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Introdução à Cromatografia

em Fase Gasosa

Humberto Ribeiro Bizzo


23 e 24 de agosto de 2016
Programa

• Histórico
• Teoria do processo cromatográfico
• Cromatografia capilar X empacotada
• Seleção de Colunas
• Injetores e técnicas de injeção
• Detectores
• Análise Qualitativa
• Análise Quantitativa
O que é cromatografia?

• É uma técnica de separação dos componentes de


uma mistura.

• A separação ocorre em função dos diferentes


equilíbrios de distribuição dos componentes em
duas fases imiscíveis distintas.
O que é cromatografia?

• Para duas substâncias, A e B:

CA na fase 1 CB na fase 1
KA= KB=
CA na fase 2 CB na fase 2

Para haver separação entre A e B: KA  KB


Tipos de cromatografia

• Classificadas em 4 grupos, de acordo com o


fenômeno físico ou químico envolvido no processo
de separação.

• Adsorção
• Partição
• Troca iônica
• Exclusão por tamanho
Tipos de cromatografia

• Adsorção
– Cromatografia líquido-sólido em coluna aberta
– Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
– Cromatografia em papel
– Cromatografia em camada delgada
– Cromatografia radial
– Cromatografia em coluna gás-sólido (CG)
• Colunas empacotadas
• Colunas tubulares abertas (capilares)
Tipos de cromatografia

• Partição
– Cromatografia líquido-líquido em coluna aberta
– Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
– Cromatografia em papel
– Cromatografia em camada delgada
– Cromatografia radial
– Cromatografia contra corrente
– Cromatografia em coluna gás-líquido
• Colunas empacotadas
• Colunas tubulares abertas (capilares)
Tipos de cromatografia

• Troca iônica
– Cromatografia líquido-sólido: cromatografia de íons
– Cromatografia em papel
– Cromatografia em camada delgada
– Cromatografia por afinidade
Tipos de cromatografia

• Exclusão por tamanho


– Cromatografia de filtração em gel
– Cromatografia de permeação em gel
– Cromatografia com peneiras moleculares
Histórico
• Runge 1834-1850
– Separação de extratos de plantas e pigmentos com papel
– Soluções salinas em papel
Histórico

• Tswett 1906
– Separação de pigmentos de plantas

M. Twsett, Ber. Deut. Bot. Ges.,1906, 34, 316.


Histórico

• Izmailov e Schraiber 1938


– Análise de extrato de planta em placa de vidro recoberta
com alumina

• Meinhard e Hall 1949


– Adição de amido ao suporte para melhorar resistência
mecânica
Histórico

• Kirchner 1951: “chromatostrips”


– Método de eluente ascendente
– Separação de terpenos
Histórico

• Stahl 1956
– Série de artigos sobre “Thin Layer Chromatography”
– Descreve técnicas, materiais
– Emprega gel de sílica como suporte e gesso como ligante

• Stahl e colaboradores 1965


– “Thin Layer Chromatography – A Laboratory Handbook”
– Merck inicia a comercialização de placas prontas para uso
– Gel de sílica nach Stahl (segundo Stahl)
Histórico

• Tiselius 1940
– Desenvolvimento da eletroforese
– Prêmio Nobel 1948
Histórico

• Em 1941, A. J. P. Martin e R. L. M. Synge, descrevem a


cromatografia de partição líquido-líquido aplicando-a à análise
de aminoácidos.
Biochemical Journal, 1941, 35, 1358.

• Neste trabalho, escrevem: “A fase móvel não precisa ser um


líquido, mas pode ser um vapor...”
Histórico - CG

• Em 1952, A. T. James e A. J. P. Martin descrevem a


cromatografia de partição gas-líquido aplicando-a à análise de
ácidos graxos voláteis, separando os homólogos do ácido
fórmico ao dodecanóico.

Biochemical Journal, 1952, 50, 679.


Pausa para meditação:

• O que é um cromatograma?
O que é um cromatograma?

• Representação gráfica da variação de um sinal


elétrico versus tempo.

Intensidade
de sinal

Tempo em min
Histórico

Biochemical Journal, 1952, 50, 679.


Histórico
Histórico (Pré-)
1,50 m

1,80 m

Um moderno cromatógrafo nos anos 1950


Histórico - CG

60 cm

1m
Cromatógrafo anos 1960
Histórico - CG

Cromatógrafo anos 1980


Histórico - CG

Anos 1990-2005
Histórico - CG

Por enquanto...
Histórico - CG
28 cm

55 cm

15 cm

Cromatógrafo portátil (de campo)


Histórico - CG
Projeto Viking (anos 1970).
Veículo Curiosity (2012).

Cromatógrafo portátil em Marte:


http://ssed.gsfc.nasa.gov/sam/samiam.html
Histórico - CG

• Golay, em 1957, introduz as colunas capilares.


– Aumento da eficiência de separação

• Em 1979, Dandeneau e Zerenner iniciam a


utilização de sílica fundida para a confecção das
colunas.
Histórico - CG

• Anos 1970 e 1980:


– desenvolvimento de detectores seletivos

– automação do processo de introdução de


amostra (injetores automáticos)

– uso de computadores para quantificação e


processamento dos dados analíticos
Histórico - CG

• Anos 1970 e 1980:


– desenvolvimento de técnicas hifenadas:
• CG/EM
• CG/IV
• CG/CG (cromatografia multidimensional)
Histórico - CG

• Anos 1990:
– automação dos controles pneumáticos

– operação e controle em rede (network)

– cromatógrafos portáteis

– geradores de gases
O que é um cromatógrafo?
O que é um cromatógrafo a gás?
Para que usar cromatografia?

• Separação de componentes de uma mistura.

• Quantificação e identificação dos


componentes de uma mistura.
Separação

Gasolina
Quantificação

• A área de um pico é proporcional à


quantidade de substância presente na
amostra.
A quantificação pode ser:

• Relativa:
– O componente “x” corresponde a 27% do total da
amostra.

• Absoluta, com o uso de um padrão:


– A área do pico “x” no cromatograma corresponde
a 41 pg.
Identificação

• Injeção de padrões

• Detectores espectrométricos
– espectrometria de massas (CG e CLAE)
– espectroscopia no infravermelho (CG)
– espectroscopia no ultravioleta (CLAE)
– ressonância magnética nuclear (CLAE)
Identificação

A bundance

T IC : L E M O N 1 .D

900000

800000

700000

600000
H O
500000

400000

300000

200000 Neral
100000

5 .0 0 1 0 .0 0 1 5 .0 0 2 0 .0 0 2 5 .0 0 3 0 .0 0 3 5 .0 0 4 0 .0 0 4 5 .0 0
T im e - - >
Area Percent Report
Identificação

A b u n d a n c e

S c a n 3 1 0 0 (1 6 . 3 3 5 m in ): L E M O N 1 . D
6 9
9 0 0 0 4 1
8 0 0 0
7 0 0 0
6 0 0 0
5 0 0 0
4 0 0 0 9 4
8 4 1 0 9
3 0 0 0
2 0 0 0 5 3 5 9
1 1 9
1 0 0 0 7 7 1 3 7
1 0 3 1 5 2
0
3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0
m / z -->
A b u n d a n c e

# 3 7 9 3 9 : N E R A L
4 1 6 9
9 0 0 0
8 0 0 0
7 0 0 0
6 0 0 0
5 0 0 0
4 0 0 0 9 4 1 0 9
3 0 0 0 5 3 8 1

2 0 0 0 5 9 1 1 9
1 0 0 0 1 3 7
7 5 1 0 3 1 2 5 1 5 2
0
3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0
m / z -->
Identificação

A b u n d a n c e

T I C : L E M O N 2 . D

9 5 0 0 0 0

9 0 0 0 0 0

8 5 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0

7 5 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0

6 5 0 0 0 0 B
6 0 0 0 0 0

5 5 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0
A
1 5 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0

