10/04/2016 DNA Microarray para a detecção de vírus gastrointestinais

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Journal of Clinical Microbiology
jcm.asm.org

Os trabalhos aceitos publicado on-line 29 de outubro de 2014 , doi: 10,1128 / JCM.01317-14

J. Clin. Microbiol. Janeiro 2015 vol. 53 sem. 1 136-145

DNA Microarray para a detecção de vírus gastrointestinais
para para * b c , d e
Miguel A. Martinez , Maria de los Dolores Soto-del Rio , Rosa Maria Gutierrez , Charles Y. Chiu , Alexander L. Greninger ,
f e um e
Juan Francisco Contreras , Susana López , Carlos F. Arias e Pavel Isa

BA Forbes , Editor

+ Autor Filiações

ABSTRATO

A gastroenterite é uma doença clínica de seres humanos e outros animais que se caracteriza por vómitos e diarreia e causadas por uma variedade de
agentes patogénicos, incluindo os vírus. Um número crescente de espécies virais têm sido associados a gastroenterite ou foram encontrados em
amostras de fezes como novas ferramentas moleculares têm sido desenvolvidos. Neste trabalho, um microarray de ADN capaz de detecção, em teoria
paralela de mais de 100 espécies virais foi desenvolvido e testado. A validação inicial foi feito com 10 espécies diferentes de vírus, e um adicional de
5 espécies foram validados utilizando amostras clínicas. Os limites de detecção de 1 × 10 3 partículas do vírus de humano adenovírus C (HAdV),
astrovirus Humano (HAstV), e grupo A Rotavírus (RV-A) foram estabelecidos. Além disso, quando o RNA exógeno foi adicionado, o limite para o RV-A
detecção reduzida por um registo. Em um pequeno grupo de amostras clínicas de crianças com gastroenterite ( n = 76), o micro-arranjo detectada
pelo menos uma espécie virais em 92% das amostras. A infecção simples foi identificada em 63 amostras (83%), e a co-infecção com mais do que um
vírus foi identificado em amostras de 7 (9%). As espécies de vírus mais abundantes foram RV-A (58%), seguido por Anellovirus (15,8%), HAstV (6,6%),
HAdV (5,3%), vírus de Norwalk (6,6%), enterovírus humano (HEV) (9.2%) , parechovirus Humanos (1,3%), vírus Sapporo (1,3%), e bocavirus Humanos
(1,3%). Para testar adicionalmente a especificidade e sensibilidade do microarray, os resultados foram verificados por detecção de transcrição
reversa-PCR (RT-PCR) de 5 vírus gastrointestinais. O ensaio de RT-PCR detectou um vírus em 59 amostras (78%). O microarray mostrou um bom
desempenho para a detecção de RV-A, HAstV e calicivírus, enquanto a sensibilidade para HAdV e HEV foi baixa. Além disso, algumas discrepâncias
na detecção de infecções mistas foram observadas e foram tratadas por transcrição reversa PCR quantitativa (qPCR-RT) dos vírus envolvidos.
Observou-se que as diferenças na quantidade de material genético favoreceram a detecção do vírus mais abundante. O microarray descrito neste
trabalho deve ajudar na compreensão da etiologia das gastroenterites em humanos e animais.

INTRODUÇÃO

Gastroenterite está entre as cinco principais causas de mortalidade por doença e morbidade em todas as idades em todo o mundo. A população mais
afetada é crianças com menos de 5 anos de idade, onde responde por a segunda causa de morte pós-neonatal, com cerca de 2,6 milhões de mortos
por ano ( 1 ). Embora a maioria das mortes ocorrem em países em desenvolvimento, doenças diarreicas está entre as causas mais comuns de doença
em todo o mundo, com cerca de 4.620 milhões de episódios por ano ( 1 ). Além dos seres humanos, todas as espécies de vertebrados sofrem de
doenças entéricas. Infecções em animais de fazenda pode levar a grandes perdas econômicas, enquanto animais domésticos, como cães e gatos,
também são afetados. Por outro lado, os animais selvagens, como veados, macacos, morcegos, raposas, lobos e javalis, entre outros, podem atuar
como potenciais reservatórios para patógenos ( 2 ). Infecções gastrointestinais (GI) são causadas por uma variedade de agentes patogénicos,
incluindo parasitas, bactérias e vírus. A caracterização dos patógenos causadores de infecções gastrointestinais de etiologia viral levou à criação de
um grupo principal de patógenos ( Rotavirus A [RV-A], vírus Norwalk [NV], astrovírus humanos [HAstV] e adenovírus humano F [HAdV-F ]) ( 3 ) para
os quais foram desenvolvidos testes de diagnóstico específicos ( 4 ). Os testes de vírus secundários ou raras estão disponíveis, mas são geralmente
restrito ao uso experimental. Métodos diagnósticos de rotina para a gastroenterite viral são hoje em dia com base na detecção de componentes de
vírus por imunoensaios ou por métodos moleculares ( 5 , 6 , 7 , 8 ), com a maioria destes ensaios destinados a avaliar apenas um único agente
patogénico de cada vez.

A utilização de dois ou mais conjuntos de iniciadores específicos (multiplexação) em PCR permite a amplificação de vários alvos em um teste. Embora
os testes multiplex estão disponíveis para diversos vírus ( 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ), facilitando a detecção rápida e sensível dos principais agentes de
doenças GI, estes ensaios são ainda limitados no número de vírus detectados, e os resultados podem ser afetados por mutações nos locais de ligação
do iniciador. Por outro lado, microarrays de ADN representam uma alternativa para a detecção de centenas a milhares de potenciais agentes
patogénicos num único ensaio. Microarray detecção baseia-se na hibridação em fase sólida, em que as sondas específicas são depositadas sobre
uma superfície e reagir com uma mistura de ácidos nucleicos marcados. Até agora, diferentes microarrays foram desenvolvidos para a detecção de
agentes infecciosos causadores associados com um número de doenças: respiratória ( 14 , 15 , 16 ), hemorrágico ( 17 ), pelo sangue ( 18 , 19 ), e do
sistema nervoso central ( 20 ) síndromes . Outros microarrays gerais têm sido desenvolvidos para a descoberta de vírus ( 21 ); No entanto, um
diagnóstico específico para o vírus de microarray encontrado no tracto GI é inexistente. Dado o aumento recente do número de novas espécies virais
( 22 , 23 , 24 , 25 , 26 ), DNA microarrays de diagnóstico representar uma possibilidade de testar a sua importância clínica e impacto na saúde
humana e animal.

