INDICE

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1- Introducción.

1.1- El cáncer y el sistema inmune.

El término cáncer es usado para clasificar las enfermedades en las cuales se

produce una división celular descontrolada con capacidad de invadir otros tejidos. [1]
El cáncer es considerado como una compleja enfermedad celular. Puede ser
explicado en parte como una tolerancia anormal del sistema inmune hacia células
descontroladas. Dichas células generalmente son reconocidas como células tumorales y
son eliminadas, pero ocasionalmente se escapan a este control por distintas razones.
El cáncer es una enfermedad que se origina a partir de secuencias de ADN
mutantes que redirigen vías cruciales en la regulación de la homeostasis, la muerte y/o
la vida celular.
Los cánceres, están compuestos por múltiples tipos celulares tales como
fibroblastos y células epiteliales, células del sistema inmune innato y adaptativo, células
del sistema sanguíneo y linfático, así como también células mesinquemales. Mientras
que la homeostasis tisular es mantenida por interacciones cooperativas entre estos
diversos tipos celulares, el desarrollo del cáncer es promovido cuando células mutantes
utilizan este cooperativismo para favorecer su propia supervivencia. Cuando la
homeostasis es perturbada, los macrófagos y células mastoideas liberan inmediatamente
mediadores, como citoquinas, quemoquinas, proteasas y especies reactivas del oxígeno
(ROS), y también, mediadores bioactivos como la histamina, la que induce la
movilización e infiltración de leucocitos en el tejido dañado. Las células dendríticas
(DCs) captan antígenos foráneos y migran hacia los órganos linfoides donde presentan
estos antígenos a las células del sistema inmune adaptativo [2].
Inicialmente se creía que la infiltración leucocitaria dentro y alrededor de
neoplasmas en desarrollo representaba un indicio de erradicar las células neoplásicas.
De hecho, la infiltración extensiva de células NK en carcinoma gástrico o colorrectal, es
asociada a un pronóstico favorable. Sin embargo, los tejidos malignos que contienen
infiltraciones de otros tipos de células pertenecientes a la inmunidad innata, como los
macrófagos y las células mastoideas tienden a ser asociadas a un pronóstico clínico
desfavorable [2, 3, 4]. Estudios basados en poblaciones, revelaron que individuos que

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son propensos a enfermedades inflamatorias crónicas poseen gran riesgo de desarrollar
cáncer. [5]. Una predicción que puede ser hecha a partir de esos estudios es que, en
individuos con desórdenes inflamatorios crónicos, existen mutaciones o polimorfismos
en genes que codifican modificadores inmunes. Los polimorfismos en genes que
codifican para citoquinas, proteasas y proteínas transductoras de señales, han sido
identificados como factores etiológicos en diversos desórdenes inflamatorios crónicos,
indicando qué terapias pueden ser eficaces y beneficiosas basándose en la
normalización del balance inmunitario.
Los microambientes tumorales son ricos en citoquinas y mediadores pro-
angiogénicos derivados de células del sistema inmune, tales como TNFα, TGFβ, VEGF
e IL-1 y 6. La producción de factor de crecimiento de endotelio vascular, VEGF, provee
un mecanismo por el cual los leucocitos (que se infiltran en tumores) incrementan la
angiogénesis y promueven el desarrollo tumoral. Similarmente, el TNFα (citoquina
clave en la inflamación aguda) es mediadora en el desarrollo del cáncer. Otro promotor
tumoral relacionado a la inflamación asociada al cáncer es el factor de trascripción
nuclear kB (NFkB). Se descubrió que la supervivencia del hepatocito en un carcinoma
hepatocelular es regulada por este factor, y su estado de activación y localización celular
están bajo el control paracrino del TNFα [6]. Se vio que el NFkB poseía dos roles en la
promoción tumoral, primero, previniendo que no se produjera la apoptosis de células
potencialmente malignas, y segundo, mediante la estimulación de la producción de
citoquinas pro-inflamatorias por parte de células tumorales. Luego estas citoquinas
contribuyen de forma paracrina a la proliferación de células neoplásicas y al incremento
de la supervivencia de éstas.
Las células del sistema inmune innato al estar crónicamente activadas,
contribuyen además al desarrollo del cáncer a través de la supresión de la respuesta
inmune adaptativa.
Un subconjunto de células de la inmunidad innata (como los supresores
mieloides) se acumula en tumores y órganos linfoides. Los supresores mieloides son
conocidos por inducir la disfunción de los linfocitos T mediante el contacto célula-
célula y por la producción de mediadores inmunosupresores, y por lo tanto inhiben
activamente la inmunidad adaptativa antitumoral [7, 8].