1 7 . 0 0 1 8 . 0 0 1 9 . 0 0 2 0 . 0 0 2 1 . 0 0 2 2 . 0 0 2 3 . 0 0 2 4 . 0 0 2 5 . 0 0 2 6 . 0 0 2 7 . 0 0 2 8 . 0 0 2 9 . 0 0 3 0 . 0 0 3 1 . 0 0
T im e -->
Identificação
A b u n d a n c e

S c a n 4 8 7 7 ( 2 3 . 9 3 3 m i n ) : L E M O N 2 . D
9 3 1 1 9
1 0 5 0 0

1 0 0 0 0

9 5 0 0

9 0 0 0

8 5 0 0

8 0 0 0

7 5 0 0

7 0 0 0

6
5

0
0

0
0

0 A
5 5 0 0

5 0 0 0

4 5 0 0
6 9
4 0 0 0 1 0 7
4 1
3 5 0 0

3 0 0 0

7 9
2 5 0 0
5 5
2 0 0 0

1 5 0 0

1 0 0 0 1 6 1
1 3 3
5 0 0 1 4 7 1 8 9
2 0 4

0
3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0
m / z - - >
A b u n d a n c e

S c a n 5 0 8 0 ( 2 4 . 8 0 1 m i n ) : L E M O N 2 . D
1 1 9

1 6 0 0 0 0 9 3

1 5 0 0 0 0

1 4 0 0 0 0

1 3 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0

1 1 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

9 0 0 0 0

8 0 0 0 0
B
7 0 0 0 0

6 9
6 0 0 0 0
4 1 1 0 7
5 0 0 0 0

7 9
4 0 0 0 0
5 5
3 0 0 0 0

2 0 0 0 0
1 6 1
1 0 0 0 0 1 3 3
1 4 7 1 8 9 2 0 4
1 7 5
0
3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0
m / z - - >
Identificação

A b uu nn d d a a n nc ce e

S cS ac na n 4 58 07 87 0 ( (22 34 . 9
8 03 13 mm i inn ) ): : L LE EM M O O N N2 .2 D . D
9 3 1 11 99
1 0 5 0 0 9 3
1 6 0 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0
9 5 0 0

1 4 9 0 00 00 00

1 3 8 0 50 00 00

8 0 0 0
1 2 0 0 0 0
7 5 0 0
1 1 0 0 0 0
7 0 0 0

1 0 6 0 50 00 00

6 0 0 0
9 0 0 0 0
5 5 0 0
8 0 0 0 0
5 0 0 0

7 4 0 50 00 00

6 9
4 0 0 0 6 9 1 0 7
6 0 0 0 0
44 11
3 5 0 0 1 0 7
5 0 0 0 0
3 0 0 0
7 9
4 2 0 50 00 00 7 9
5 5
5 5
3 2 0 00 00 00

1 5 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 1 6 1
1 6 1
1 3 3
1 0 0 0 0 1 3 3
5 0 0 1 4 7 11 88 9 9
1 4 7 22 00 44
1 7 5
00
33 0 44 00 5 00 6 00 7 00 8 00 9 00 1 00 00 1 11 00 1 22 00 1 33 00 1 44 00 1 55 00 11 66 00 11 77 00 11 88 00 11 99 0 0 22 00 0 0 22 11 0 0
m / z - -- >>
Limitações da CG (ma non troppo...)

• A amostra deve ser:


– volátil
– termoestável
Limitações da CG

• O que é substância volátil:


– A rigor, é aquela que tem um ponto de ebulição fixo a uma
determinada temperatura.

– Em termos práticos, para CG, esse ponto de ebulição deve


ser inferior a 400ºC.
Limitações da CG

• A volatilidade e a termoestabilidade podem ser alteradas por


modificações químicas nos analitos.

Silanização
O OH O Si(CH 3)3
HO (H 3C) 3Si
(CH3)3SiCl
HO OH (H3C) 3Si Si(CH 3)3

OH Si(CH 3)3

Esterificação
O CH2N2 O

OH OCH 3
Limitações da CG

• Em alguns casos, a decomposição térmica é


desejável. Os produtos de decomposição permitem
caracterizar os analitos geradores.

• Esta é a técnica de pirólise.


Limitações da CLAE

• Uso de solventes (custo e contaminação ambiental)


– Caso da acetonitrila

• A amostra tem que ser solúvel na fase móvel:

– Isso é crítico. Qualquer material sólido entope a coluna.


– Coluna entupida é coluna perdida!!!
Limitações da CLAE

• A resolução é menor quando comparada à cromatografia


gasosa.

– Separação difícil de amostras com muitos componentes.


Limitações da CLAE

• Os componentes da amostra têm que ter alguma propriedade


compatível com os detectores:

– Cromóforos (UV / Fluorescência)


– Não podem ser mais voláteis que a fase móvel (detector
evaporativo)
Limitações da CLAE
• A falta de cromóforos pode ser contornada com reações de
derivatização. Na CLAE as reações podem ser realizadas
antes ou após a separação da amostra na coluna.
Literatura - Livros
• Cromatografia: princípios básicos e técnicas afins. F. Radler Aquino
Neto, D. S. Souza Nunes, ed. Interciência, 2003. (R$ 47,00)

• Fundamentos de cromatografia. Carol H. Collins, Gilberto L. Braga,


Pierina S. Bonato, Editora Unicamp, 2011, (R$ 32,00).

• Modern practice of gas chromatography. 4th ed. R. Grob,


John Wiley & Sons, 2004. US$ 125.00

• Basic gas chromatography. H M McNair, J M Miller, John Wiley & Sons,


1998. US$ 42.00

• Analytical gas chromatography. 2nd ed. W. Jennings, Academic Press,


1997. US$ 78.00
Literatura - Revistas

• Advances in Chromatography
• Analytical Chemistry
• Chromatographia
• Journal of Chromatographic Sciences
• Journal of Chromatography
• Journal of High Resolution Chromatography
• Journal of Separation Science
• LC-GC
• Separation Science and Technology
Recursos on-line

• www.chromatography-online.org
• www.earl2learn.com
• teaching.shu.ac.uk
• www.danispa.it
• www.waters.com
• www.agilent.com
• www.justchromatography.com
Teoria do processo cromatográfico
Teoria

• Tipos de separação:

– Adsorção  cromatografia gás-sólido

– Partição  cromatografia gás-líquido


Teoria

• No caso da cromatografia gás-sólido a


separação deve-se à adsorção do analito na
fase estacionária.
Teoria
• A partição na coluna cromatográfica é semelhante
àquela que ocorre no funil de separação, no laboratório
de química orgânica, quando se faz a extração de um
soluto com dois solventes imiscíveis.
Teoria

• A seguir, parâmetros para avaliação do processo


cromatográfico:
Partição

• Constante de distribuição:

concentração na fase líquida


KD=
concentração na fase gasosa
Partição

• Para duas substâncias, A e B:

CA na fase líquida CB na fase líquida


KA= KB=
CA na fase gasosa CB na fase gasosa

Para haver separação entre A e B: KA  KB


Partição

C na fase líquida m/V na f líquida m na f líquida V na f gasosa


KD= = = X
C na fase gasosa m/V na f gasosa m na f gasosa V na f líquida

k: fator de capacidade : razão de fase


ou razão de
distribuição de massa
Fator de capacidade

m na fase líquida
k=
m na fase gasosa

O fator de capacidade (ou razão de distribuição de


massa) está associada ao tempo em que a amostra
permanece na fase líquida.

tR’
k=
tM

tM = tempo de retenção da fase móvel


Partição

• Razão fase:

= r
2df

Onde r é o raio da coluna e


df é a espessura da fase estacionária
Partição

• A razão de fase, , é alta para colunas capilares.

• r pode ter valores de 0,025 a 0,260 mm.

• df tem valores de 0,10 a 100 m.


= r
2df

• Caso típico: r= 0,125mm e df = 0,25m.