Neste trabalho, o desenvolvimento e validação de um microarray de DNA projetado para detectar, em princípio, mais de 100 espécies virais
associados com o trato GI em vertebrados é apresentado. Este micromatriz foi utilizado com sucesso para identificar vírus em um pequeno conjunto
de amostras clínicas gastroenterite.

MATERIAIS E MÉTODOS

Células, vírus e amostras clínicas. Os vírus foram quer presente no nosso laboratório ou gentilmente fornecida por diferentes laboratórios parceiras
( Tabela 1 ). Amostras clínicas de crianças com gastroenterite durante a temporada de inverno 2004-2005 foram obtidos em Monterrey, México, com
o consentimento escrito de um dos pais ou responsável. Análise de amostras clínicas humanas foi aprovado pelo Comitê de Bioética do Instituto de
Biotecnologia. O rastreio inicial de amostras para RV-A foi realizada em Monterrey por coloração com prata de RV-A segmentados ARN de cadeia
dupla separaram-se por SDS-PAGE. Nenhuma triagem prévia para agentes bacterianas ou parasitárias foi realizada no grupo de amostras. Partículas
de camada tripla de RV-A RRV estirpe foram purificados com um gradiente de densidade de cloreto de césio como anteriormente descrito ( 27 ).

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TABELA 1
Ver esta tabela:

Nesta janela Em uma nova janela espécies de vírus de referência utilizado na validação de microarray

Projeto sonda Microarray. Todas as espécies de vírus que ou foram associados com gastrenterite ou encontradas no trato gastrointestinal foram
identificados por uma extensa revisão da literatura publicada e selecionado para ser incluído no microarray. Todos os genomas completos
disponíveis ou sequências de genes completos das espécies de vírus selecionados foram obtidos a partir de GenBank (até fevereiro de 2009), e as
bases de dados adequadas foram criadas. Para cada espécie de vírus, redundância sequência foi eliminado de acordo com a similaridade de
sequência com os valores de corte de 95 a 99% usando o software CD-HIT ( 28 ). Uma sequência para cada espécie foi seleccionado como uma fonte
para a produção de sonda e foi processado tal como descrito anteriormente ( 29 ). Especificamente, as sequências foram consecutivamente dividida
em 70-meros com uma janela mudando de 3 nucleótidos, com cada um 70-mero correspondente a uma sonda potencial. As sondas 70-mer de
comprimento tem tamanho suficiente para permitir a condições de hibridação rigorosas, enquanto que permite um certo grau de
desemparelhamentos, mas que são suficientemente pequenas para manter a especificidade de espécie ( 30 , 31 , 32 ). Sondas alvo foram
seleccionadas para serem incluídas no microarray por análise dos resultados de BLAST e de cálculo da termodinâmica hibridação (Δ G ) calculada
pelo método do vizinho mais próximo ( 33 ). Para a sonda a ser considerado um bom candidato para o micro-arranjo, o Δ L foi necessário para ser,
pelo menos, -70 kcal / mol para sequências homólogas e maior do que -40 kcal / mol para sequências heterólogas. Um mínimo de 6 sondas que
não se sobrepõem a partir de regiões conservadas no genoma de vírus foram seleccionados para cada um dos vírus, e cada sequência de genoma
disponíveis no banco de dados de alvo para uma dada espécie foi reconhecida por pelo menos duas sondas. Quando necessário, devido à
variabilidade dentro de uma espécie, duas ou mais sequências de origem foram escolhidas e cada sequência única foi processado tal como descrito
acima.

Sonda Microarray in silico análise. A termodinâmica de hibridação para o RV-A sondas selecionados foram avaliados in silico com segmentos VP1,
VP2 e nsP5 de estirpes RV-A que representam todos os full-genoma Genótipos G e P disponível. A hibridação Δ G (kcal / mol) entre a sonda e o alvo
foi calculada pelo método de vizinho mais próximo. O melhor sonda-alvo Δ L foi representada graficamente em um mapa de calor utilizando R. A
detecção de um alvo é, quando o Δ L é <-50 kcal / mol.

Produção. Microarray seleccionado sondas 70-meros foram sintetizados por Ilumina Oligator (Illumina Inc., CA, EUA). Os oligonucleótidos foram
ressuspensas a 400 pmol em 3 × tampão SSC (NaCl 0,45, citrato de sódio 45 mM, pH 7,0) e depositados em lâminas de vidro revestidas com epóxido
na instalação de Microarray do Centro da próstata em Vancouver General Hospital, Vancouver, British Columbia, Canadá. Cada local continha uma
sonda específica para detectar uma espécie de vírus e 4 pmol de spike70 (um 70-mer, sem uma sequência complementar biológico conhecido) ( 34 ),
utilizados para identificar com precisão os locais pontuais sonda no microarray. As lâminas foram mantidas numa câmara de humidade livre-até à
sua utilização.

Extracção de ácido nucleico, amplificação, e rotulagem. O material genético a partir de lisados de vírus (sobrenadantes de culturas celulares a
partir de estirpes de referência) foi extraída com o kit de ARN / ADN viral PureLink de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, EUA). Para
amostras clínicas e Norwalk de vírus e Sapporo controlos positivos, 100? G de fezes foi adicionado a tubos de tampa roscada cónicos contendo 100
mg de grânulos de 150 a 212 mícrons de vidro (Sigma, USA), clorofórmio (100 ul), e fosfato solução salina tamponada (PBS) até 1 ml. As amostras
foram homogeneizadas num batedor de esferas (Biospec Products, EUA). Após 10 min de centrifugação a 2000 × g , os sobrenadantes foram
recuperados e filtrados em filtros de spin x 22 mícrons de poros (Costar, NY) a 5000 × g durante 10 a 20 min. As amostras filtradas foram tratados
com DNase Turbo (Ambion, EUA) e RNase (Sigma, EUA) durante 30 min a 37 ° C e imediatamente arrefecido em gelo. Os ácidos nucleicos foram, em
seguida, extraiu-se a partir de 200 ul utilizando o kit de ARN / ADN viral PureLink de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, EUA). Os
ácidos nucleicos a partir de lisados de vírus ou de amostras clínicas foram eluídas em água isenta de nuclease, aliquotadas, quantificado em
NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, DE), e armazenadas a -70 ° C até à sua utilização.

