Você está na página 1de 5

MAJORARTICLE

Fibrose e hipertrofia induzida por Trypanosoma cruzi em um


sistema CardiomyocyteCulture Three-Dimensional

Descarregado a partir https://academic.oup.com/jid/article-abstract/197/6/906/920971 por Cruz utilizador Fundação Oswaldo (FIOCRUZ) em 06 de janeiro de 2020
Luciana Ribeiro Garzoni, 1,2 Daniel Adesse, 2 Maurilio José Soares, 3,5 Maria Isabel Doria Rossi, 4 Radovan Borojevic, 4
e Maria de Nazaré Leal de Meirelles 2
1 Laboratório de Farmacologia neurocardiovasculares e 2 Laboratório de Ultra-estrutura Celular, Instituto Oswaldo Cruz / Fiocruz, 3 Fundação Oswaldo Cruz, e 4 Laboratório de

Proliferação e Diferenciação Celular, Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, e 5 Instituto de Biologia Molecular do Paraná, Curitiba,

Paraná, Brasil

danos cardíacos causados ​por in vivo infectionwith Trypanosoma cruzi ainda não são totalmente clarificado. Aqui nós descrevemos para o fi uma
primeira vez em vitromodel de fi Brosis, hipertrofia e remodelação induzida pela T. cruzi em esferóides de cardiomiócitos (cardiacmicrotissues).
Neste novo sistema 3-dimensional, esferóides cardíacas mostrou contractilidade espontânea, com cardiacmorphology típico andproductionof
componentes matriz extracelular. Therewere 4- e 6-vezes, respectivamente, os aumentos na área e o volume de T. cruzi cardiomiócitos infectados e
inteiros microtissues, em conjunto com uma redução de 50% da população de células. Imuno fluorescência mostraram um aumento da expressão de
fi bronectin, colagénio IV e laminina nas microtissues 144 h após a infecção. T. cruzi infecção induzida por um aumento da inboth os
extracellularmatrixcomponents incardiac esferóides celular areaand, whichcontributed a um aumento no volume total microtissue, tornando este um
poderoso 3-dimensional modelo in vitro para o estudo da hipertrofia do tecido cardíaco, fi Brosis, e remodelação.

remodelação cardíaca (RC) é caracterizada por alterações na estrutura do infecção [2]. Esta doença provoca cardiomiopatia doença de Chagas, uma

miocárdio, em resposta a uma sobrecarga mecânica ou lesão cardíaca. CR doença progressiva na qual os pacientes apresentam com miocardite, fi

pode ser adaptativa ou pode resultar de fenotípicas modi fi cações, tais como Brosis, e hipertrofia do miocárdio [3].

fi Brosis, durante condições clínicas que podem alterar a expressão do gene Recentemente, foi demonstrado que os cardiomiócitos desempenhar um

do miocárdio [1]. papel activo na na inflamação em resposta a T. cruzi,

porque, durante a infecção por este organismo, as células cardíacas expressam

doença de Chagas, a qual é causada pelo protozoário factor tecidular-necrose , Interleucina 1 [4, 5]
Trypanosoma cruzi, é endêmica na América Latina, afetando 16-18 milhões e factor de crescimento do tumor- (TGF ) [6], possivelmente con-
de pessoas e 90 milhões estão em risco de buir para a génese de hipertrofia e fi Brosis in vivo. A persistência da

infecção, a presença de antigénios de parasitas no local em inflamatória,

e / ou processo auto-imune são possíveis causas das lesões patológicas


Recebeu 12 Abril de 2007; aceito 25 de junho de 2007; publicado eletronicamente 15 de fevereiro, 2008.
no tecido do coração de doentes infectados com [7-9].
Potenciais itos con fl de interesse: nenhum relatou.

Apresentado em parte: 46.ª reunião da American Society for Cell Biology, San Diego, Califórnia,
2-dimensionais sistemas de cultura de monocamada (2D) ter sido o
9-13 Dezembro de 2006 (apresentação 1.977 / cartaz B578); XXII reunião anual da reunião anual da
Sociedade Brasileira de Protozoologia e XXXIII de Pesquisa Básica em Doença de Chagas, Caxambu, método de escolha em estudos da interacção entre T. cruzi e
Minas Gerais, Brasil, 6-8 de Novembro de 2006 (BC53 abstrato).
cardiomiócitos e, fornecendo detalhes sobre essa relação, já
Apoio financeiro: Fundação Instituto Oswaldo Cruz / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado respondeu a muitas perguntas relativas a alterações na célula
do Rio de Janeiro, Programa de Apoio à Pesquisa Estratégica em Saúde IV / Fundação Instituto
hospedeira e fisiologia do parasita [5, 6, 10-20]. No entanto, as
Oswaldo Cruz, e Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientí fi co e Tecnológico.
culturas 2D falhar para imitar o CR causada por fi Brosis e hipertrofia
Reimpressões ou correspondência: Luciana Ribeiro Garzoni, Instituto Oswaldo Cruz / Fiocruz,
observada in vivo durante a cardiomiopatia Chagas.
Laboratório de Ultra-estrutura Celular, Avenida Brasil 4365, Manguinhos, 21045-900 Rio de Janeiro, RJ.

