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Universidade do Algarve – Faculdade de Ciências e Tecnologia

Departamento de Química e Farmácia

Técnicas Separativas
Ano Letivo 2011 – 2012

Relatório 3

Electroforese

Grupo:

Nº Nome .

Nº Nome .

Nº Nome .

Turma: 17/04/2012

Curso: Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas

Resumo:
O objectivo do trabalho consiste no estudo por electroforese em papel da mobilidade de
três aminoácidos (ácido glutâmico, alanina e lisina) a um determinado valor de pH e da sua
eventual separação numa mistura ao mesmo valor de pH. Tendo em atenção os resultados
obtidos a vários valores de pH é possível fazer uma estimativa para os valores dos respectivos
pontos isoeléctricos.

Introdução:

Muitas moléculas biológicas apresentam carga eléctrica cujo valor e sinal depende das
suas características e também do pH e da composição do meio em que se encontram. Estas
moléculas carregadas electricamente (iões), quando colocadas num local onde é aplicado um
campo eléctrico, migram em solução para os eléctrodos de sinal contrário ao da sua carga
global. Na técnica que é designada por electroforese este fenómeno é utilizado para separar
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moléculas.

Para evitar fenómenos de convecção a electroforese pode ter lugar num meio de
suporte. Um dos meios de suporte que pode ser utilizado é o papel de filtro, o qual é
impregnado com uma solução tampão.

Na electroforese em papel a amostra é aplicada num ponto de uma tira de papel (origem)
a meia distância entre os compartimentos dos dois eléctrodos, cátodo e ânodo, de uma tina
para electroforese. Esses compartimentos contêm uma solução tampão de pH adequado.
Uma vez criado o campo eléctrico, as substâncias carregadas electricamente movimentam-se
no sentido do compartimento do eléctrodo de carga contrária (as com carga positiva para o
cátodo e as com carga negativa para o ânodo), com velocidades que dependem das suas
dimensões e da sua carga eléctrica. Para os aminoácidos a carga eléctrica será determinada
pelo valor do pH da solução tampão. A aplicação do campo eléctrico é feita por um período
de tempo inferior ao que seria necessário para que as substâncias atingissem os eléctrodos,
pelo que elas ficam separadas no papel em pontos intermédios entre os eléctrodos. As tiras
de papel são então submetidas a uma secagem rápida, para evitar a difusão das substâncias
separadas (outra das razões por que se usa um meio de suporte), e reveladas por um método
químico apropriado, que, no caso dos aminoácidos, será uma reacção com o reagente
químico ninidrina. Desta reacção, que se dá a quente em meio neutro ou ligeiramente
alcalino, resulta um composto corado de cor azulada.

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Numa solução tampão tem-se uma mistura de um ácido fraco com a sua base conjugada.
Exemplificando com o caso do ácido acético, o pH de uma solução contendo uma certa
quantidade da sua forma ácida (HAc) e da sua forma básica (Ac−), pode ser previsto com base
na eq. de Henderson – Hasselbalch:

[ HAc]
pH  pKa  log
[ Ac  ]

Se se pretende que o pH se mantenha constante, a razão entre as concentrações do ácido


e da base conjugada não deve ser senão ligeiramente alterada pela adição de pequenas

quantidades de ácido ou de base. A adição de ácido (H+) conduz à formação de HAc não

ionizado e consequente consumo do H+ adicionado:

H+ (aq) + Ac− (aq) → HAc (aq)

e a de base (OH−) conduz à ionização de HAc e consequente consumo do OH− adicionado:

HAc (aq) + OH− (aq) → Ac− (aq) + H2O

pelo que, se as concentrações de HAc e Ac− forem elevadas, as adições de H+ ou OH− terão

um efeito muito pequeno na razão [Ac−]/[HAc] e o pH será pouco afectado.

O poder tampão de uma solução tampão depende do volume da solução e das

concentrações dos seus componentes HAc e Ac−. Corresponde ao número de moles de H+ ou

OH− que é necessário adicionar a um litro de solução para que o seu pH varie de uma

unidade.