O processamento da amostra e a amplificação aleatória de ácidos nucleicos foram realizadas essencialmente como descrito anteriormente ( 21 , 35 ,
36 ). Resumidamente, a transcrição reversa foi realizada utilizando SuperScript III transcriptase reversa (Invitrogen, EUA) e o iniciador A (5'-
GTTTCCCAGTAGGTCTCN 9 -3 '). A cadeia de cDNA foi gerado por dois ciclos de síntese com o Sequenase 2.0 (USB, EUA). O ADNc obtido foi, em
seguida, amplificado com polimerase de KlenTaq (Sigma, EUA) ou Taq polimerase (New England Biolabs, EUA) utilizando o iniciador B (5'-
GTTTCCCAGTAGGTCTC-3 ') por 30 ciclos do seguinte programa: 30 s a 94 ° C , 1 min a 50 ° C e 1 min a 72 ° C. Como último passo, o análogo de
nucleótido aminoallyl-dUTP (TriLink, EUA) em uma proporção de 7: 3 com dTTP foi incorporado durante um período adicional de 20 ciclos de PCR
utilizando as mesmas condições descritas acima e 5 uL de produto da PCR anterior como partida material. Os produtos amplificados foram
purificados com o DNA Clean & Concentrador-5 kit (Zymo Research, EUA). Reações de acoplamento de ADN da amostra com Cy3 e sonda 70 (70-
mero complementar a espiga 70) com corantes Cy5 (GE Healthcare, EUA) foram feitas como descrito em outro lugar ( 31 ). -Fluoróforo marcado DNA
foi purificado com o Zymo DNA Clean & Concentrador-5 kit, e incorporação rótulo foi quantificado com NanoDrop.

Deslize preparação, hibridação e digitalização. Corrediças Microarray foram tratados apenas antes da sua utilização com uma solução de lavagem
de etanolamina (etanolamina a 50 mM, SDS a 0,1%, Tris 0,1 M, pH 9) para 15 min a 50 ° C, seguido por duas lavagens em água destilada de água, e
foram em seguida secas por centrifugação durante 5 min a 500 rpm. Lâminas processadas foram carregados com 30 ul de uma combinação de ADN
Cy3- e marcada com Cy5 em 3 × tampão SSC, e a hibridação foi deixada prosseguir de câmara selada submerso num banho de água a 65 ° C durante
8 a 12 h. Após a incubação as lâminas foram lavadas consecutivamente em 2 x SSC (65 ° C), 2 x SSC, 1 x SSC, e 0,2 x SSC e secou-se durante 5 min a
500 rpm. Hibridação imagens foram adquiridas com um digitalizador GenePix 4000B Axon (Molecular Devices, EUA) sincronizados com o software
GenePix Pro 6.0 para detectar e medir intensidades de mancha.

. Análise de dados intensidades local hibridação foram filtrados pela primeira vez pelos seguintes parâmetros de controle de qualidade local:
tamanho de ponto e forma (denotado como bom / mau ausente /), canal 532 de primeiro plano (F532) saturação de sinal (% F532 saturada, <5), e
F532 proporção de sinal ao longo do canal de 532 sinal de fundo (B532) [(%> B532 + 2 desvios-padrão)> 50%]. Pontos que mostram boa qualidade
foram usadas para gerar os valores de fundo nível de microarray. Normalização dos valores de intensidade foi feito com a fórmula (F532i / F532m) -
(B532i-B5532m), onde F532i e B532i são os sinais de primeiro e segundo plano de spot "i", respectivamente, e F532m e B532m são as somas de
todos os conhecimentos novos ou manchas de fundo, respectivamente.

A significância estatística de intensidades de sonda nas amostras de referência foi obtida pelo algoritmo de classificação produtos ( 37 ), utilizando
um mínimo de três réplicas técnicas. Valores de classificação de amostras de controlo negativo foram gravadas e usadas para gerar um "valor de
classificação spot" incluídas na análise de qualidade de pontos subseqüentes. Para amostras clínicas, z-score transformado intensidades e suas P
valores foram analisados com o pacote de ferramenta FDR ( 38 ) em R ( 39 ). Espécies de vírus positivos foram definidos como tendo pelo menos
duas sondas com P valores de <0,05 e as taxas de falso-descoberta (FDRs) de <0,01.

Os ensaios de limite-de-detecção. A fim de determinar a quantidade de partículas virais detectáveis por o micro-arranjo, três vírus de referência
com diferentes tipos de genoma foram ensaiadas: RV-A de ARN de cadeia dupla (ARNcd), HAstV ARN de cadeia simples positiva (ssRNA + ), e HAdV-
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Os ensaios de limite-de-detecção. A fim de determinar a quantidade de partículas virais detectáveis por o micro-arranjo, três vírus de referência
com diferentes tipos de genoma foram ensaiadas: RV-A de ARN de cadeia dupla (ARNcd), HAstV ARN de cadeia simples positiva (ssRNA + ), e HAdV-
C ADN de cadeia dupla (dsDNA). O ARN foi extraído a partir de RV-A RRV estirpe purificada e células MA104. O RV-A genoma massa molecular foi
calculada de acordo com a seguinte fórmula: (comprimento genoma [bp] × 325) /6.022 × 10 23 ( 40 ). Diminuindo diluições de RV-A de ARN
correspondente a 1 x 10 8 a 10 partículas foram analisados por si só ou misturado com um excesso de células MA104 de RNA (50 ng). Do mesmo
modo, diminuindo diluições de lisados de células titulado unidades formadoras de focos de HAstV ou HAdV-C, o que corresponde a 1 x 10 7 a 100
partículas de vírus, foram extraídos, amplificada, marcada, e processados utilizando o protocolo de micro-arranjo completo tal como descrito acima.

