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Aplicações:
• Diagnóstico de Doenças Infeciosas;
• Diagnóstico de Doenças Auto-imunes;
• Tipagem sanguínea;
Fatores que influenciam a formação de agregados
• Classe do Ac envolvido;
• Tempo/ temperatura;
• Tempo;
• Contaminação bacteriana;
• Lipemia;
• Hemólise;
• Pipetagem;
Vantagens VS Desvantagens
Vantagens Desvantagens
Tipo de
Grupo Tipo de
Aglutinogé
Sanguíneo Aglutinina
nio
A A Anti-B
B B Anti-A
AB AeB ----------
Anti-A e
0 ----------
Anti-B
Sistema Rh
• Landsteiner e Wiener, em 1940, com sangue de macaco do género Rhesus
verificaram que ao injetar o sangue em cobaias havia produção de
anticorpos contra as hemácias.
• Ao centrifugar o sangue das cobaias obteve-se o soro que continha
anticorpos anti-Rh e que poderia aglutinar as hemácias.
Ag PRESENTE Rh positivo
Ag AUSENTE Rh negativo
Sistema Rh
- Possíveis transfusões
Sistema Rh - Procedimento do Teste
1. Preparar a suspensão de eritrócitos a 40% em solução fisiológica a 0,85%.
2. Colocar uma gota de Controle Rh na lâmina pré-aquecida (não obrigatoriamente) em aglutinoscópio,
facilitando a observação de reações fracas pelo efeito de iluminação e contraste.
3. Adicionar 2 gotas de suspensão de eritrócitos.
4. Misturar o reagente com a suspensão.
5. Movimentar suavemente a lâmina para promover a mistura e examinar a presença ou não de aglutinação.
6. Os testes que não apresentarem aglutinação, deverão ser observados por 2 minutos e não mais. Não
interpretar secagem periférica como aglutinação.
Sistema Rh
- Doença Hemolítica do Recém-Nascido (Eritroblastose)
Grande
diversidade de Ag Aplicação muito
que se podem variada deste tipo de
ligar às células ou teste
partículas
Aglutinação Indireta (Passiva)
Dentro da aglutinação passiva há que distinguir dois casos específicos:
Analisar os resultados a olho nu sob uma fonte de luz branca de boa intensidade:
- O controle negativo não deverá apresentar nenhuma aglutinação;
- O controle positivo deverá apresentar aglutinação;
- NEGATIVO: não apresentam aglutinação visível (formando então mistura homogénea
com o látex).
- POSITIVO: apresentam aglutinação e deverão ser submetidas a prova quantitativa para
se obter o título.
Teste de Artri-Slidex - Procedimento
- Teste Quantitativo
Exemplo:
[FR] = 8 x 8 = 64 UI/mL
Aglutinação com Anticorpos incompletos
- Teste de Coombs
O soro Anti-IgG (Soro de Coombs) destina-se à pesquisa de Ac da fração
gamaglobulina humana
O que é?
Fluorocromos
O que são?
Substâncias capacitadas de absorver a luz
ultravioleta num determinado λ (espetro de
absorção) e emitem parte dessa energia sob a
forma de luz visível (λ superior- espetro de
emissão) - fluorescênia
Os mais ultilizados:
-Fluoresceína (FITC - isotiocianato de fluoresceína) - verde
-Rodamina (TRICT - isotiocianato de tetrametil rodamina) - vermelho
TRICT
FITC
• Os fluorocromos ligam-se á cauda do anticorpo através de
ligações covalentes
Observação das
Maior intensidade preparações numa sala
escura
Melhor definição da
imagem
Fluorocromo
Anticorpo primário
Antigénio
Lâmina
Fluorocromo
Anticorpo secundário
Anticorpo primário
Antígeno
Lâmina
1. Adição de um soro à lamina contendo anticorpos específicos para o Antigénio em questão
2. Lavagem da solução para retirar os anticorpos não fixados
3. Adição de anti-Ac conjugado com fluorocromo
4. Lavagem da solução para retirar os anti-Ac não conjugados
5. Montagem e observação em microscópio de imunofluorescência
Na dupla marcação, é imperativo que os anticorpos
primários sejam de diferentes espécies para não
ocorrerem reacções cruzadas entre anti-anticorpos com
diferentes fluorescências
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ELISA (Enzime Linked Immunosorbent
Assay)
Antigénio
Colorido
Enzima + Substrato Produto Fluorescente
Quimioluminescente
Anticorpo
Ensaio qualitativo
ELISA Ensaio quantitativo
Aplicações
As técnicas de
ELISA são
actualmente muito
utilizadas para
dosear marcadores
tumorais, antigénios
e anticorpos
microbianos,
hormonas, fracções
do complemento,
fármacos, etc.
Teste laboratorial imunoenzimático
Baseia-se na interação Antigénio-Anticorpo;
Recorre ao uso de cromogéneos.
Realiza-se:
Numa microplaca de 96 poços de
plástico com carácter hidrofílico
O fundo dos poços da placa com
polímero de carbono;
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Metodologia
Material
• Conjunto avidina-peroxidase
• Microplaca de 96 poços
(HRP)
revestida de anticorpos
• Diluente
• Anticorpo de detecção
• Substrato TMB
conjugado com Biotina
• Solução Stop
• Proteína padrão
• Tampão de lavagem
B. Efetuar uma lavagem (3x) com solução tampão para retirar o excesso de Ac;
B. Lavar (3x)
B. Lavar (5x)
3) Adição de uma outra solução contendo Ag marcado no mesmo poço. Existe competição
entre estes dois Ags pelo Ac incubado para a formação do imunocomplexo e aquele que
tiver maior afinidade, ligar-se-á a mais Ac. Lavagem.
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A intensidade da cor é inversamente
proporcional à concentração de Ag-
teste no soro, uma vez que quanto
mais Ag houver, menor será a
quantidade de Ag (marcado) que se
fixa e, consequentemente, menor
será o número de enzimas no meio.
Desvantagens
• Elisa Sandwich
Ac anti hCG monoclonais (marcados com
micropartículas de ouro coloidal) + Ag hCG
Mudança de cor
POSITIVO
Exemplo: Dengue Vírus
IgM CaptureDxSelect™
da Focus Diagnostics.
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