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Fundamentos Teóricos

• Decorre da interação Ac – Ag.

• Agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se


ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.;

• Agregação visível das partículas;

• A técnica é mais sensível do que as reações de precipitação.

Aplicações:
• Diagnóstico de Doenças Infeciosas;
• Diagnóstico de Doenças Auto-imunes;
• Tipagem sanguínea;
Fatores que influenciam a formação de agregados

• Classe do Ac envolvido;

• Concentração iónica e pH do meio;

• Presença de macromoléculas, iões, enzimas e conservantes;

• Tempo/ temperatura;

• Concentração ótima de Ag ou Ac;

• Estabilidade da ligação Ag/Ac;


Causas de Erros na Reação

• Tempo;

• Contaminação bacteriana;

• Lipemia;

• Hemólise;

• Pipetagem;
Vantagens VS Desvantagens

Vantagens Desvantagens

• Baixo custo • Baixa sensibilidade

• Boa especificidade • Reprodutibilidade dos lotes de

• Análise visual fácil reagentes

• Facilidade de execução • Acessibilidade molecular para


Ag/Ac
• Processo rápido
• Estabilidade da ligação Ag/Ac
Tipos de Reação
• Aglutinação Direta (Ativa)
• Sistema ABO
• Sistema Rh

• Aglutinação Indireta (Passiva)


• Teste Artri-Slidex
• Teste de Waller-Rose

• Aglutinação com anticorpos incompletos


• Teste de Coombs
Aglutinação Direta

• A reação baseia-se na deteção de anticorpos específicos mediante


emprego de antigénios conhecidos ou na identificação de antigénios
específicos por meio de sua reação com anticorpos conhecidos;

• O Ag faz parte naturalmente da célula e haverá aglutinação dessas células


promovida por anticorpo contra esses antigénio;

Ex: Sistema ABO


Aglutinação Direta
Aglutinação Direta
• Testes para a deteção de Ac específicos são realizados empregando-se
diluições em série do anticorpo face a uma quantidade constante de Ag;

• O resultado é expresso em “Titulação de Anticorpos” – máxima diluição


em que ocorre a aglutinação;
Titulação de Anticorpos
Sistema ABO
•O Sistema ABO foi descoberto no início do século XX, pelo
cientista austríaco Karl Landsteiner.
• Fez reagir amostras de sangue de diversas pessoas, isolou as hemácias e
fez diferentes combinações entre plasma e hemácias, tendo como resultado
a presença de aglutinação dos glóbulos em alguns casos e ausência noutros.

presença ou ausência de dois


antigénios (A e B) – aglutinogénios -
na superfície das hemácias
Sistema ABO
• Indivíduos do grupo O (dador universal) não
possuem nenhum dos dois antigénios

• Indivíduos do grupo A possuem apenas o


antigénio A, e portanto podem apresentar os
anticorpos anti-B;

• Indivíduos do grupo B possuem apenas o


antigénio B, e portanto podem apresentar os
anticorpos anti-A;

• Indivíduos do grupo AB (recetor universal)


possuem ambos os antigénios, e nenhum
anticorpo.
Da combinação entre o Sistema ABO e do Fator Rh, podemos encontrar os
chamados dadores universais (O negativo) e recetores universais (AB positivo).
Sistema AB0
➢ Utilizam-se Anticorpos Anti- A e Anti- B e mediante a
aglutinação desses anticorpos com as glicoproteínas à
superfície das células determina-se o grupo sanguíneo.

Tipo de
Grupo Tipo de
Aglutinogé
Sanguíneo Aglutinina
nio
A A Anti-B
B B Anti-A
AB AeB ----------
Anti-A e
0 ----------
Anti-B
Sistema Rh
• Landsteiner e Wiener, em 1940, com sangue de macaco do género Rhesus
verificaram que ao injetar o sangue em cobaias havia produção de
anticorpos contra as hemácias.
• Ao centrifugar o sangue das cobaias obteve-se o soro que continha
anticorpos anti-Rh e que poderia aglutinar as hemácias.

