7.

Técnicas de Biología Molecular Aplicadas en Medicina

1. Huella genética y medicina forense.

1.1. Regiones variables de secuencias repetidas en tandem (VNTR).
1.2. Repeticiones cortas en tandem (SRT).
2. Terapia génica.
2.1. Clonaje de un gen en un vector retroviral y producción de
retrovirus recombinantes.
2.2. Inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X
(X-SCID).
2.3. Edición del genoma con nucleasas artificiales.

152
 OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Técnicas de Biología Molecular Aplicadas en Medicina

- Describir que es la huella dactilar del DNA y su utilidad en Medicina Forense.

- Explicar los polimorfismos más comunes analizados en Medicina Forense (VNTR y STR).
- Comparar las técnicas de Southern Blot y PCR, enumerando los pasos necesarios para
obtener la huella dactilar con estas técnicas.
- Definir terapia génica y los virus más utilizados.
- Explicar los pasos necesarios para producir retrovirus que puedan utilizarse en terapia
génica.
- Entender el concepto de terapia génica ex-vivo y dar un ejemplo.
- Explicar los pasos necesarios para editar el DNA genómico con nucleasas artificiales.
- Describir las similitudes y diferencias entre las distintas nucleasas artificiales utilizadas.
- Describir cada uno de los componentes del sistema CRISPR-Cas9, y su función en el
proceso de edición.

153
 Recursos en la Web

DNA fingerprinting: DNA interactive. Cold Spring Harbor Laboratory

http://www.dnai.org/

Videos sobre terapia génica:

Gene Therapy for Beta Thalassemia
https://www.youtube.com/watch?v=MUi94tvclxY

Gene Therapy, a new tool to cure human diseases (video UAB).

https://www.youtube.com/watch?v=U3RygvuSrok

Gene therapy clinical trials: http://www.abedia.com/wiley/index.html

Videos sobre edición del genoma:

Genome Editing with CRISPR-Cas9. https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8

McGovern Institute for Brain Research at MIT

Genome Engineering with CRISPR-Cas9. https://www.youtube.com/watch?v=SuAxDVBt7kQ

Jennifer Doudna (UC Berkeley / HHMI)

154
 Bibliografía

NELSON D.L. y COX M.M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 5º ed. Ed.

Omega, 2009. Capítulo 9.

WATSON J.D., MYERS R.M., CAUDY A.A. and WITKOWSKI J.A.

Recombinant DNA: Genes and Genomes- a short course. 3rd ed. Ed. W.H.
Freeman and Company, 2007. Capítulo 16.

KIM H. y KIM J-S. A guide to genome engineering with programmable

nucleases. Nature Reviews Genetics. 2014,15: 321-334.

MOJICA F.J. y RODRIGUEZ VALERA F. The discovery of CRISPR in

archaea and bacteria. FEBS J. 2016, 283: 3162-3169.

MOJICA F.J. y MONTOLIU L. On the Origin of CRISPR-Cas Technology:

From Prokaryotes to Mammals. Trends Microbiol. 2016, 24: 811-820.

155
 1. HUELLA GENÉTICA Y MEDICINA FORENSE
En 1985 el genético inglés Alec Jeffreys describe por primera vez un método
basado en técnicas de DNA recombinante denominado huella dactilar del DNA
(“DNA fingerprinting”), que permite detectar diferencias en las secuencias entre
individuos basándose en los polimorfismos existentes.

Los polimorfismos más útiles para la medicina forense se encuentran en los

denominados loci hipervariable:

1. Regiones variables de secuencias repetidas en tándem (VNTR).

2. Repeticiones cortas en tándem (STR).

1.1. Regiones variables de secuencias repetidas en tándem (VNTR).

Regiones que contienen secuencias que se repiten en tándem y que
contienen entre 15 y 70 bp por cada repetición (el número de repeticiones
varia en cada individuo). Cuando se corta con un enzima de restricción el
DNA en las secuencias que flanquean estas regiones se obtienen
fragmentos de DNA de diferente tamaño en distintos individuos.

