de verde a azul.
Reacción positiva: azul
Reacción negativa: verde
H2S: determina la capacidad de la bacteria de reducir el tiosulfato a H 2S para reducir la tensión de oxígeno.
El H2S se combina con sales de hierro y forma un precipitado negro.
Reacción positiva: precipitado negro
Reacción negativa: ausencia de precipitado
URE: determina la actividad de la enzima ureasa
ureasa
urea---------------------------NH4
El amonio produce un cambio de pH y un viraje del indicador de amarillo a rojo si se observa entre las 18 h y las 24 h, o de
naranja a rojo si se observa entre las 36 y 48 h.
Reacción positiva: rojo o naranja
TDA: determina la actividad de la enzima triptofano deaminasa.
TDA
triptofano-----------------------indolpirúvico + NH4
Al final de la incubación se agrega una gota de cloruro férrico al 10%. El ácido indolpirúvico produce un color rojo-amarronado
en presencia del mismo.
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Reacción positiva: rojo-amarronado

IND: determina la capacidad de la bacteria de metabolizar el triptofano.
triptofanasa
triptofano------------------------indol
Al final de la incubación se agrega una gota del reactivo de Kovacs. La reacción debe ser leída dentro de los dos minutos de
agregado el mismo. El indol se combina con el p-dimetilamino benzaldehído presente en el reactivo y se forma una quinona
de color rojo violáceo.
Reacción positiva: color rojo
VP: Determina la presencia de acetoína como intermediario en el metabolismo de la glucosa.
Al final de la incubación se agrega una gota de KOH al 40% y luego una gota de alfa-naftol. Se esperan 10 minutos antes de
observar el resultado.
Reacción negativa: incoloro
Reducción de nitratos: Determina la capacidad del microorganismo de reducir el nitrato a nitrito o a nitrógeno libre. La
prueba se lleva a cabo en el mismo microtubo que la de glucosa. Además de anotar el resultado de dicha prueba, se observa
si hay burbujas, lo cual indica que se redujeron los nitratos a nitrógeno gaseoso. Se agregan dos gotas de ácido sulfanílico al
0.8% y dos gotas de N,N- dimetil-a naftilamina. Se espran de 2-3 minutos. Si hay nitritos en el medio, los mismos forman un
complejo de color rojo con los reactivos. Los resultados negativos se confirman agregando zinc al microtubo. Los nitratos son
reducidos por el zinc dando un color rosa anaranjado. Si no hay un cambio de color, es porque los nitratos fueron reducidos
primeramente a nitritos y posteriormente a N2 o a alguna amina aerogénica.
GEL: Determina la activiada de la enzima gelatinasa.
La licuefacción de la gelatina por esta enzima libera un pigmento negro que difunde al medio.
Reacción positiva: difusión del pigmento negro
Reacción negativa: no hay difusión
GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA: Determinan la capacidad de un organismo anaeróbico de fermentar el
carbohidrato o la de un organismo aeróbico de oxidarlo.
GLU: glucosa, MAN: manitol, INO: inositol, SOR: sorbitol, RHA: ramnosa, SAC: sacarosa, MEL: melibiosa, AMY: amigdalina,
ARA: arabinosa.
Como consecuencia de la utilización del carbohidrato, se forman productos ácidos. El descenso de pH produce un viraje del
indicador de azul a amarillo.
MAN; INO; SOR: determina la actividad de la enzima catalasa.
2 H2O2 2 H2O + O2 (gas)
La reacción se lleva a cabo en los mismos microtubos utilizados para MAN; INO y SOR. Después de leer los resultados de
dichas reacciones, se agrega una gota de H 2O2 al 1.5% a cada tubo. Se espera de 1-2 minutos y se observa si hay formación
de burbujas.
Reacción positiva: formación de burbujas
Reacción negativa: no se forman burbujas
Prueba de oxidasa: Se embebe un papel de filtro con una suspensión bacteriana similar a la utilizada para inocular los
microtubos. Se agrega una gota de clorhidrato de tetrametil-p-fenildiamina al 1%. Si la reacción es positiva, el área del papel
que contiene la suspensión de bacterias toma un color púrpura dentro de los 30 segundos. Si la reacción es negativa no se
registra ningún cambio de color.
75
76
CEPA PROBLEMA
PRUEBA BIOQUÌMICA NOMBRE:
Resultados obtenidos Reportado en la

bibliografía
Gram
Estructuras especiales
Oxidasa
Catalasa
Utilización de sacarosa
O/F glucosa
Kligler:
1)Fermentación de glucosa
2)Fermentación de lactosa
3)Producción de H2S
Citrato
Ureasa
Rojo de metilo (RM)
Voges-Proskawer (VP)
SIM:
1) Producción de H2S
2) Indol
3) Movilidad
Conclusiones
Seguridad e higiene
Evaluación
 Se evalúa el reporte de la práctica realizada, trabajo en equipo, valores y actitudes, considerando los criterios
establecidos en las rúbricas diseñadas para cada actividad. Además, el siguiente cuestionario:
1. ¿Por qué el medio utilizado para la prueba de motilidad de las bacterias, es semisólido?
2. ¿En el agar hierro de Kligler se pueden diferenciar microorganismos que realizan fermentación ácido-mixta
de aquellos que realizan fermentación butilenglucólica? Justifique.
3. ¿Qué tipo de metabolismo y qué produtos se ponen en evidencia al realizar las pruebas de Rojo de metilo
y Voges-Proskauer? ¿Qué precauciones debería tener para la correcta interpretación de ambas pruebas?
4. En una placa inoculada a partir de un cultivo de E. coli se observa una presunta contaminación con
Pseudomonas aeruginosa. Indique por los menos 3 pruebas bioquímicas y los resultados esperados de las
mismas que le permitirían comprobar que se trata de estos dos microorganismos.
5. ¿Qué resultados espera obtener en las pruebas bioquímicas en agar hierro de Kligler y óxido/fermentación
de lactosa como única fuente de carbono, para microorganismos con las siguientes características
metabólicas? A) aerobio estricto que no utiliza la lactosa como fuente de carbono. B) aerobio facultativo
que no utiliza la lactosa como fuente de carbono. C) aerobio facultativo que utiliza la lactosa como fuente
de carbono.
6. ¿Qué ventajas y desventajas encuentra al emplear tanto las pruebas bioquímicas tradicionales como las
galerías API para determinar la fisiología bacteriana?
77
Bibliografía
Tortora, Gerard J. Funke, Berdell, y Case, C.L. 2007. Introducción a la Microbiología. 9ª. Edición. Editorial
Panamericana.
Willey, J. M., Sherwood, L. M., y Woolverton, Ch. J. 2009. Microbiología de Pescott, Harley y Klein. 7ª. Edición.
Editorial McGraw-Hill Interamericana. Madrid.
78