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Parte Experimental

a) Materiais

Para os ensaios em electroforese foi utilizada uma tina e uma fonte de alimentação para
electroforese, 4 tiras de papel Whatman 3 MM Chr (28 3 cm), medidor de pH e eléctrodos.
Foram ainda utilizados pulverizadores, secador e luvas.

b) Reagentes

Foram utilizados como aminoácidos (aa); o ácido glutâmico (Solução de ácido glutâmico a
0.5% p/v preparada com solução tampão), a alanina (Solução de alanina a 0.5% p/v
preparada com solução tampão) e a lisina (Solução de lisina a 0.5% p/v preparada com
solução tampão).
Foram utlizadas soluções tampão de pH=2 e pH=11, a solução contendo a mistura dos
três aa, cerveja e a solução de ninidrina com pH adequado.

c) Técnica

Depois de preparadas as duas soluções tampão de pH 2 e pH 11 e as soluções dos três


aminoácidos, procede-se à preparação do material para a realização de electroforese.
Desenha-se levemente a lápis uma linha transversal (origem) no centro das tiras de papel( 8
cm por 18 cm), assinalala-se o centro das linhas com uma pequena cruz e identifica-se a lápis
as tiras numa das extremidades com o nome da amostra a colocar, marcando as
extremidades catódica (com C) e anódica (com A).
Com uma micropipeta aplica-se na origem de cada uma das duas tiras de papel uma
pequena gota(10L), respectivamente, de cada uma das soluções ácido glutâmico, alanina,
lisina e mistura dos três aa, e secar imediatamente a tira com um secador para evitar a
difusão da gota.
De seguida pulveriza-se as tiras de papel com as soluções tampão(pH=2 para a tina 1 e
pH=11 para a tina 2) usando um pulverizador e protegendo a parte central da tira, que
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contém a amostra, com uma régua de plástico de modo a conservá-la seca e a evitar a
difusão da amostra.
Colocam-se as duas tiras de papel na tina de electroforese depois de a ter enchido com a
solução tampão.
Posteriormente ligam-se os eléctrodos à fonte de alimentação aplicando uma diferença
de potencial de 200 V durante trinta minutos.
Ao fim desse tempo desliga-se a fonte de alimentação, retirarando rapidamente da tina as
tiras de papel e secá-las rapidamente com um secador.
Pulveriza-se as tiras de papel secas com a solução reveladora de ninidrina de pH
adequado e aqueçê-as com o secador.
Por último com um lápis, delimita-se as manchas coradas que aparecerem nas tiras de
papel e mede-se as distâncias (em mm) da origem até ao centro de cada mancha.
O procedimento experimental é apresentado no anexo I.

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RESULTADOS E CÁLCULOS
a) RESULTADOS EXPERIMENTAIS

Tabela 1 – Distâncias percorridas por cada aminoácido

Distância percorrida (mm) Distância percorrida (mm)


pH=2 pH=11
Aminoácidos
Cátodo(+) Ânodo(-) Cátodo(+) Ânodo(-)

Ácido Glutâmico ---- 0 15 ----

Lisina ---- 6 15 ----

Alanina ---- 4 11 ----

Mistura dos três


aminiácidos ---- 17 6 ----

Cerveja ---- 3 no no
no- não observável

Tabela 2 – Distâncias percorridas por cada aminoácido de outro grupo de trabalho

Distância percorrida (mm) Distância percorrida (mm)


pH=2 pH=11
Aminoácidos
Cátodo(+) Ânodo(-) Cátodo(+) Ânodo(-)

Ácido Glutâmico ---- 28 10 ----

Lisina ---- 51 23,5 ----

Alanina ---- 45 51,5 ----

Mistura dos três


aminiácidos ---- 27; 39; 61 18,5; 26; 45,5 ----

Cerveja ---- 10 41 no

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b) CÁLCULOS

Fórmulas estruturais para as formas predominantes dos aminoácidos ao valor de pH a que foi
realizada a electroforese
Alanina – aminoácido apolar