•  = 0,25mm / 2 (0,00025mm) = 250


Partição

• Relação entre KD, k e :

KD= k
Pausa: o pico cromatográfico

• Pico ideal: formato simétrico.


Pausa: o pico cromatográfico

• Tempo de retenção (tR ):


– é o tempo que um analito leva para percorrer toda a
extensão da coluna

• Tempo de retenção corrigido (tR’)


– é o tempo de retenção do analito menos o tempo de
retenção de uma substância não retida (o próprio gás de
arraste, por exemplo).

tR’ = tR - tM
Pausa: o pico cromatográfico
Teoria

• Dois modelos fisico-químicos podem ser usados


para descrever o processo de separação:

• Pratos teóricos (semelhante à destilação fracionada);

• Taxas (transferência de massa entre as fases, difusão do


soluto na coluna e hidrodinâmica da fase móvel).
Pratos teóricos

A separação dos componentes é


baseada no equilíbrio de fases.
Separação: equilíbrio de fases
Número de pratos teóricos

2
(tR ) tR 2
n= w 2 = 16
b
wb
4
Número de pratos teóricos
Num cromatograma, é mais fácil medir a largura
do pico a meia altura do que a largura da base.

(tR)2 tR 2
n= w 2 = 5,545
h wh
2,354
Número de pratos teóricos

O tempo que qualquer substância permanece


na fase gasosa é sempre o mesmo.

PORQUE

A velocidade de qualquer substância na fase


gasosa é sempre a mesma, ou seja, é a
velocidade da própria fase móvel.
Número de pratos teóricos efetivos

• Assim, o número de pratos teóricos efetivos é


calculado usando-se o tempo de retenção corrigido.

tR 2 tR’ 2
n= 5,545 N= 5,545
wh wh
Número de pratos teóricos

• Para uma substância injetada em duas colunas de mesmo


comprimento, foram observados seguintes dados de operação:
• Coluna 1: tR 5 min; wh 1 mm;
• Coluna 2: tR 7 min; wh 2 mm;
• Qual coluna tem mais pratos teóricos?

tR 2
n= 5,545
wh
Altura do prato teórico

• A altura equivalente de um prato teório (HETP) é:

L
h=
n

onde L é o comprimento da coluna


Altura do prato teórico

• Qual coluna é mais eficiente na separação:

• Uma com 100m e 3000 pratos/cm ou uma com 30 m e 8000


pratos/cm?
Altura do prato teórico

• Quanto menor for a altura equivalente de um prato teórico,


mais eficiente é a coluna.

• Quantos mais pratos teóricos tiver, mais eficiente é a coluna.


Teoria das Taxas
• A separação cromatográfica ocorre em função:
– Difusão ordinária das moléculas do soluto, que é função do
movimento das moléculas, colisão;
– Difusão na trajetória, quando esta é não uniforme, isto é,
diferentes moléculas podem percorrer diferentes caminhos;
– Condições locais (pontuais) de não equilíbrio.
Teoria das Taxas
• Difusão ordinária das moléculas do soluto, que é função do
movimento das moléculas, colisões, sua energia cinética.

Em que situação
poderia ser
observada esta
distribuição?
Teoria das Taxas
• Difusão na trajetória (eddy diffusion), quando esta é não
uniforme, isto é, diferentes moléculas podem percorrer
diferentes caminhos.
• É independente da velocidade da fase móvel.
• É dependente do tamanho das partículas da fase estacionária.
Teoria das Taxas
• Difusão na trajetória (eddy diffusion), quando esta é não
uniforme, isto é, diferentes moléculas podem percorrer
diferentes caminhos
Teoria das Taxas
• Condições locais (pontuais) de não equilíbrio
Teoria das Taxas
• Condições locais (pontuais) de não equilíbrio
A equação de Van Deemter

h = A + B/ + C 

onde:
 A corresponde à difusão caótica da amostra
(variações no fluxo de gás)
 B corresponde à difusão axial da amostra
 C é um termo associado à resistência de
transferência de massa
A equação de Van Deemter

h = A + B/ + C 
A equação de Van Deemter

B = 2Dg C = Cg + Cl

onde:
 Dg é o coeficiente de difusão do soluto na fase
gasosa
 Cg e Cl correspondem à resistência à transferência
de massa na fase gasosa e líquida
A equação de Van Deemter
A equação de Van Deemter

Para colunas capilares, A  0 e C  Cg

h = B/ + Cg 

 O fator Cl depende da espessura da fase


estacionária, que é muito pequena em colunas
capilares.
A equação de Van Deemter

• O termo Cg é diretamente proporcional ao quadrado


do raio da coluna.

• Dg é, em geral, um valor pequeno.

• Conseqüência: para colunas capilares, quanto menor


o raio da coluna, menor a altura de um prato teórico
e, desse modo, mais eficiente é a coluna.
A equação de Van Deemter

h = B/ + Cg 
A equação de Van Deemter
A equação de Van Deemter
A equação de Van Deemter
Temperatura X Viscosidade da fase móvel
Temperatura X Viscosidade da fase móvel
Fator de seletividade

• É a relação entre os tempos de retenção de dois


componentes de uma amostra.

t’R2
=
t’R1
Resolução

• É uma medida da separação de dois componentes


de uma amostra.

• Depende das larguras e dos tempos de retenção


dos picos.
Resolução

2 (tRB – tRA)
R= w +w
A B
Resolução

Sendo:
coluna 1
tRA = 7,5 e tRB = 10 wA = 3 mm e wB = 2 mm
coluna 2
tRA = 12 e tRB = 16 wA = 0,5 mm e wB = 0,7 mm

Qual coluna apresenta melhor resolução?

2 (tRB – tRA)
R= w +w
A B
Colunas para Cromatografia
Colunas para cromatografia

• Empacotadas (packed)

• Capilares
Capilar X Empacotada
Colunas empacotadas
Colunas empacotadas

• Primeiras colunas utilizadas

• Confeccionadas em:
– cobre
– aço
– vidro
Colunas empacotadas

• Fase estacionária adsorvida em suporte


sólido

• Coluna recheada com o suporte


Vantagens da coluna empacotada

• Uma grande quantidade de amostra pode


ser injetada

• Muito mais barata

• Pode ser feita em casa com facilidade


Vantagens das novas
colunas empacotadas

A fabricação tem incorporado tecnologia das colunas


capilares:

• fase ligada quimicamente (bonded phase)

• utilização de novos materias para confecção das


colunas, com alta inércia
Coluna empacotada
Coluna empacotada “moderna”
Coluna empacotada “moderna”
Tipos de adsorventes

• Alumina
• Sílica
• Carvão ativo grafitado
• Polímeros orgânicos (Porapak®)
• Terra de diatoamácea (Chromosorb®)
• Peneiras moleculares
Terra de diatomácea
• É o esqueleto de algas diatomáceas, organismos unicelulares.
Os esqueletos individuais são muito pequenos, porosos e têm
grande área superficial.
Terra de diatoamácea
• A composição química é de micro partículas de sílica amorfa,
contendo algumas impurezas como óxidos metálicos.
Peneira molecular
• São compostos sintéticos, as zeólitas.
• Zeólitas são silico-aluminatos, arranjados espacialmente de
modo que há formação de cavidades internas.
Peneira molecular
• Os poros de acesso a essas cavidades têm diâmetro controlado
no processo de síntese, variando de 3 a 15 Aº (3 X 10-10m).
Peneira molecular

• São os melhores suportes para a separação de


gases, água e pequenas moléculas.

• A entrada (ou não) de uma molécula na cavidade, e


a sua permanência lá, determinam o tempo de
retenção daquele analito.
Aplicações mais comuns

• Análise de gases (Por que?)

• Análise de resíduos de pesticidas (Por que?)


Colunas capilares
Colunas capilares

Filme de poliimida

Fase estacionária

Capilar de sílica fundida


Colunas capilares
Colunas capilares
Tipos de coluna capilar

• WCOT: wall coated open tubular

• SCOT: suppot coated open tubular

• PLOT: porous layer open tubular


Tipos de coluna capilar
Coluna PLOT

• Nas colunas PLOT, a superfície interna recebe


tratamento químico (NH3, HCl, HF).