La detección de VNTR se basa en la técnica de Southern blot, utilizando

una sonda que reconoce a estas secuencias repetidas.

El método es muy preciso y fue usado por primera vez en casos penales
a finales de la década de 1980.
156
Alec Jeffreys utilizó una sonda de DNA que reconocía una región VNTR situada en el intrón 1 del gen de la
mioglobina. Sin embargo, existen otras regiones VNTR situadas en otros lugares en el genoma humano que
también son reconocidas por esta misma sonda (en este caso las regiones VNTR I, VNTR II y VNTR III). En el
ejemplo mostrado, al cortar con enzimas de restricción que flanquean estas regiones obtenemos 6 fragmentos
de DNA de tamaño variable por cada individuo (dependiendo del número de repeticiones en cada región VNTR).

157
El Southern blot se puede utilizar para obtener la
huella dactilar de DNA y resolver casos de
investigación policial. En este ejemplo, el DNA de una
muestra de semen procedente de una victima de violación y
asesinato se comparó con muestras de DNA de la víctima y dos
sospechosos. Se obtuvieron fragmentos de cada muestra,
cortando con enzimas de restricción, que se separaron por
electroforesis en gel de agarosa. Se usaron sondas de DNA
radioactivas que reconocen las regiones VNTR para
identificar un pequeño subconjunto de fragmentos que
contenían secuencias complementarias de la sonda. Los
tamaños de los fragmentos variaban de un individuo a otro. Uno
de los sospechosos muestra un patrón de bandas de DNA
idéntico al de la muestra de semen presente en la víctima.

158
 Alec Jeffreys, 1989.

Alec Jeffreys mostró que el DNA

de la huella dactilar de Andrew
contenía alrededor de 25 bandas El Ministerio del Interior aceptó la evidencia de
que fueron heredadas de su huellas dactilares del DNA, y permitió que Andrew
madre. permaneciera en Inglaterra con su madre y
hermanos. También anunció que no se opondría a
casos de inmigración futuros si las pruebas de
DNA similares estaban disponibles.

Aunque el DNA del padre de Andrew no estaba disponible,

Jeffreys reconstruyó la huella dactilar de DNA del padre con las
bandas presentes en los otros tres hijos de Christiana, pero
ausentes en Christiana. Alrededor de la mitad de las bandas de
Andrew coincidían con las bandas del “padre reconstruido” y las
bandas restantes estuvieron presentes en la huella digital de
Christiana. La posibilidad de que esto ocurra por casualidad es de
menos de uno en un billón.
Alec Jeffreys, 2002.
www.dnai.org Applications Human identification 1. Profiling, 2. Family.

159
 Sin embargo la técnica de
Southern blot requiere una
cantidad importante de DNA no
degradado (>25 ng), que a
menudo no se encuentra en la
escena del crimen.

1.2. Repeticiones cortas en tándem (STR).

En la década de 1990 los científicos forenses utilizaron la técnica de PCR y las
repeticiones cortas en tándem (STR), que permiten una mayor sensibilidad. Se
pueden hacer amplificaciones a partir de menos de 1ng de DNA parcialmente
degradado, cantidad que puede obtenerse de un único folículo piloso, una gota de
sangre, una pequeña muestra de semen de una sábana o muestras que pueden
tener meses o incluso años de antiguedad.

Las STR son secuencias cortas (2-7 bp) repetidas

múltiples veces en tándem (4-50 repeticiones).
Existen más de 20.000 loci STR en el genoma
humano, y pueden representar hasta el 3% de todo el
DNA humano.
Se pueden amplificar estas regiones por PCR
utilizando “primers” de las secuencias flanqueantes.
160
 PCR

STR Typing

161
El FBI ha seleccionado 13 STR que están presentes en cualquier experimento de
tipificación de DNA realizado en EEUU. El gen de la amelogenina también se usa
como marcador porque está presente en los cromosomas sexuales humanos y
permite identificar el sexo del donante de DNA. Utilizando primers específicos
flanqueantes se puede amplificar una región de 112 bp en el cromosoma Y, o bien
de 106 bp en el cromosoma X (el gen de la amelogenina tiene una deleción de 6 bp
en el intron 1 del cromosoma X).

