VECTOR DE ADN

Un vector genético es una molécula de ADN que proviene de una célula donadora y se
introduce artificial o naturalmente en una célula receptora incorporándose en su propio
material genético, de este modo la información que contiene dicha molécula de ADN
puede codificar para expresarse en esta nueva célula produciendo las proteínas o
realizando las funciones para las que esta molécula estaba codificada originalmente en la
célula donadora.Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que
transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados mediante técnicas de
ADN recombinante. Para que sirva de vector, una molécula debe de ser capaz de
replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta, también debe presentar
secuencias de recombina miento que estas permitan la inserción del fragmento de ADN a
clonar. La clonación dependiente de células para fragmentos de ADN de diferentes
tamaños es facilitado por una amplia variedad de sistemas de vectores.

Son sistemas que se utilizan como ayuda al progreso de transferencia de un gen exógeno
al interior de la célula, facilitan la entrada y biodisponibilidad intracelular del material
genético a traducir y para su funcionamiento correcto.

Un vector génico es un agente que transfiere información genética, por algún medio, de
un organismo a otro. Son utilizados en biotecnología para portar el ADN recombinante
desde una célula donadora hasta la célula receptora en los que se inserta el gen que se
quiere transferir. A continuación se infecta la célula hospedadora con ese vector
recombinante, obteniéndose la célula transgénica.

Un vector con el que los científicos experimentan son los plásmidos, con los que es
posible insertar genes foráneos al núcleo de una célula. Otros vectores génicos son los
bacteriófagos y cósmidos. También se puede considerar vectores genéticos a los virus,
puestos que en el curso de su ciclo insertan información genética en las células que
invaden.
Los vectores deben llevar, además del gen protagonista, otros genes llamados
marcadores, que puedan identificar a las células que sean resistentes al antibiótico
marcado o que emitan luz, según los casos, serán las portadoras del ADN recombinante.
La probabilidad de fracaso en la formanción del transgénico es muy alta, debido al
descontrol en la inserción de ADN foráneo, de manera que la célula puede desorganizarse
y morir.

Existen muchos sistemas para poder llevar a cabo el proceso, pero estos varían de
acuerdo a su función de la especialidad de la célula o del tamaño del inserto por ejemplo.

Transformación: esto consiste a la introducción de material genético en las bacterias

esto se hace con plásmidos en los cuales se inserta el material genético que se desea.
Transfección: consiste en la introducción de material genético externo en células
eucariontes mediante plásmidos
Bacteriófagos: tuene reducidas dimensiones de su genoma y tiene facilidad de
crecimiento in vitro. Consiste en virus que infectan a las bacterias
Plásmidos: son secuencias de ADN extra cromosómicas que tienen una capacidad de
reproducirse automáticamente, y de pasar de una célula los plásmidos llevan consigo
genes en grado de conferir particularidades fenotípicas a las bacterias que los contienen,
los plásmidos se utilizan para clonar fragmentos pequeños de DNA en bacterias.
Cósmidos: son vectores híbridos construidos utilizando parte del cromosoma del fago
lambda y de DNA plasmidico.
De alta capacidad (P1,PAC, BAC, YAC)

CARACTERÍSTICAS PARA QUE UNA MOLÉCULA DE ADN PUEDA SERVIR COMO

VECTOR
1. Debe replicarse independientemente junto con el segmento de ADN que
transporta
2. Contener sitios de corte para enzimas de restricción, que se encuentran presentes
una vez en el vector
3. Tener algún marcador de selección (resistentes a antibiótico genes de enzimas
que la célula huésped no tiene)
4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar
Una de estas moléculas usadas como vector genético son los plásmidos de las bacterias,
que son fragmentos de DNA extracromosómicas que pueden transmitirse a otras células
para dar a ella nuevas características a expresar, como la resistencia a antibióticos o el
producir alguna proteína especial; el uso de plásmidos bacterianos como vectores
genéticos en la actualidad es de gran importancia ya que se aplica en distintos campos
como la medicina, la agricultura, y la industria.
Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el
fragmento de DNA que transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento
que permitan la inserción del fragmento de DNA a clonar.
Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez
en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de restricción y se
utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima.
PLASMIDOS

Explican cómo se inicia la replicación de los plásmidos bacterianos

Los plásmidos son anillos de ADN -moléculas de doble cadena con información genética-
que se encuentran dentro de la mayoría de bacterias. Estas estructuras circulares, que
son independientes del ADN bacteriano, contienen un conjunto de genes beneficiosos
para la vida de las bacterias.