• Com isso, forma-se uma camada porosa, que pode


ter espessura da ordem de 20m.
Diferenças entre SCOT e PLOT

• SCOT: camada interna é recoberta com material


finamente particulado.

• PLOT: tratamento químico provoca formação de


porosidade na parede interna da coluna.
Semelhanças entre SCOT e PLOT

• Ambas podem ser utilizadas para a obtenção de


colunas capilares para cromatografia de adsorção.

• A superfície (SCOT) ou os poros (PLOT) podem ser


preenchidos com adsorventes tipo peneiras
moleculares, alumina, sílica, carvão ativo e outros.
Semelhança SCOT e PLOT

• Ambas podem ser utilizadas também para a


obtenção de colunas capilares para cromatografia de
partição.

• A superfície (SCOT) pode ser preenchida com


adsorventes já contendo filmes líquidos de fases
estacionárias, como nas colunas empacotadas.
Semelhanças entre SCOT e PLOT

• A camada porosa (PLOT) pode ser preenchida com


adsorventes ou diretamente com filmes líquidos de
fases estacionárias.
Fases estacionárias: DB-1
Composição: dimetilpolissiloxano
CH3 (ou metilpolissiloxano)

O Si O Polaridade: apolar
CH3
Faixa de operação: 50-325ºC
100%

Características: baixa seletividade, excelente estabilidade térmica,


separa os componentes em função de seus pontos de ebulição.

Nomes comerciais: SE-30, OV-1, OV-101, DB-1, SPB-1, BP-1, HP-1,


ULTRA-1, RTx-1, AT-1, CPSil-5

Usos: solventes, derivados de petróleo, produtos farmacêuticos,


ceras.
Fases estacionárias: DB-5
Composição:
5% difenilpolissiloxano
CH3
95% dimetilpolissiloxano
O Si O
O Si O
Polaridade: apolar
CH3

Faixa de operação: 50-325ºC


95% 5%

Características: similar à metilpolissiloxano, porém um pouco mais


seletiva; excelente estabilidade térmica.

Nomes comerciais: SE-54, OV-23, DB-5, SPB-5, BP-5, HP-5,


ULTRA 2, RTx-5, CPSil-8

Usos: aromas, amostras ambientais, hidrocarbonetos aromáticos.


Fases estacionárias: DB-17
Composição: fenilmetilpolissiloxano

Polaridade: média
O Si O
Faixa de operação: 40-325ºC
CH3

100%
Características: Maior seletividade devido ao alto conteúdo de grupos
fenila. Maior retenção para substâncias similares quando comparada às
fases de metilpolissiloxano. Boa estabilidade térmica.

Nomes comerciais: OV-17, DB-17, SPB-7, BP-10, HP-17, RTx-17, AT-50.

Usos: triglicerídeos, esteróis, fenóis, ftalatos, hidrocarbonetos


poliaromáticos (PAH), açúcares, amostras biológicas (drogas).
Fases estacionárias: DB-225
NC
CH 2 Composição:
H2C 50% fenilcianopropil
CH3
CH 2 50% dimetilpolissiloxano
O Si O O Si O
CH3 Polaridade: polar

50% Faixa de operação: 40-240ºC


50%

Características: Eficiente separação de substâncias polares. Baixa


estabilidade térmica.

Nomes comerciais: HP-225, SP-2330, CP-Sil 43 CB, Rtx-225, BP-


225, OV-225, 007-225, AT-225.

Usos: FAME (ésteres metílicos de ácidos graxos),carboidratos.


Fases estacionárias: DB-210
CF 3 Composição:
H2C
CH3
50% trifluoropropilmetil
CH 2 50% dimetilpolissiloxano
H2C O Si O

O Si O CH3 Polaridade: polar


CH3
50%
Faixa de operação: 40-300ºC
50%

Características: Seletividade para substâncias com par de elétrons


não ligados e grupos carbonila. As substâncias oxigenadas eluem
na ordem éter, hidróxi, éster e ceto. Boa estabilidade térmica.

Nomes comerciais: DB-210, RTx-200, HP-210.

Usos: Pesticidas clorados, fenóis, nitroaromáticos e benzenos


policlorados (PCB).
Fases estacionárias: DB-Wax
H H Composição: 100% polietilenoglicol

O O Polaridade: polar
H H
Faixa de operação: 20-260ºC

Características: Ótima seletividade para substâncias que podem fazer


ligação hidrogênio. Muito útil na análise de misturas complexas de
oxigenados. Degrada-se na presença de oxigênio (O2). Não
recomendada para amostras com agentes de silanização.

Nomes comerciais: DB-Wax, Carbowax 20M, Supelcowax 10, Super-


ox, CPWax-52, Stabilwax, BP-20, HP-20M, AT-Wax, InnoWax.

Usos: FAME, aromas, fragrâncias, aminas, solventes, ácidos.


Fases estacionárias: FFAP
COOH
H H Composição:
NO 2
Polietilenoglicol modificado
O O
com ácido 2-nitrotereftálico
H H COOH
Polaridade: polar

Faixa de operação: 20-260ºC

Características: Boa estabilidade térmica. Sofre degradação na


presença de oxigênio (O2, contaminante na fase móvel). Sensível à
presença de agentes de silanização na amostra.

Nomes comerciais: OV-351, DB-Wax, SP-1000, AT-1000, HP-FFAP,


AT-1000.

Usos: Ácidos graxos livres (Free Fatty Acids Phase), FAME


Fases estacionárias: Líquidos Iônicos
O O O F 3C O O
F 3C
S
N
-
S S
- S
O Composição: Líquidos iônicos
CF 3 O N
O CF 3
Polaridade: média a polar.
+ +
N N N
N

Faixa de operação: 40-280ºC

Características: Boa estabilidade térmica. Pode ser usada com


amostra aquosa (detecção de solventes em água). A SLB-IL111 é a
fase mais polar disponível comercialmente.

Nomes comerciais:SLB-IL60, SLB-IL82, SLB-IL100, SLB-IL111


Diferentes polaridades

Usos: petróleo, FAME, fragrâncias, solventes.


Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Natureza da amostra
– quantidade de componentes
– faixa de peso molecular
– polaridade
– estabilidade térmica
– reatividade
– faixa de concentração (concentrado/traço)
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Condições de análise
– alta temperatura  fase deve ser estável
– reatividade (amostras agressivas)
– faixa de concentração (concentrado/traço)
– detector de massas  colunas com baixo
sangramento
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Caso 1: análise de gases leves
– cromatografia de adsorção
– coluna empacotada com peneiras moleculares
– opção: coluna PLOT ou SCOT de adsorção
– custo/benefício: rapidez e resolução para as capilares
(amostra complexa)
– baixo custo da empacotada, para amostras simples
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Caso 1: análise de gases leves
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Caso 2: análise de ácidos graxos
– cromatografia de partição
– amostra polar: utilizar fase polar
– fases mais usadas: DB-225, CPSil-88, SP2340
– se a faixa de eluição é muito grande, com altas
temperaturas, utilizar coluna termoestável
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Caso 2: análise de ácidos graxos
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Caso 3: análise de amostras ambientais
– cromatografia de partição
– coluna empacotada (amostra simples, pequena quantidade,
temperatura baixa a moderada)
– coluna capilar (amostra complexa, alta temperatura)
– fase de baixa polaridade: DB-1, DB-5
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Caso 3: análise de amostras ambientais
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Caso 3: análise de amostras ambientais
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Caso 4: derivados de petróleo
– cromatografia de partição
– coluna capilar (amostra complexa, grande faixa de
temperatura)
– utilizar coluna inerte em função de contaminantes
presentes
– Fases apolares/baixa polaridade: DB-1
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Caso 4: derivados de petróleo
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Caso 5: óleos essenciais
– cromatografia de partição
– coluna capilar (amostra complexa, grande faixa de
temperatura)
– Fases apolares/baixa polaridade: DB-1, DB-5
– Fases polares: Carbowax 20M (álcoois e outros)
Passo a passo para a escolha da
coluna cromatográfica
• Caso 5: óleos essenciais
• Outros fatores para a escolha da coluna
– Velocidade do gás X diâmetro da coluna
• Outros fatores para a escolha da coluna
– Capacidade da coluna
• Outros fatores para a escolha da coluna
– Eficiência da coluna
Injetores
Injeção da amostra

• É a introdução da amostra no cromatógrafo.