162
163
ANÁLISIS POR PCR DE UN LOCUS STR

Locus D7S820

164
 ANÁLISIS POR PCR DE UN LOCUS STR

1) Se diseñan cebadores
(primers) marcados con un
colorante fluorescente para
2) Los dos cromosomas de un
amplificar por PCR un
individuo pueden tener alelos
segmento que contenga la
distintos con un número
región repetitiva STR.
diferente de repeticiones en el
mismo locus.

3) La PCR genera dos 4) Estos productos se

productos de tamaño separan en un gel capilar de
diferente. poliacrilamida. Las bandas
fluorescentes se analizan
con un laser de barrido, que
combinados con los
marcadores de tamaño
1 locus (D7S820) indica el tamaño de cada
fragmento.

5) La combinación de los
productos de la PCR de
múltiples loci genera un
patrón múltiplex. Los
distintos cebadores tienen
diferentes colorantes.

165
 RFLP
RFLP PCR

VNRT

STR

Restriction Site PCR Primer

STR Typing

Esquema que ilustra las dos técnicas utilizadas para detectar polimorfismos.
El análisis de RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción) detecta polimorfismos debido a la
presencia o ausencia de sitios de restricción en lugares concretos del DNA (esta técnica también nos permite
detectar inserciones y delecciones en genes concretos). El análisis de RFLP solo nos permite obtener una huella
del DNA cuando se utilizan los marcadores VNTR, que contienen repeticiones de 15-70 bases y que están
flanqueados por sitios de restricción conservados. El análisis de RFLP utiliza la técnica de Southern Blot y es
necesario preparar una sonda radioactiva para detectar los fragmentos producidos. Para obtener la huella
genética con la técnica de PCR se utilizan los marcadores STR, que contienen repeticiones de 2-4 bases, y
mediante múltiples primers flanqueantes se amplifica el DNA en distintas regiones. La técnica de PCR también
puede utilizarse para detectar inserciones y delecciones en zonas concretas, e incluso para secuenciar el DNA.
166
 NDNAD
United Kingdom National DNA Database

167
 2. TERAPIA GÉNICA
Terapia génica: Introducción de un ácido nucleico en el paciente para tratar una enfermedad.
En la mayor parte de los casos se intenta reemplazar un gen mutado por una copia normal.
Enfermedades tratadas con éxito en terapia génica:

● Síndrome de inmunodeficiencia combinada severa (SCID):

- X-SCID (asociada al cromosoma X)
- ADA-deficiency (adenosina desaminasa)
● Amaurosis congénita de Leber.
● Hemofilia.
● β-talasemia.
● Adenoleucodistrofia.

Virus utilizados para transferir el DNA:

● Retrovirus. Se integran en el genóma de la célula huesped. Los

● Lentivirus (HIV). lentivirus y virus adeno-asociados pueden infectar
● Virus adeno-asociados. células que no se dividen.
● Adenovirus Se mantienen como un DNA extra-cromosómico.
Problemas:

● Respuesta inmune.
● Elevada expresión del gen integrado.
● Activación de oncogenes o inactivación de genes supresores de tumores.
● Elevado coste.
168
Gene therapy clinical trials: http://www.abedia.com/wiley/index.html