Los plásmidos son moléculas de material genético (ADN) que se replican independientes
del cromosoma bacteriano (ADN que contiene los genes esenciales para la supervivencia
de la bacteria).

La palabra plásmido fue dada a conocer por primera vez por el biólogo molecular
norteamericano Joshua Lederberg en 1952 (quien obtuvo el premio Nobel de Fisiología y
Medicina en 1958). En 1957, durante una epidemia de disentería en Japón, un grupo de
investigadores descubrió que ciertas formas bacterianas eran resistentes a los antibióticos
empleados para tratar esta enfermedad. Tiempo después se encontró que esta resistencia
se debía nada más y nada menos que a los mencionados plásmidos.

Sólo tienen lo esencial

Así como todas las personas tenemos características similares que son las que nos
definen como humanos, también hay características diferentes que nos hacen distintos
entre sí; por su parte los plásmidos poseen propiedades semejantes que están presentes
en todos ellos, pero también contienen características que los hace ser especiales.
Algunas de estas características son las siguientes:

La mayoría son muy pequeñitos en comparación con el cromosoma bacteriano. Esto lo

podemos apreciar mejor en la siguiente figura y, aunque casi todos ellos son circulares,
hay algunos lineales.

Cada plásmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de
replicación lo cual permite al ADN ser reproducido en forma independientemente del
cromosoma.

Poseen genes que dan ventajas a las bacterias que los contienen, de lo que hablaremos
más adelante.

La replicación de plásmidos

La replicación del ADN de los plásmidos se origina siempre en el mismo lugar y utiliza un
mecanismo denominado de círculo rodante. En el punto de origen, sobresale una
protuberancia en forma de horquilla de cabello donde se engancha la proteína RepB para
iniciar la replicación. Lo que han descubierto los investigadores es que la proteína
iniciadora es un hexámero en forma de anillo y, por lo tanto, contiene seis centros activos
y seis motivos de unión al ADN que, además, son móviles. Estas características le
confieren varias habilidades: reconocer el lugar de origen de la replicación, cortar una de
las cadenas de ADN, rodear la otra y desenredarla para que la maquinaria de replicación
-el replisoma- pueda avanzar a lo largo del ADN y, finalmente, volver a atar la cadena de
ADN cortada, completando el círculo.

La estructura de la proteína RepB muestra similitudes con la familia de proteínas

helicasas de tipo anillo que intervienen en diversos procesos relacionados con el ADN, por
ejemplo, en la replicación de los virus. En particular, los investigadores han visto que una
parte de RepB tiene una estructura muy similar a los iniciadores de la replicación de dos
virus que provocan cáncer en humanos: el virus del papiloma humano (útero) y el virus
SV40 (mesoteliomas). Según Coll, esta coincidencia estructural muestra la relación
evolutiva entre los mecanismos y las proteínas de replicación de los plásmidos y los virus.

Plásmidos
• Moléculas de ADN circular extracromosómico, presentes naturalmente en bacterias.

• Se replican autónomamente utilizando las enzimas de la bacteria.

• El número de copias por bacteria es variable.

Bacteriófago
Los bacteriófagos (fagos) son parásitos intracelulares obligados que se multiplican al
interior de las bacterias, haciendo uso de algunas o todas sus maquinarias biosintéticas
(p. ej., los virus que infectan bacterias).

Existen muchas similaridades entre los bacteriófagos y los virus de células animales. Así,
los bacteriófagos pueden ser visualizados como sistemas modelo de los virus de células
animales. Además es necesario el conocimiento previo del ciclo de vida del bacteriófago
para entender uno de los mecanismos por los cuales los genes bacterianos pueden
transferirse de una bacteria a otra.