3
Órganos linfoides secundarios
Sistema inmune adaptativo
 Progresión neoplásica

Citoquinas pro-inflamatorias
Estimulación tumoral
Pro-crecimiento
Migración y Expansión tisular
presentación Conversión maligna
antigénica de las CD
Respuesta inmune Inhibición muerte cel.
innata Inestabilidad genómica
Activación fibroblastos
angiogénicos
Proteínas séricas

Activación LB y
LT Anti tumor:
Citotoxicidad dependiente de LT
Órganos linfoides secundarios Citotoxicidad dependiente de anticuerpos
Sistema inmune adaptativo Lisis mediada por complemento

Figura 1: esta figura representa el modelo de la función celular de la inmunidad innata y adaptativa, asociada al desarrollo del
cáncer durante la inflamación.
Los antígenos captados por las CD en los tejidos neoplásicos, son transportados hacia órganos linfoides donde se produce la
presentación antigénica; de esta forma, se activa la respuesta inmune adaptativa, resultando en dos efectos contrapuestos, uno
tumoral y otro promotor tumoral. La activación de los linfocitos B y de la inmunidad humoral producen la activación crónica
de las células del sistema inmune innato en los tejidos neoplásicos. Esta activación de células del sistema inmune innato como
células mastoideas, granulocitos y macrófagos, promueven el desarrollo tumoral al liberar moléculas que modulan la
expresión génica en células neoplásicas, culminando en la alteración del ciclo celular y en el incremento de la supervivencia.
Las células inflamatorias influyen positivamente en el remodelamiento tisular y en el desarrollo de sistemas vasculares
angiogénicos mediante la producción de mediadores pro-angiogénicos y proteasas extracelulares. Los tejidos en los que esta
vía esta activamente comprometida exhiben un elevado riesgo de desarrollo tumoral. Por el contrario, la activación del
sistema inmune adaptativo provoca respuestas antitumorales a través de citotoxicidad dependiente de células T, citotoxicidad
dependiente de anticuerpos y lisis mediada por complemento

Adaptado de Visser y col. [2]

1.2- Terapias.

En la actualidad hay muchos tratamientos para combatir el cáncer, pero podemos

agruparlos en tres grupos, Quimioterapia, Radioterapia e Inmunoterapia.
La quimioterapia es un tratamiento con drogas específicas que detienen la
división celular. En la radioterapia, se utiliza la elevada energía radiante de los rayos x,
rayos gamma, neutrones, protones y otros, para eliminar células tumorales. Esta energía
radiante puede provenir de una máquina (radioterapia externa) o puede provenir de un
material radiactivo colocado dentro del cuerpo del paciente en una zona cercana al
tumor (radioterapia interna). La radioterapia sistémica, utiliza una sustancia radiactiva,

4
como por ejemplo, un anticuerpo monoclonal marcado radiactivamente, que viaja en la
sangre hacia los tejidos.
La inmunoterapia, tiene como objetivo promover o restaurar el sistema inmune
para combatir el cáncer y otras enfermedades. En esta terapia se intenta dilucidar el
cómo del mecanismo que permite la inmunotolerancia tumoral. La inmunoterapia se
clasifica en Activa y Pasiva. En la pasiva, actúan generalmente los anticuerpos
monoclonales contra un antígeno comúnmente expresado en una línea tumoral
determinada. La producción del Ab se realiza ex vivo y luego se lo trasfiere al paciente.
Otra forma de inmunoterapia pasiva es aislar linfocitos y expandirlos con Ag
inmunogénicos in vitro y luego transferirlos al paciente.
En la inmunoterapia activa, el propósito es la total estimulación del sistema
inmune (inmunoterapia inespecífica) o la estimulación de uno o varios Ag específicos
del tumor a través de la propia maquinaria inmune del paciente (inmunoterapia
específica o vacunas tumorales).
Hay diversas estrategias para estimular el sistema inmune contra tumores.
Algunos agentes quimioterapéuticos, como antraciclinas y gemcitabine, son efectivos
promotores de la respuesta inmune a través de la sobreexpresión de antígenos
específicos de tumores luego de la destrucción apoptótica de la célula tumoral. Otras
estrategias, como la del GM-CSF o la de IL-2, son propuestas para incrementar el
número de células del sistema inmune en la proximidad del tumor, por lo que se mejora
la presentación antigénica, la activación de los linfocitos T y la proliferación celular.
Comparada con la quimioterapia clásica o con la radioterapia, el desarrollo de la
inmunoterapia presenta dos potenciales ventajas: i. especificidad hacia la célula blanco,
reduciendo efectos adversos en el tejido normal y ii. menor interferencia con otras
terapias, convirtiéndola en un apropiado tratamiento adyuvante de la quimio o
radioterapia.
Lamentablemente no se han obtenido beneficios clínicos significantes con los
modelos usados hasta el momento. De todas formas, recientemente se han propuesto
nuevas estrategias antitumorales, como por ejemplo, específicos agentes
quimioterapéuticos que pueden fácilmente estimular el sistema inmune contra el cáncer
combinado con el uso de citoquinas (GM-CSGF, IL-2) de esta forma se produce un

5
sinergismo entre la quimioterapia clásica y los nuevos tratamientos anticancerígenos, lo
cual abre una nueva y próspera área en la cual enfocarse. [9]

2- Objetivos.

El objetivo de este estudio es conocer qué efectos produce la Crotoxina sobre la

funcionalidad fagocítica y lítica de los neutrófilos, utilizándose como base el estudio de
Fase I mencionado anteriormente. De modo que se utiliza la dosis máxima tolerable
(750pg/ml en plasma) para saber si a esta concentración se produce la inhibición de una
de las células más importante en el sistema inmune.