Descoberta de um antigénio de membrana que foi denominado Rh


(Rhesus)

• Três pares de genes estão envolvidos na herança do fator Rh

O gene R, dominante, determina a presença


do fator Rh, enquanto o gene r, recessivo,
condiciona a ausência do referido fator.
Sistema Rh
• Grupo de antigénios eritrocitários de grande importância
• Natureza glicoproteica Grande variabilidade

O individuo pode apresentar, ou não, este Ag à superfie das suas hemácias

Ag PRESENTE Rh positivo

Ag AUSENTE Rh negativo
Sistema Rh
- Possíveis transfusões
Sistema Rh - Procedimento do Teste
1. Preparar a suspensão de eritrócitos a 40% em solução fisiológica a 0,85%.
2. Colocar uma gota de Controle Rh na lâmina pré-aquecida (não obrigatoriamente) em aglutinoscópio,
facilitando a observação de reações fracas pelo efeito de iluminação e contraste.
3. Adicionar 2 gotas de suspensão de eritrócitos.
4. Misturar o reagente com a suspensão.
5. Movimentar suavemente a lâmina para promover a mistura e examinar a presença ou não de aglutinação.
6. Os testes que não apresentarem aglutinação, deverão ser observados por 2 minutos e não mais. Não
interpretar secagem periférica como aglutinação.
Sistema Rh
- Doença Hemolítica do Recém-Nascido (Eritroblastose)

• Destruição das hemácias do feto ou do recém-nascido


• Durante a gestação existe apenas a passagem de plasma entre
mãe/filho e vice-versa Barreira Hemato-Placentária

Acidentes vasculares na placenta permitem a passagem de


hemácias do feto para a circulação materna
Sistema Rh
- Doença Hemolítica do Recém-Nascido (Eritroblastose)
Sistema Rh
- Doença Hemolítica do Recém-Nascido (Eritroblastose)

O diagnostico pode ser feito:

Precocemente Durante a Gestação

Tipagem Sanguínea do pai e da mãe Teste de Coombs


Aglutinação Indireta (Passiva)
• Absorção de Ac ou Ag proteicos solúveis na superfície de
micropartículas inertes (suporte) – látex, leveduras, hemácias, etc.

Podem ser sensibilizadas por :

• Absorção passiva – contacto direto com os Ag solúveis;

• Absorção via agentes químicos –cloreto de crómio (por exemplo);

• Conjugação com o Ag – ligações químicas covalentes;

Grande
diversidade de Ag Aplicação muito
que se podem variada deste tipo de
ligar às células ou teste
partículas
Aglutinação Indireta (Passiva)
Dentro da aglutinação passiva há que distinguir dois casos específicos:

Teste de Artri-Slidex Teste de Waller-Rose

Teste Qualitativo Teste Quantitativo Teste Qualitativo Teste Semi-


Quantitativo
Teste de Artri-Slidex
• Teste também utilizado para diagnóstico de atrite reumatóide (doença auto-
imune). Dois terços dos doentes apresentam no sangue o factor reumático, ou
seja, uma IgM que tem a capacidade de se ligar à porção Fc das Ig G.

• Utilizam-se esferas de latex com IgG absorvido à superfície às quais se juntam o


soro do doente que se quer analisar.

• Caso exista aglutinação, pode-se concluir que o individuo sofre de atrite


reumatóide, já que o factor reumatóide se ligou à porção Fc da IgG que estava na
esfera de látex. Se não existir aglutinação, não existe o factor reumatóide no soro.
- Fator Reumatoide
O que é?

• O termo Fator Reumatoide (FR) engloba um grupo de auto-anticorpos das


classes IgG, IgM e IgA que têm em comum a capacidade de reagir com
diferentes epítopos da porção Fc da molécula da imunoglobulina G (IgG)
humana
•FR e a IgG unem-se para formar complexos imunes que contribuem para
causar doenças reumáticas.
• O risco de desenvolvimento de artrite reumatoide aumenta de forma
proporcional ao aumento da concentração de FR serve como marcador
para a doença
- Fator Reumatoide/ Artrite Reumatoide

• Os anticorpos IgG produzidos pelos linfócitos nas articulaçãos sinoviais


reagem com outros anticorpos IgG ou IgM, produzindo complexos imunes,
ativação do complemento e destruição tecidual.
• O FR está presente em cerca de 50-90% dos casos de AR clássicos, alguns
meses após o início da doença
• Durante a fase activa da doença, são encontradas concentrações mais
elevadas, que começam a decair à medida que o paciente evolui, mantendo-
se positivas em níveis baixos e estáveis e tornando-se a elevar nos períodos
de reactivação da doença.
Teste de Artri-Slidex - Procedimento
- Teste Qualitativo