Brasil ( largarz @ COI. Fi ocruz.br).

The Journal of Infectious Diseases 2008; 197: 906-15 Bioengenharia, que surgiu durante a última década, tem-se centrado
© 2008 por Infectious Diseases Society of America. Todos os direitos reservados. 0022-1899 / 2008 /
sobre o cultivo celular por 3D Systems, por causa da semelhança dos
19706-0018 $ 15.00 DOI: 10,1086 / 528373

seus resultados aos de tecido

906 ● JID 2008: 197 (15 de março) ● Garzoni et al.


Descarregado a partir https://academic.oup.com/jid/article-abstract/197/6/906/920971 por Cruz utilizador Fundação Oswaldo (FIOCRUZ) em 06 de janeiro de 2020
Figura 1. Aspectos ultra-estruturais do ciclo de intracelular Trypanosoma cruzi, como mostrado por varrimento ( UMA - C) e transmissão ( D - F) microscópio eletrônico. Após sete dias de cultura, esferóides

cardíacos foram infectados com T. cruzi tripomastigotas. UMA, Superfície de microtissue não infectados, com células redondas sobre a fl na superfície. B, Grande aumento fi cação de microtissue não

infectada, que mostra mais pormenores da superfície de cardiomiócitos com projecções de membrana. C, Lançamento de um tripomastigota ( seta). Note-se a célula hospedeira danificada expondo as

estruturas intracelulares (*) e uma zona protegida ( ).

formas amastigotas proliferativas (*) observada 48-72 h após a infecção de exposição kinetoplasts em forma de barra. D, cardiomiócitos diferenciados, mostrando junções intercelulares ( ponta de seta), mio

fi fibrilas (MF) perto de mitocôndrias (Mt), e retículo sarcoplasmático (SR). E, A partir do processo de infecção, que mostra um tripomastigota (P) com o cinetoplástico típico em forma de cesto dentro de um

vacúolo parasitóforo (PV). F, formas amastigotas proliferativas (*) observada 48-72 horas após a infecção, exibindo kinetoplasts em forma de barra.

morfologia e porque proporcionam um ambiente adequado para as interacções esferóides e completa o seu ciclo intracelular. Além disso, verificou-se que a
celulares. As células em 3Dcultivation tem uma maior semelhança com a situação in infecção induzida por um aumento e redistribuição de matriz extracelular (ECM)
vivo, em termos de expressão do gene, proliferação, diferenciação e apoptose. componentes suchas fi bronectin, colagénio e laminina, whichwas seguido por um
Embora monocamada sistemas de cultura têm contribuído para avanços aumento tanto na área do celular e o volume total dos esferóides cardíacas.
importantes, eles são limitados em fornecer a informação clinicamente relevante [21,

22].

O objectivo do presente estudo foi o de reproduzir, in vitro, as condições relacionadas com MATERIAIS E MÉTODOS
a doença de Chagas cardiomiopatia, usando um sistema 3Dcultivation para cardiomiócitos

infecto (esferóides cardíacas) com T. cruzi. Anticorpos e reagentes. Os anticorpos policlonais de coelho contra fi
Nós demonstramos que este parasita invade com sucesso o cardíaca bronectin e laminina, 4' , 6-diamidino-2-fenilindole

T. cruzi -Cardiomyocyte modelo in vitro 3D ● JID 2008: 197 (15 de março) ● 907
Descarregado a partir https://academic.oup.com/jid/article-abstract/197/6/906/920971 por Cruz utilizador Fundação Oswaldo (FIOCRUZ) em 06 de janeiro de 2020
Figura 2. Hipertrofia e remodelação de microtissue cardíaca, induzida pela Trypanosoma cruzi infecção. UMA e B, Tridimensional (3D) de microscopia confocal de esferóide coradas com 4' , dicloridrato

de 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) após 13 dias de cultura. O esferóide mostrado no painel B foi analisado 6 dias (144 horas após a infecção [144hpi]) após a infecção e demonstraram um aumento de

volume, em comparação com aquele de um controlo não infectado ( UMA). C e

D, cortes ópticos, como mostrado por microscopia confocal, de esferóides todo-mount, mostrando T. cruzi hipertrofia induzida em 3D cultivadas cardiomiócitos. DAPI ( azul) foi usada para acolhimento de
células mancha e parasita (indicado pelas setas no painel D) núcleos. coloração Evans ( vermelho) análise permitiu da morfologia celular.