Clave: AEM-1050
Práctica 15. Cultivo e identificación de hongos filamentosos y Duración (h): 4
levaduras
Competencia general
Desarrolla cultivos de hongos filamentosos y levaduriformes y los identifica utilizando criterios macroscópicos,
microscópicos y fisiológicos.
 Realiza el aislamiento de hongos filamentosos y levaduriformes utilizando las técnicas de punción y estría
cruzada respectivamente.
 Identifica especies de hongos filamentos por sus características macroscópicas y visualización microscópica
de estructuras especiales.
 Identifica especies de hongos levaduriformes por sus características metabólicas.
Actitudes y valores
 Colabora en equipo de aprendizaje para la consecución de objetivos comunes, asumiendo los copromisos con
responsabilidad.
Los hongos constituyen un conjunto de organismos vivos que incluye desde organismos unicelulares a
organismos pluricelulares macroscópicos. Están formados por células eucariotas con una pared rígida y
se caracterizan por se inmóviles, presentar nutrición heterótrofa por absorción y reproducción asexual y sexual.
Los hongos forman un grupo de organismos heterogéneos desde el punto de vista morfológico; unos
son unicelulares y están constituidos por células aisladas, ovales, de 3-10 µm de diámetro denominadas
levaduras. Otros son multicelulares como los hongos filamentosos, que están constituidos por células alargadas
de 3 a 12 µm de diámetro, dispuestas linealmente formando unas estructuras filamentosas denominadas hifas, y
el conjunto de éstas se denomina micelio. El micelio se diferencia en dos partes, la que penetra en los
sustratos nutritivos, para absorberlos, denominada micelio vegetativo y la que se dispone en superficie y
contiene las estructuras reproductoras, que constituye el micelio aéreo o reproductor. El cuerpo o estructura
vegetativa característica de los hongos filamentosos se denomina talo (conjunto de micelio). En algunas
especies se forman septos a lo largo de la hifa, quedando entonces dividida en pequeños
compartimentos, a la cual se le denomina hifa septada. Existen especies que no presentan septos en las hifas y
el protoplasma fluye continuamente a lo largo de la hifa, denominándose entonces como hifa no
septada o cenocítica.
Los hongos crecen fácilmente en los medios de cultivo convencionales dando lugar a colonias visibles
microscópicamente, con morfología bien diferenciada, según estén formadas por levaduras u hongos
filamentosos. En general las células fúngicas se observan bien por microscopía convencional, aunque
pueden requerir tinciones especiales para facilitar su visualización. La identificación de las levaduras se
efectúa por el estudio de sus características metabólicas, sin embargo la identificación de los hongos
filamentosos se basa en sus características morfológicas. Un hongo se identifica en primer lugar, por la
morfología macroscópica de la colonia, color, textura y velocidad de crecimiento; para observar la estructura
microscópica, puede tomarse un pequeño fragmento de cultivo y montarlo entre cubre y portaobjetos, en
fresco o contrastado con un colorante para su posterior observación. Los hongos filamentosos se identifican a
nivel de género o especie por la morfología del micelio, pero sobre todo, por las características microscópicas
de sus esporas asexuales y los elementos que las originan. Los hongos levaduriformes se identifican
mediante pruebas metabólicas, de una forma semejante a las bacterias.
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Materiales Equipo
 Espátulas  Microscopio
 Asa de siembra  Horno Pasteur de aire caliente
 Portaobjetos  Incubadora con termómetro
 Cubreobjetos  Balanza analítica
 Placas de Petri estériles  Potenciómetro
 Micropipetas con puntillas estériles de 1,0 ml  Autoclave u olla de presión
 Tubos de Durham
 Matraz Erlenmeyer de 250 ml y de 500 ml
 Vasos de precipitado de 50, 250 y de 500 ml
 Cubreboca
 Algodón
 Gasa
 Papel metálico
 Parafilm
 Solución de lactofenol-azul de algodón
 Solución de verde de malaquita
 Solución salina isotónica estéril
 Glucosa, sacarosa, lactosa, galactosa, maltosa y
rafinosa
 Nitrato de potasio
 Peptona
 KH2PO4
 MgSO4.7H2O
 (NH4)2SO4
 Agar-agar
 Agar dextrosa Sabouraud
 Cultivos de hongos filamentosos y levaduriformes
Procedimiento
 Siga los procedimientos de asepsia y seguridad en el laboratorio.
1. Siembra de hongos filamentosos
 Prepare una placa de Petri con agar dextrosa Sabouraud (SDA) estéril para cada integrante del equipo.
 Siembre un hongo filamentoso diferente por cada integrante del equipo.
 Esterilice el asa y deje enfriar dentro de la zona aséptica.
 Tome una pequeña cantidad del cultivo del hongo seleccionado y siembre en el centro de la placa de Agar
Sabouraud, presionando ligeramente el asa sobre el medio de cultivo.
 Selle la caja e inviértala.
 Incube la placa invertida a 28°C durante 5-7 días.
2. Identificación de hongos filamentosos
 De las colonias de hongos aislados tome nota de sus características: desarrollo, color, aspecto del micelio
(algodonoso, aterciopelado u otro), pigmentación, elevación, consistencia, entre otros.
 Haga una preparación en fresco, utilice el asa de siembra y desprenda una pequeña porción y suspéndala en
una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjetos, coloque un cubreobjetos y examine al microscopio con
los objetivos de 10 y 40X buscando estructuras representativas (tipo de esporas y de micelio)
 Tome fotografías de lo observado.
80
3. Siembra de hongos levaduriformes

 Prepare una placa de Petri con agar dextrosa Sabouraud (SDA) estéril para cada integrante del equipo.
 Siembre un hongo levaduriforme diferente por cada integrante del equipo.
 Inocule con el asa una placa de Agar Sabouraud con el cultivo de levadura utilizando la técnica de estría
cruzada.
 Selle la placa e incúbela invertida a 35ºC durante 24-48 horas.
4. Identificación de hongos levaduriformes

 Observe las características de las colonias: forma, color, borde, elevación, textura, consistencia.
 Haga una suspensión de levadura a partir del cultivo realizado utilizando solución salina isotónica estéril.
Tome con una asa una pequeña gota de la suspensión y colóquela en una gota de azul de metileno diluido
sobre un portaobjetos, coloque el cubreobjetos y observe al microscopio con los objetivos 10 y 40X. Observe
el tamaño comparándolo con el de las bacterias, busque estructuras representativas como blastosporas u
otras.
 Realice las siguientes pruebas fisiológicas para la identificación de la levadura en estudio:
Prueba de crecimiento
 En un matraz Erlenmeyer de 125 ml, prepare 80 ml de extracto de levadura o extracto de malta.
Esterilice y deje enfriar. Inocule con 10 ml de la suspensión de levaduras preparada anteriormente, incube a
8ºC en el refrigerador por 30 días. Después de la incubación, verifique si la levadura forma o no película en
la superficie del medio, o si ha formado micelio y/o anillo en las paredes del matraz.
Prueba de fermentación de azúcares
 Prepare un tubo de cultivo con tubo de Durham y 10 ml de cada una de las soluciones al 2% de glucosa,
galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y rafinosa. Esterilice a baño María a 80ºC durante 20minutos a fin de
evitar su degradación.
 Inocule cada uno de los tubos con 1 ml de la suspensión de levaduras e incube a 35ºC durante 24-48 horas.
Después de este periodo, observe que tipo de azúcares fermenta la levadura en estudio.
Prueba de formación de ascosporas
 Coloque en un vaso de precipitado de 50 ml, un bastidor de papel filtro. En el fondo del vaso de precipitado,
vierta 10 ml de una solución de acetato de sodio al 0,5% estéril. Sobre el bastidor de papel filtro coloque 0,1
ml de la suspensión de levaduras. Incube a 35ºC durante 24-48 horas.
 Tome una pequeña cantidad del cultivo que se encuentra sobre el papel filtro y realice una tinción de verde
81
de malaquita (las esporas se tiñen de verde). Observe al microscopio con los objetivos de 10 y 40X buscando
estructuras representativas.
Prueba de asimilación de azúcares
 Prepare una placa de Petri con medio para asimilación de azúcares (ver apéndice), inocule con 1 ml de la
suspensión de levaduras y distribuir el inóculo utilizando la varilla acodada, hasta que se absorba el inóculo.
Divida la placa con un marcador indeleble en 6 sectores numerados y a cada número le corresponderá un
azúcar utilizado: glucosa (1); sacarosa (2); lactosa (3); maltosa (4); galactosa (5) y rafinosa (6). Los
gránulos de cada azúcar se colocan en el sector correspondiente.
 Incube la placa a 35ºC durante 24-48 horas. Observe los resultados: Las zonas de crecimiento indican el tipo
de azúcar que fue asimilado.
Prueba de asimilación de nitrógeno
 Prepare una placa de Petri con medio para asimilación de nitrógeno (ver apéndice). Inocule con 1 ml de la
suspensión de levaduras y distribuir el inóculo utilizando el método de la varilla acodada. Dividir la placa en
dos partes iguales con un marcador indeleble. En una de las partes coloque sobre la superficie del medio de
cultivo, unos cristales de nitrato de potasio y en la otra deposite como control, unos gránulos de peptona.
 Incube a 35ºC durante 24-48 horas. Observe los resultados. Únicamente las levaduras que asimilan el
nitrógeno crecerán alrededor de los cristales de nitrato de potasio.
Conclusiones
Seguridad e higiene
Evaluación
Se evalúa el reporte del experimento, valores y actitudes, considerando los criterios establecidos en las rúbricas
diseñadas para cada actividad. Además de contestar las siguientes preguntas:
1. ¿Por qué los hongos levaduriformes se siembran de igual forma que las bacterias?
2. ¿Por qué los hongos filamentosos se siembran por picadura?
3. ¿Qué pasaría si sembraras un hongo filamentoso por agotamiento por estría?
4. Identifique los géneros o especies de los hongos filamentosos observados, teniendo en cuenta las
características de la colonia: desarrollo (escaso, medio, abundante); color; aspecto y color tanto del
micelio superficial como del vegetativo. Considerando además, las características microscópicas: tipo
de hifas y de cuerpo fructífero; morfología, aspecto y color de las esporas y de los elementos que las
originan. Contraste las observaciones realizadas con las reportadas en bibliografías.
5. Identifique los géneros o especies de hongos levaduriformes considerando las pruebas metabólicas.
y comparando con la información que usted buscará en las diferentes fuentes de información.
Bibliografía
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V. y Clark, D.P.2009. Brock: Biología de los microorganismos. 12ª
edición. Editorial Pearson.
Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L. 1995. Microbiology an Introduction. 5a. ed. The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.
Vullo, D., M. Wachsman, L. Alche. 2000. Microbiología en Práctica. Manual de laboratorio para la enseñanza de
Microbiología básica y aplicada. 1ª edición. Atlante S. R. L. Argentina
Willey, J. M., Sherwood, L. M., y Woolverton, Ch. J. 2009. Microbiología de Pescott, Harley y Klein. 7ª.edición.
Editorial McGraw-Hill Interamericana.
82