CH3 CH3
 
HC – NH3 + HC – NH2
 
COOH COO-

Em meio fortemente ácido Em meio fortemente básico

Lisina – aminoácido polar com dois grupos básicos

NH3+ NH2
 
(CH2)4 (CH2)4
 
CHNH3+ CHNH2
 
COOH COO-
Em meio fortemente ácido Em meio fortemente básico

Ácido Glutâmico – aminoácido polar

+
H3N – CH – COOH H2N – CH – COO-
 
CH2 CH2
 
CH2 CH2
 
COOH COO-

Em meio fortemente ácido Em meio fortemente básico

Tabela 3 - Carga eléctrica das espécies predominantes dos aminoácidos ao pH a que foi
realizada a electroforese
Carga
Aminoácidos
pH=2 pH=12

Ácido Glutâmico + -

Lisina + -

Alanina + -

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Tabela 4 – Pontos Isoeléctricos dos aminoácidos, PI

Aminoácidos pK

-COOH NH3 Outro(R) PI

Ácido 4,25 [pKa(COO-)+pKa(COO-)]/2


2,19 9,67
Glutâmico (carboxil) 3,22

10,53 [pKa(NH3+)+pKa(NH3+)]/2
Lisina 2,18 8,95
(-amino) 9.74

[pKa(COO-)+ pKa(NH3+)]/2
Alanina 2,34 9,69
6.02

Ponto isoeléctrico - valor de pH para o qual a carga global do aminoácido é neutra e que,
consequentemente, não permite que o aminoácido se mova num campo eléctrico.

DISCUSSÃO DE RESULTADOS

Com a solução tampão de pH 2 não houve deslocamento no ácido glutâmico pois o PI é


muito próximo deste valor não havendo por isso migração para qualquer direcção. Todos os
outros sofreram um deslocamento no sentido do pólo negativo uma vez que neste pH
predominam cargas positivas e por isso migram no sentido da carga contrária. O que sofreu
maior deslocamento foi a mistura dos três aminoácidos.
Com a solução tampão de pH 11 todos eles sofreram deslocamento no sentido do pólo
positivo uma vez que neste pH predominam cargas negativas e por isso migram no sentido da
carga contrária. O maior deslocamento foi o do ácido glutâmico e da lisina.
A mistura dos três aminoácidos obteve o maior deslocamento na solução de pH 2.
Comparativamente com os valores obtidos por outro grupo de trabalho, os
deslocamentos efetuados foram muito maiores tendo sido a alanina com o maior deslocamento.
Ao contrário do nosso, foi observável na mistura dos três aminoácidos os três deslocamentos.
Em ambos os grupos na amostra de cerveja o único aminoácido encontrado foi a alanina.

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O uso da Ninidrina é essencial para evidenciar aminoácidos, pois ela reage com os grupos
amino livres das soluções.
O uso das duas soluções tampão foi essencial pois a migração ocorre de acordo com o
grau de ionização, tamanho e forma da molécula e das características da solução tampão
onde se realiza o processo.
As frações nas quais predominam as cargas negativas, o aminoácido dirige-se para o
ânodo (pólo positivo) e as positivas, migram para o cátodo (pólo negativo). Como a carga do
aminoácido depende da concentração do ião hidrogénio da solução, o pH deve ser
especificado e mantido constante durante o procedimento.
A carga líquida de um aminoácido depende do número de cadeias ionizáveis, o valor
do pK e o pH do meio. O pH onde a soma cargas negativas é igual a das cargas positivas é
denominado ponto isoelétrico (pI) do aminoácido. Quando submetido a um campo eléctrico
como na eletroforese, um aminoácido no seu pI não migra em qualquer direção. O pI varia
de um aminoácido para outro e depende dos valores individuais de pK de todos os grupos
ionizáveis presentes nas cadeias laterais dos aminoácidos e dos extremos das cadeias
polipeptídicas.
Em pH maior do que o pI o aminoácido tem carga negativa efetiva. Em pH menor do
que o pI a proteína tem carga positiva efetiva. A magnitude da carga elétrica efetiva de
umaminoácido é função da distância entre o pH e o pI.