3- Marco teórico.

Muchas drogas utilizadas para el tratamiento del cáncer son citotóxicas para
linfocitos y células fagocíticas (monocitos y granulocitos) maduras y sus precursores.
Por lo que el paciente durante el tratamiento con estas drogas atraviesa un período de
inmunodeficiencia con alto riesgo de morbimortalidad por infecciones.
Las infecciones son la complicación más frecuente y encabezan las causas de
muerte en pacientes con leucemia aguda. La Neutropenia es el factor preponderante que
predispone a los pacientes a una infección bacteriana o fúngica. Los defectos de las
células fagocíticas en los pacientes con leucemia, son a menudo causados por la
enfermedad misma, pero los efectos supresores debidos al tratamiento también son
importantes. Algunas drogas antimicrobianas afectan a los neutrófilos potenciando o
inhibiendo sus funciones. De todas formas, la mayoría de estas drogas no ejercen un
efecto directo sobre los PMN, sino que producen diversas alteraciones en el patógeno,
facilitando su fagocitosis por el neutrófilo. Pallister y col. testearon el efecto sobre la
fagocitosis y muerte celular de blastosporos de Candida albicans por neutrófilos con
cuatro antimicrobianos y tres antineoplásicos. En este estudio mostraron que la
Amphotericina B causa un importante incremento en la fagocitosis y muerte celular. El
antineoplásico Tobramycin no afectó la fagocitosis pero aumentó la muerte celular, en
cambio el Methotrexate y Prednisolone causaron un aumento significativo de la
fagocitosis pero no modificaron la muerte celular. La combinación de estas drogas (tal
cual como se las utiliza en el tratamiento de la Leucemia Linfoblástica Aguda en niños)
inhibe la fagocitosis, pero no causa ningún efecto sobre la muerte de C. albicans.

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 La Crotoxina es una nueva y potencial droga antitumoral. Se ha comprobado que
exhibe actividad citotóxica in vitro e in vivo sobre numerosas líneas celulares de
tumores de origen murino y humano. La eficacia de la CTX se demostró mediante la
administración diaria por inyección intramuscular. Se registró una inhibición del
crecimiento en carcinoma de pulmón de Lewis (83% de inhibición), y carcinoma
mamario humano MX-1 (69% de inhibición), mientras que produjo una inhibición del
44% en células de leucemia HL-60. Pudiéndose decir que posee una mayor afinidad por
tumores sólidos. [10, 11].
Los resultados de un estudio con líneas celulares tumorales que difieren en el
nivel de expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFr), mostraron
que las células con mayor nivel de expresión del EGFr poseían una sensibilidad 60
veces mayor a la acción citotóxica de la crotoxina que las que expresan niveles menores
de EGFr. Esto sugiere que los receptores de dicho factor o la función de receptor, juega
un rol importante como “blanco” de la crotoxina. [12].
En el año 1999 se realizó el estudio clínico de Fase I en donde se determinó la
dosis máxima tolerable (MTD) y la farmacocinética de la droga. Los efectos colaterales
como la neurotoxicidad reversible y limitada a paresias de los músculos oculares
externos, resultante en diplopía y/o ptosis palpebral, se tomaron como limitantes de
toxicidad. La mayoría de los pacientes evaluados indicaron disminución o desaparición
del dolor durante el tratamiento, lo que se acompañó de una notable disminución en el
consumo de analgésicos.
Respecto a la respuesta de la enfermedad, no se observó progresión del tumor en
cuatro pacientes, respuesta parcial en tres pacientes y un paciente presentó una respuesta
completa, que persistió seis meses después de la suspensión del tratamiento. [13].

3-1- Polimorfonuclear neutrófilo.

El neutrófilo polimorfonuclear comparte la célula madre hematopoyética

precursora común con los demás elementos figurados de la sangre y es el glóbulo
blanco dominante en el torrente sanguíneo. Es una célula de vida corta (4 -5 días) y la
médula produce unos 80 millones/minuto.
Un vez que salen de la médula ósea, la vida de los granulocitos normalmente es
de 4 a 8 horas circulando en la sangre y el resto de tiempo en los tejidos.

7
 El desarrollo de los granulocitos en la médula ósea atraviesa 2 fases bien
diferenciadas una mitótica y otra no mitótica. Cada fase dura aproximadamente una
semana. En la mitótica, las células maduran de mieloblastos a promielocitos y
mielocitos, coincidiendo con la aparición de los gránulos citoplasmáticos
característicos. Se desarrollan progresivamente los metamielocitos, los neutrófilos
encayados o inmaduros y finalmente los neutrófilos maduros.
En el PMN existe un sin número de gránulos, es por esto que se ha adoptado
como criterio de clasificación su contenido citoplasmático.
• Primarios o Azurófilos:
o Hidrolasas Acidas
o Mieloperoxidasas
o Fosfatasa Acida
o Β-glucuronidasa
o RNasa
o DNasa
o Mucopolisacárido sulfatado resistente a la
heparina
o Proteínas ricas en Arginina
• Secundarios o Específicos:
o Fosfatasa Alcalina
o Muramidasa

Los gránulos azurófilos son descargados en primer lugar durante la fagocitosis y en ese
momento el pH de la vacuola fagocítica es óptimo para la acción de sus enzimas; luego
lo hacen los específicos.