Clave: AEM-1050
Práctica 16. Identificación de algas y protozoarios Duración (h): 4
Competencia general
Identifica algas y protozoarios, mediante sus estructuras y organización celular.
 Realiza la identificación y ubicación taxonómica de algas y protozoos, mediante preparaciones en fresco
observadas al microscopio.
 Organiza e interpreta los resultados del estudio microscópico de algas y protozoarios, reconociendo
estructuras típicas y la organización celular.
 Establece las diferencias estructurales y morfológicas de algas y protozoarios, comparándolas con las de las
bacterias y hongos.
 Formula hipótesis.
Actitudes y valores
 Colabora en equipo de aprendizaje para la consecución de objetivos comunes, asumiendo los compromisos
con responsabilidad.
Las algas y protozoarios son protoctistas que tienen en común ser eucariotas y no formar tejidos. Las algas
pertenecientes al reino protista, pueden ser esféricas, alargadas o fusiformes, móviles o no móviles, con uno o
más cloroplastos. Son autótrofas fotosintéticas y la mayoría acuáticas, casi siempre marinas, aunque habitan en
agua dulce y otras son terrestres. Las algas unicelulares suelen flotar libremente y formar el fitoplancton y son,
por tanto, el primer eslabón en la cadena trófica de los ecosistemas marinos del que se alimentan muchos
organismos acuáticos. Las algas multicelulares se fijan al fondo.
Las algas son organismos aerobios fotosintéticos, algunas pueden crecer en la nieve, otras a temperaturas
elevadas (70ºC), y las algas marinas se adaptan a las concentraciones salinas y otras habitan sobre suelos
húmedos y corteza de los árboles. Se clasifican de acuerdo a su pigmento, productos alimenticios de reserva,
paredes celulares y organización celular. La algas reúne una gran cantidad de organismos muy heterogéneos,
cuyas divisiones más representativas de la algas son las siguientes: 1) Clorophyta: algas verdes, clorofila a y b,
unicelulares o con ramificaciones, pared celular de celulosa y de formas muy variables. La mayoría de las
especies microscópicas son propias de agua dulce, aunque hay numerosos grupos marinos y otros de suelos.
Ejemplos: Chlorella, Volvox. 2) Euglenophyta: pequeño grupo de organismos unicelulares flagelados, con
clorofila a y b, carecen de pared celular, y la mayoría son de agua dulce y estancada. Tienen cloroplastos
encerrados por una membrana triple, no doble. No poseen pared celular, lo cual les permite cambiar su forma.
Son de estructura muy sencilla cuya característica más distintiva es la presencia de una mancha de pigmento
fotosensible. 3) Chrysophyta: llamadas algas doradas, unicelulares, con clorofila a, c y e, pared celular de sílice y
su material de reserva son los lípidos. Habitan en aguas dulces, aguas marinas y suelos. Su principal
característica es la presencia de cromatoforos con pigmentos de color amarillo-naranja (fucoxantina), que les
confiere un aspecto dorado. Son de morfología variable con flagelos y sin ellos. La mayoría forma parte del
plancton de agua dulce pero existen también especies marinas (silicoflagelados) que presentan
caparazones silíceos de diseños característicos. 4) Phaeophyta: llamadas algas pardas, todas multicelulares
compuestas por filamentos ramificados; con pared celular constituida de celulosa. La combinación del pigmento
fucoxantina, abundante en sus cloroplastos, con las clorofilas a y c, les binda el color pardo. Son prácticamente
marinas en su totalidad, muy pocas de ellas viven en agua dulce. Ejemplo: Laminaria. 5) Pyrrophyta: constituye
un grupo de organismos unicelulares móviles conocidos como dinoflagelados. Estos a su vez son uninucleados
con numerosas especies que habitan en distintos tipos de agua, especialmente marina. Su locomoción la realiza
con ayuda de sus dos flagelos, uno largo y otro corto; pared de celulosa; sus pigmentos son la clorofila a y c; su
83
material de reserva es el almidón. Muchas de sus especies son de color verde amarillento o pardo amarillento;
otras son incoloras, esta coloración se debe a la presencia de cromatóforos que llevan como pigmento clorofila,
caroteno y xantofilas. Muchas especies son bioindicadoras de masas de agua, permitiendo predecir el inicio,
desarrollo e intensidad de dichas corrientes en un área geográfica determinada. Muchas otras especies alteran el
ecosistema y causan muertes de peces, mamíferos y aves, debido a sus toxinas. Estas toxinas no solo afectan
al ecosistema marino sino también al hombre, puesto que se acumulan en moluscos, bivalvos y crustáceos,
muchos de ellos de consumo humano, causando muertes y enfermedades. La toxina más conocida es la
saxitoxina, considerada como una neurotoxina. 6) Rhodophyta: algas marinas llamadas algas rojas,
generalmente multicelulares formadas por filamentos con ramificaciones, y de menor complejidad que las algas
pardas. Su color se debe a la presencia del pigmento rojo ficoeritrina acompañando a las clorofilas a y d,
y a la ficocianina (azul). Estos pigmentos les permiten realizar la fotosíntesis con menor cantidad de luz,
por eso son las algas que viven a mayores profundidades. En este grupo se encuentran la mayoría de las algas
que secretan carbonato de calcio y y cumplen un papel crucial en la formación de los arrecifes de coral. Ejemplo,
el género Porphyra.
Al igual que las algas, los protozoarios también pertenecen al reino protista. Son organismos eucariotas,
unicelulares, carecen de pared celular y varían en forma y tamaño. Se alimentan por ingestión. Los protozoos no
tienen estructuras internas especializadas a modo de órganos o, si las tienen, están muy poco diferenciadas.
Existen protozoos capaces de desarrollarse de forma libre en el ambiente y otros son parásitos. Se encuentran
en casi todos los hábitats húmedos tales como los estanques, lagos, ríos, arroyos, arena o grava húmeda, suelos
húmedos, aguas negras, plantas de tratamiento de esta agua; aguas marinas como estanques costeros
formados por la marea, en vegetación flotante, estuarios, bahías, aguas termales y estanques glaciales. Con
base en sus mecanismos de locomoción se clasifican en 4 clases:1) Sarcodina: Presentas varios núcleos y
vacuolas digestivasos y una vacuola contráctil. Se mueven formando expresiones transitorias del plasma celular
a las que se les conoce como pseudópodos para fagocitar. Son de vida libre o parásitos, como Entamoeba
histolítica. 2) Flagelados: Se mueven utilizando uno o varios flagelos a modo de látigos. Hay especies parásitas
como Trypanosoma ssp, Giardia ssp, Trichomonas, Leishmania; otras especies son de vida libre como Euglena
spp. 3) Esporozoos: todas las especies son parásitas, por ello carecen de estructuras especiales para la
locomoción. Pueden alojarse en animales o en el humano. El ejemplo más conocido es el género Plasmodium y
el Toxoplasma. 4) Ciliados: los protozoos más complejos de todos. Poseen cilios que les sirven para la
locomoción o la captura del alimento. Presentan dos núcleos, uno que se encarga de las funciones vegetativas y
el otro de la reproducción. Tienen formas y tamaños muy variados, la mayoría son de vida libre y no se conocen
formas parásitas. Habitan en aguas dulces y marinas. Un género representantivo de este grupo es Paramecium.
Materiales Equipo
 Portaobjetos  Horno Pasteur de aire caliente
 Cubreobjetos  Refrigerador
 Pipetas Pasteur  Balanza analítica
 Pipetas de 1 ml  Microscopio óptico
 robeta de 100 ml  Centrífuga
 Cubreboca
 Piseta
 Solución salina fisiológica (0.85% NaCl)
 Muestras de agua estancada y agua corriente
Procedimiento
 Siga los procedimientos de asepsia y seguridad en el laboratorio.
 Centrifugue cada una de las muestras recolectadas.
 A partir del centrifugado, realice una preparación en fresco de las muestras de agua recolectadas.
 Coloque una gota de solución de lugol en un portaobjetos limpio y desengrasado.
 Con una pipeta Pasteur transfiera una gota de la muestra en estudio, a la gota de la solución de lugol que se
encuentra al centro del portaobjeto.
 Cubra la preparación en fresco con un cubreobjetos limpio y desengrasado.
 Observe al microscopio con el objetivo de 10X y luego con el de 40X.
 Identifique algas y protozoos presentes en las muestras, y clasifíquelos basándose en la información con la
84
que usted cuenta.