RT-PCR. Diagnóstico ou confirmação Convencionais Os ácidos nucleicos extraídos de amostras clínicas foram usadas para executar diagnóstico de
transcrição-reversa PCR (RT-PCR) utilizando um-passo kit da Qiagen de RT-PCR (Qiagen, EUA) ou SuperScript III um passo RT- PCR com Platinum
Taq polimerase (Invitrogen, EUA). Para confirmação de RT-PCR, o ADNc foi gerado com SuperScript III transcriptase reversa (Invitrogen, EUA), e Taq
polimerase (New England Biolabs) foi utilizado para a PCR seguindo as instruções do fabricante. Os iniciadores oligonucleotídicos usados no
diagnóstico de confirmação ou de RT-PCR estão listadas na Tabela S1 no material suplementar. PCRs para RV-A detecção incluído um passo de
ebulição de 5 min, seguido do passo imediato de refrigeração de gelo imediatamente antes de RT-PCR. As condições de amplificação para RV-A,
HAstV, e calicivírus (CV) foram os seguintes: 30 min a 50 ° C; 15 min a 95 ° C; 40 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 50 ° C e 1 min a 72 ° C; e uma
extensão final de 5 min a 72 ° C. Condições de adenovírus humano por RT-PCR (HAdV) foram os seguintes: 30 min a 50 ° C; 15 min a 95 ° C; 40 ciclos
de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C e 1 min a 72 ° C; e uma extensão final durante 5 min a 72 ° C. O programa de amplificação enterovírus humano (VHE),
foi como se segue: 30 min a 50 ° C; 15 min a 95 ° C; 40 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 50 ° C, e 30 s a 72 ° C; . e extensão final de 5 min a 72 ° C
parechovirus Humanos (HPeV) de amplificação foi como se segue: 30 min a 50 ° C; 15 min a 95 ° C; 35 ciclos de 1 min a 95 ° C, 1 min a 48 ° C e 1 min
a 72 ° C; e uma extensão final durante 5 min a 72 ° C. Anellovirus (TTV) confirmação foi realizada como uma PCR seminested. Condições para o
primeiro ciclo foram as seguintes: 2 min a 94 ° C; 35 ciclos de 30 s a 94 ° C, 30 s a 55 ° C, e 30 s a 72 ° C; e uma extensão final durante 5 min a 72 °
C. A segunda ronda utilizou o mesmo programa, mas com apenas 30 ciclos. Bocavírus Humanos (HBoV) foi detectada por Seeplex RV15 OneStep ACE
detecção (Seegene, EUA). Os produtos de PCR foram visualizados em geles de agarose a 2,0%, excepto para HEV, que requeria 3,5% de gel devido a
um pequeno tamanho do fragmento amplificado.

Semiquantitativa RT-PCR e a detecção por PCR do vírus. Um passo em tempo real de RT-PCR e PCR em tempo real foram realizadas utilizando
iniciadores de segmentação regiões genómicas conservadas (ver Tabela S1 no material suplementar). RV-A detecção requerido exemplo anterior a
ferver durante 5 min e gelo imediato refrigeração. Para os vus de ARN (RV-A, HAstV, NV, e HEV), a detecção foi realizada como um processo em duas
etapas. Em primeiro lugar, 3 ul de ARN (5 ng) foi transcrito de forma inversa com 0,125 mL (50 U / ul) SuperScript III transcriptase reversa
(Invitrogen, EUA), 0,25 ul de inibidor de RNase (20 U / ul), 12,5 ul de 2 × SYBR mistura verde mestre (Applied Biosystems, EUA), 1 ul de iniciador, e
dietilpirocarbonato (DEPC) tenha sido tratada com água num volume final de 24 ul. As amostras foram incubadas durante 30 min a 48 ° C, seguido de
inactivação da enzima durante 10 min a 90 ° C. Na segunda etapa, adicionou-se 1 ul de segundo iniciador, e a PCR foi realizada como se segue. O
programa HAstV e RV-A amplificação consistiu de 10 min a 95 ° C e 40 ciclos de 15 s a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. O programa de amplificação foi NV 5
min a 95 ° C e 45 ciclos de 10 s a 95 ° C, 20 s a 48 ° C, e 45 s a 60 ° C. O programa de HEV foi de 10 min a 95 ° C, 45 ciclos de 20 s a 95 ° C, 20 s a 55
° C e 1 min a 72 ° C, e de extensão final de 5 min a 72 ° C. No caso de HEV, ambos os iniciadores específicos foram adicionados antes da PCR, uma
vez que o passo de RT foi realizada utilizando hexâmeros aleatórios. HAdV misturas de reacção de amplificação consistiu de 3 ul (5 ng) de ADN, 12,5
ul de 2 × SYBR green Master Mix, e 1 ul de cada iniciador de síntese correspondente, num volume de 25 ul. As condições eram de 95 ° C durante 8
min, 45 ciclos de 30 s a 95 ° C, 20 s a 55 ° C, e 20 s a 72 ° C, e uma extensão final de 5 min a 72 ° C. As amplificações foram levadas a cabo num
sistema 7500 detector de sequência ABI Prism (Applied Biosystems). As curvas de dissociação foram avaliadas para os produtos não específicos. Ciclo
limiar ( C T ) os valores correspondentes a detecção de sequências específicas de vírus foram obtidos a partir de triplicados de amostras
seleccionadas apresentando co-infecções e comparada para os vírus detectados. Conjuntos de iniciadores de PCR para a detecção de CV, HAdV e HEV
foram concebidos para reconhecer o alvo no nível de gênero ( 5 , 6 , 41 ).

RESULTADOS

Selecção de vírus relacionados com infecções gastrointestinais. Uma vantagem da tecnologia de microarray é a capacidade de testar centenas ou
mesmo milhares de alvos num único ensaio. O principal objetivo deste estudo foi desenvolver um ensaio para a detecção de todos os vírus que foram
encontrados em amostras de fezes de vertebrados, associada ou não a gastroenterite, o que deve facilitar estudos clínicos e epidemiológicos em
humanos e animais. Uma pesquisa profunda da literatura científica disponível em bases de dados públicas resultou em uma lista de 128 espécies de
vírus relatados para estar presente no tracto gastrointestinal, o que representa 55 géneros que pertenciam a 17 famílias virais (ver Tabela S2 no
material suplementar). A lista de espécies de vírus inclui os vírus conhecidos humanos gastroenterite (grupo calicivirus, rotavírus, astroviruses
humanos, e adenovírus entéricos), juntamente com alguns vírus humanos recentemente descritos ( adenovírus humano G [ 23 ], bocavirus Humanos
[ 42 ], Cosavirus [ 24 ], vírus Saffold [ 43 ], e Salivirus Um [ 25 , 44 ]). , Vírus clássicos não humanos gastrointestinais (coronavírus, circovírus, e
pestivírus) e outros agentes virais descobertos novos (no momento da concepção de microarray) a partir de diferentes espécies animais, tais como
anelloviruses animais ( 45 , 46 ), astroviruses bastão ( 47 ), e kobuviruses bovina ( 48 ), cuja participação como agentes patogénicos não é bem
compreendida, também estão incluídas no microarray. Assim, as espécies de vírus de interesse englobava uma variedade de vírus com características
diferentes, tais como ARN e ADN de genomas, envolto / viriões nonenveloped, segmentado ou não-segmentados genomas e genomas simples ou de
cadeia dupla. Todas as sequências de genes ou genômicas completas disponíveis foram recuperados a partir de uma base de dados pública
(GenBank) e foram organizados em um banco de dados hierárquico taxonômica seguindo a classificação ICTV na data das sondas de microarranjo
foram concebidos (ICTV, 2009) ou, para as novas espécies, como sugerido por o descobridor.