- Interpretação dos Resultados

Analisar os resultados a olho nu sob uma fonte de luz branca de boa intensidade:
- O controle negativo não deverá apresentar nenhuma aglutinação;
- O controle positivo deverá apresentar aglutinação;
- NEGATIVO: não apresentam aglutinação visível (formando então mistura homogénea
com o látex).
- POSITIVO: apresentam aglutinação e deverão ser submetidas a prova quantitativa para
se obter o título.
Teste de Artri-Slidex - Procedimento

- Teste Quantitativo

- Interpretação dos Resultados

• Multiplicar o titulo obtido por 8,0.

Exemplo: aglutinação até a diluição 1:8 indica título 8 equivalente a 64 UI/mL (8 x


8 = 64).
Aglutinação passiva
Teste Waaler-Rose e Teste Arthri-Slidex
Teste de Waller-Rose
• É uma técnica de hemaglutinação em placa para a determinação direta e

semi-quantitativa de fatores reumatoides (FR). O antigénio, uma suspensão


de hemácias de ovelha sensibilizadas com fração IgG de soro de coelho anti-
hemácias de ovelha, aglutina em presença de fatores reumatoides.
Teste de Waller-Rose – Procedimento
- Teste Qualitativo
- Interpretação dos Resultados

POSITIVO: Presença de uma discreta aglutinação e a formação de um nítido halo central


(concentração das hemácias) dentro do minuto seguinte após finalização da reação, evitando
mover ou levantar a placa durante a observação. A presença de aglutinação indica um conteúdo de
fator reumatoide no soro igual ou superior a 8 UI/ml.
Os soros positivos podem ser titulados.
NEGATIVOS: Expressar o resultado como menor que 8UI/ml.
Teste de Waller-Rose – Procedimento
- Teste Semi-Quantitativo
- Interpretação dos Resultados

O título aproximado corresponderá à maior diluição do soro que apresentar aglutinação


claramente visível. A concentração aproximada de FR presente na amostra pode ser
obtida multiplicando-se o limite de sensibilidade (8UI/mL) pelo título obtido.

Exemplo:

Fração diluição = 1/8


Titulo Obtido = 8
Sensibilidade = 8UI/mL

[FR] = 8 x 8 = 64 UI/mL
Aglutinação com Anticorpos incompletos
- Teste de Coombs
O soro Anti-IgG (Soro de Coombs) destina-se à pesquisa de Ac da fração
gamaglobulina humana

Absorvidos às hemácias humanas Livres no plasma, o que se deteta


“in vivo” depois de absorção “in vitro”
Teste de Coombs Direto Teste de Coombs Indireto
Teste de Coombs Direto – Procedimento do Teste
1. Colocar num tudo de ensaio uma gota de suspensão de hemácias do paciente a 5% previamente preparadas
em solução salina a 0,9%.
2. Lavar por três vezes as hemácias com solução salina a 0,9%. Desprezar o sobrenadante, secando os bordos do
tubo na ultima lavagem para retirar toda a solução.
3. Acrescentar 2 gotas de soro Anti-IgG. Misturar bem.
4. Centrifugar a 3400rpm por 15 segundos.
5. Agitar suavemente o tubo para pesquisar ou não a presença de aglutinação.
Teste de Coombs Indireto – Procedimento do Teste
1. Colocar num tudo de ensaio uma gota de suspensão de hemácias a 5% escolhidas para o teste,
previamente preparadas em solução salina a 0,9%.
2. Adicionar duas gotas de soro a ser testado.
3. Acrescentar 2 gotas de Albumina Bovina a 22%
4. Incubar o tubo em banho-maria durante 15-30 minutos a 37ºC.
5. Lavar por três vezes as hemácias com solução salina a 0,9%. Desprezar o sobrenadante, secando os bordos
do tubo na ultima lavagem para retirar toda a solução.
6. Acrescentar 2 gotas de soro Anti-IgG. Misturar bem.
7. Centrifugar a 3400rpm por 15 segundos.
8. Agitar suavemente o tubo para pesquisar ou não a presença de aglutinação.
Imunofluorescência

O que é?