169
2.1. CLONAJE DE UN GEN EN UN VECTOR RETROVIRAL Y EMPAQUETAMIENTO
1. Todos los retrovirus contiene
3 genes (gag, pol, env) que
2. Podemos preparar codifican para los principales
una línea celular que
componentes estructurales de
contenga plásmidos
los retrovirus, y que se
recombinantes con los
requieren para empaquetar su
genes gag, pol, env,
RNA genómico en partículas
(pero sin las secuencias
víricas. El genoma del virus esta
LTR) de forma que estas
flanqueado por secuencias LTR
células expresarán
(long terminal repeats), que son
proteínas capaces de
necesarias para integrarse en el
empaquetar un RNA con
genoma de la célula infectada.
LTR, pero no
empaquetarán el RNA
propio.
3. Podemos clonar el gen
que nos interese en otro
plásmido que contiene
secuencias LTR (pero no
los genes gag, pol, env) y
expresar este gen bajo el
control de LTR, que tiene
actividad promotora. Esto
es un vector retroviral.

4. Se transfectará este plásmido en la

línea celular preparada anteriormente (2).

5. Las células transfectadas que

contienen estos tres plásmidos son
capaces de expresar el RNA del gen
que nos interesa y de empaquetarlo.
170
2.1 PRODUCCIÓN Y UTILIZACIÓN DE RETROVIRUS RECOMBINANTES
5. Las células transfectadas que
contienen estos tres plásmidos son
capaces de expresar el RNA del gen
que nos interesa y de empaquetarlo.

6. Los virus liberados por estas células

contienen RNA que consiste en el gen que
nos interesa (en forma de RNA)
flanqueado por secuencias LTR.

7. Estos virus se pueden utilizar para infectar

otros tipos celulares, dando lugar a la
integración del gen de forma estable y a la
producción de la proteína codificada por el
gen. Puesto que el virus recombinante no
contiene gag, pol, env, las células infectadas
no producen virus.

Terapía génica ex-vivo

8. La terapia génica puede encontrarse con
diversos problemas: lugar de integración del
gen y niveles de expresión de la proteína.
Un ejemplo de terapia génica con retrovirus:
Inmunodeficiencia combinada severa asociada al
171
cromosoma X (X-SCID).
 2.2. INMUNODEFICIENCIA COMBINADA SEVERA ASOCIADA AL
CROMOSOMA X (X-SCID)
Los niños con X-SCID no tienen linfocitos T, B y NK (natural killers)
necesarios para combatir los virus y bacterias que infectan el organismo. Sin
un trasplante de médula ósea suelen morir antes de los dos primeros años de
vida.

Tienen una mutación en el gen IL-2RG, que codifica para la subunidad γC, que esta presente en el
receptor de varias interleuquinas. Estas interleuquinas y sus receptores están implicados en el
crecimiento y maduración de células T, B y NK.

2.000
Se diseño un vector retroviral con el gen IL-2RG substituyendo los genes necesarios para la
replicación del retrovirus. Se aislaron células madre de la médula ósea de cada paciente y se
infectaron con los retrovirus modificados. Estas células, que ahora contenían una copia
integrada del gen IL-2RG, se introdujeron en cada donante y se permitió que repoblaran la
médula osea (terapía génica ex-vivo).

18/20 niños tratados presentaron una gran mejora en el sistema inmune.

Sin embargo, 5/20 niños tratados con éxito desarrollaron leucemia, por activación de un oncogen
(LMO2) como resultado de la integración del retrovirus (uno murió como consecuencia de la
leucemia, los otros 4 se han recuperado después de la quimioterapia).

2.011
Nuevo ensayo con un vector retroviral autoinactivado (delecciones en las secuencias LTR enhancer
del virus). 7/8 niños curados sin leucemia y sin inserción en oncogenes.

172
 2.3. EDICIÓN DEL GENOMA CON NUCLEASAS ARTIFICIALES

1. Introducimos en la célula una endonucleasa artificial que reconoce un

sitio especifico en el DNA genómico y produce un corte en las dos cadenas.

2. A continuación, la célula repara ese corte utilizando mecanismos endógenos:

- Recombinación homóloga (HDR, homology directed repair).
- Unión de extremos no homólogos (NJEJ, non homologous end joining).