Selecção de sondas e validação de microarray. Um conjunto de 1.256 sondas microarray 70-mer foram seleccionados a partir de regiões
conservadas e concebido para identificar 128 espécies virais associados com o tracto GI, com pelo menos 6 sondas concebidas para cada uma das
espécies virais e pelo menos 2 sondas correspondentes às cada genoma viral sequenciado. Para manter as condições experimentais rigorosas
(hibridação a 65 ° C) ao mesmo tempo permitindo que uma determinada quantidade de variabilidade de sequências, as sondas foram concebidos
como 70-mers. O maior número de sondas coberto RV-A (42 sondas), Alphacoronavirus (28 sondas) e mamíferos Orthoreovirus (25 sondas) (ver
quadros S2 e S3 no material suplementar). Para alguns vírus, o desenho de um conjunto completo de 6 oligonucleotídeos não foi possível devido à
falta de sequências completas suficientes; No entanto, foram incluídas sondas disponíveis para cada uma das espécies virais.

Cepas de referência para 10 espécies virais estavam disponíveis para a validação da sonda. Estas espécies representam 6 famílias virais e incluem 4
principais patógenos humanos (HAstV, NV, SV e RV-A), outros vírus humanos (mamíferos Orthoreovirus , HAdV-C e vírus da dengue 4 ), e três vírus
não humanos ( calicivírus felino , vírus da diarreia viral bovina 1 e bovina vírus parainfluenza 3 ) ( Tabela 1 ). Todas as cepas de referência testadas
foram detectados como esperado, incluindo quatro cepas diferentes RV-A (estirpe humana Wa, RRV estirpe símia, vírus suíno TFR-41, e tensão de
bovino do Reino Unido) e duas de mamíferos diferentes Orthoreovirus cepas (T1L e t3d) ( Tabela 1 ). Para testar a in silico capacidade de sondas para
reconhecer estirpes diferentes e variáveis, 42 sondas específicas para rotavírus foram analisados com um painel de todos os genótipos G e P
disponíveis (ver Fig. S1 no material suplementar). O único genótipo que o microarray provavelmente não detectar foi G22P [35], que pertence a uma
estirpe de peru rotavírus.

A sensibilidade e a especificidade do ensaio. Para determinar os limites de sensibilidade de microarray de ADN, o material genético do vírus foi

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A sensibilidade e a especificidade do ensaio. Para determinar os limites de sensibilidade de microarray de ADN, o material genético do vírus foi
extraído a partir de lisados de células ou HAstV- HAdV-C-infectadas ou de partículas estirpe RRV simian CsCl-purificadas. Em uma série de diluições

de lisados celulares (correspondentes a partir de 10 2 a 10 7 partículas virais), o micro-arranjo foi capaz de detectar apenas 10 3 HAdV-C ou HAstV
partículas de vírus. Da mesma forma, RV-A de ARN (que corresponde a 10 a 10 8 partículas virais) foi amplificado antes ou depois da adição de uma
quantidade constante de ARN celular (50 ng). Na ausência de ARN celular, o limite de detecção para o RNA viral foi 10 3 cópias de genoma; No
entanto, quando a complexidade da amostra foi aumentada pela adição de ARN celular, o limite de detecção era um logaritmo inferior, detectando 10
4 cópias do genoma.

Para avaliar a especificidade da sonda, um algoritmo de classificação produtos ( 37 ) foi aplicada aos resultados obtidos a partir de técnicas de
repetições vírus de referência e os controlos de células falsamente infectadas (células MA104, células A549 e C6 / 36 células). Com base no teste de
taxa de falsos descoberta (FDR) incluído no software, 16 sondas foram identificados como apresentando comportamento não específico (marcado
com um asterisco na Tabela S3 no material suplementar). Quando analisada, estas sondas não específicos não mostrou qualquer característica
comum, embora alguns apresentou um teor de GC elevado (> 70%). Em experiências que se seguem, os resultados obtidos com estas sondas foram
excluídos da análise.

Análise de amostras clínicas. Para testar ainda mais a capacidade do microarray para detectar vírus, 76 amostras de crianças com menos de 5 anos
de idade, recolhidos durante a temporada de inverno 2004-2005 em Monterrey, México, foram analisados. A recolha de amostras foi inicialmente
rastreados por RV-A através de electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e armazenado a -70 ° C. Usando o microarray desenvolvido
neste estudo, um agente virai foi detectada em 70 de 76 (92%) das amostras testadas; um único vírus foi encontrado em 63 (83%) das amostras,
enquanto duas ou mais espécies virais foram detectados em 7 (9%) amostras ( Fig. 1 ). Entre os vírus detectados, o mais comum era RV-A (44
amostras), seguido de TTV (12 positivos), HEV (7), calicivírus (6 [5 NV e uma SV]), HAstV (5), HAdV (4 [3 HAdV-F e 1 HAdV-A]), HPeV (2), e HBoV (1) (
Fig. 1 ). É importante mencionar que apenas 6 (8%) amostras manteve-se negativa após a detecção microarray e que nem todos os vírus encontrados
são conhecidas por serem patogénicas. Como mencionado acima, após a recolha de todas as amostras foram rastreadas para a presença de RV-A por
SDS-PAGE. Além disso, como descrito abaixo, todas as amostras testadas com o microarray foram testados à presença de vírus seleccionados,
incluindo rv-a, por RT-PCR de diagnóstico. Em 34 amostras RV-A foi identificada pelos três métodos testados; 5 amostras adicionais foram
encontradas positivas pelo microarray e ensaios de RT-PCR ( Fig. 2 ). Outra 8 foram encontradas positivas, quer por microarranjo ( n = 5) ou por RT-
PCR ( n = 3) ( Fig. 2 ). Notavelmente, as 3 amostras que eram positivas apenas para RV-A por meio de RT-PCR foram amostras de infecção mista.

FIGURA 1

Prevalência de vírus em amostras clínicas. Um grupo de 76 amostras clínicas de crianças com

gastroenterite foi analisado por o micro-arranjo descrito (A) ou de diagnóstico por RT-PCR para os
5 agentes patogénicos gastrointestinais mais comuns (B). As amostras com co-infecções são
mostrados. Negativo, nenhum vírus identificado.
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FIG 2

Identificação de rotavírus grupo A. Um grupo de 76 amostras de gastroenterite foi analisado por

três métodos para a presença de rotavírus. Estes foram rotavirus visualização de ARNcd por SDS-
PAGE, por RT-PCR, e o microarray concebida neste trabalho. Os círculos representam amostras de
números rotavirus positivo identificados por um, dois, ou três dos métodos utilizados.