3.1-a- Fagocitosis de los neutrófilos.

Es el proceso por el cuál la célula fagocítica introduce al citoplasma partículas
de tamaño relativamente grandes. Es un mecanismo complejo que se inicia con la
localización del agente patógeno y concluye con su eliminación.
En esta actividad están implicados múltiples factores como las características del
microorganismo invasor, la liberación de opsoninas, la activación de receptores de

8
membrana específicos y los efectos moduladores de las citoquinas del hospedador y de
los productos secretados por el microorganismo.
En la fase inicial de este proceso los neutrófilos se desplazan por vía
intravascular hasta el foco infeccioso, favorecidos por la acción quimiotáctica de
sustancias liberadas por el microorganismo y por el propio huésped, como C5a, LTB4 o
IL8. El neutrófilo comienza un proceso de adhesión mediado por selectinas a la pared
del vaso. Entonces se produce la adhesión firme a la pared vascular mediada por las β 2-
integrinas y por moléculas de adhesión endoteliales (ICAM-1, ICAM-2). La
transmigración es la fase final del tránsito del neutrófilo hacia los tejidos, y se modula
por la presencia de las moléculas PECAM-3 y CD31, localizadas en las uniones
intercelulares.
Para facilitar el reconocimiento e ingestión del microorganismo, éste es
opsonizado por moléculas (opsoninas) como la IgG y C3b. El neutrófilo tiene en si
membrana receptores para la fracción C3b del complemento y para el fragmento Fc de la
IgG.
Los complejos antígeno-anticuerpo activan el complemento y se produce la
fracción C3b que se fija a los complejos formados. De esta manera pueden actuar
opsonizando las partículas no sólo por las IgG sino todas las que sean capaces de fijar
complemento luego de reaccionar con el antígeno.
Una vez que se produce el contacto del microorganismo y el neutrófilo se inicia el
proceso de ingestión mediante la extensión de seudópodos que la rodean y finalmente se
fusiona formando la vacuola fagocítica o fagosoma primario. Este posteriormente se
fusiona con los lisosomas dando lugar al fagolisosoma, en cuyo interior el
microorganismo queda expuesto a 2 sistemas microbicidas.
• Sistema microbicida oxígeno independiente: Sistema constituido por pH ácido,
lisozima, lactoferrina y proteína catiónica granular. Este sistema puede actuar
intracelularmente, localizando su accionar en los fagolisosomas, o
extracelularmente por efecto de estímulos que induzcan su liberación (péptidos
quimiotácticos, complejos inmunes, etc.).
• Sistema microbicida oxigeno dependiente: Puede ser mediado por la
mieloperoxidasa (MPO) o independiente de la mieloperoxidasa. Durante el
proceso fagocítico se produce un incremento en el consumo de oxígeno de hasta

9
 50 veces el valor normal. También se produce la metabolización de grandes
cantidades de glucosa y la consiguiente producción de NADPH.
La gran cantidad de oxígeno producido es utilizada para producir sustancias
tóxicas derivadas del oxígeno como el anión superóxido, radicales hidroxilos,
peróxido de hidrógeno, hipocloritos, etc.

Para la fagocitosis es necesaria la presencia de cationes bivalentes siendo más

efectivo el Ca2+ que el Mg2+; se produce óptimamente a 37º C y se inhibe a 4º C; es muy
sensible a cambios de osmolaridad pero se produce en un amplio rango de pH.

3.2- Crotoxina.

La crotoxina representa el 60-65% del peso seco del veneno de la serpiente

Crotalus durissus terrificus. Es un complejo no covalente formado por dos tipos de
fosfolipasa A (una ácida y una básica) y una proteína no enzimática. La subunidad
básica (CtxB), tiene un de PM 16300, pI=9,7, presenta actividad fosfolipasa A2. Es el
agente farmacológico esencial del complejo Ctx, ya que es capaz de reproducir todos los
efectos farmacodinámicos de éste. La actividad fosfolipasa de la CtxB es indispensable
para la toxicidad. Posee poca actividad neurotóxica pero porta la mayor actividad
hemolítica del complejo Ctx.
El componente ácido del complejo crotoxina (CtxA) tiene un PM de 8000-10000 y
un pI=3,7 que carece de citotoxicidad y actividad hemolítica [14]. Cuando se adiciona a
CtxB se observan efectos relevantes en cuanto al mecanismo de toxicidad del complejo,
como por ejemplo:
i. Inhibe específicamente la actividad fosfolipasa de la CtxB sobre lipoproteínas,
y
ii. Potencia la toxicidad de la CtxB alterando el comportamiento farmacocinética
de la enzima de modo específico. [15]

La inyección subcutánea de Ctx en ratones BALB/C machos induce mecanismos

endógenos, evidenciados por las alteraciones en la secreción de citoquinas,

10
 glucocorticoides y la distribución de leucocitos circulantes ya que causa una fuerte
disminución de las células mononucleares circulantes. [16]

4- Material y método.