3.1. Edición mediante HDR: Junto a la endonucleasa artificial también

introducimos un DNA donador, que contiene la secuencia que queremos
introducir o sustituir en el genóma flanqueada por una secuencia homóloga a la
zona donde se producirá el corte del DNA. El sistema de recombinación homóloga
(HDR) sustituirá la secuencia de DNA genómico por la secuencia de DNA donador.

3.2. Edición mediante NJEJ: No es necesario añadir ninguna secuencia

donadora, porque la maquinaria endógena repara la zona, pero cometiendo
errores (inserciones o delecciones de unos pocos nucleótidos).

4. Se seleccionan las células que han incorporado la edición del DNA que
nos interesa, para utilizarlas en terapia génica.

173
EDICIÓN DEL GENOMA MEDIANTE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA (HDR)

DNA genómico

Rotura de doble
cadena del DNA

DNA donador (doble cadena) DNA donador (doble cadena)

HDR
Reparación por
recombinación homóloga DNA donador (cadena sencilla)

Inserción en el DNA genómico Corrección o mutagénesis puntual en el

DNA genómico 174
 NUCLEASAS ARTIFICIALES QUE CORTAN EL DNA GENÓMICO

Dominio con
Dominio de actividad nucleasa
1. NUCLEASAS DE DEDOS DE ZINC dedo de zinc
Cada dedo de zinc reconoce 3 bp.
Aminoácidos del
La especificidad de unión al DNA del dedo de zinc dedo de zinc.
(las 3 bases que reconoce) se puede modificar
alterando la secuencia de aminoácidos del dedo de
zinc.

Dedos de zinc

2. TALENs
(Transcription activator-like effector nucleases)
aa RVD base
Repeat variable residues (RVD) Asn-Asn G
Estos dos aminoácidos determinan la especificidad del par de Asn-Ile A
bases que reconocen en el DNA. His- Asp C
Asn-Gly T
Dominio de unión al DNA
(33-35 aminoácidos)
Los dos aminoácidos del
RVD interacionan con el
surco mayor del DNA.

175
3. NUCLEASAS CON RNA GUÍA (REGENs): CRISPR/CAS9.
En bacterias es un sistema de defensa contra fagos o plásmidos
invasores (un tipo de sistema inmunitario procariota). DNA genómico
En eucariotas introducimos la nucleasa Cas9 y un SgRNA diseñado
artificialmente para dirigir al complejo SgrRNA/Cas9 al sitio del
genoma que queremos cortar.
Cas9
Cas9 (nucleasa)
Rotura de doble cadena (entre A y G)

Secuencia de 3 nucleótidos
reconocida por Cas9.

DNA
genómico

SgRNA
(RNA guía de
cadena única)

Secuencia guía del SgRNA (20bp)

CRISPR/Cas9 esta formado por un SgRNA que contiene una secuencia de 20 bp (secuencia guía)
complementaria con una secuencia específica del DNA genómico. Después del apareamiento del
complejo CRISPR/Cas9 con el DNA genómico, la nucleasa Cas9 realiza un corte en las dos cadenas
del DNA genómico (flecha roja), creando extremos romos.
176
 Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells
We demonstrate the therapeutic potential of our strategy by targeting a corrective complementary DNA into the IL2RG gene
of HSCs from healthy donors and a subject with X-linked severe combined immunodeficiency (SCID-X1).
Genovese P. et al. Nature. 2014 Jun 12;510(7504):235-40.

Nature. 2014 Jun 12;510(7504):226-7. Gene therapy: Repair and replace.

In gene addition, stem cells harbouring a genetic mutation are

An alternative approach is gene repair, whereby a nuclease enzyme
pre-stimulated to prepare them for genetic manipulation, and
engineered to create DNA breaks around the mutated site and a DNA
then a functional copy of the mutated gene is transported into
template for the functional sequence are added to pre-stimulated cells
the cells in a retroviral vector. The functional gene integrates
using a viral vector. The mutated sequence is then replaced with the
into the genome at a semi-random site, restoring normal gene
functional copy by homologous recombination (white dotted lines).
expression.
177