Alguna vez se pensó que el uso de los bacteriófagos podría ser una vía efectiva para
tratar las infecciones bacterianas, pero pronto se hizo aparente que los fagos son
removidos rápidamente del cuerpo así que resultaron de poco valor clínico. Sin embargo,
los bacteriófagos son útiles en el diagnóstico de laboratorio para la identificación de
bacterias patógenas (fago-tipificación). Aunque la fago-tipificación no se usa en el
laboratorio clínico de rutina, sí se usa a en los laboratorios de referencia con propósitos
epidemiológicos. Recientemente, se ha desarrollado un nuevo interés en el posible uso de
los bacteriófagos para el tratamiento de infecciones bacterianas y en la profilaxis. De
manera que la decisión de si los bacteriófagos serán usados en la medicina clínica o no,
aún está por ser determinada.

COMPOSICIÓN Y ESTRUCTURA DEL BACTERIÓFAGO

Composición

Aunque diferentes bacteriófagos pueden contener diferentes materiales todos ellos

contienen ácido nucleico y proteína.

Dependiendo del fago, el ácido nucléico puede ser ya DNA o ya RNA pero no ambos y
puede existir en varias formas. Los ácidos nucléicos de los fagos a menudo contienen
bases raras o modificadas. Estas bases modificadas protegen a los ácidos nucleicos del
fago de las endonucleasas que cortan los ácidos nucléicos del huésped durante la
infección. El tamaño de los ácidos nucleicos varía dependiendo del fago. Los fagos más
simples solo tienen suficiente ácido nucleico para codificar un promedio de 3-5 productos
génicos, mientras que los fagos mas complejos, pueden codificar para mas de 100
productos génicos.

El número de proteínas de diferentes clases y la cantidad de cada una de ellas en la

partícula del fago variará dependiendo de la clase de fago que se trate. El fago mas
simple posee varias copias de solo una o dos diferentes proteínas, mientras que los mas
complejos podrían poseer muchos tipos de proteínas diferentes. La función de las
proteínas durante la infección es proteger al ácido nucleico de las nucleasas de su medio
ambiente.

Estructura

Los bacteriófagos vienen en muchas diferentes formas y tamaños. Las características

básicas estructurales de los bacteriófagos se ilustran en la Figura 1, la cual muestra al
fago denominado T4.

1. Tamaño - T4 está entre los fagos mas grandes, tiene aproximadamente 200 nm de
largo y 80-100 nm de ancho. Otros fagos son mas pequeños. La mayoría de los fagos
están entre un rango de 24-200 nm de longitud.

2. Cabeza o Cápside – Los fagos clásicos poseen una estructura a manera de cabeza y
pueden variar de tamaño y forma. Algunos son icosaédricos (20 caras) otros son
filamentosos. La cabeza o cápside está compuesta de muchas copias de una o más
proteínas diferentes. Al interior de la cabeza se encuentra el ácido nucleico. La cabeza
actúa como una cubierta protectora para el ácido nucleico.

3. Cola – Muchos, aunque no todos los fagos muestran una cola unida a la cabeza del
fago. La cola es un tubo hueco a través del cual el ácido nucleico pasa durante la
infección. El tamaño de la cola puede variar y algunos fagos ni siquiera la tienen. En los
fagos más complejos como T4, la cola se rodea de una cortina contráctil durante la
infección de la bacteria. Al extremo de la cola los fagos más complejos como T4 presentan
una placa en la base y una o mas fibras unidas a ella. Esta placa de base y las fibras de la
cola están involucradas en la unión de los fagos a la célula bacteriana. No todos los fagos
tienen placas de base ni fibras de la cola, En tales casos existen otras estructuras que se
ven asociadas en la unión de partícula del fago a la bacteria.

Método: Extracción de ADN plasmídico (Lisis alcalina modificado)

Usando el método de extracción por lisis alcalina se puede obtener entre 100-500 µg de
ADN partiendo de 1.5 mL de cultivo de bacterias en fase exponencial con un moderado
número de copias (10 a 20 por bacteria).

Pero la pureza y cantidad del ADN dependerá de los siguientes factores: Mayor tamaño
del plásmido, menor cantidad y pureza de ADN. Mayor número de copias del plásmido,
mayor cantidad de ADN. Cepas que producen grandes cantidades de carbohidratos
deterioran la pureza del ADN e interfieren con la actividad de las enzimas de restricción.