D, No 144hpi, cardiomiócitos apresentado um aumento na área celular ( áreas de branco-limitada). E, Histograma que mostra que o volume de esferóide foi aumentada em 144hpi, em comparação com o que
em esferóides de controlo não infectadas. medições de volume realizados pelo uso de software Image Browser LSM revelaram um

aumento de 5,9 vezes no volume de esferóides infectados ( P . 05, por meio de análise de variância [ANOVA]). F, Histograma mostrando que a infecção induzida uma
aumento de 4,8 vezes na área celular dos cardiomiócitos ( P . 05, por ANOVA). G, Histograma que mostra o número de núcleos nas esferas, revelando
uma redução de 50% na densidade celular ( P . 05, por ANOVA).

dicloridrato (DAPI), 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO), andbovine EU- glutamina, penicilina, estreptomicina, e fi modificado por Dulbecco ed meio de

serumalbuminwere comprada fromSigma-Aldrich. colagénio policlonal de Eagle da Sigma-Aldrich.

coelho anti-tipo IV (Instituto Pasteur) foi fornecida pelo laboratório no timo culturas de células cardíacas primárias. ratinhos Swiss Webster foram
Research, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. Secundária AlexaFluor obtidos a partir de CECAL-FIOCRUZ. Foram produzidos e manipulados de acordo
488 cabra anti-coelho IgG foi comprado fromMolecular Sondas (Invitrogen). com as recomendações aprovadas pelo Comité FIOCRUZEthical inanimal Uso
Para o isolamento e cultivo de cardiomiócitos, de tripsina foi obtido a partir de (CEUA-FIOCRUZ protocolo 232/04). Os corações de embriões de 18 dias de
Disco Laboratories, colagenase de tipo II a partir de Worthington oldmouse foram submetidos a dissociao enzimica usando tripsina a 0,05% e
Biochemical, e soro fetal de bovino (FBS),
0,01% de colagenase em PBS (pH 7,2) a 37 ° C, como descrito mais-

908 ● JID 2008: 197 (15 de março) ● Garzoni et al.


em que [10]. Para permitir a formação de esferóides cardíacas (3Dmicrotissues), 25 10 3 cardiomiócitos

foram plaqueadas em placas de 96-L-poço de plástico agarosecoated. Células

weremaintained a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 em atmosfera modi fi Dulbecco

ed meio de Eagle suplementado com 10% FBS, 1 mmol / L de CaCl 2, 1 mmol / L

EU- glutamina, 2% de extracto de pintainho-embrião, 1000 U / mL de penicilina, e 50 estreptomicina

g / mL.

T. cruzi infecção de microtissue cardíaca. formas de tripomastigota T. cruzi estirpe

Descarregado a partir https://academic.oup.com/jid/article-abstract/197/6/906/920971 por Cruz utilizador Fundação Oswaldo (FIOCRUZ) em 06 de janeiro de 2020
Y (MHOM / BR / 1950 / Y) foram obtidas a partir do sobrenadante de células Vero

infectadas previamente cultivadas em meio RPMI (CULTILAB) suplementado com 10% de

FBS. Após 7 dias de cultura, esferóides cardíacos foram infectadas a uma 20: 1 parasita:

rácio de cardiomiócitos. No especi fi c vezes, infectados e não infectados microtissues

cardíacos foram lavadas 3 vezes em PBS e foram fixado para uso em diferentes ensaios

de microscopia.

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) e microscopia eletrônica de

varredura (MEV). Microtissue amostras foram fi xa durante 60 min a 4 ° C com 2,5% de

glutaraldeído em 0,1 mol / L de tampão de cacodilato (pH 7.2). Depois de pós-fi xação

durante 30 min com 1% de OsO 4 / 0,8% ferricianeto de potássio / 2,5 mmol / L de CaCl 2 no

mesmo tampão, as amostras foram desidratadas através de uma série de acetona (30%

-100%). Para MET, o material foi incorporado em PolyBed812 (PolySciences) resina.

Secções ultrafinas foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo e foram

examinados por utilização de um microscópio electrónico de transmissão Zeiss EM10C; por

SEM, os esferóides foram de ponto crítico secou-se com CO 2, foram montadas em bases de

alumínio, e foram revestidas com uma camada de 20 nm de espessura de ouro. As

amostras foram examinadas por utilizao de um Zeiss DSM-640 microscópio electrónico de

varrimento.