Técnica que permite a deteção ou a localização de


antigénios nos tecidos ou células a partir de
anticorpos conjugados- marcados com
fluorocromos, de modo que a detecção se torna
visível ao microscópio de fluorescência.
Anticorpos não visíveis a olho nu ...

Fluorocromos
O que são?
Substâncias capacitadas de absorver a luz
ultravioleta num determinado λ (espetro de
absorção) e emitem parte dessa energia sob a
forma de luz visível (λ superior- espetro de
emissão) - fluorescênia
Os mais ultilizados:
-Fluoresceína (FITC - isotiocianato de fluoresceína) - verde
-Rodamina (TRICT - isotiocianato de tetrametil rodamina) - vermelho

TRICT
FITC
• Os fluorocromos ligam-se á cauda do anticorpo através de
ligações covalentes

• São utilizados vários fluorocromos diferentes nos


laboratórios clínicos para imunofluorescência.

• Isotiocianato de fluoresceína e compostos da rodamina


são os fluorocromos mais usados para conjugação
com anticorpos para torná‐los fluorescentes sob
condições adequadas de iluminação.
Fluorescência – propriedade que algumas substâncias
possuem, após serem excitadas com radiação de baixo
comprimento de onda, resultando na emissão de radiação de
maior comprimento de onda.

Absorção de energia da luz ultravioleta e emissão de radiação


dentro do espectro da luz visível.
Vantagens Desvantagens

Permite o estudo e Preparações não


observação de células vivas definitivivas

Observação das
Maior intensidade preparações numa sala
escura

Melhor definição da
imagem
Fluorocromo
Anticorpo primário
Antigénio
Lâmina

A técnica de imunofluorescência directa utiliza um único anticorpo


(Ac) conjugando-o de forma directa com um fluorocromo. O anticorpo
específico marcado com fluorocromo vai reconhecer a molécula alvo,
ligando-se ao seu antigénio, formando assim um imunocomplexo
estável.
As etapas deste procedimento compreendem:

1. Através de uma punção ou de uma biópsia são obtidas amostras do


tecido a analisar (pele ou membrana mucosa);
2. As amostras são cortadas num comprimento de 3 a 5 mm de espessura.
3. Fixação do esfregaço da lâmina;
4. Tratamento com anticorpo marcado com o fluorocromo especifico;
5. Incubação;
6. Lavagem para remover excesso de anticorpos marcados não ligados;
7. Visualização no microscópio fluorescente.
Deteção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos, etc.
VANTAGENS DESVANTAGENS

❖ Especificidade ❖Muito dispendioso


devido a anticorpos ❖Subjetividade da
Imunofluorescência leitura
monoclonais
Directa ❖Necessidade de um
❖Possibilidade de
deteção de proteínas conjugado para cada
intracelulares e da antigénio que se quer
sua localização identificar
Detecção da bactéria Legionella através
da técnica de imunofluorescência
directa

Anti-soros são marcados directamente com o


fluorocromo FITC sendo utilizados para
detectar a bactéria causadora da doença
Legionella em secções histológicas, e em
células pulmonares.

Diagnóstico e confirmação de lúpus


eritematoso

Este exame avalia a presença de auto-


anticorpos sendo as amostras tratadas com
anticorpos anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA,
anticomplemento e antifibrinogénio humanos,
marcados com fluoresceína.
Esta técnica pode ajudar ainda na
diferenciação entre lúpus e outras doenças que
podem ter alterações clínicas e histológicas em
comum.
Neste tipo de imunofluorescência, além do anticorpo primário, é colocado um
anticorpo secundário. Este está conjugado a um fluorocromo, ou seja, o antígenio é detectado
indiretamente.