• A forma mais comum é a injeção da amostra líquida,


dissolvida em um solvente volátil.
Injeção da amostra

• A amostra também pode ser injetada como um gás


ou vapor.

• Outra forma de injeção é a dessorção térmica da


amostra, adsorvida ou particionada em um suporte
ou fase estacionária.
Tipos de injetores

• Direto

• Split/splitless (com/sem divisão de fluxo)

• PTV (programmed temperature vaporizer)

• On-column
Injetor direto

• Toda a amostra contida na seringa entra na coluna.

• A amostra é vaporizada no injetor, que está


aquecido.

• A amostra na fase vapor é empurrada, pelo gás de


arraste, para dentro da coluna.

• Usado para injeção em colunas empacotadas.


Injetor direto
Injetor split/splitless

• Injetor mais usado, resolve 95% das necessidades


de injeção.

• Amostras muito diluídas, em quantidades traço, são


injetadas no modo splitless.
Injetor split/splitless

• Modo split, com divisão de fluxo:


– uma fração da amostra, entre 1/20 a 1/200, entra na coluna
para análise
– o restante é descartado

• Esse é um recurso para evitar sobrecarga da coluna


capilar.
Injetor split/splitless

• Modo splitless, sem divisão de fluxo:


– todo o volume de amostra injetado vai para dentro da
coluna
– após um tempo determinado, a saída de fluxo é aberta,
para eliminar o solvente residual

• Este modo de injeção é utilizado com amostras


diluídas, como resíduos de pesticidas e aromas.
Injetor split/splitless

• O modo splitless é o ideal para ser utilizado quando se injeta


uma amostra sem solvente, através de dessorção ou injeção de
gases.
Injetor Split/Splitless
Injetor Split/Splitless
 Injeção no modo split.

http://www.restek.com/images/animations/animation_split/Split
_Animation_content.html
http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/sound.html
Injetor Split/Splitless
 Injeção no modo split: razão de split.
Injetor Split/Splitless
 Injeção no modo split: linearidade do split.
Injetor Split/Splitless
 Injeção no modo splitless.
Injetor Split/Splitless
 Injeção no modo splitless: tempo de abertura do split.
Injetor Split/Splitless
 Injeção no modo splitless: discriminação por abertura
prematura do split.
Injetor Split/Splitless
 Injeção no modo splitless: focalização é necessária.
Injetor Split/Splitless
 Animações: The Transparent Injector

Recursos na Internet:

http://www.restek.com/images/animations/animation_split/Split
_Animation_content.html

http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/sound.html
Injetor PTV

• O injetor PTV (vaporizador de temperatura


programada) permite:
– injeção da amostra a frio
– injeção de grande volume de amostra

• Este injetor opera no modo split/splitless.


Injetor PTV

• A injeção da amostra a frio pode ser feita para


substâncias termolábeis.

• Para vaporizar o material, o injetor é aquecido


rapidamente (até 720ºC/min), de modo que a
amostra destile para dentro da coluna antes de se
decompor.
Injetor PTV

• Na injeção de grandes volumes de amostra (10-


20L), ele opera em uma temperatura ligeiramente
acima do ponto de ebulição do solvente.

• O solvente evapora e é eliminado pelo split,


enquanto que a amostra fica retida, condensada nas
paredes do injetor.

• Terminada a eliminação do solvente, o injetor é


rapidamente aquecido, vaporizando a amostra e
fazendo com que ela entre na coluna.
Injetor PTV

• Isso permite concentrar os analitos da amostra de


10 a 20 vezes em relação à concentração original.

• O aquecimento do injetor é muito rápido, para evitar


que haja alargamento da banda de eluição da
amostra.
Injetor PTV
Injetor PTV
Injetor on-column

• Injeção de amostras termo-sensíveis.

• Injeção de amostras muito diluídas (análise de


traços).

• A amostra é injetada dentro da coluna capilar,


utilizando-se uma seringa cuja ponta é também um
capilar, de diâmetro menor que o da coluna.
Injetor on-column
Problemas na injeção

• Backflash

• Alargamento de picos do solvente e amostra.


– utilização de lacuna de retenção
– utilização de focalização da amostra

• Discriminação dos componentes da amostra.

• Amostra não volátil / termolábil.


Problemas na injeção

• Backflash: expansão do solvente para fora do liner. Causa


alargamento dos picos e contaminação das partes do injetor.

Volumes de expansão para líquidos a 250ºC e 15 psig

Ponto de ebulição Volume de expansão


Solvente
(ºC) (mL)
Acetona 56 290
Acetonitrila 85 405
Dissulfeto de carbono 46 355
Acetato de etila 77 215
Isoctano 99 130
Metanol 65 525
Diclorometano 40 330
n-Hexano 69 165
Tolueno 111 200
Água 100 1180
Tipos de liner
Lacuna de retenção
Lacuna de retenção

• A amostra é injetada com coluna fria, de 30 a 40


graus abaixo do ponto de ebulição do solvente.

• O solvente e os componentes da amostra, que foram


vaporizados no injetor, são recondensados na lacuna
de retenção.

• Ao atingir o início da coluna, o solvente entra na


coluna, mas os analitos são retidos e, concentrados
no mesmo ponto (focalização).
Focalização
Discriminação

• Ocorre quando a vaporização da amostra no injetor


não é uniforme.

• Os componentes pesados demoram mais a se


volatilizar e são preferencialmente eliminados pelo
divisor de amostra (split).

• Soluções:
– aumentar a temperatura do injetor
– usar amostra mais diluída
Discriminação

• Se o volume do liner for muito grande ou a


velocidade do gás carreador for baixa, os
componentes mais leves sofrem difusão nas partes
do liner e são eliminadas pelo divisor de amostra
(split).

• Soluções:
– aumentar a velocidade do carreador
– usar liners com volume interno menor
Discriminação
Discriminação

• A discriminação não pode ser completamente


eliminada, mas pode ser minimizada.

• A composição que entra na coluna pode não ser


exatamente aquela da amostra.

• Para análises quantitativas, usa-se, de preferência,


o modo splitless.
Discriminação
Discriminação na agulha

• Injeções com agulha fria levam à volatilidade


insatisfatória dos componentes pesados.

• A agulha vazia deve ser aquecida por alguns


segundos antes de o êmbolo ser abaixado para a
injeção.

• Referência: K. Grob, Split and Splitless Injection in Capillary


Gas Chromatography. 4th ed. Darmstadt: Wiley VCH, 2001,
480p.
Detectores
Detectores

• Os detectores em cromatografia gasosa são do


tipo diferenciais, isto é, respondem a uma
perturbação em uma medida de fundo, como a
condutividade térmica ou a variação de uma
corrente elétrica.
Detectores

• Há dois tipos de detectores diferenciais:

– Resposta proporcional à concentração

– Resposta proporcional à massa


Detectores

• Condutividade térmica (TCD)


• Ionização por chama (FID)
• Captura de elétrons (ECD)
• Nitrogênio e fósforo (NPD)
• Fotometria de chama (FPD)
• Espectroscopia no Ultravioleta a Vácuo (VUV)
• Espectroscopia no Infravermelho (IR)
• Espectrometria de massas (MSD)
Condutividade térmica
Condutividade térmica (TCD)

• Não destrutivo

• Resposta proporcional à concentração

• Grande faixa linear (104 - 105)

• Pode ser utilizado com amostras que não queimam (H2O, O2,
CO, CO2)
Condutividade térmica

• Nos detectores mais novos, utilizam-se dois filamentos.