CONCLUSÃO

A electroforese tem como objetivo separar os aminoácidos de acordo com a sua carga
elétrica. Neste ensaio realizou–se a separação de misturas de aminoácidos, isso é possível,
pois o grupo R dos aminoácidos relaciona-se de forma diferente com soluções a pH
diferentes. A alanina tem um grupo ácido e outro grupo básico, o ácido glutâmico tem dois
grupos ácidos e a lisina dois grupos básicos Dessa forma foram evidenciadas algumas
propriedades dos aminoácidos e assim pôde–se caracterizá–los de acordo com sua carga.
Conclui–se que os dados obtidos no ensaio foram os esperados uma vez que todos eles
migraram de acordo com a sua carga elécrica.

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A electroforese é um método em que a migração ocorre de acordo com o grau de
ionização, tamanho, forma da molécula, características da solução tampão onde se realiza o
processo, da força do campo eléctrico, da porosidade, viscosidade e da temperatura.
As frações nas quais predominam as cargas negativas, a proteína se dirige para o
ânodo (pólo positivo) e as positivas, migram para o cátodo (pólo negativo). Como a carga
depende da concentração do ião hidrogénio da solução, o pH deve ser especificado e
mantido constante durante o procedimento, o que será uma das causas de erro do método.
A electroforese não é adequada para a determinação de compostos voláteis, não
polares e de massa molecular baixa, sendo melhores determinados por cromatografia
gasosa.

BIBLIOGRAFIA

[1] – “Manual de boas práticas e tratamento de resultados em Química Analítica” AR Garcia, I


Cavaco, Universidade do Algarve, 2007

[2] – M. Melvin, Electrophoresis, ed. ACOL, John Wiley & Sons, Chichester, 1987.

[3] – J.R. Sargent, Methods in Zone Electrophoresis, BDH Chemicals Ltd, Poole, 1969.

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ANEXO I

A Parte experimental
Material
Tina para electroforese Fonte de alimentação para electroforese
2 tiras de papel Whatman 3 MM Chr (18 × 8 cm)
Medidor de pH e eléctrodos Secador
Pulverizadores Micropipetas
Luvas

Reagentes
Solução tampão de pH 2 e pH 11
Solução de ácido glutâmico a 0.5% (solução 1).
Solução de alanina a 0.5% (solução 2).
Solução de lisina a 0.5% (solução 3).
Solução contendo uma mistura dos três aminoácidos (solução 4).
Cerveja (solução 5).
Solução de ninidrina com pH adequado

Procedimento experimental

Electroforese: preparação do material e realização experimental

Obs. prévia: A pulverização com ninidrina deverá ser efectuada na “hotte”. Usar sempre
luvas para manusear as tiras de papel.

• Desenhar levemente a lápis uma linha transversal (origem) no centro das tiras de papel,
assinalar o centro das linhas com uma pequena cruz, identificar a lápis as tiras numa das
extremidades com o nome da amostra a colocar e marcar as extremidades catódica (com
C) e anódica (com A).

• Com uma micropipeta aplicar na origem de cada uma das duas tiras de papel uma
pequena gota(10L), respectivamente, de cada uma das soluções 1, 2, 3, 4 e 5 e secar
imediatamente a tira com um secador para evitar a difusão da gota.

• Pulverizar as tiras de papel com a solução tampão usando um pulverizador e protegendo


a parte central da tira, que contém a amostra, com uma régua de plástico de modo a
conservá-la seca e a evitar a difusão da amostra.

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• Colocar as quatro tiras de papel na tina de electroforese depois de a ter enchido com a
solução tampão.
• Ligar os eléctrodos à fonte de alimentação e aplicar uma diferença de potencial de
200 V durante trinta minutos.

• Ao fim desse tempo desligar a fonte de alimentação, retirar rapidamente da tina as


tiras de papel e secá-las rapidamente com um secador.

• Pulverizar as tiras de papel secas com a solução reveladora de ninidrina de pH


adequado e aqueçê-las com o secador.

• Com um lápis, delimitar as manchas coradas que aparecerem nas tiras de papel e
medir as distâncias (em mm) da origem até ao centro de cada mancha.

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