 Tome fotografías de lo observado el microscopio, o bien, esquematice sus observaciones y a partir de ello,
contraste lo observado con la información recabada anteriormente y clasifique las algas y protozoarios
observados.
Conclusiones
Seguridad e higiene
Evaluación
Se evalúa el reporte del experimento, valores y actitudes, considerando los criterios establecidos en las rúbricas
diseñadas para cada actividad. Además de contestar las siguientes preguntas:
1. En los protozoos ¿Qué tipo de pseudópodos es posible observar en la clase Sarcodina?
2. Identifique los géneros o especies de las algas y protozoarios observados, contrastando las
observaciones realizadas, con las reportadas en bibliografías.
Bibliografía
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P. V. y Clark, D.P. 2009. Brock Biología d los microorganismos.
Viramontes Ramos, Sabina y Portillo Ruis, Martha. 2009. Atlas para la identificación de algas y protozoos de vida
libre. Volumn 60 de Colección de Textos universitarios. Universidad Autónoma de Chihuahua. México.
Vullo, D., M. Wachsman, L. Alche. 2000. Microbiología en Práctica. Manual de laboratorio para la enseñanza de
Microbiología básica y aplicada. 1ª edición. Atlante S. R. L. Argentina.
85


Clave: AEM-1050
Práctica 17. Ecología microbiana Duración (h): 4
Competencia general
Investiga la diversidad microbiana presente en un microambiente, relacionándola con sus características
fisiológicas.
 Diseña una columna de Winogradsky para establecer diferencias entre los grupos microbianos presentes en
un microambiente.
 Compara los microorganismos que crecen a lo largo de la columna en diferentes tiempos, explicando las
causas que originan la sucesión de microorganismos observada.
 Organiza el material para su fácil identificación y manejo.
 Genera informes de experimentos realizados a partir de la búsqueda, procesamiento y análisis de información
procedente de diversas fuentes.
Actitudes y valores
 Sustenta una postura personal sobre el tema, considerando otros puntos de vista de manera crítica y
reflexiva.
El estudio de las comunidades microbianas en el laboratorio, puede llevarse a cabo en un sistema autoreciclable
denominado columna de Winogradsky, la cual simula un microambiente. La columna permite la ilustración de
cómo los microorganismos ocupan microespacios específicos con base a sus requerimientos medioambientales y
sus necesidades vitales en cuanto a los requerimientos de carbono y energía. Además, ilustra la
interdependencia entre los microorganismos presentes, de forma tal, que la actividad metabólica de un
microorganismo posibilita el crecimiento de otros y viceversa.
Las columnas de Winogradsky se preparan con muestras de suelo colectadas en ambientes húmedos, las cuales
son enriquecidas con compuestos orgánicos e inorgánicos y finalmente son expuestas a una fuente de luz
natural. En ellas se observa que después de 3 ó 4 semanas de incubación aumenta la cantidad de los distintos
tipos de microorganismos, mismos que de acuerdo con sus características fisiológicas, se establecen en las
diferentes zonas a lo largo de la columna (sucesión). De forma tal, que el resultado es una columna estratificada,
donde es posible visualizar las distintas zonas de diferente color, tanto en el suelo como en el agua, donde cada
estrato se relaciona con un proceso bioquímico. En la zona inferior de lodos se desarrollan microorganismos
fermentadores que producen alcohol y ácidos grasos como subproductos de su metabolismo. Estos productos de
desecho constituyen el sustrato para el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato, las cuales como resultado
de su metabolismo liberan sulfuros que difunden a la zona superior oxigenada creando un gradiente en el que se
desarrollan bacterias fotosintéticas que utilizan el azufre. Por encima de esta zona pueden desarrollarse las
bacterias púrpura que no utilizan el azufre y que obtienen su energía de reacciones luminosas, pero que emplean
ácidos orgánicos como fuente de carbono para su síntesis celular. Finalmente, en la zona aerobia crecen las
cianobacterias y algas las cuales como producto de su metabolismo liberan oxígeno. También pueden crecer
bacterias que oxidan compuestos del azufre y del nitrógeno hasta sulfatos y nitratos respectivamente. Todos
estos grupos sintetizan su materia orgánica a partir del CO 2.
Materiales Equipo
 2 probetas de 1000 ml o 2 frascos de 2 L con boca  Balanza granataria
ancha, transparente y con tapa.  Microscopio óptico
 Pipetas graduadas de 5 y 10 ml  Cronómetro
 2 clavos de hierro no galvanizado
86
 2 clavos de hierro galvanizado

 Papel de extrasa finamente cortado
 Parafilm
 3 m de cordón de nylon o hilo cáñamo
 Cubreobjetos
 Portaobjetos con y sin muesca
 1 varilla de vidrio de 50 cm
 1 espátula
 Piseta
 Algodón
 Sales de CaCO3, CaSO4 y CaHPO4
 Colorantes para la tinción de Gram
 Solución alcohol-ácido acético (8:2)
 Solución de safranina
 Aceite de inmersión
 Agua destilada
 Cáscara de huevo pulverizada
 Material biológico: 300 g de barro o lodo
(sedimento superficial o subsuperficial) de un
arroyo, lago, estanque o río y 1500 ml de agua
de estanque, arrroyo, lago o río, por cada una de
las columnas.
Fundamento
En la columna se desarrollan poblaciones bacterianas fotosintéticas que utilizan el sulfuro de hidrógeno como
donador de electrones en su metabolismo fotoautrotrófico. Este modelo de ecosistema imita la situación de
una columna anóxica de agua que recibe luz, produciéndose una zonación semejante a los sedimentos
naturales, pero en escala milimétrica. De forma tal, que el resultado es una columna estratificada, donde es
posible visualizar las distintas zonas de diferente color, tanto en el suelo como en el agua, donde cada estrato se
relaciona con un proceso bioquímico.
Procedimiento
 Colecte una muestra de 300 g de suelo, lodo o barro, ricos en materia orgánica. Remueva las piedras, ramas
o partículas grandes del material en estudio.
 Adicione a la muestra 1 g de cada una de las sales (CaCO 3 y CaSO4); el papel periódico finamente cortado y
la cáscara de huevo pulverizada. Mezcle hasta homogeneizar completamente.
 Coloque la mezcla en el fondo de una probeta de vidrio de 1000 ml. Compacte el suelo con la ayuda de la
espátula para eliminar burbujas de aire.
 Añada la muestra de agua de aguas negras, estanque, arroyo, lago o río a la muestra de suelo hasta llegar a
una altura de aproximadamente de 3 a 5 cm abajo del borde. Tenga
cuidado de no re-suspender la muestra
compactada, para ello, resbale por las
paredes lentamente la muestra de agua.
 Agite la solución con una varilla de vidrio
para eliminar burbujas de aire.
 Registre el aspecto final de la columna
considerando el color del sedimento y del
líquido.
 Tome 8 portaobjetos y hágales unas
muescas. Sobre ellas, amarre un extremo del hilo cáñamo de tal
forma que se pueda jalar el portaobjetos con el otro extremo.
 Coloque los 8 portaobjetos en una posición vertical a diferentes
niveles, cuatro sobre el sustrato, inclinados contra la pared del
recipiente dejando que el extremo de hilo suelto quede suspendido
fuera de la probeta y cuatro en los primeros 10 cm de la superficie.
 Coloque dos clavos (uno galvanizado y uno no galvanizado) al
87
fondo, sobre el sustrato amarrados de un hilo.

 Marque el nivel de agua y cubra la boca de la probeta con
parafilm. Puede ser necesario reponer muestra de agua para
mantener el nivel original.
 Incube la columna a temperatura ambiente (25 a 30°C)
cerca de una ventana para que reciba la luz solar o bien,
exponga la columna a luz continua de un foco de 60 watts a una
distancia entre 30 y 40 cm.
 Después de una semana de incubación, observe las
columnas y registre, los cambios físicos producidos con
respecto al aspecto inicial.
 Remueva dos portaobjetos (uno de la superficie y otro del
fondo). Dado que los microorganismos pueden colonizar ambos
lados de los portaobjetos, es necesario limpiar una de sus
caras; observe los
m.o. sin teñir con
los objetivos de 10
y 40x. Luego fije
con alcohol-ácido
acético (8:2) durante 5 minutos a temperatura ambiente y tiña con
azul de metileno o safranina.
 Observe con el objetivo de inmersión, esquematice o tome
fotografía de los microorganismos observados y registre.
 Recuerde que las bacterias son los primeros microorganismos en
colonizar los portaobjetos, seguidos por las algas y los
protozoarios.
 Tome muestras de los diferentes niveles de las columnas con una
pipeta, iniciando en la superficie y terminando en la zona más
profunda. Utilice una pipeta diferente para tomar cada una de las
muestras. Coloque cada una de las muestras en un tubo de
cultivo no estéril.
 Haga 3 preparaciones de cada una de las muestras. Realice de
cada muestra una preparación húmeda colocando una gota de
muestra en un portaobjetos y cubriendo con el cubreobjetos.
Observe el tipo y la abundancia de los diferentes
microorganismos, así como su movilidad. Se recomienda este tipo
de preparación sin teñir cuando las muestras proceden de la zona aeróbica o superior, donde se encuentran
con mayor probabilidad algas, protozoarios y cianobacterias. En la segunda preparación coloque la muestra,
agregue una gota de azul de metileno y coloque el cubreobjetos. Por último, haga una preparación fija y
teñida, tome una gota de muestra y realice un frotis, tiña con Gram. Observe al microscopio. Registre y
esquematice los distintos tipos de microorganismos observados.
 A partir de la segunda semana de incubación, y de las subsiguientes, repita el procedimiento indicado en los
incisos 1 a 5.
 Registre y esquematice los cambios físicos de la columna, así como los distintos tipos de microorganismos.
 Compare los esquemas e identifique los cambios físicos que tienen lugar en la columna a lo largo del tiempo
y describa la sucesión de los microorganismos.
Conclusiones
Seguridad e higiene
Evaluación
88
 Se evalúa el informe que elabora el alumno, considerando los siguiente: las observaciones periódicas de la
apariencia de la columna, haciendo hincapié en los cambios macroscópicos, tales como la aparición
de organismos fotosintéticos, o cualquier otro cambio observado. También reporte las observaciones al
microscopio, describiendo las características de los organismos encontrados en el agua y sedimento de la
columna.
1. ¿Por qué se adiciona las sales de CaCO3, CaSO4 y CaHPO4 a la muestra de sedimento?
2. ¿En qué se basa para decir que hay crecimiento de microorganismos fotosintéticos?
3. ¿Qué tipo de microorganismos son los que proporcionan los primeros nutrientes al medio, los cuales
permiten el crecimiento de otros microorganismos?
Bibliografía
Ramírez- Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía Chávez, G.
Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M. de l C. Urzúa Hernández.
2006. Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª edición. Facultad de Química, UNAM. México.
Tortora, Gerard J.Funke, Berdell y Case, C. 2007. Introducción a la Microbiología. 9ª.edición. Ed. Panamericana.
Vullo, D., Wachsman, M., Alche, L. 2000. Microbiología en Práctica. Manual de técnicas de laboratorio para la
enseñanza de Microbiología básica y aplicada. Primera edición Editorial Atlante S.R.L., Buenos Aires.
Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Química. Departamento de Biología. Protocolo de
Prácticas Microbiología Experimental. 2012.
89