4.1- Materiales.

1. Sangre venosa de pacientes asintomáticos.

2. Cultivo de Candida albicans. Los cultivos se realizan en agar Sabouraud.
3. Medio RPMI 1640
4. PBS
5. Azul Tripán al 4%
6. Colorantes MayGrünwald y Giemsa 10%
7. Material de vidrio y plástico

4.2- Metodología de trabajo.

a- Actividad fosfolipasa de la Crotoxina. La actividad fosfolipasa de la Ctx es

determinada por la disminución de la turbidez de una suspensión de yema de huevo,
cuantificada a 925nm. [17]
Protocolo:
i. Se prepara una suspensión de yema de huevo al 5% en buffer
Tris-HCl 50mM pH=7,5
ii. En una tubo con 800µl de solución de NaCl al 0.85% se colocan
200µl de la suspensión de yema de huevo
iii. Se colocan 100µl de Ctx [µg/ml]
iv. Se incuba por 15,30 y 60 minutos a 37ºC.
Una unidad de actividad específica de Fosfolipasa (UEF), se expresa como la
cantidad de enzima de producir la disminución de la turbidez de la mezcla en
una miliunidad de absorbancia a 925nm por minuto.

11
b- Candida albicans. Se realiza un repique a medio estéril unas 8 horas antes de realizar la
experiencia para obtener células en etapa exponencial de crecimiento y además para que
no se formen conglomerados celulares difíciles de romper. En el momento de la
experiencia se procede a preparar la suspensión de levaduras.
Protocolo:
i. Recoger con el ansa estéril y colocarlas en un tubo con PBS a
37ºC
ii. Se centrifuga a 3000rpm 10 minutos.
iii. Se desecha el sobrenadante y se resuspende en PBS
iv. Se centrifuga a 3000rpm, 10minutos.
v. Se desecha el sobrenadante y se resuspende en PBS.
vi. Se ajusta la concentración a 5x106 células/ml.
vii. Se agrega 10% del volumen de suero AB sin descomplementar.

c- Solución de Crotoxina. Se realizó la dilución de la solución madre de Crotoxina

(4mg/ml) utilizando el medio RPMI 1640, llegando a un volumen final de 750 pg/ml.

d- Viabilidad de PMN frente a Crotoxina. Se determinó la viabilidad de los neutrófilos

frente a Crotoxina mediante la observación y recuento en microscopio con tinción azul
tripán.
Protocolo:
i. Se preparan 4 portaobjetos. Se realiza por duplicado.
ii. Se extraen 12mL de sangre venosa
iii. A 4 mL de sangre se le agrega la solución de Crotoxina
715ρg/mL
iv. Se coloca en cada portaobjeto 2mL de sangre
v. Se incuba en cámara húmeda a 37ºC 1 hora.
vi. Se lava 3 veces con RPMI 1640 a 37ºC.
vii. Se procede a incubar con solución de azul tripán al 4% durante 5
minutos. Se observan las células coloreadas (muertas) y sin
colorear (viables). Se hace el recuento sobre 200 células.

12
e- Viabilidad de C. albincans frente a Crotoxina. La viabilidad de las levaduras también se
realizó por el método de tinción con azul tripán.

f- Ensayo de función fagocítica. Se determina la función fagocítica de los PMN frente a

C.albincans siguiendo la técnica descripta por P. D Blanzaco y col. (1983). [18] previa
incubación de éstos con Crotoxina.
Protocolo:
i. Se preparan 4 portaobjetos. Se realiza por duplicado.
ii. Se extraen 12mL de sangre venosa
iii. A 4 mL de sangre se le agrega la solución de Crotoxina
715ρg/mL
iv. Se coloca en cada portaobjeto 2mL de sangre
v. Se incuba en cámara húmeda a 37ºC 1 hora.
vi. Se lava 3 veces con RPMI 1640 a 37ºC.
vii. Se procede a incubar los portaobjetos con las levaduras 1mL con
una concentración aproximada de 5x106 células/mL
viii. Se incubar a 37ºC 30 minutos.
ix. Se lava 3 veces con RPMI 1640-PBS 37ºC
x. Se colorea con MayGrünwald-Giemsa 10%
xi. Se realiza el conteo de células. Se cuenta el número de levaduras
fagocitadas/lisadas cada 100 neutrófilos.

5- Análisis estadístico de los datos.

Para el análisis de los datos se utilizó el programa SPSS versión para

estudiantes.
Sabiendo por anteriores experiencias (nuestras y de otros grupos de
investigación) que fagocitosis y lisis distribuyen según curvas normales [18, 19, 20, 21],
se realizó una prueba t para muestras pareadas para determinar las siguientes hipótesis:
• Hipótesis nula: H0: µcontrol = µCtx
• Hipótesis alternativa: H1: µcontrol ≠ µCtx

13
6- Resultados.

6.1- Viabilidad celular de neutrófilos.

Se observó una viabilidad mayor al 95%.