• Em um deles, passa somente o gás carreador. No outro, passa


gás e amostra.

• O sinal de resposta é a diferença entre as correntes dos dois


filamentos.
Condutividade térmica
Condutividade térmica

• Pouco sensível, até 1 ng/mL

• Gás de arraste deve ser nitrogênio


– hidrogênio e hélio têm alta condutividade térmica
Ionização por chama (FID)
Ionização por chama

• Promove a combustão da amostra


• Grande faixa linear (107)
• Muito sensível, até 1 pgC/s (10-12g, ppt)
• “Universal” para substâncias orgânicas
Ionização por chama
Ionização por chama

• Destrutivo

• Não detecta água, O2, N2, CO e CO2


Captura de elétrons (ECD)

• Responde a fluxo de massa.

• Uma fonte radioativa interna de 63Ni emite partículas .


Captura de elétrons

• Substâncias ricas em elétrons (e com grande volume iônico ou


atômico) capturam as partículas .

• Mais sensível que o FID para substâncias cloradas e


bromadas.

• Muito sensível, até 10 fg/s (10-14g)

• Pouco sensível para não halogenados e não oxigenados.


Captura de elétrons
Captura de elétrons
Nitrogênio e Fósforo (NPD)

• É um detector de ionização por chama modificado.

• Opera com baixo fluxo de ar.

• Substâncias contendo fósforo ou nitrogênio queimam com mais


intensidade sobre a pérola de rubídio, produzindo um sinal
mais intenso que os demais compostos de carbono.
Nitrogênio e Fósforo (NPD)
Nitrogênio e Fósforo (NPD)

• Utilizado principalmente na análise de pesticidas


organofosforados.

• A sensibilidade é maior para fósforo do que para nitrogênio.

• Muito sensível, até 1 pgN/s ou 0,5 pgP/s (10-12g, ppt)

• O detector é cerca de 5000 vezes mais sensível a uma


substância fosforada do que em relação a um análogo não
fosforado.
Fotométrico de chama (FPD)

• Responde a fluxo de massa.

• Muito sensível, até 50 pgS/s ou 2 pgP/s (10-12g, ppt)

• Faixa linear de 103 (S) e 104 (P)


Fotometria de chama (FPD)
Ultravioleta no Vácuo (VUV)
• Faixa de operação de 120 a 240 nm.

• Universal (qualquer C-H absorve na região).

• Quantitativo por curvas de calibração ou, se a absortividade


molar for conhecida, dispensa a curva.

• Quantificação baseada em Beer-Lambert.

• Linearidade de 3-4 ordens de grandeza.

• Limite de detecção: 15 pg de benzeno.


Ultravioleta no Vácuo (VUV)

Ver: Analytical Chemistry, 2014, 86, 8329-8335.


Detector de Infravermelho (IRD)

• FTIR em fase vapor.

• Análise não destrutível.

• Pode ser hifenada com GC-IR-MS.

• Velocidade de 4 Hz a 4 cm-1.

• Bibliotecas de espectros disponíveis.

• Ótimo para diferenciar isômeros.


Detector de Infravermelho (IRD)
Espectrometria de massas

• Muito sensível (até 1 X 10-15g).

• Universal (carbono, nitrogênio, água, gases, halogenados).

• Pode ser tornado seletivo, se for programado para monitorar


apenas alguns fragmentos específicos.
Espectrometria de massas

• Usado para a identificação dos componentes da amostra.

• Não é o mais indicado para a quantificação.

• A quantificação pode ser feita, mas é necessário construir


curvas de calibração para sinais selecionados.
Espectrometria de massas

• Fragmenta (quebra) os componentes da amostra.

• As massas dos fragmentos são identificadas.

• A partir dos fragmentos, chega-se a uma substância de origem


(quebra-cabeças).

• Utiliza espectrotecas para comparação e identificação das


substâncias.
Espectrometria de massas

• Limitação: dois componentes diferentes podem apresentar o


mesmo espectro de massas (ou muito parecido). Neste caso,
uma segunda técnica de identificação deve ser utilizada.

• Para óleos essenciais, além da espectro de massas, usa-se o


índice de retenção para identificar os componentes do óleo.

• Limitação: é um equipamento caro, requer manutenção


periódica, limpeza e troca de componentes se as amostras são
sujas ou corrosivas.
Preços
• Cromatógrafo com FID e computador:
– A partir de US$ 20,000.00

• Cromatógrafo com FID, injetor automático e computador:


– A partir de US$ 25,000.00

• Cromatógrafo com detector de massas, computador, injetor


automático:
– A partir de US$ 80,000.00
Espectrometria de massas
Espectrometria de massas
Espectrometria de massas
Fonte de ionização

• É onde ocorre a ionização dos analitos, seja ionização


eletrônica ou química.

• Também é onde ocorre a focalização e aceleração dos íons


formados, antes da entrada no analisador.
Espectrometria de massas
Analisador: Quadrupolo

• São quatro bastões monolíticos recobertos em ouro.

• O alinhamento é crítico.

• Em geral, não há necessidade de manutenção.


Espectrometria de massas
Espectrometria de massas

Quadrupolo
Espectrometria de massas

Analisador: Ion trap


Espectrometria de massas

Ion trap
Espectrometria de massas
Detector
• É um eletron-multiplicador do tipo multi-dinodo.

• Um único íon é amplificado até 108 vezes.


Espectrometria de massas

Detector: HED (high energy dynode)


Espectrometria de massas
Abundance

S c a n 4 8 9 ( 5 .1 7 2 m in ) : L E M O N 1 .D
93
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000 77
2000
121
41 105 136
1000 53 67
61 87 115 128
0
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
m /z - - >
Abundance

# 2 5 1 9 9 : .A L P H A .- P IN E N E , ( - ) - $ $ B ic y c lo [3 .1 .1 ]h e p t- 2 - e n e , ...
93
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000 77
2000 28
105 121
1000 41 55 67 136
0
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
m /z - - >
Espectrometria de massas

HO

Eugenol

Metil-eugenol
Espectrometria de massas
A b u n d a n c e

S c a n 4 8 7 7 ( 2 3 . 9 3 3 m i n ) : L E M O N 2 . D
9 3 1 1 9
1 0 5 0 0

1 0 0 0 0

9 5 0 0

9 0 0 0

8 5 0 0

8 0 0 0

7 5 0 0

7 0 0 0

6 5 0 0

6 0 0 0

5 5 0 0

5 0 0 0

4 5 0 0
6 9
4 0 0 0 1 0 7
4 1
3 5 0 0

3 0 0 0

7 9
2 5 0 0
5 5
2 0 0 0

1 5 0 0

1 0 0 0 1 6 1
1 3 3
5 0 0 1 4 7 1 8 9
2 0 4

0
3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0
m / z - - >
A b u n d a n c e

S c a n 5 0 8 0 ( 2 4 . 8 0 1 m in ) : L E M O N 2 . D
1 1 9

1 6 0 0 0 0 9 3

1 5 0 0 0 0

1 4 0 0 0 0

1 3 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0

1 1 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

9 0 0 0 0

8 0 0 0 0

7 0 0 0 0

6 9
6 0 0 0 0
4 1 1 0 7
5 0 0 0 0

7 9
4 0 0 0 0
5 5
3 0 0 0 0

2 0 0 0 0
1 6 1
1 0 0 0 0 1 3 3
1 4 7 1 8 9 2 0 4
1 7 5
0
3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0
m / z - - >
Comparação entre detectores
Faixa
Gases para Limite de
Detector Tipo Seletividade linear
operação detecção
dinâmica
Condutivida
Concen-
de térmica nitrogênio Universal 1 ng 105
tração
(TCD)
Ionização
Fluxo de hidrogênio
por chama Maioria das substâncias orgânicas. 100 fgC/s 107
massa e ar
(FID)
Captura de
Fluxo de Haletos, nitratos, nitritos, peróxidos,
elétrons Make-up 10 fg/s 104
massa anidridos, organometálicos
(ECD)
Nitrogênio e Fluxo de hidrogênio 1 pgN/s
Nitrogênio e fósforo 104
Fósforo massa e ar 0,5 pgP/s
Fotométrico hidrogênio
Fluxo de Enxofre, fósforo, estanho, boro, 50 pgS/s 103
de chama e ar;
massa arsênico, germânio, selênio, cromo 2 pgP/s 104
(FPD) oxigênio
Massas Fluxo de hélio,
Universal 1 fg ---
(MSD) massa hidrogênio
Análise Qualitativa
Análise Qualitativa

• Injeção ou co-injeção de padrão autêntico.