Imuno fluorescência e confocal microscopia. esferóides cardíacos foram fixado em

4% de paraformaldeído (PFA) durante 1 h a 4 ° C, foram embebidos em Tissue-Tek

composto carbamoiltransferase ornitina (Sakura Finetechnical, Japão), foram

armazenadas a 80 ° C, e, em seguida, foram cortados por meio de criomicrotomia. Para

as análises wholemount, esferóides foram fixada durante 1 h com PFA a 4% e foram

permeabilizadas durante a noite com 0,5% de Triton X-100. Todas as lavagens foram

realizadas com Triton X-100, com a mesma concentração. Após 1 h de bloqueio em PBS /

3% de albumina de soro bovino, as fatias e conjunto de montagem em esferdes foram Figura 3. Trypanosoma cruzi induzida fi Brosis em microtissues cardíacos.
incubadas durante a noite a 4 ° anticorpo primário contra Cwith fi bronectin, colagénio IV, 3D microscopia confocal revelou que a express e a imunorreactividade de fi bronectin em

ou laminina. As amostras foram então lavadas 3 vezes com PBS e foram incubadas, em microtissues foi aumentada a 144 h após a infecção (144hpi)
(B), em comparação com o que microtissues controlo ( UMA). As imagens foram adquiridas depois
ambas as 37 ° C durante 2 h (criocortes) ou durante a noite a 4 ° C (esferóides conjunto
de todo-mount imunomarcação de esferóides cardíacos.
de montagem), com um anticorpo secundário AlexaFluor 488. ADN nuclear foi corado com

DAPI diluído em PBS. esferóides inteiras foram ressuspensas em DABCO antifading

agente e foram colocados em pratos confocal (Mattek); criocortes foram montados através cruzi. Microtissues werewashed inPBS, fixado durante 1 h a 4 ° C em PFA a 4%, e
da utilização de peças de cobertura. As análises foram realizadas com o uso de um laser mantida em 0,5% de Triton X-100 durante a noite a 4 ° C. Eles foram então lavadas em
Zeiss 510Meta digitalização microscópio confocal. PBS, e o DNA de coloração com DAPI foi realizada. Os esferóides foram então

coradas durante 1 min com

0,1% de azul de Evans, ressuspensas inDABCO, colocado inMattek pratos confocal, e

observado por meio de microscopia confocal.

Análise da hipertrofia de microtissue cardíaca. O tamanho dos esferóides e Quanti fi cações e análise estatística. A percentagem de área manchada de
cardiomiócitos foi medida a 144 h (6 dias) após a infecção, quando a maioria das compostos de ECM nos esferóides cardíaco foi medido através da utilização de

células já foram infectadas com T. programa Image-Pro-Plus. O número de

T. cruzi -Cardiomyocyte modelo in vitro 3D ● JID 2008: 197 (15 de março) ● 909
Descarregado a partir https://academic.oup.com/jid/article-abstract/197/6/906/920971 por Cruz utilizador Fundação Oswaldo (FIOCRUZ) em 06 de janeiro de 2020
Figura 4. Trypanosoma cruzi aumento induzido por infecção na expressão de fi bronectin em esferóides cardíacas. Criocortes de controlo ( painéis esquerdo-lado)
e infectados ( painéis lateral direita) microtissues foram coradas quer com 4' , dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindole ( UMA e B) ou com anti-coelho fi bronectin anticorpo primário e anticorpo
secundário anti-coelho de 488 AlexaFluor ( C e D). imagens fundidas de painéis UMA e C (E) e de painéis B
e D (F) são também mostrados. análise confocal revelou alterações da distribuição de aumento e fi bronectin coloração em esferóides infectados ( D e
F). Considerando que a coloração em microtissues controlo estava presente principalmente na periferia da célula ( C e E), que em esferóides infectados foi difundida (*) em todo o microtissue ( D e F). Em regiões
com ninhos de amastigotas ( Setas; flechas), houve uma redução na coloração fi bronectin, como mostrado na painéis B, D e F. Inserções em painéis E e F mostram uma vista geral de fi bronectin coloração

e ADN de coloração em esferóides.

núcleos e a área de miócitos, o volume e o diâmetro de esferóides, e o Obtiveram-se cardiacmicrotissues. A análise estatística foi realizada por um teste
número de células por diâmetro de esferóides foram estimados por utilização de análise de variância, com P . 05 como o nível

de software Image Browser LSM (Zeiss). fatias confocal dez do topo para o de significância. Os dados são representativos de 3 expericias independentes, com 10

meio de todo-mount esferóides por experimentação.

910 ● JID 2008: 197 (15 de março) ● Garzoni et al.