Clave: AEM-1050
Práctica 18. Biología Molecular: Extracción, amplificación y Duración (h): 12
observación del DNA
Competencia general
Extrae, amplifica y observa el DNA utilizando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y
electroforesis en gel de agarosa.
 Comprende los principios en los cuales se basa la reacción en cadena de la polimerasa.
 Relaciona el número de ciclos de PCR con la cantidad de DNA amplificada.
 Lleva a cabo la electroforesis en gel de agarosa a fin de observar el producto obtenido.
Actitudes y valores
 Respeta a sus compañeros.
La PCR es una técnica para la síntesis "in vitro" de secuencias específicas de DNA. Las siglas PCR significan
"Polimerase Chain Reaction" o Reacción en Cadena de la Polimerasa. Mediante esta técnica es posible
multiplicar el DNA presente en diferentes muestras biológica, obteniéndose millones de copias de una
determinada secuencia de DNA. Esta técnica fue descrita por primera vez en 1985 por Kary Mullis y se basó en
la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Esta enzima realiza la
síntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero
a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región doble cadena, se usan los denominados primers
o cebadores, que son dos oligonucleótidos entre 20-45 nucléticos que son sintetizados químicamente para que
sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea amplificar. Partiendo
de este principio, la reacción en cadena de la polimerasa, se basa en la repetición de un ciclo formado por tres
etapas: 1) desnaturalización del DNA doble cadena. 2) hibridación de los cebadores a la zona 3´ específica de
cada una de las hebras. 3) extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa.
Una reacción típica de PCR contiene DNA molde, Taq polimerasa y los 4 dNTPS en un tampón de reacción
apropiado. El volumen total de reacción es de 25-50 μl. En el primer paso (desnaturalización) la doble hélice de
DNA se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC).
La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya. En el segundo paso (hibridación), los
cebadores se unen a las zonas 3´ complementarias que rodean el fragmento que se quiere amplificar. Se realiza
debido a la reducción de la temperatura (50-65ºC) de la muestra. En el tercer paso, conocido como extensión, la
temperatura es elevada a 72ºC y la Taq polimerasa incorpora los deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) a los
cebadores para completar la síntesis de una nueva cadena complementaria en la dirección 5´-> 3´ siguiendo la
cadena molde. Estos tres pasos constituye un ciclo de PCR.
Este proceso se repite durante 20-40 ciclos amplificando la secuencia objeto exponencialmente. La PCR se lleva
a cabo en un termociclador, instrumento que es programado para un rápido calentamiento, enfriamiento y
mantenimiento de las muestras durante varias veces. Una vez completado el primer ciclo, se dispone de 2 copias
de la muestra original, al final del segundo ciclo se tienen 4, al final del tercero 8, y así sucesivamente. Si los
ciclos se producen un número "n" de veces y suponiendo que el número de copias de DNA se duplica en cada
90
n
ciclo, se obtiene una cantidad de DNA de 2 , por lo que la amplificación se realiza en forma de progresión
geométrica. El producto amplificado es luego detectado por separación de la mezcla de reacción mediante
electroforesis en gel de agarosa.
Materiales Equipo
 Morteros y pistilo  Gabinete de bioseguridad
 Guantes de látex estériles  Centrifuga
 Puntas de Micropipetas  Horno de microondas
 Micropipeta de 100-1000 µl  Termociclador
 Tubos para Microcentrifuga de 1.5 ml  Cámara de electroforesis
 Alcohol  Fuente de poder
 Balanza analítica
 Hielo
 Transiluminador de luz uv
 Buffer de extracción CTAB (Tris 100 mM, pH = 8;
 Fotodocumentador
NaCl 1.4 M, EDTA50 mM, pH = 8; CTAB 2.5%,
 Fuente de voltaje
Polivinilpirolidona [PVP] 1%, 2-mercaptoetanol
 Molde para geles de agarosa
0.2%)
 Termomixer
 Cloroformo alcohol isoamilico
 Autoclave
 Etanol al 70%  Estufa de esterilización
 Agua nanopura estéril (grado inyectable)
 Marcador molecular de 100 pb
 Caja refrigerante de -20°C
 Tubos de reacción
 Oligonucleótidos
 Kit de PCR ( Go Taq PCR Core Systems l)
®
 Puntas de Micropipetas de 10 µl y 100 µl

 Micropipetas de 0.5-10 µl y 10-100 µl
 Matraz
 Probeta
 Bromuro de etidio
 Buffer TAE
 Agarosa
 Tejido vegetal de 2 especies distintas
 DNA de 2 especies vegetales
91
Fundamento
El método se basa en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas
reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones, el
tramo de DNA elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser
nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da
lugar a la amplificación geométrica del segmento de DNA delimitado por los cebadores o primers.
Procedimiento
1. Extracción del DNA
 Colóquese los guantes de látex y esterilizar la zona de trabajo.
 Pulverice 1 g de cada uno de los tejidos vegetales en un mortero limpio.
 Agregue 3 ml de Buffer de extracción CTAB y homogenice; tome 1.5 ml del homogenizado e incúbelo a
65°C durante 30 minutos en termomixer a 600 rpm
 Transcurrido el tiempo de incubación, centrifugue a 13,000 rpm por 5 min.
 Tome 700 µl (o menos) del sobrenadante y colóquelos en un tubo de microcentrifuga nuevo estéril y
agregue un volumen igual de cloroformo alcohol isoamilico (24:1), homogenice cuidadosamente con
pequeños golpecitos y centrifugue a 16,000 xg durante 10 minutos.
 Tome 500 µl del sobrenadante y colocarlo en otro microtubo nuevo estéril y agregar un volumen igual de
cloroformo alcohol isoamilico (24:1). Homogeniza cuidadosamente y centrifugar a 16,000 xg durante 10
minutos y colocar 450 µl del sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrifuga.
 Precipite el DNA con 0.8 volúmenes de isopropanol, incube en hielo durante 5 minutos, dar dos vórtex
manuales ligeros y centrifugue a 13,000 rpm durante 10 minutos.
 Elimine el sobrenadante con cuidado para evitar tomar la pastilla de DNA y agregar 450 µl de etanol al
70%, centrifugue a 13,000 rpm durante 10 minutos, elimine el sobrenadante y deje secar 10 minutos.
 Re-suspenda el DNA en 60 µl de agua nanopura estéril (libre de nucleasas), disuelva la pastilla de DNA
y almacene a -20°C hasta su uso.
2. Amplificación del DNA: Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR) en punto final