• Cálculo de índices de retenção.

• Uso de detectores seletivos.

• Uso de detector espectrométrico (massas).

• Isolamento para análise complementar.


Injeção de padrão autêntico

• Uma substância qualquer analisada sempre nas mesmas


condições elui sempre no mesmo tempo de retenção.

• Um padrão autêntico (caracterizado por métodos físicos ou


químicos) é injetado nas mesmas condições analíticas.

• Caso o tempo de retenção do padrão seja o mesmo, confirma-


se a identidade da substância de interesse.
Injeção de padrão autêntico

S
A
B
Co-injeção de padrão

• Após uma análise preliminar (amostra pura), uma quantidade


do padrão é adicionada à amostra.

• Na nova análise (padrão + amostra), a área da substância de


interesse deve aumentar, proporcionalmente à quantidade de
padrão adicionada.
Co-injeção de padrão
B+S

A
B
Injeção de padrão autêntico
Injeção de padrão: problemas

• O analito de interesse é completamente desconhecido. Como


escolher um padrão?

• Não existe um padrão autêntico disponível comercialmente.

• Duas ou mais substâncias diferentes podem eluir no mesmo


tempo de retenção (co-eluição).
Índices de retenção

• Os tempos de retenção são normalizados.

• Calculados em temperatura constante ou em temperatura


variada linearmente.
Índices de Kováts

• Desenvolvido pelo professor Ervin Kováts.

• Helvetica Chimica Acta, 1958, 41, 1915-1932.

• Consiste na normalização do tempo de retenção de um analito


de interesse em relação aos picos anterior e posterior de uma
série homóloga.

• Diversas séries homólogas podem ser utilizadas.


Índices de Kováts

A série utilizada por Kováts foi a de n-alcanos.

Abundance

T IC : K O V A T S .D
4 .3 8
6500000

6000000
6 .9 4
5500000 3 5 .4 9
1 0 .4 7 3 1 .6 3
1 4 .6 2 1 9 .0 0 2 3 .3 6 2 7 .5 8
5000000

4500000

4000000

3500000 3 9 .1 4
4 2 .6 4
3000000 4 5 .9 9
2500000 4 9 .1 9

2000000 5 2 .2 5
1500000 5 5 .1 9

1000000 5 8 .0 1
6 0 .7 5
500000 6 3 .9 1

5 .0 0 1 0 .0 0 1 5 .0 0 2 0 .0 0 2 5 .0 0 3 0 .0 0 3 5 .0 0 4 0 .0 0 4 5 .0 0 5 0 .0 0 5 5 .0 0 6 0 .0 0 6 5 .0 0
T im e - ->
Índices de Kováts

• Trabalhando em condições isotérmicas, o índice de retenção,


chamado de índice de Kováts, é calculado por:

It =[ log TR subst. - log TR n + n ] x100


________________________________________

log TR n+1 - log TR n


Onde:

It: índice de Kováts (ou KI) na tempertura t


tr X: tempo de retenção da substância X
tr N: tempo de retenção do alcano N com tr anterior à substância X
tr N+1: tempo de retenção do alcano N com tr posterior à substância X
n: número de átomos de carbono do alcano N
Índices de Kováts

• Os índices de Kováts são usados para a previsão de


parâmetros físico-químicos de substâncias, tais como entalpia
de vaporização e ponto de ebulição.

• Isto é possível porque todas as medidas são feitas na mesma


temperatura (processo isotérmico).
Índices de retenção linear

• É uma aproximação do índice de Kováts.

• É o tipo de índice de retenção mais utilizado.

• Utilizado em análises com programação linear de


temperatura.

• A taxa de variação da temperatura não deve ser muito


elevada, para evitar desvios nos valores dos índices de
retenção.
Índices de retenção linear

Onde:

RI: índice de retenção linear (algumas vezes, LRI)


tr X: tempo de retenção da substância X
tr N: tempo de retenção do alcano N com tr anterior à substância X
tr N+1: tempo de retenção do alcano N com tr posterior à substância X
n: número de átomos de carbono do alcano N
Índices de retenção
A b u n d a n c e

T IC : K O V A T S .D
T IC : L E M O N 2 .D (* )

6 5 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0

5 5 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0

0
1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0 2 4 .0 0 2 6 .0 0 2 8 .0 0 3 0 .0 0
T im e - - >
Índices de retenção

• Consultando-se uma tabela ou livro como os índices


publicados, podemos identificar um pico desconhecido no
cromatograma.

• É preciso utilizar índices obtidos em pelo menos duas colunas


com fases diferentes (uma polar e uma apolar) para ter a
identificação.

• Outra opção é combinar o índice de retenção com o espectro de


massas da substância.
Índices de retenção
USO DOS ÍNDICES DE RETENÇÃO - ATENÇÃO

• Trabalhar com soluções diluídas e evitar usar picos


estourados para o cálculo, pois nestes casos há distorção no
valor do tempo de retenção.
Análise Quantitativa
Quantificação

• A área de um pico é proporcional à quantidade de substância


presente na amostra.
Quantificação

• Relativa: área de um componente em relação à área total

– Abundância relativa percentual (percentagem relativa)


– Abundância normalizada percentual (normalização relativa)

• Absoluta: padronização externa e interna


Abundância relativa percentual
• A percentagem de um componente, em condições ideais é:

P = A1 X 100
A
Onde A1= área absoluta do componente 1.
A = somatório de todas* as áreas absolutas.

• *Todas as que você quiser: as áreas a serem usadas


podem ser selecionadas, ligando-se e desligando-se o
integrador nos tempos de retenção desejados.
Abundância relativa percentual
Pico Área Área %
1 9,62 0,57
2 7,11 0,42
3 9,60 0,57
4 8,56 0,51
5 54,31 3,22
6 43,45 2,58
7 23,01 1,36
8 227,09 13,47
9 11,51 0,68
10 8,08 0,48
11 42,41 2,52
12 12,37 0,73
13 14,90 0,88
14 472,21 28,01
15 237,26 14,07
16 8,14 0,48
17 27,96 1,66
18 9,63 0,57
19 14,69 0,87
20 7,08 0,42
21 33,12 1,96
22 124,41 7,38
23 81,96 4,86
24 40,91 2,43
25 19,07 1,13
26 13,83 0,82
27 26,02 1,54
28 45,55 2,70
29 7,62 0,45
30 35,91 2,13
31 8,55 0,51
Total 1685,93 100,00
Abundância relativa percentual

Pico Área Área %


8 227,09 26,22
11 42,41 4,90
14 472,21 54,52
22 124,41 14,36
Total 866,12 100,00
Abundância relativa percentual

Pico Área Área % Pico Área Área %


8 225,947 26,82 8 227,09 26,22
11 41,0819 4,88 11 42,41 4,90
14 457,608 54,32 14 472,21 54,52
22 117,793 13,98 22 124,41 14,36
Total 842,43 100,00 Total 866,12 100,00

As áreas estão diferentes. Por que?


Abundância relativa percentual
• Na maioria dos casos, a área do solvente não é utilizada no
cálculo.