Material

Micropipetas

tubos de ensayo

tapones para tubos de cultivo

tubos de 1.5 mL

centrifuga refrigerada para tubos 1.5 mL

botellas para colocar los buffers o reactivos recipiente para colocar hielo

Vortex

Centrífuga con vacío para secar muestras

Reactivos

Medio de cultivo Agua ultra pura libre de nucleasas

RNAsa

Tris base
EDTA

Hidróxido de sodio NaOH

SDS

Acetato de sodio C2H3NaO2

Hielo Etanol grado biología molecular

Agarosa

Procedimiento

El siguiente método es una modificación donde se omite el uso de disolventes orgánicos

como: fenol y cloroformo.

Inocular 3 mL de medio de cultivo e incubar 12 horas a la temperatura óptima de la cepa y

en agitación.

Transferir 1.5 mL del cultivo a un tubo nuevo estéril y libre de nucleasas y centrifugar a
13,000 x g por 1 minuto.

Desechar el sobrenadante y lavar el botón con agua estéril y libre de nucleasas para
retirar totalmente el medio de cultivo. NOTA: El medio de cultivo interfiere con la pureza
del ADN.

Resuspender el botón celular en 100 µL de RNAsa/TE en un vortex. TE: 10 mM Tris ph

7.5 y EDTA 1 mM, RNAsa 5 mg/mL. NOTA: La glucosa es más común en cósmidos. Esta
disolución isotónica secuestra los iones presentes en el medio, que son cofactores de las
endonucleasas.

Adicionar 450 µL de NaOH 100 mM/SDS 0.5% y agitar por inversión. NOTA: El SDS es un
detergente que rompe las membranas bacterianas y desnaturaliza proteínas. El NaOH
desnaturaliza el ADN.

Adicionar 225 µL de Acetato de sodio 3 M, pH 5.2 y agitar por inversión. NOTA: El acetato
renaturaliza las cadenas de ADN, puede ser de potasio 5M. Además, el potasio forma
complejos con el SDS que a su vez interaccionan con las proteínas formando precipitados
junto con el ADN cromosomal.
Deja incubando 10 min sobre hielo. NOTA: es necesario dejarlo inmediatamente sobre
hielo para mejorar la extracción

Centrifugar a 14,000 x g a 4°C durante 10 min. NOTA: los complejos ADN cromosomal-
proteínas precipitan, y el ADN plasmídico permanece disuelto.

Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5 mL. NOTA: la concentración de ADN

no es suficiente para saturar la disolución.

Adicionar al sobrenadante 700 µL de etanol frío al 99.9 % y dar vortex. NOTA: El ADN es
insoluble en etanol, por lo que precipita.

Centrifugar a 14,000 x g a 4 °C durante 5 min. NOTA: esto ayudará a precipitar el ADN y

formará un botón traslúcido.

Retirar el sobrenadante y adicionar 1 mL de etanol al 70 %. NOTA: el acetato y otras sales

presentes se disuelven en agua contenida en el etanol.

Resuspender con ayuda con un vortex y centrifugar a temperatura ambiente a máxima

velocidad durante 2 min. NOTA: Para pureza de la extracción repita los pasos 12 y 13

Retirar el sobrenadante y seque la muestra con una centrífuga con vacío (speed vac).

Resuspender en 50-100µL de agua ultra pura libre de nucleasas o TE

Analizar 2 µL de muestra en un gel de agarosa al 1 %.

Resultado

Figura 1.
Imagen en negativo de un gel de agarosa 1%. Dos
extracciones del plásmido pBBR1MCS5 donde se puede
apreciar dos bandas. La banda de mayor peso molecular
representa concatámeros (2 o más plásmidos unidos
derivados del proceso de replicación). Este tipo de
moléculas se cortan posteriormente con una topoisomerasa
para separar los plásmidos involucrados y la banda de
menor peso molecular corresponde a los plásmidos
individuales. Foto de: Orlando Santillán

Mapa del plásmido: usando SanpGene