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Para comparar os resultados do método de microarray com os de um método de diagnóstico de rotina para a gastroenterite viral, detecção de RT-
PCR para um painel de 5 vírus (RV-A, HAstV, HAdV, CV [NV e VS], e HEV) foi realizada em todas as amostras clínicas. É importante salientar que os
conjuntos de primers para HAdV, CV, e HEV são projetados para reconhecer seu alvo no nível de gênero ( 5 , 6 , 41 ).

O painel de RT-PCR detectou, pelo menos, um vírus em 59 amostras (78%) ( Fig. 1B ), uma taxa de detecção mais baixo do que aquele com o
microarray de ADN, quando analisando apenas estes vírus 5 ( n = 65, 85%). No nível de vírus individuais, o painel de RT-PCR confirmou os
resultados de microarray em todas as amostras de HAdV-positivas (1 HAdV-A e 3 HAdV-F), que tem um valor preditivo positivo (PPV) de 100%, em
todos os CV (5 NV e uma SV) amostras -positivas (PPV, 100%), e em 39 de 44 amostras-a-RV positivo (PPV, 89%), enquanto VPP foram menores para
HAstV, com 3 de 5 amostras positivas identificados por microarranjo ( PPV 60%), e HEV, com 5 de 7 amostras positivos identificados por microarranjo
(PPV 71%) ( Fig. 3 ).

FIG 3

sensibilidade diagnóstica Microarray e especificidade. Um painel de 5 grupos de vírus (rotavírus do

grupo A [RV-A], astrovirus humana [HAstV], adenovírus humanos [HAdV], calicivírus [CV], e
enterovirus humano [HEV]) foi testada por meio de RT-PCR em todas as 76 amostras . Os
resultados foram comparados aos obtidos por análise de microarray. A sensibilidade,
especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) do microarray (array),
em comparação com RT-PCR (PCR) para a detecção de patógenos específicos são mostrados.
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Detecção de vírus em MI. O rastreio por RT-PCR resultou na identificação de 16 infecções mistas (MI), enquanto o microarray identificou apenas 7
mi ( Fig. 1 ). O microarray detectado até 4 tipos diferentes de vírus dentro de uma amostra, com TTV encontrado em todas as amostras MI. As
seguintes combinações virais foram encontrados por microarray: 3 amostras com HEV B / TTV e uma amostra cada um com NV / TTV, HEV-B / HAstV
/ TTV, RV-A / HPeV / TTV e SV / HEV-B / HPeV / TTV ( Fig. 1 ). De interesse, parechovirus humano e vírus Sapporo foram detectados apenas em co-
infecção. As combinações MI observados em RT-PCR foram RV-A / HAdV (8 amostras), RV-A / HEV (5), HAstV / HEV (1), RV-A / CV (1), e HAdV / CV /
HEV (1) ( Fig. 1B ). Examinar estas 16 amostras, observou-se que RV-A foi o único vírus identificado por microarray em todas as amostras com RV-A
/ HAdV co-infecção ( n = 8) e em 4 dos 5 RV-A / amostras HEV, enquanto HAstV foi o único vírus identificado em amostras com HAstV / HEV co-
infecção ( Tabela 2 ). Em um exemplo, NV foi identificado como a única espécie de microarray, enquanto que os resultados de RT-PCR mostrou CV /
HAdV / HEV coinfecção tripla ( Tabela 2 ). Assim, em todas estas 16 amostras, um único vírus foi identificado por microarray, enquanto, pelo menos,
duas espécies virais foram detectados por RT-PCR.

MESA 2
Ver esta tabela:
Nesta janela Em uma nova janela C T valores para quantificação de ácido nucleico viral em amostras com co-infecção

Uma possível explicação para as diferenças na identificação de infecções mistas utilizando microarrays e RT-PCR pode ser a variabilidade na
quantidade relativa de material genético de cada vírus em amostras clínicas, como tem sido observado que os indivíduos infectados com alguns
vírus, por exemplo RV-a e NV, pode lançar grandes quantidades de partículas virais na fase aguda da infecção ( 49 , 50 , 51 ). Para explorar esta
possibilidade, a quantidade de material genético do vírus em amostras seleccionadas com infecção mista foi quantificada pelo tempo real de RT-PCR.
A utilização de quantidades iguais de material de partida nos permitiu comparar directamente a amplificação de C T s dos dois vírus dentro de uma
amostra. Os resultados mostraram que o único vírus detectado por microarranjo tinha, na maioria dos casos, um inferior C T valor do que o segundo
vírus detectado por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR), com a única excepção é a combinação RV-A / HEV, onde RV-a foi o único vírus identificados por
microarranjo, apesar do facto de HEV tinha inferior C t os valores ( Quadro 2 ). Isto indica que MI apresentando grandes diferenças nas quantidades
de material genético dos agentes virais envolvidas são propensos a resultar na detecção de vírus-única da micromatriz (geralmente a uma detecção
mais abundantemente presente).

Consequentemente, quando se compara a sensibilidade e especificidade do microarray com o painel de RT-PCR de diagnóstico individuais, o mais
prevalente ou mais frequentemente encontrada vírus em infecções simples, tais como RV-A, HAstV e CV, apresentou boa sensibilidade e
especificidade ( 85-100%), ao passo que a sensibilidade para vírus tais como HAdV e HEV era baixa, variando de 30 a 42%, sendo claramente afectada
por outros vírus presentes na amostra ( Fig. 3 ; Tabela 2 ). Por exemplo, 4 amostras que apresentaram apenas HAdV foram positivos por ambos
microarray e RT-PCR, enquanto que nos restantes 9 amostras, que apresentaram HAdV co-infecção com RV-A (8 amostras) e CV (uma amostra),
apenas o segundo vírus foi identificado por microarranjo ( Tabela 2 ). Deve salientar-se que a maioria destas amostras continha um baixo nível de
material genético HAdV, com C T valores próximos do valor de controlo nontemplate (44,5) ( Tabela 2 ).

Detecção de vírus GI incomuns. De nota, o microarray encontrados 3 vírus que geralmente não são avaliados em amostras de gastroenterite. Duas
amostras apresentaram HPeV, tanto em co-infecção (um com RV-A / TTV e outro com SV / HEV B / TTV). Uma amostra adicional contendo HBoV foi
identificado (RV-A foi identificado por RT-PCR na amostra), e 12 amostras apresentaram TTV, 5 amostras como infecção único e 7 em co-infecção
com outros vírus. Como amostras de referência para estes vírus não estavam disponíveis, a confirmação de RT-PCR em conjunto com a sequenciação
capilar foi realizado, e os vírus detectados por microarray foram confirmadas em todas estas amostras (resultados não mostrados). O fato de que as
amostras TTV-positivas individuais foram encontrados não é um indicador de causalidade.