 Colóquese los guantes de látex y esterilice con alcohol la zona de trabajo.
 Realice los cálculos para generar una mezcla maestra o madre, que incluirá los componentes de
reacción para PCR indicados en la tabla 1.
 Prepare la mezcla maestra en un tubo de 1.5 ml, adicionando los componentes en el orden especifico
como se marca en la tabla 1. Cambie la puntilla de la micropipeta con cada componente de reacción.
 La Taq polimerasa es el penúltimo reactivo adicionado a la mezcla de reacción y debe mantenerse
dentro de la caja refrigerante -20°C hasta su uso.
92
 Después de preparar la mezcla maestra, se le dará un spin, se homogenizará y se alicuotará en los

tubos de reacción estériles de 0.5-ml.
 El DNA se agregara hasta el final y no se trabajara con el en la campana de preparación de mezclas
maestras.
 Programe las condiciones del termociclador, coloque las muestras en su carril correspondiente y
asegúrese que la tapa de los tubos está bien cerrada antes de correr el programa.
 Terminado el tiempo del programa, se debe de realizar una electroforesis en gel de agarosa para
observar resultados en el transiluminador de luz uv o bien almacenar el producto de la PCR a -20°C,
hasta su uso.
Tabla 1. Mezcla maestra con primers Gamma 1A y Gamma 1B
COMPONENTE CONCENTRACIÓN VOLUMEN PARA 1 VOLUMEN PARA CONCENTRACION

REACCION 2.5REACCIONES FINAL
MgCl2 25mM 2 µl 5 µl 2 mM
5X Green Go Taq® 5 µl 12.5 µl 1X
Flexi buffer
PCR nucleotide mix 10mM 0.4 µl 1 µl 160 µM
Forward primer 10 µM 2 µl 5 µl 0.8 µM
Reverse primer 10 µM 2 µl 5 µl 0.8 µM
DNA polimerasa 5U/ µl 0.2 µl 0.5 µl 1U
DNA N/A 1 µl 2.5 µl N/A
Agua libre de N/A 12.4 µl 31 µl N/A
nucleasas
3. Electroforesis en gel de agarosa y visualización de los productos de la PCR
 Colóquese los guantes de látex y esterilice con alcohol la zona de trabajo.

 Arme el molde del gel y coloque el peine adecuado al número de muestras.
 Mida en la probeta la cantidad de buffer TAE 1X necesario (preparación del buffer TAE 1X en la tabla 2.
 Mezcle el buffer TAE y la agarosa en un matraz de vidrio, tape con papel aluminio para impedir la salida
de vapores y caliente en el mechero hasta observar que la mezcla no tenga grumos.
 Apague el mechero y cuando el matraz de vidrio se encuentre a una temperatura adecuada para
manipularse con la mano, aproximadamente 55°C, adicione el bromuro de etidio (ver cantidad en la tabla
3), se mezclará y se verterá el contenido en el molde para gel.
 Espere hasta que el gel este solidificado, retire el peine y después coloque el gel en la cámara de
electroforesis.
 Llene la cámara con buffer TAE 1X.
93
 Prepare las muestras para ser colocadas dentro de los pozos del buffer. Coloque en el primer carril 3 µl
marcador de 100 pb + 1 µl de buffer de carga 6X y en los siguientes carriles 5 µl del producto de PCR de
cada una de las muestras.
 Al terminar de colocar las muestras, encienda la cámara de voltaje a 65 volts durante un tiempo
aproximado de 45 minutos.
 Observe los resultados en el transiluminador de luz ultravioleta, comparando los tamaños de bandas de
las muestras contralas bandas observadas en el marcador molecular colocado en el carril 1, y se
registraran tomando una fotografía con el fotodocumentador.
Tabla 2. Preparación del buffer TAE
Para preparar 1000 ml de buffer TAE 1X a partir de la solución stock de buffer TAE 40X, empleamos: (C1) (V1)= (C2) (V2)
(40X) (X) = (1X) (1000 ml)
X = (1) (1000 ml) / (40)
X = 25 ml
Por lo tanto, se deberá tomar 25 ml de buffer TAE 40X, y aforar con agua destilada hasta 1000 ml.
Tabla 3. Preparación de gel de agarosa 1%

Gel pequeño (10 pozos)
Componente Cantidad Concentración

Agarosa 0.40 g 1%
Buffer TAE 1X 40 ml 1X
Bromuro de etidio 1 µl ---
Conclusiones
Seguridad e higiene
94
Tanto los residuos como los desechos biológicos reciben el tratamiento adecuado para evitar contaminación.
Evaluación
curso.
1. ¿Qué importancia tiene la amplificación de DNA?
2. ¿Cuál es la diferencia entre la reacción de PCR y la replicación en las células?
3. ¿Cuál es la función de los 4 nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en una reacción de PCR?
4. ¿Por qué hay 2 diferentes cebadores o primers?
5. ¿Considera que esta metodología podría tener un impacto en su desarrollo profesional? Explique.
Bibliografía
Ausubel F., Brent R., Moore D., Seidman J., Smith J., Struhl K. 2003. Current protocols in molecular biology. Jonh
Wiley & Son Inc.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) en National Institutes of Healt (NIH). Disponible en Internet
< http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast >
Lewin, B, Genes IX, 2008, Jones and Bartlett Publishers, USA.
Tortora, Gerard J. Funke, B. y Case, C. 2007. Introducción a la Microbiología, 9ª Ed. Editorial Panamericana.
Saenz Peña, Chaco. “Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en Hipertextos del área de la Biología.
Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Agroindusrias. Argentina [publicación en línea]. Disponible en
Internet < http://www.biologia.edu.ar/bacterias/identificacion/1.htm >
Willey, Joanne M.Microbiología de Prescott Harley y Klein, 7ª. Edición. Editorial, McGraw Hill.
95

Anexos
Anexo 1. Preparación de colorantes y reactivos

1. Alcohol acetona
o Alcohol etílico (95%)..............................................................................................................................125 ml
o Acetona ................................................................................................................................................. 75 ml
2. Alcohol ácido (solución decolorante)
o Ácido clorhídrico concentrado ................................................................................................................3.0 ml
o Etanol (95%).......................................................................................................................................... 97 ml
o Preparación: Disolver el ácido en el alcohol suavemente.
3. Azul de lactofenol
o Ácido láctico ............................................................................................................................................20 ml
o Fenol ……................................................................................................................................................. 20 g
o Azul de anilina o azul algodón..…………………………………………………………..............................0,05 g
o Glicerol. ……………………………………………………………………………………. …………………… 40 ml
o Agua destilada …………………………………………………………………………………………………..2 0 ml
o Preparación: Disolver fenol en el ácido, glicero y agua calentando suavemente, luego agregar colorantes.
4. Azul de metileno: coloración simple
o Azul de metileno.......................................................................................................................................1.0 g
o Agua destilada......................................................................................................................................100 ml
5. Colorante para flagelos de Leifson:
o Solución A
 Fucsina básica ................................................................................................................................... 1,2 g
 Etanol 95%.......................................................................................................................................100 ml
o Solución B
 Ácido tánico........................................................................................................................................ 3.0 g
 Agua destilada..................................................................................................................................100 ml
o Solución C
 Cloruro sódico.....................................................................................................................................1,5 g
 Agua destilada.................................................................................................................................100 ml
 Mezclar cantidades iguales de las soluciones A, B y C y guardar 4°C en frasco cerrado herméticamente
6. Cristal violeta: Para tinción Gram y tinción simple.
o Cristal violeta (violeta de genciana)..................................................................................................... 1.0 g
o Agua destilada......................................................................................................................................100 ml
7. Fuchina diluida: Para tinción Gram y tinción simple.
o Fuchsina fenicada de Ziehl-Neelsen...................................................................................................10 ml
o Agua destilada.......................................................................................................................................100 ml
8. Fuchsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tinción ácido-alcohol resistente.
o Fuchina básica......................................................................................................................................... 0,3 g
o Etanol 95%...............................................................................................................................................10 ml
o Fenol………………………….................................................................................................................. 5. 0 g
o Agua destilada…………………………………………………………………………………………………. 100 ml
o Preparación: Disolver la fuchsina en el etanoly disolver el fenol, una vez fundido en el agua. Mezclar y
dejar reposar varios días y filtrar.
9. Lactofenol: Para preparaciones microscópicas en fresco de mohos.
o Ácido láctico...........................................................................................................................................100 ml
o Fenol.................................................................................................................................................... 100 g
o Glicerol................................................................................................................................................ 200 ml
o Agua......................................................................................................................................................100 ml
10. Lactofenol de azul Algodón: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos.
o Agua destilada ……………………………………………………………………………………………………20 ml
o Cristales de fenol Q.P……………………………………………………………………................................. 20 g
o Ácido láctico …………………………………………………………………………….………………………..20 ml
o Glicerina …………………………………………………………………………………………………………..20 ml
96
o Azul de algodón …………………………………………………………………….…………………………..0,05 g