Fluorocromo
Anticorpo secundário
Anticorpo primário
Antígeno
Lâmina
1. Adição de um soro à lamina contendo anticorpos específicos para o Antigénio em questão
2. Lavagem da solução para retirar os anticorpos não fixados
3. Adição de anti-Ac conjugado com fluorocromo
4. Lavagem da solução para retirar os anti-Ac não conjugados
5. Montagem e observação em microscópio de imunofluorescência
Na dupla marcação, é imperativo que os anticorpos
primários sejam de diferentes espécies para não
ocorrerem reacções cruzadas entre anti-anticorpos com
diferentes fluorescências

Se tivermos uma proteina A e outra B que fazem


parte do mesmo componente e elas se ligarem a
Ac marcados com fluorescência (verde) e a Ac
marcados com rodamina (vermelho), irá existir
uma co-localização com emissão de luz amarela
VANTAGENS DESVANTAGENS
❖ Sensibilidade ❖ Necessidade de
❖ Especificidade microscópio de
❖Reprodutibilidade fluorescência
❖De simples ❖ Subjetividade na
padronização e Imunofluorescência leitura
execução Indireta
❖O mesmo conjugado
pode ser usado em
sistemas diferentes
❖Para determinar as
classes e subclasses de
anticorpos são
utilizados conjugados
específicos;
Método que utilizam
isótopos radioactivos, é
A especificidade do método altamente sensível.
vai depender diretamente
do tipo de anticorpos Quantidade na ordem
usados. dos picograma.
(1 pg = 10-12 g/ml).

Anticorpos Monoclonais Anticorpos Policlonais

São todos iguais e todos eles Mistura de anticorpos diferentes


reconhecem o mesmo epitopo do que reconhecem diferentes
mesmo antigénio. epitopos do mesmo antigénio.
IF Direta IF Indireta

Alta Combina especificidade


especificidade com sensibilidade

Ac-Monoclonais 1ºAc-Monoclonal +Especificidade


Aumentam a especificidade 2ºAc-Policlonal + Sensibilidade
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA VS IMUNOFLUORESCÊNCIA
INDIRETA

Sendo um método de elevada especificidade, o método direto


relativamente ao indireto apenas permite a pesquisa do Ag.
O método indireto possibilita uma fluorescência mais evidente,
uma vez que os Ac fluorescentes se podem associar apenas a Ac
primários.
O método indireto, além de permitir trabalhar com diversos Ac
primários específicos para diferentes tipos de Ag, é capaz de
identificar a classe a que pertence o Ac.
IFI VS IFD
Vantagens: maior sensibilidade, utilização do mesmo
conjugado para vários sistemas.

Desvantagens: menor especificidade, mais demorada,


maior número de reagentes.
Imunofluorescência VS Elisa

→ Imunofluorescência permite avaliar a qualidade da amostra, o


padrão de coloração e a localização morfológica
Permite identificar doenças que induzem a
produção de imunoglobulinas;
Identificar presença ou não de antigénio ou
anticorpo específico;
MUITO IMPORTANTE para avaliar a resposta
humoral.

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ELISA (Enzime Linked Immunosorbent
Assay)

Antigénio
Colorido
Enzima + Substrato Produto Fluorescente
Quimioluminescente
Anticorpo
Ensaio qualitativo
ELISA Ensaio quantitativo

Aplicações
As técnicas de
ELISA são
actualmente muito
utilizadas para
dosear marcadores
tumorais, antigénios
e anticorpos
microbianos,
hormonas, fracções
do complemento,
fármacos, etc.
Teste laboratorial imunoenzimático
Baseia-se na interação Antigénio-Anticorpo;
Recorre ao uso de cromogéneos.

Realiza-se:
Numa microplaca de 96 poços de
plástico com carácter hidrofílico
O fundo dos poços da placa com
polímero de carbono;
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Metodologia
Material

• Conjunto avidina-peroxidase
• Microplaca de 96 poços
(HRP)
revestida de anticorpos
• Diluente
• Anticorpo de detecção
• Substrato TMB
conjugado com Biotina
• Solução Stop
• Proteína padrão
• Tampão de lavagem

Anticorpo de Antigénio Anticorpo de Enzima para Substrato


captura detecção coloração colorido

As placas são As amostras Os anticorpos que Avidina conjugada O substrato é


revestidas com diluídas e o padrão contêm Biotina com a enzima adicionado a
o anticorpo são adicionados a são adicionados a (HRP) é adicionada cada poço.
primário cada poço e são cada poço e são a cada poço. Desenvolver
para a citocina. incubados. incubados. Desenvolver durante 15
(1-2 horas) (1-2 horas) durante 30 minutos.
minutos.
ELISA DIRECTO

Antigénio Anticorpo Enzima


conjugado SubstratoTMB
Peroxidase
ELISA INDIRECTO

Antigénio Anticorpo a ser detectado SubstratoTMB


Anticorpo inespecífico Anticorpo conjugado Enzima Peroxidase
ELISA SANDWICH

Antigénio a ser detectado Anticorpo primário Substrato TMB

Outros componentes do soro Anticorpo conjugado Enzima Peroxidase


A intensidade da cor depende da concentração de Ag no soro, sendo-lhe diretamente proporcional.