6.2- Viabilidad celular de C. albicans.

La viabilidad fue mayor al 95%.

6.3- Morfología celular.

Como se puede ver en las fotos, la morfología de los neutrófilos no se vio

afectada por el tratamiento con crotoxina. Puede verse que la integridad de la membrana
permanece intacta, igual que el núcleo lobulado.

a b

Figura 2. Fotografía con aumento de 100X del ensayo de fagocitosis de levaduras por los PMN, la fotografía (a) corresponde al
control, en donde se ve la fagocitosis de C. albincas y en algunas se comienza a ver su destrucción (marcada con la flecha) que se
denota por la refringencia que toma la célula (imagen fantasma). (b) corresponde a ensayo con crotoxina, puede ver que no hay
diferencias con la figura (a) en lo que respecta a morfología, tanto del neutrófilo como de la levadura. Aquí también puede verse

como empiezan a ser lisadas las levaduras por el mecanismo lítico de los PMN.

6.4- Fagocitosis celular.

El análisis estadístico nos dice que para un nivel de significancia α=0,5, no se

puede rechazar la hipótesis nula. Es decir que no hay pruebas suficientes para decir que

14
la crotoxina ha afectado de alguna forma la fagocitosis de C. albincans por parte de los
PMN.

Estadísticos de muestras relacionadas

Error típ. de la
Media N Desviación típ. media
Par 1 CONTFAG 376,7667 30 61,52246 11,23241
CTXFAGO 375,9000 30 66,63713 12,16622

Prueba de muestras relacionadas

Sig.
Diferencias relacionadas t gl (bilateral)
Error típ. 95% Intervalo de
Desviación de la confianza para la
Media típ. media diferencia
Inferior Superior
Par 1 CONTFAGO –
,8667 52,21292 9,53273 -18,6300 20,3633 ,091 29 ,928
CTXFAGO

700

600

500

400

300

200
N= 30 30

CONTFAGO CTXFAGO

Figura 3. Diagrama de cajas que representan los datos tratados en el ensayo de fagocitosis. CONTFAGO:
ensayo control de la fagocitosis. CTXFAGO: ensayo con crotoxina de la fagocitosis.

15
 6.5- Lisis celular.

El análisis estadístico nos dice que para un nivel de significancia α=0,5, no se

puede rechazar la hipótesis nula. Es decir que no hay pruebas suficientes para decir que
la crotoxina ha afectado de alguna forma la lisis de C. albincans por parte de los PMN.

Estadísticos de muestras relacionadas

Error típ. de la
Media N Desviación típ. media
Par 1 CONTLISI 18,9000 30 13,37870 2,44261
CTXLISIS 19,3333 30 9,68587 1,76839

Prueba de muestras relacionadas

Diferencias relacionadas
95% Intervalo de
confianza para la
diferencia
Desviación Error típ. de
Media típ. la media Inferior Superior t gl Sig. (bilateral)
Par 1 CONTLISI -
-,4333 13,71051 2,50319 -5,5529 4,6863 -,173 29 ,864
CTXLISIS

70

60

50

40

30

20

10

-10
N= 30 30

CONTLISI CTXLISIS

Figura 4. Diagrama de cajas que representan los datos tratados en el ensayo de lisis. CONTLISI: ensayo
control de lisis celular. CTXLISIS: ensayo con crotoxina de lisis celular.

16
7- Discusión y conclusión.

El método por el cual se realizó la fagocitosis y lisis es sencillo, robusto y

económico. El mayor inconveniente que muestra es el “revelado” ya que es un recuento
por microscopio óptico. Debido a esto el error del método reside fundamentalmente en
el error por parte del operador. Por lo que se deben tomar las precauciones debidas cada
vez que se realiza la prueba. Dentro de las consideraciones generales, se encuentran
que:
• El cultivo de Candida albicans al momento de realizarse la prueba debe tener
una incubación de hasta 8 horas. De no ser así, se formarán pseudohifas, de
modo que se dificultará la disrupción de éstas y por consiguiente se complica el
recuento, aún en 100X.
• Al colorear con MayGrünwald-Giemsa 10%, asegurarse de no sobrepasar el
tiempo de contacto entre el colorante y la muestra, debido a que las células
cuando toman mucho color no se distinguen bien para su conteo.
• Tener en cuenta la temperatura de la solución de lavado, y tener mucho cuidado
en que esta no se contamine, ya que cualquier variación en el pH produce que
los neutrófilos pierdan la adherencia al vidrio.