• Uma classe particular de substâncias, como os ésteres de


ácidos graxos, pode ser selecionada, desde que a identidade
dos picos seja conhecida.

• É a mais usada para óleos essenciais.

• Só é válida para comparação dos resultados dentro de


uma única amostra.
Abundância normalizada percentual

• A área de cada componente de interesse é normalizada em


relação à área de um padrão interno adicionado à amostra.

P = A1 X 100
Ap
Quantificação

• O comportamento real é diferente.

• Quantidades iguais de substâncias diferentes vão produzir


respostas diferentes do detector e, deste modo, áreas de pico
diferentes.

• Se um resultado muito exato é necessário, devem ser


determinados os fatores de resposta dos componentes de
interesse.
Fator de resposta

• É calculado injetando-se uma solução padrão da substância


de interesse, com concentração conhecida.

• A área do pico é associada diretamente à massa injetada.

Apmp Rf = A p
mp
Limitação do fator de resposta

• É necessário ter padrões de todas as substâncias para as


quais se deseja obter o fator de resposta.

• Curvas de fator de resposta em diferentes concentrações


podem ser preparadas, e os dados extrapolados para outras
substâncias da mesma classe química.

• Variações nas condições de operação do detector


(temperatura, vazão dos gases, comprimento de onda da luz,
energia de ionização) alteram o fator de resposta.
Fator de resposta

Área
massas 1 2 3 Média DP CV Rf RRf
Eucalyptol 10,7 42,971 42,395 42,996 42,79 0,3 0,0079 4,00 0,80
Guaiacol 14,1 45,177 44,338 45,116 44,88 0,5 0,0104 3,18 0,64
Mentol 16,4 68,29 66,599 68,011 67,63 0,9 0,0134 4,12 0,83
Terpin hydrate 10,3 34,09 33,011 33,916 33,67 0,6 0,0172 3,27 0,66
Tetradecano 8,6 43,277 42,262 43,207 42,92 0,6 0,0132 4,99 1,00

Rf = A p Rf1
RRf =
mp Rfp
Quantificação absoluta

• Padronização externa

• Padronização interna
Padronização externa

• Preparam-se soluções de diferentes concentrações da


substância a ser usada como padrão.

• No mínimo 5 concentrações diferentes, que serão injetados


em triplicata (15 pontos).

• As soluções são injetadas e as áreas são representadas em


gráfico área X massa.
Padronização externa

• A amostra com a substância a ser quantificada é injetada e,


por interpolação do valor de sua área, a massa (ou a
concentração) do analito é obtida.

m
Padronização externa

• A concentração da substância em análise deve ser obtida


por interpolação e não por extrapolação, pois as faixas de
linearidade da curva não foram estabelecidas.

• É possível preparar a curva de calibração com uma


substância diferente da que se quer quantificar. O erro
associado é o mesmo quando não se usa o fator de
resposta.
Padronização externa

• VANTAGEM:
– O fator de resposta é o mesmo, desde que a curva tenha sido
preparada com o analito de interesse. Logo, a resposta do
detector será a mesma tanto para a construção da curva
quanto para a análise. Não precisa calcular nem corrigir o
fator de resposta.

• DESVANTAGEM:
– Pequenas variações no processo de injeção (volume injetado,
transferência do injetor para a coluna, diferentes operadores)
vão gerar erros aleatórios, reduzindo a precisão e a exatidão.
Padronização interna

• Prepara-se uma solução de concentração conhecida de uma


substância que:

– Não está presente originalmente na amostra.


– Elui separadamente dos demais componentes da amostra.
– De preferência, usa-se um padrão da mesma classe química e
com peso molecular próximo.
Padronização interna

• Adiciona-se uma quantidade conhecida do padrão à amostra.

• A amostra com o padrão é injetada no cromatógrafo.

• A massa ou concentração da substância desejada é obtida


diretamente da relação de áreas e da massa ou concentração
de padrão.

• Se o padrão for quimicamente muito diferente, devem ser


usados os fatores de resposta para corrigir os valores das
áreas.

• É o método de quantificação mais preciso.


Padronização interna

• Quando não se dispõe de padrões para o cálculo dos


fatores de resposta, pode-se fazer uma aproximação com
a equação:

mp
m1= A1 X
Ap
Padronização interna

• Usando-se o fator de resposta, divide-se o fator de resposta de


cada componente a ser quantificado pelo fator de resposta do
padrão interno. Estes valores são os fatores de resposta
relativos.
Rf1
RRf =
Rfp
• Para cada pico, divide-se a área medida pelo respectivo fator
de resposta relativo, obtendo-se a área corrigida para aquele
pico.

A1
CA1 =
RRf1
Padronização interna
• Cada área corrigida é dividida pela área corrigida do padrão
interno. Obtém-se assim a quantidade relativa do componente
na amostra injetada.

CA1
mR1 =
CAp

• Multiplicando-se a quantidade relativa pela concentração


nominal do padrão interno calcula-se a quantidade nominal de
cada componente na amostra.

m1 = mR1 X mp
Aplicações
CG multidimensional

O que é cromatografia multidimensional?

• Uma dimensão, em termos analíticos, é um mecanismo


de separação.

• Na CG convencional, é a interação do soluto com a fase


estacionária.

• A grandeza que permite a identificação dos componentes


de uma mistura é o seu tempo de retenção, isto é, o
tempo que a substância leva para atravessar a coluna e
chegar ao detector.

• Principais aplicações: petróleo, fragrâncias, alimentos.


CG multidimensional

O que é cromatografia bidimensional (2DGC)?

• Quando se conectam duas colunas cromatográficas, diz-


se que o sistema é bidimensional.

• Duas situações são possíveis:

• Apenas uma parte da amostra injetada vai para a


segunda coluna
• Toda a amostra injetada vai para a segunda coluna
CG multidimensional
HEART CUT OU MDGC
• Apenas uma parte da amostra é transferida para a
segunda coluna.

• Só um grupo de substâncias apresenta interesse


analítico.

• Principais usos: cromatografia quiral, contaminantes.


CG multidimensional
Cromatografia multidimensional abrangente (GCXGC)

• Quando toda a amostra é transferida da primeira coluna para a


segunda coluna, o processo é dito abrangente (comprehensive).

• Usada para misturas complexas onde todas ou a maior parte das


substâncias devem ser analisadas.
CG multidimensional
COMPARAÇÃO ENTRE MDGC E GCXGC
CG multidimensional

• A amostra, depois de uma separação inicial, é transferida para


uma segunda coluna, com polaridade diferente da primeira.
CG multidimensional
CG multidimensional
CG multidimensional

1D chromatogram: sacaca SV-3, 10% in hexane, 0.2µL, split 1:40 (10a1104)


FID1A, (HUMBERTO10A11022010-01-1117-00-17\10A1104.D)
pA

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
CG multidimensional
GCXGC study on sacaca oil
3.25

3.00

2.75

2.50
s

2.25

2.00

1.75

1.50

1.25

22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0

min

125 250 375 500 625 750 875

Te mp1_csv24_x

Sesquiterpenes / sesquiterpenes alcohols PM=3s Rt=3s


CG multidimensional
Características dos resultados de GCXGC

Separação de
análogos em
regiões
definidas
Análise olfatométrica ou
CG-Olfatometria (CG-O)
CG-Olfatometria
Quando o nariz é o detector cromatográfico
CG-Olfatometria
Quando o nariz é o detector cromatográfico

• GC-O
• CHARM
• AEDA
• OSME
• NIF, SNIF
CG-Olfatometria

• É a utilização do nariz como detector cromatográfico.


CG-Olfatometria
• Aromagrama
Aromagrama
Diferenças entre os detectores: FID X nariz
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa

Humberto Ribeiro Bizzo


D.Sc. Pesquisador A
Laboratório de Óleos Essenciais e Aroma
Tel: 3622-9605
email: humberto.bizzo@embrapa.br