o Preparación: Disolver el fenol en el agua, agregar el ácido y la glicerina, calentar a 70ºC, adicionar el
colorante y guardar en frasco de vidrio.
11. Lugol: Solución de yodo para tinción Gram
o Yodo...................................................................................................................................................... 1.0 g
o Yoduro potásico.......................................................................................................................................2.0 g
o Agua destilada....................................................................................................................................300 ml
o Preparación: combinar yodo y yoduro en un mortero, lavar el contenido de éste con agua destilada.
Agregar agua suficiente para obtener 300 ml. Almacenar la solución en frasco ámbar con tapón de vidrio.
12. Nigrosina de Dorner
o Nigrosina …............................................................................................................................................. 10 g
o Formol……………………………………………………………………………………..…………………… 0,5 ml
o Preparación: Añadir la nigrosina al agua y mezclar. Calentar en un baño de agua a 100ºC durante 20-30
min. Ajustar el volumen final a 100 ml con agua. Añadir el formol y filtrar.
13. Reactivo de Kovac
o Para-dimetil.amino-benzaldehido............................................................................................................ 5,0 g
o Alcoho amílico ………………………………………………………………….............................................. 75 ml
o Ácido clorhídrico …………………………………………………..........................…………………………..0,17 g
o Preparación: disolver el p-dimetil en el alcohol. Calentar suavemente la solución en un baño de água tíbia.
Una vez disueltos los ingredientes, agregar el ácido clorhídrico con cuidado. Guardar en frasco ámbar en
refrigeración.
14. Rojo de metilo
o Rojo de metilo ……................................................................................................................................. .0,2 g
o Alcohol etílico (95%)..............................................................................................................................600 ml
o Agua destilada.....................................................................................................................................1000 ml
o Preparación: Disolver el colorante en el alcohol a temperatura ambiente y añadir el agua.
15. Safranina para tinción Gram
o Safranina............................................................................................................................................... 0,25 g
o Alcohol etílico (95%)............................................................................................................................... 10 ml
o Preparación: Disolver el colorante en el alcohol, agregar el agua y filtrar.
16. Safranina al 0,5% para tinción de esporas
o Safranina................................................................................................................................................. 0,5 g
o Preparación: Disolver el colorante y filtrar.
17. Solución salina
o Cloruro de sodio .......................................................................................................................................1.0 g
o Agua destilada.................................................................................................................................... 100 ml
o Preparación: Disolver el cloruro en el agua por calentamiento suave, ajustar el pH a 6.6. Esterilizar a
121ºC durante 15 minutos.
18. Solución de acetato sódico al 0,5% (para identificación de ascosporas)
o Acetato de sodio .................................................................................................................................. 0,5 g
o Agua destilada...................................................................................................................................... 100 ml
o Preparación: Disolver el acetato en el agua por calentamiento suave, ajustar el pH a 6.6. Esterilizar a
121ºC durante 15 minutos.
19. Solución de fenol para desinfectar superficies
o Fenol ...................................................................................................................................................... 5.0 g
o Preparación: Disolver el fenol en agua destilada por calentamiento suave.
20. Solución de benzal para desinfectar superficies
o Benzal ................................................................................................................................................... l0 ml
o Agua destilada........................................................................................................................................ 90 ml
o Preparación: Disolver el benzal en agua destilada.
21. Verde de malaquita al 5%
o Verde de malaquita ................................................................................................................................. 5.0 g
o Disolver el colorante en agua, dejar reposar 90 min., filtar y guardar en frasco ámbar.
22. Verde de bromocresol al 0,05%
o Verde de bromocresol .......................................................................................................................... 0,05 g
97
o Alcohol (95%).........................................................................................................................................100 ml
o Preparación: Disolver el colorante en agua, dejar en reposo 1 hora y media. Filtar y guardar en frasco
ámbar.
98

Anexo 2. Preparación de medios de cultivo

1. Agua peptonada (diluyente para diluciones de muestras)
o Peptona ………………………...................................................................................................................1,0 g
o NaCl........................................................................................................................................................ 0,5 g
o Agua destilada ………………………………………………………………………………………………...1000 ml
o Preparación: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0
N. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 C. Si este diluyente no es usado inmediatamente,
almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5,0°C por un tiempo no mayor de un mes, en
condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
2. Agar Mossel
o Peptona de carne ……………………………………………………………………………………………....10,0 g
o Extracto de carne………………………………………………………………………………………………….1,0 g
o D (-) manita ………………………………………………………………………….….…………………….....10,0 g
o Cloruro de sodio .……………………………………………………………………….……………………….10,0 g
o Rojo de fenol …………………………………………………………………….…………………………... 0,025 g
o Agar ……………………………………………………………………………………...……………………….12,0 g
o Agua destilada …………………………………………………………………….…………………………. 1000 ml
o Preparación: Disolver los componentes en agua excepto el agar. Ajustar el pH a 7. Añadir el agar llevar a
ebullición. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Después de esterilizado, agregar 100 ml de una
emulsión de yema de huevo al 50% de polimixina B.
o Emulsión de yema de huevo: Huevos de gallina frescos, se lavan varias horas en etanol al 70%. Luego se
flamean y se abren asépticamente y bajo condiciones de esterilidad se separan las yemas de las claras.
Se mezclan homogéneamente 50 ml de yema con 50 ml de solución estéril de polimixina B, evitando la
formación de espuma.
o Polimixina B: solución estéril por filtración.
3. Agar EMB (eosine mutilen blue de Levine)
o Peptona de carne ……………….………………………………………………………………………………10,0 g
o Di-potasio hidrógeno fosfato…………………………………………………………………………………... 2,0 g
o Lactosa …………………………………………………………………………………………………………..10,0 g
o Eosina yellow …………………………………………………………………….……………………………. 0,04 g
o Azul de metileno ……………………………………………………………………..……………………… 0,065 g
o Agar …………………………………………………………………………………….………………………...15,0 g
ebullición. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.
4. Agar EMB (eosine mutilen blue de Levine)
o Peptona de carne ……………….……………………………………………………….……………………..10,0 g
o Di-potasio hidrógeno fosfato……………………………………………………………………………………. 2,0 g
o Lactosa …………………………………………………………………………………………………………. 10,0 g
o Eosina yellow …………………………………………………………………….…………………………….. 0,04 g
o Azul de metileno ……………………………………………………………………..………………………. 0,065 g
o Agar …………………………………………………………………………………….………………………...15,0 g
ebullición. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.
5. Agar hierro de Kligler
o Extracto de carne ……………….………………………………………………………………………………. 3,0 g
o Extracto de levadura ……………………………………………………………………………………………. 3,0 g
o Peptona.……………………………………………………………………………….………………………... 15,0 g
o Proteosa peptona……………………………………………………………………….……………………….. 5,0 g
o Lactosa……………………………………………………………………………….………………………… 10,0 g
o Glucosa ………………..……………………………………………………………….………………………... 1,0 g
99
o Sulfato ferroso……………………………………………………………………….……………………….… 0,02 g