Los resultados obtenidos son alentadores debido a la gran necesidad de contar con
agentes quimioterapéuticos que no causen disfunción en los neutrófilos. Esto no quiere
decir que la Ctx no pueda causar otros efectos sobre los PMN tales como modificar su
quimiotaxia, o la liberación de citoquinas pro-inflamatorias, etc., por lo que es necesario
realizar los estudios y las pruebas correspondientes. Además, debería completarse la
evaluación del efecto de la Ctx sobre las demás células del sistema inmune innato y
adaptativo.
Sampaio y colaboradores realizaron numerosas pruebas con macrófagos murinos.
Los estudios de estos investigadores discordan con resultados de este trabajo ya que
demuestran que la capacidad fagocítica de los macrófagos se ve disminuida por la
crotoxina. Esta discordancia puede deberse al tipo de célula tratada. Es muy interesante
mencionar sus hallazgos ya que nos pueden guiar en los mecanismos por los que actúa

17
la crotoxina. El veneno completo al igual que su componente principal, la Ctx, causan la
disminución de la capacidad fagocítica y lítica, diminuyen la difusión y regulan el
metabolismo de los macrófagos, induciendo una mayor producción de especies
reactivas del oxígeno y nitrógeno, tales como el peroxido de hidrógeno (H 2O2) y oxido
nítrico (NO), también aumenta la liberación de IL-6, TNF e IFN-γ [22]. Aumenta
además la actividad de enzimas claves de la glucólisis y glutaminólisis. [23] Esto
sugiere que la crotoxina dejaría a los macrófagos en un estado activado, pero dicho
estado no incluye la difusión y la fagocitosis [24].
Como se dijo anteriormente, la crotoxina está compuesta por dos subunidades, una
de ellas, la fosfolipasa A2 (PLA2), es la responsable de la disminución de la difusión de
los macrófagos. Además inhibe la fagocitosis de partículas de Zimosan opsonizadas,
eritrocitos de carnero opsonizados y de Candida albicans, con lo que se puede decir que
este efecto inhibitorio no depende del tipo de receptor involucrado en el proceso
fagocítico [25].
Por otra parte se vio que la incubación de macrófagos con crotoxina produce un
incremento en los niveles de prostaglandinas y lipoxinas, con lo que se demostró que
eicosanoides derivados de lipoxigenasa están involucrados en la inhibición fagocítica.
Estos eicosanoides actuarían incrementando la cantidad de Actina F, inhibiendo la
fosforilación de tirosinas y activación de proteínas involucradas en la señalización
intracelular para el proceso fagocítico de los macrófagos. [26, 27]
Las lipoxinas A y B actúan sobre los neutrófilos produciendo su degranulación,
aumentando la liberación de anión superóxido y de enzimas lisosomales. Además
inducen la agregación leucocitaria [28]. Por lo que el efecto de la crotoxina sobre los
neutrófilos debería ser, en parte, contrario al de los macrófagos, a pesar de que el
mecanismo de fagocitosis incluye varias etapas secuenciales comunes en ambas células.
Estas son sólo hipótesis que deben ser esclarecidas.

18
8- Bibliografía.

1. National Cancer Institute- U.S National Institutes of Health- www.cancer.gov

2. de Visser, K. E.; Eichten A. y Coussens L. M. 2006. “Paradoxical roles of the
immune system during cancer development”. Nature Reviews Cancer. 6, 24-37.
3. Ribatti, D. et al. 2003. “Tumor vascularity and tryptase-positive mast cells
correlate with a poor prognosis in melanoma. Europe Journal of Clinic
Investigation. 33, 420-425.
4. Leek, R. D.; Landers, R. J.; Harris, A. L y Lewis, C. E. 1999. “ Necrosis
correlates with higth vascular density and focal macrophage infiltration in
invasive carcinoma of breast.” British Journal of Cancer. 79, 991-995.
5. Balkwill, F.; Charles, K. A and Mantovani, A. 2005. “Smoldering and polarizad
inflammation in the initiation and promotion of malignant disease”. Cancer
Cell. 7, 211-217.
6. Pikarsky, E. et al. 2004 “NF-κB functions as a tumour promoter in
inflammation-associated cancer”. Nature. 431, 461–466.

19
7. Serafini, P. et al. 2004. “Derangement of immune responses by myeloid
suppressor cells.” Cancer Immunology Immunother. 53, 64–72 .
8. Gabrilovich, D. I., Velders, M. P., Sotomayor, E. M. y Kast, W. M. 2001.
“Mechanism of immune dysfunction in cancer mediated by immature Gr-1+
myeloid cells.” Jouranl of Immunology. 166, 5398–5406.
9. De La Cruz-Merino, L.; Grande-Pulido, E.; Albero-Tamarit, A.; Codes-Manuel
de Villena, M. (2008). Cancer and Immune Response: Old and New Evidence
for Future Challenges”. The Oncologist.13, 1246-1254.
10. Newman, R.A.; Yu, Y.H.; Xu, F.J.; Thomton, A.; Bast, R.C.; Von Hoff, D.D.;
Vidal, J.C.: Etchevery, M.A. (1996). Cellular pharmacology and cytotoxicity of
crotoxin, a phospholipase A2 toxin, againts human breast, colon and ovarian cell
lines.Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 37, 393-398.
11. Rudd, C.J.; Viskatis, L.J.; Vidal, J.C.; Etcheverry, M.A. (1994). In Vitro
comparision of cytotoxic effects of crotoxin against three human tumor and a
normal human keratinocyte cell lines .Invest. New Drugs. 12, 183-184.
12. Donato NJ, Martin CA, Perez M, Newman RA, Vidal JC, Etcheverry M. 1996
Jun “Regulation of epidermal growth factor receptor activity by crotoxin, a
snake venom phospholipase A2 toxin. A novel growth inhibitory
mechanism”.Biochem Pharmacol. 14, 1535-43.
13. J. E. Cura, P. D. Blanzaco, C. Brisson, M. A. Cura, R. Cabrol, L .Larrateguy, C.
Mendez, J. C. Sechi, J. S. Silveira, E. Theiller, A. R. de Roodt, and J. C. Vidal.
2002. “Phase I and Pharmacokinetics Study of Crotoxin (Cytotoxic PLA2, NSC-
624244) in Patients with Advanced Cancer”. Clinical Cancer Research. 8,
1033–104.
14. Hendon R.A Fraenkel-Conrat. April 1971. “Biological roles of the two
components of Crotoxin”. Proc. Nat. Acad. Sci USA.68, 1560-156.
15. Canzini G.A. 1984. “Mecanismo de acción del complejo crotoxina de veneno de
Crotalus durissus terrificus”.Tesis. UBA.FCEN. Vol 1.
16. Cardoso D.F., Lopes-Ferreira M., Faquir-Mauro E., Macedo M.S., y Farsky
S.H.P. 2001. “Roles of crotoxin, a phospholipase A2 isolated from Crotalus
durissus terrificus snake venom, on inflammatory and immune reactions”.
Mediators of Inflammmation.10, 125-133.