Imagem retirada de: Leinco Tecnologies, Inc. (http://www.leinco.com/sandwich_elisa)

Vídeo retirado de: https://www.youtube.com/watch?v=q8-bBetS00Q 65


Vantagem: sensibilidade (capacidade de detetar uma quantidade mínima de antigénio).

1) Adiciona-se ao suporte sólido um Ac monoclonal não marcado que se fixa à placa;


A. Deixar incubar a placa durante a noite

B. Efetuar uma lavagem (3x) com solução tampão para retirar o excesso de Ac;

2) Adiciona-se o soro do doente que contém ou não o Ag que queremos detetar;


A. Incubar 2h a temperatura ambiente

B. Efetuar outra lavagem (3x);

3) Adicionar o Ac de deteção marcado que se vai ligar ao Ag em estudo;


A. Incubar 2h a temperatura ambiente

B. Lavar (3x)

4) Adicionar uma enzima que se irá ligar ao anticorpo marcado;


A. Incubar

B. Lavar (5x)

5) Adiciona-se o substrato que ao reagir com a enzima desencadeia o aparecimento de uma


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1) Adição do Ac específico aos poços da placa seguido de lavagem.

2) Adição da solução com o Ag-teste (amostra do paciente) a ser pesquisado e lavagem

3) Adição de uma outra solução contendo Ag marcado no mesmo poço. Existe competição
entre estes dois Ags pelo Ac incubado para a formação do imunocomplexo e aquele que
tiver maior afinidade, ligar-se-á a mais Ac. Lavagem.

4) Adiciona-se o substrato. Caso o Ag marcado se tenha ligado aos Ac da placa, ocorrerá


reação enzimática e o cromogéneo será oxidado, havendo desenvolvimento de cor

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A intensidade da cor é inversamente
proporcional à concentração de Ag-
teste no soro, uma vez que quanto
mais Ag houver, menor será a
quantidade de Ag (marcado) que se
fixa e, consequentemente, menor
será o número de enzimas no meio.

✓ Dosagem de hormonas, marcadores tumorais e outras proteínas séricas.


✓ Diagnóstico sorológico de algumas doenças
✓ Dosagem de T3, T4, testosterona, estradiol, progesterona. 68
Vantagens

• Elevada especificidade e sensibilidade


• Elevado grau de confiabilidade como ensaio quantitativo
• Rápido e de fácil execução
• Custo baixo a médio
• Mais seguro e menos dispendioso do que as técnicas de RIA

Desvantagens

• Pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem


alterar os resultados
• A fragilidade das enzimas constitui um factor limitante
Constituído por papel de celulose com diferentes zonas:

• Linha de Controlo de Qualidade


Ac anti hCG em excesso

• Elisa Sandwich
Ac anti hCG monoclonais (marcados com
micropartículas de ouro coloidal) + Ag hCG

• Local onde se coloca a urina


Ac anti hCG que se liga ao correspondente Ag
hCG, na presença de urina
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ELISA – Dengue IgM
Baseia-se na técnica de ELISA de Captura para deteção de anticorpos da classe IgM
contra o vírus da Dengue no soro humano.

Os poços da placa são revestidos com anticorpo específico anti-IgM humana. As


amostras diluídas de soro e controlo são incubadas nas cavidades e a IgM presente
na amostra liga-se ao anticorpo específico anti-IgM humana.

Adiciona-se o antígeno do vírus da dengue (DV) às cavidades e, se IgM anti-DV


estiver presente na amostra, ocorre a ligação antígeno DV com IgM anti-DV.

Mudança de cor
POSITIVO
Exemplo: Dengue Vírus
IgM CaptureDxSelect™
da Focus Diagnostics.
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