o Cloruro de sodio ……………………………………………………………………….………………………... 5,0 g
o Tiosulfato de sodio ……………………………………………………………….…………………………….. 3,0 g
o Rojo fenol ……………………………………………………………….……………………………………. 0,024 g
o Agar …………………………………………………………………………………….………………………...12,0 g
ebullición. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Tubo en agar inclinado.
6. Agar citrato de Simmons
o Sulfato de magnesio .............................................................................................................................. 0,2 g
o Fosfato dihidrógeno amónico ………………………………………………………………………………..… 1,0 g
o Fosfato dipotásico ……………………………………………………………………………………………..... 1,0 g
o Citrato sódico …………………………………………………………………………..……………………….. 2,0 g
o Cloruro sódico …………………………………………………………………………………………………... 5,0 g
o Azul de bromotimol ………………………………………………………….………………………………... 0,08 g
o Agar …………………………………………………………………………………….………………………… 15 g
o Preparación: Disolver los componentes en agua excepto el agar. Ajustar el pH a 6,8. Añadir el agar llevar
a ebullición. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.
7. Agar CLED
o Peptona de gelatina ............................................................................................................................... 4,0 g
o Extracto de carne ………………………………………………………..…………………………………….. 3,0 g
o Triptona .................................................................................................................................................. 4,0 g
o Lactosa………………………………………………………………………………………............................... 10 g
o L-cictina………………………………………………………………………………...…............................... 0,13 g
o Azul de bromotimol ………………………………………………………………….……………………...… 0,02 g
o Agar……………………………………………………………………………………...……………………….... 15 g
o Preparación: Disolver los componentes en agua a excepción del agar, ajustar a pH 7,3, agregar el agar y
llevar a ebullición hasta disolver por completo. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
8. Caldo nutritivo
o Extracto de carne ................................................................................................................................... 3,0 g
o Peptona de carne.................................................................................................................................... 5,0 g
o Agua destilada ………………............................................................................................................. 1000 ml
o Preparación: Disolver los componentes en agua, ajustar a pH 7 y esterilizar en autoclave a 121ºC durante
15 minutos.
9. Caldo cerebro -corazón
o Infusión de cerebro ................................................................................................................................12,5 g
o Infusión de corazón............................................................................................................................... 10,0 g
o Proteosa-peptona................................................................................................................................. 10,0 g
o D (+) glucosa ......................................................................................................................................... 2,0 g
o Cloruro de sodio ………………………………………………………………………….……………………... 5,0 g
o Di-sodio hidrógeno fosfato …………………………………………………………………............................ 2,5 g
o Agua destilada …………………………………………………………………………................................1000 ml
o Peparación: Disolver los componentes en agua, ajustar a pH 7,4 y esterilizar en autoclave a 121ºC
durante 15 minutos.
10. Caldo tioglicolaton
o Peptona de casína................................................................................................................................. 15,0 g
o Extracto de levadura .............................................................................................................................. 5,0 g
o Proteosa-peptona................................................................................................................................. 10,0 g
o D (+) glucosa .......................................................................................................................................... 5,5 g
o Cloruro de sodio ………………………………………………………………………….……………………... 2,5 g
o Sodio tioglicolato ………………………………………………………………………………………………...2,5 g
o Resazurina sódica ………………………………………………………………….………………………... 0,001 g
o Peparación: Disolver los componentes en agua, ajustar a pH 7,1 y esterilizar en autoclave a 121ºC
durante 15 minutos.
11. Medio para asimilación de nitrógeno (identificación de levaduras)
o (NH4)2 SO4.............................................................................................................................................. 0,5 g
o KH2PO4 ………………………………………………………..…………………………..……………………... 0,1 g
100
oMgSO4.7H2O......................................................................................................................................... 0,05 g
oAgar……….………………………………………………………………………………..…………………….. 2,0 g
oAgua destilada …………………………………………………………………………................................ 100 ml
oPreparación: Disolver los componentes en agua a excepción del agar, ajustar a pH 7, agregar el agar y
12. Medio para asimilación de azúcares (identificación de levaduras)
o Glucosa ................................................................................................................................................... 2,0 g
o KH2PO4 ………………………………………………………..…………………………..……………………... 0,1 g
o MgSO4.7H2O........................................................................................................................................ .0,05 g
o Agar……….………………………………………………………………………………..…………………….. 2,0 g
o Agua destilada …………………………………………………………………………..................................100 ml
o Preparación: Disolver los componentes en agua a excepción del agar, ajustar a pH 7, agregar el agar y
13. Medio de Voges-proskauer
o Peptona................................................................................................................................................. 7,0 g
o Glucosa ................................................................................................................................................. 5,0 g
o Fosfato dipotásico ............................................................................................................................... 5,0 g
o Agua destilada………………………………………………………………………..…………………….1000 ml
o Preparación: Disolver en el agua todos los ingredientes por calentamiento suave a excepción del agar.
Ajustar el pH a 6,9. Agregar el agar, llevar a ebullición. Distribuir en tubos (8-10 ml), y esterilizar en
autoclave a 121ºC por 15 min.
14. Medio VL (para cultivo en profundidad)
o Peptona ....................................................................................................................................................10 g
o Cloruro de sodio ...................................................................................................................................... 5,0 g
o Extracto de carne .................................................................................................................................... 2,0 g
o Extracto de levadura ……………………………………………………………………………………………. 5,0 g
o Clorhidrato de L-cisteína ……………………………………………………………………………………..... 0, 3 g
o Glucosa …………………………………………………………………………………….……………………. 2,0 g
o Agar…………………………………………………………………………………...………………………...… 6,0 g
o Preparación: Disolver todos los componente en el agua . Ajustar el pH a 7,5 y calentar hasta la total
disolución del medio. Vaciar a tubo y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Dejar que el
agar solidifique en posición vertical.
101

Anexo 3. Características de algunos medios de cultivo
Medio de cultivo Tipo de medio Agente Azúcar fermentable Sistema Indicador

bacteriostático
ALRF (agar lactosa diferencial (no ----- lactosa rojo fenol
rojo fenol) selectivo)
Agar Cetrimide selectivo bromuro de ----- -----
cetiltrimetil amonio
Agar Mac Conkey selectivo y diferencial cristal violeta, sales lactosa rojo neutro
biliares
VRBA (violeta rojo selectivo y diferencial cristal violeta, sales lactosa rojo neutro
bilis agar) biliares
Manitol Salt Agar selectivo y diferencial cloruro de sodio manitol rojo fenol
(Chapman)
XLD agar (xilosa selectivo y diferencial desoxicolato de lactosa, xilosa, rojo fenol, citrato
lisina desoxicolato) sodio sacarosa férrico amónico y
tiosulfato de sodio
BiS agar (bismuto selectivo y diferencial verde brillante, sulfito glucosa indicador de sulfito
sulfito) de bismuto de Bi y sulfato
ferroso
Baird Parker agar selectivo y diferencial Cloruro de litio y ------ yema de huevo,
telurito de potasio telurito de potasio
TSB + 10% NaCl enriquecimiento cloruro de sodio ------ ------
selectivo
Caldo Tetrationato enriquecimiento Tetrationato, sales ------ ------
selectivo biliares
CLBVB (caldo enriquecimiento verde brillante, sales lactosa producción de gas
lactosa bilis verde selectivo biliares
brillante)
102

Anexo 4. Características de algunas pruebas bioquímicas
Medio de Propósito Inoculación Tratamiento Resultados

cultivo post-incubación
Agar de Almidón Producción de la 24-48 h/ 37ºC Yodo (2-3 gotas) Área clara alrededor Color negro
exoenzima del cultivo alrededor del
Amilasa cultivo
Agar con Gelatina Producción de la 24-48h/ 37ºC Colocar en Nevera Licuefacción de la Solidificación
exoenzima Pcadura sin tocar por 30 minutos gelatina
Gelatinasa el fondo
Rojo Fenol Determinar si la 24-48h/ 37ºC - Amarillo (producción Rojo, aumento del
Carbohidrato bacteria puede “loop” de ácidos, pH (producción de
 Dextrosa utilizar, ese fermentación del sustancias
 Mannitol carbohidrato carbohidrato) alcalinas por
 Lactosa Puede haber utilización de
 Sacarosa producción de gas peptonas)
Agar de Tres Ver el patrón de 18-28h/ 37ºC - Utilización de Utilización de

azucares y Hierro fermentación de 1-picadura glucosa peptonas
(TSIA) la bacteria 2-estría
Rojo Rojo
Amarillo Rojo
2
Utilización de
1 Lactosa y/o sucrosa
Amarillo
Amarillo
En ambos puede
haber producción de
gas y H2S (negro)
103
1. Determinar si la 24-48h/ 37ºC Para Indol: 2 a 3 Rojo (anillo) – Amarillo, la

SIM bacteria a través Picadura sin tocar gotas del reactivo presencia de indol bacteria no puede
de el fondo de Kovac (triptófano fue degradar el
Triptofanasas degradado). triptófano
puede degradar
el Triptófano a Medio de cultivo
indol. Negro (precipitado), se queda igual.
2. Determinar si producción de H2S
hay producción
de H2S a partir
de aminoácidos La bacteria sólo
azufrados Difuminación de la crece en la línea
3. Determinar si la bacteria hacia los de inoculación
bacteria es lados
móvil.
Caldo MR-VP Determinar 48h/ 37ºC 2 a 3 gotas de Rojo, presencia de Amarillo,no

Prueba de Rojo habilidad de las “loop” Rojo de Metilo ácidos, pH 4 producción de
de Metilo bacterias para (después de los ácidos estables.
producir ácidos siete días)
estables por
fermentación de la
glucosa
Prueba de Voges-
Proskauer Color rosa, No desarrollo de
Determinar la 48h/ 37ºC 10 gotas de α presencia de color rosa,
capacidad de “loop” naphtol acetoina ausencia de
producir acetoina 5 gotas KOH 40% acetoina
por fermentación
de la glucosa
Agar citrato de Utilización del 24-48h/ 37ºC -

Simmons citrato como única Estría Azul Verde
fuente de carbono.
Caldo de Urea Determinar si la 48h / 37ºC - Rosa intenso Medio permanece

bacteria degrada la “loop” igual
Urea
Agar de Nitrato Determinar si la 24-48 h/ 37ºC 1 gota de ácido

bacteria tiene la Estría sulfanílico Rojo Medio permanece
capacidad de 1 gota de α (sin echar el polvo igual (con el polvo
reducir nitratos a naphtilamina de zinc) de zinc cambia a
nitritos Polvo de Zinc rojo)
Catalasa: Agar Determinar si la 1 gota de H2O2 a Efervescencia Permanece igual

Nutritivo bacteria produce una colonia
catalasa para
degradar el H2O2.
104

Anexo 5. Guía para la elaboración de informes prácticos
Asignatura…………………………………………..
Grupo…………………………………………
Integrantes del equipo………………………………….............
……….………………………………….
……….………………………………….
INFORME PRÁCTICO NO.........

TITULO ……………………………………………………………………..
Competencia general:
Observaciones y resultados obtenidos:

(Utilice tablas, gráficos, fotografías, entre otros, que expresen los resultados concretos, sin detallar los métodos
utilizados que aparecen en el manual)
Conclusiones:
(Haga comentarios de sus conclusiones obtenidas a partir del análisis de las observaciones y resultados)
Fuentes consultadas:
(Cite adecuadamente las fuentes consultadas que utilizó, con el propósito de ampliar sus conocimientos sobre el
tema en cuestión)
105

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Instituto Tecnológico de Culiacán

Departamento de Ingeniería Química- Bioquímica