20
17. Marinetti, G.V. 1965. “The action of phospholipase A on lipoproteins”. Biophys.
Acta.98, 554-565.
18. P.D. Blanzaco, C. Brisson, D. Scotto, S. Denner. 1983. “Capacidad de
fagocitosis y lisis de polimorfonucleares neutrófilos humanos frente a Candida
pseudotropicalis”. Análisis Clínicos. Órgano oficial del colegio de bioquímicos
de la Provincia de Entre Ríos. 5, 70-72.
19. Lehrer, R.I., Cline, M.J. 1969. “Interacton of Candida albicans with human
leukocytes and serum”. Journal of Bacteriology. 98, 996-999.
20. Lehrer, R.I. 1975. “The fungicidal mechanisms of human monocytes. I.
Evidence for myeloperoxidase-linked and myeloperoxidase-inependent
cadidacidal mechanisms”. Journal of Clinical Investigation. 55, 338-46.
21. Ballart, I.J., Estevez, M.E., Diez, R.A., Sen, L. 1987. “Comparison of Candida
killing activity measured by chemiluminescence and cytomorphological
methods in human phagocytes”. Journal of Immunology Methods. 97, 263-8.
22. Hernández Cruz A., Mendoza R.Z., y Petricevich Vera L. 2005. “Crotalus
durissus terrificus venom interferes with morphological, functional, and
biochemical changes in murine macrophage”. Mediator of inflammation. 6, 349-
359.
23. Sampaio, S.C, Sauce-e-Silva M. C. C., Borelli, P., Curi. R, y Curi. Y. 2001.
“Crotalus durissus terrificus snake venos regulates macrophage metabolism and
function”. Journal of Leukocyte Biology. 70, 551-558.
24. Sampaio, S.C, Brigatte, M.C.C, Sauce-e-Silva, dos-Santos E.C, Rancel-Santos
A.C., Curi. R, y Curi. Y. 2003. “Contribution of crotoxin for the inhibitory effect
of Crotalus durissus terrificus snake venom on macrophages function”. Toxicon.
41, 899-901.
25. Sampaio, S.C., Rangel-Santos A.C., Peres C.M., Curi. R, y Curi. Y. 2005.
“Inhibitory effect of phospholipase A2 isolated from Crotalus durissus terrificus
venom on macrophage function”. Toxicon. 45, 671-676.
26. Sampaio, S.C., Alba-Loureiro T.C., Brigatte P., Landgraf R.G., dos Santos E.C.,
Curi. R, y Curi. Y. 2005. “Lipoxygenase-derived eicosanoids are involved in the
inhibitory effects of Crotalus durissus terrificus venom or crotoxin on rat
macrophage phagocytosis”. Toxicon. 47, 313-321.

21
 27. Sampaio, S.C, Santos, M.F., Costa E.P., Rangel-Santos A.C., Carneiro S.M.,
Curi. R, y Curi. Y. 2006. “Crotoxin induces actin reorganization and inhibits
tyrosine phosphorilation and activity of small GTPases in rat macrophages”.
Toxicon. 47, 909-919.
28. Rojas-Espinosa, O. y Arce-Paredes, P. 2003. “Fagocitosis: mecanismos y
consecuencias. Primera Parte.”. Bioquimia. 28, 19-28.

Agradecimientos.

En primer lugar quiero agradecer a mis padres por ayudarme a elegir esta carrera
en la etapa confusa de mi adolescencia. Quiero agradecerle el apoyo, la fuerza y la
paciencia a mi prometida, Silvina. Sin ellos no creo que estaría aquí.
Al Dr. Blanzaco, que me abrió las puertas para que pudiera realizar este
proyecto.
A Cecilia Brisson, por ayudarme con su experiencia en el tema.
A todo el Departamento de Bioquímica Clínica.

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