DISCUSSÃO

Testes de rotina viral corrente é concebido para detectar apenas os vírus mais prevalentes, deixando frequentemente 30 a 50% dos casos sem um
agente identificado ( 52 ). Nos últimos anos, avanços na biologia molecular e da implementação de sequenciamento de última geração permitiu a
identificação de vários novos vírus em amostras intestinais ( 53 , 54 , 55 , 56 , 57 ). Os papéis da maioria desses vírus ( vírus Aichi , Anellovirus ,
Bocavírus Humano , parechovirus Humano , Picobirnavirus humano , e alguns enterovírus, entre outros) na doença diarreica ainda não está claro,
levantando a necessidade de estudar em detalhe a sua epidemiologia. A fim de reunir informações sobre a diversidade de vírus GI, ferramentas
adequadas são necessários para a sua monitorização. Neste trabalho, um microarray de ADN completa e sensível foi desenvolvido e testado, que
permite, em princípio, a detecção paralela de mais de 100 espécies de vírus associados a tracto gastrointestinal.

Implementação de um microarray para a detecção de vírus não é uma tarefa fácil. Concepção de sondas e condições experimentais são dois
parâmetros importantes a considerar. Microarrays resequencing permitir a identificação de mutações, mas exigem um elevado número de sondas
para um único agente, aumentando o custo ( 58 ). Arrays para subtipagem usar menos e mais curtas sondas mas muitas vezes são projetados para
apenas uma espécie virais ( 59 , 60 , 61 , 62 , 63 ). Microarrays utilizados para a descoberta do vírus provaram ser muito útil quando suspeitos do
costume são descartados ou em casos de doenças raras, mas a identificação não é clara e requer uma análise complexa ( 34 ).

Vários microarranjos de DNA tenham sido previamente relatado para a identificação dos principais vírus conhecidos gastrointestinais patogénicos (
59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75 ); no entanto, eles eram orientados principalmente para a identificação
ou subtipagem de uma espécie virais, e nenhum tinha especificamente dirigida a lista de vírus que podem ser encontrados em amostras de fezes.

A plataforma de microarray descrito neste trabalho foi validado com estirpes virais 14 de referência, representando 10 espécies de vírus diferentes.
Importante, 5 outras espécies virais foram identificados usando o microarray ao analisar amostras clínicas: HAdV-F, HAdV-A, HPeV, HBoV, e vários
TTVs. A capacidade do microarray para identificar corretamente vírus cujas sondas não foram validados neste trabalho com cepas de referência em
cultura confirma que a metodologia utilizada para projetar sondas é adequada e aumenta a probabilidade de que as sondas restantes será também
capaz de identificar seus vírus alvo, e esta é adicionalmente suportada por in silico detecção de uma ampla variedade de estirpes de RV-a, utilizando
sondas obtidas a partir de genes conservados; No entanto, os testes com outras estirpes de referência seria necessário. Durante as experiências de
validação, algumas sondas foram encontrados para reagir não especificamente com o DNA marcado amplificado, independentemente da sua origem;
Em outras palavras, eles foram encontrados para ser "pegajoso", e eles foram excluídos de análises posteriores. Nenhuma característica comum foi
encontrada entre essas sondas que poderiam ser responsáveis por seu comportamento ligação não específica.

Um dos parâmetros críticos na detecção de vírus é a sensibilidade do ensaio. Há vários fatores que podem afetar a sensibilidade. No caso de uma
micromatriz, os ácidos nucleicos da amostra são geralmente processadas por amplificação aleatória-primed antes da hibridação para assegurar a
amplificação de uma grande variedade de vírus. O produto de PCR aleatório poderia ser menor do que a de PCR específico, diminuindo a
sensibilidade do ensaio, como todo o material genético é amplificado, diluindo o sinal positivo ( 76 ). O limite de detecção para os três vírus com
diferentes tipos de genoma (dsDNA, dsRNA, e ssRNA +) foi estabelecido em 10 3 partículas de vírus, o que sugere que a natureza do genoma não
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sensibilidade do ensaio, como todo o material genético é amplificado, diluindo o sinal positivo ( 76 ). O limite de detecção para os três vírus com
diferentes tipos de genoma (dsDNA, dsRNA, e ssRNA +) foi estabelecido em 10 3 partículas de vírus, o que sugere que a natureza do genoma não

afecta a sensibilidade do ensaio. Além disso, o teste de sensibilidade de microarray com purificada RV-A de ARN, observou-se que a adição de 50 ng
de ARN celular como um ARN de diluição não específica diminuiu a sensibilidade de detecção de 10 vezes. Para tentar resolver o problema de
sensibilidade em amostras clínicas complexas, iniciadores específicos do agente foram incluídos em estudos anteriores, em conjunto com iniciadores
aleatórios durante a amplificação do material genético ( 14 , 15 ), com a desvantagem de reduzir o âmbito dos objectivos da ensaio de micromatriz.

Nós posteriormente analisaram um grupo de amostras clínicas coletadas de crianças com diarreia. Inicialmente, as amostras clínicas foram rastreados
por SDS-PAGE, o que conduziu à identificação de amostras de 34-RV-A positivas, enquanto que o micro-arranjo apresentado neste trabalho
identificou 44, sugerindo que a plataforma de microarray tem uma maior sensibilidade do que os métodos tradicionais. A sensibilidade semelhante
foi obtido por RT-PCR, tal como 42 amostras foram consideradas positivas RV-A. Mesmo que os nossos resultados indicam que o limite de detecção
do vírus purificado (1 x 10 3 partículas virais) é semelhante ao alcançado com os ensaios de PCR ( 8 ), o micro-arranjo teve um maior número de
resultados positivos quando as amostras clínicas foram testados, possivelmente devido a variação genética natural em cartilha regiões de vírus
encontrados no vírus da amostra vinculativo.

Embora ensaios multiplexados estão sendo desenvolvidos, a sua utilização em testes de rotina geralmente não é implementado, ea maioria dos
estudos utilizam testes de agentes patogénicos única. Quando o rastreio por RT-PCR para os vírus mais comuns é realizada, a percentagem de
amostras clínicas sem um vírus identificado permanece cerca de 30 a 50% ( 13 , 77 , 78 ), enquanto que o micro-arranjo apresentado neste estudo
detectado um vírus em 92% de as amostras. Esta alta taxa de detecção poderia ter sido influenciado pela época de amostragem, uma vez que o
inverno é a época alta para a gastroenterite viral na região e sem pré-selecção para patógenos foi realizada. Uma vantagem adicional do teste de
microarray comparado com um conjunto de diferentes ensaios de RT-PCR, é a capacidade de identificar os vírus que não são comumente testados
para, tais como aqueles anteriormente associado com diarreia (como HPeV) e aqueles de significado clínico claro na doença GI (HBoV e TTV). Neste
trabalho, encontramos uma grande variedade de vírus circulantes atípicas entre as crianças, da mesma forma como observado em outros estudos (
79 , 80 ), e sua vigilância contínua deve ser considerada. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relato de HPeV, HBoV e TTV em crianças
mexicanas.

Como consequência do número limitado de espécies de vírus testados rotineiramente, a prevalência de co-infecções é um assunto pouco explorado.
Normalmente, quando um painel de até 5 vírus é utilizado, as taxas de co-infecção de entre 4 e 18% são observados, com a combinação mais comum
sendo RV-A / NV ( 2 , 13 , 77 , 81 , 82 , 83 ). Mais recentemente, abrangentes estudos metagenomic mostraram que infecções mistas são mais
comuns do que se pensava ( 4 , 80 ), mesmo em indivíduos saudáveis ( 79 ). A análise do pequeno conjunto de amostras clínicas neste trabalho
mostraram que 30% (23 em 76) continham mais do que um vírus gastrointestinal. A identificação de vírus individuais em co-infecções apresentado
algumas discrepâncias quando se comparam os resultados de microarray e ensaios de RT-PCR. Dos sete amostras com infecções mistas identificados
por micro-arranjo, cinco foram confirmadas por RT-PCR, enquanto que em infecções mistas 16 identificados por RT-PCR, um único vírus foi
identificado por microarray, sugerindo que o micro-arranjo pode ser menos sensível do que a técnica de RT- PCR para a detecção de infecções
mistas. Para abordar esta inconsistência, em tempo real de RT-PCR foi implementada para as principais combinações de vírus que foram perdidas
pelo microarray. Esta plataforma mostrou uma certa vantagem para a detecção de RV-A ao longo de HAdV e HEV, como RV-A foi identificado, mesmo
quando o genoma HEV estava presente em quantidades maiores. HEV foi identificado pelo microarray em amostras coinfectados com RV-A apenas
quando RV-A RNA estava presente em pequenas quantidades, perto dos níveis de controle negativo ( Tabela 2 ). Identificação preferencial de RV-A
por o micro-arranjo pode ser devido à grande quantidade de partículas de vírus excretados durante a fase aguda da infecção e ao grande número de
sondas seleccionadas (42 oligonucleótidos, em comparação com 5 e 17 sondas para VHE A e HEV C , respectivamente, e 17 sondas de HAdV). Por
outro lado, as duas amostras positivas por HEV microarray que foram perdidas por RT-PCR correspondem às infecções mistas com HAstV / TTV e SV
/ HpeV / TTV, respectivamente. Várias tentativas para identificar HEV nestas amostras por RT-PCR resultou em resultados negativos, e, assim, a
possibilidade de um resultado falso-positivo microarray não podem ser descartados.

O número de espécies de vírus identificados aumentou consideravelmente na última década com a aplicação de emergentes tecnologias genômicas,
tais como microarrays e imparcial sequenciamento de última geração em estudos de casos fatais ou raros de doenças em seres humanos e em
animais selvagens e domésticos ( 25 , 56 , 84 , 85 , 86 ). Ferramentas adequadas que permitem a detecção de vírus patogénicos conhecidos ao
mesmo tempo que capaz de detectar os vírus novos ou raros em um único ensaio irá contribuir com informação epidemiológica úteis sobre ambos os
tipos de vírus. Este microarray inclui vírus de diferentes origens de acolhimento, a fim de alargar a gama de utilização para estudos veterinários. As
sondas oligonucleot�icas seleccionadas devem permitir a identificação de vírus alvo, apesar das variações de sequência que irão ocorrer no futuro;
No entanto, será importante para actualizar o desenho de microarray numa base regular para manter a capacidade para detectar vírus patogénicos e
amplamente para incluir espécies virais recentemente encontrados.

detecção paralela do vírus gastrointestinais além dos vírus mais comuns deverá facilitar uma melhor compreensão da etiologia do vírus, uma vez que
aumenta a taxa de casos positivos, fechando a lacuna de diagnóstico e permite a inspeção de infecções mistas, onde agentes virais secundárias
poderiam representar um fator importante. Adicionando dados a partir de estudos de caso-controle e inclusão de outros parâmetros de host, como
dados sorológicos, vai ajudar a fornecer evidências de patogenicidade do vírus. Além disso, estudos epidemiológicos adequados e abrangentes em
animais selvagens e domésticos deve ser considerada.

AGRADECIMENTOS

A análise computacional foi realizada usando o cluster do Instituto de Biotecnologia, UNAM, com o apoio de MC Jerome Verleyen. Agradecemos Paul
Gaytán Colín, Eugenio López-Bustos, e Santiago Becerra Ramírez de Unidad de Síntesis y secuenciación de DNA, Instituto de Biotecnologia, UNAM,
para a síntese dos oligonucleotídeos utilizados em ensaios de RT-PCR.

Este trabalho foi apoiado pela concessão S0008-111593 de CONACYT . Miguel A. Martínez e María de los Dolores Soto-del Rio foram apoiados por
uma bolsa da CONACYT-México .

Notas de Rodapé

Recebeu 08 de maio de 2014.

Voltou para a modificação 09 de junho de 2014.

Aceito 23 de outubro de 2014.

Os trabalhos aceitos publicado on-line 29 de outubro de 2014.

Endereço para correspondência Pavel Isa, pavel@ibt.unam.mx .

http://jcm.asm.org/content/53/1/136.full 6/9
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↵ * endereço de Presente: Maria de los Dolores Soto-del Rio, Departamento de Patologia Animal da Universidade de Turim, Grugliasco, Turim,
Itália.

Citation Martínez MA, MDLD Rio Soto-Gutierrez RM, CY Chiu, Greninger AL, JF Contreras Lopez S, Arias CF, P. 2015. Isa microarray de DNA
para detecção de vírus gastrointestinais. J Clin Microbiol 53: 136-145. doi: 10,1128 / JCM.01317-14 .

Material suplementar para este artigo pode ser encontrado em http://dx.doi.org/10.1128/JCM.01317-14 .

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